CN102993336B - 一种粗品肝素钠的提纯工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肝素钠的提纯工艺。一种粗品肝素钠的提纯工艺，依次包括如下步骤：①粗品肝素钠溶于氯化钠溶液中，加入碱性蛋白酶进行酶解；②灭活后加入硅藻土，高速离心弃去不溶杂质；③加入聚合硅酸铝盐，高速离心弃去不溶杂质；④加入酒精，沉淀，弃去上清酒精；⑤溶于氯化钠溶液，加入双氧水，氧化后高速离心弃去不溶杂质；⑥将加入酒精，沉淀弃去上清酒精；⑦过滤，真空冷冻干燥得到精品肝素钠。该粗品肝素钠的提纯工艺的优点是制得的精品肝素钠蛋白含量低，收率高。

Description

一种粗品肝素钠的提纯工艺

技术领域

本发明涉及一种肝素钠的提纯工艺。

背景技术

肝素作为抗凝血剂，于1935年正式应用于临床治疗，至今已有70余年历史。至今，它仍是世界上最有效和临床用量最大的抗凝血药物，已被收入世界各主要国家《药典》。肝素是Mclean在研究凝血机制时从猪的肝脏组织中发现的一种酸性粘多糖，是一种天然的抗凝血物质。肝素是一种天然活性物质，其活性不能用化学或物理的方法进行确切测定，只能采用生物检定法测定。不同国家及不同时期采用的方法不同，制定的标准也不同。Howell对肝素活性单位的定义是：在0℃恰好使新鲜鸽子血1mL在24h内不发生凝结所需肝素的量为1个活性单位。Reinert等介绍用椽酸抗凝的牛血浆为底物进行测定，其抗凝活性单位定义为：在37℃恰能抑制再钙化牛血浆1mL于4h内发生凝结所需肝素的量。肝素钠指标的技术指标包括比旋光度、光吸收、酸碱度、干燥失重和效价等。2010版中国药典对于精品肝素钠的规定：按干燥品计算，每1mg的效价不得少于170单位；比旋度，当平面偏振光通过含有某些光学活性的化合物液体或溶液时，能引起旋光现象，使偏振光的平面向左或向右旋转(按顺时针方向转动称为右旋，用“+”表示；按逆时针方向转动称为左旋，用“-”表示)。2010版中国药典规定：取本品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中含40mg的溶液，依法测定比旋度应不小于+50°。粗品肝素钠和精品肝素钠的主要技术指标的区别详见下表：

现有的粗品肝素钠的提纯技术，主要是先进行蛋白质去除，然后氧化，最后通过有机溶剂的分级沉淀来获得精品肝素钠。处理蛋白质的方法很多，主要包括酸碱处理蛋白质、树脂处理蛋白质和添加酒精处理蛋白质，比较常用的是酸碱处理蛋白质，其中酸处理的时间均超过一个小时。中国药典(2010版)在中国药典(2005版)的基础上提高了对杂质含量的要求，中国药典(2010版)规定，在紫外波长260nm处的光吸收应≤0.10，比中国药典(2005版)的光吸收值即≤0.20提高了要求，因而传统工艺生产的精品肝素钠已经不能达到相关的要求。现有工艺存在下述缺点：(1)酸碱处理时溶液中的酸碱蛋白不易分离，很难将蛋白质去除，最终精品肝素钠的蛋白含量偏高，从而影响精品肝素钠的质量；采用树脂吸附去除蛋白质的工艺其生产周期较长，并且会产生大量的废水，增加了环保压力，尤其是树脂为多次重复使用，对每批产品的界定不明显，树脂中残留的杂质较多，不易清洗干净，很容易造成上批产品污染下批产品的情况，故而国外已基本淘汰了离子交换树脂法生产精品肝素钠的方法；添加酒精处理蛋白质是添加酒精作为蛋白质的沉淀剂，加快蛋白质的沉降，效果不好不能完全去掉酸性蛋白质，最终的精品肝素钠的效价不超过150iu/mg。(2)在酸处理时，由于酸对肝素有降解作用，现有工艺中酸处理的时间过产，导致精品肝素钠的收率低，并且酸会破坏肝素分子产生很多小分子，影响肝素分子结构，进而影响精品肝素钠的质量。

发明内容

为了解决上述现有粗品肝素钠的提纯工艺存在的不足，本发明目的是公开一种粗品肝素钠的提纯工艺，能保证最终的精品肝素钠的蛋白含量低，收率高。

为了实现上述发明目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种粗品肝素钠的提纯工艺，依次包括如下步骤：①粗品肝素钠溶于浓度为3％-5％的氯化钠溶液中，加入碱性蛋白酶，在55℃-60℃保温酶解；②将所得溶液升温至90℃-95℃灭活，然后降至55℃-60℃，用碱调节pH至10-13，加入硅藻土，高速离心，弃去不溶杂质；③将所得澄清液降温至-2℃-4℃之间，加入聚合硅酸铝盐，用酸调节pH值至1.8-2.3，高速离心，弃去不溶杂质；④在所得溶液中加入溶液重量的0.6-0.8倍的酒精，沉淀，弃去上清酒精；⑤将所得沉淀溶于浓度为3％-5％的氯化钠溶液中，用碱调节pH值至10-13，加入双氧水，氧化12-20小时，高速离心，弃去不溶杂质；⑥将所得溶液pH值调节至6-7，再加入溶液重量的0.4-0.7倍的酒精，沉淀，弃去上清酒精；⑦将所得沉淀加水用微孔滤膜进行过滤，真空冷冻干燥得到精品肝素钠。

作为优选，所述硅藻土粒径在250目以上，将所得沉淀加水用0.22um的微孔滤膜进行过滤，硅藻土粒径与微孔滤膜的孔径对应，保证最终产品没有硅藻土的残留。

作为优选，所述双氧水是溶液重量的0.8％-1.5％。

作为优选，所述聚合硅酸铝盐质量是所得澄清液的0.02％-0.08％。

作为优选，所述硅藻土质量是所得溶液的0.02％-0.08％。

采用了上述技术方案的一种粗品肝素钠的提纯工艺，用碱性蛋白酶酶解粗品中的蛋白酶，目的是酶解粗品肝素钠中含有的蛋白质，为后步的纯化扫清障碍；在粗品肝素钠中，有部分肝素分子是和蛋白质分子通过一定的化学键连接在一起的，在碱性蛋白酶的作用下，能水解这种连接，从而使肝素游离出来，否则，在后面的酸碱处理的过程中，这部分肝素会随蛋白质一起被除掉，所以，在粗品到精品的生产工艺中使用碱性蛋白酶能提高产品的收率，并且，本工艺采用升温至90℃～95℃的方法对酶进行灭活，同时这也是对肝素原料中可能含有的病毒等进行灭活，因为粗品肝素钠是生物提取过程，可能存在未灭活的病毒。使用硅藻土对碱性蛋白进行加速吸附沉淀，硅藻土对蛋白质有吸附作用，从而和原来不易沉降的细小颗粒蛋白质结合在一起，增加了整个颗粒的半径，并且在过滤和离心时能形成滤桥，更容易过滤，根据颗粒沉降速度的公式，我们知道此颗粒能迅速沉降，从而达到我们快速分离的目的，当固相和液相完全的分离后，最终产品的杂质就少了，从最终产品的蛋白质含量上体现出来；为避免硅藻土的残留，本工艺选用粒径特殊的硅藻土，并且最终在冷冻干燥前用微孔滤膜进行过滤，保证最终产品没有硅藻土的残留。选用絮凝剂中的聚合硅酸铝盐对酸性蛋白进行加速吸附沉淀，pH值在1.8-2.3条件下，聚合硅酸铝盐能快速吸附溶液中的酸性蛋白，而对肝素不产生影响，再通过高速离心，能很好且更迅速的除去溶液中的酸性蛋白，缩短肝素溶液在低pH状态下的时间，聚合硅酸铝盐在低酸溶液中成胶体状，因其对细小颗粒的蛋白质有吸附作用，从而能使原来不易沉降的蛋白质迅速沉降，达到快速分离的目的，缩短了杂质分离的时间，而肝素在低酸的环境中是很容易失活的，故在工艺设计时应尽量减少肝素在低酸环境中的时间，而聚合硅酸铝盐的加入加快了杂质的沉降，从而缩短了肝素在低酸环境中的时间，保证了最终产品的收率。综上所述，该粗品肝素钠的提纯工艺的优点是制得的精品肝素钠蛋白含量低，收率高。

具体实施方式

一种粗品肝素钠的提纯工艺，依次包括如下步骤：①肝素总活性为10000Mega uspu的粗品肝素钠溶于1250升4％的氯化钠溶液中，加入一定量的碱性蛋白酶，具体是每克粗品肝素钠加200单位的碱性蛋白酶(碱性蛋白酶是活性物质，它是用效价单位来描述其活性的，使用的碱性蛋白酶是100000u/g)在55℃保温酶解；②将所得溶液升温至90℃灭活，然后降至60℃，用碱调节pH至11，加入硅藻土，硅藻土质量是所得溶液的0.02％-0.08％，高速离心后弃去不溶杂质；③将所得澄清液降温至4℃以下，具体是-2℃至4℃之间，加入聚合硅酸铝盐，聚合硅酸铝盐质量是所得澄清液的0.02％-0.08％，用酸调节pH至1.8，高速离心，弃去不溶杂质；④在所得溶液中加入溶液重量的0.7倍的酒精，沉淀，弃去上清酒精；⑤将所得沉淀溶于浓度为4％的氯化钠溶液中，用碱调节pH至10，加入溶液重量的1％的双氧水，氧化16小时，高速离心，弃去不溶杂质；⑥将所得溶液pH值调节至6.8，再加入溶液重量的0.4倍的酒精，沉淀，弃去上清酒精；⑦将所得沉淀加水用0.22um的微孔滤膜进行过滤，真空冷冻干燥得到精品肝素钠，精品肝素钠的主要指标测定结果如下：效价：186uspu/mg、比旋度+55°、光吸收及各项理化指标达到中国药典(2010版)的标准。

用同批次的粗品肝素钠原料分成两组用传统工艺和上述实施例的工艺进行生产，分别得到A、B精品肝素钠，光吸收值对比表如下：

由上表可知，采用了本专利工艺生产的精品肝素钠与传统工艺生产的精品肝素钠相比，代号为YT1的批次蛋白减少37.9％，代号为YT2的批次蛋白减少28.9％，代号为YT3的批次蛋白减少34.1％，平均蛋白减少率达到33.6％。检测方法：将精品肝素钠按0.4％(w/v)溶于蒸馏水中，用紫外分光光度计测量在紫外波长260nm处的吸收度，紫外光在260nm波长处的光吸收值与样品中蛋白质含量成正比关系。

用同批次的粗品肝素钠原料分成两组用传统工艺和上述实施例的工艺进行生产，分别得到A、B精品肝素钠，酸处理时间和产品收率对比表如下：

由上表可知，采用了本专利工艺生产的精品肝素钠与传统工艺生产的精品肝素钠相比，代号为YT1的批次收率提高点为0.8％，代号为YT2的批次收率提高点为1.1％，代号为YT3的批次收率提高点为1.2％，收率提高点是同批次粗品肝素分成等量的两个小批次用不同工艺生产后，两个工艺收率的差值。

Claims (4)

1.一种粗品肝素钠的提纯工艺，其特征在于依次包括如下步骤：①粗品肝素钠溶于浓度为3％－5％的氯化钠溶液中，加入碱性蛋白酶，在55℃－60℃保温酶解；②将所得溶液升温至90℃－95℃灭活，然后降至55℃－60℃，用碱调节pH至10－13，加入硅藻土，高速离心，弃去不溶杂质；③将所得澄清液降温至-2℃—4℃之间，加入聚合硅酸铝盐，用酸调节pH值至1.8－2.3，高速离心，弃去不溶杂质；④在所得溶液中加入溶液重量的0.6－0.8倍的酒精，沉淀，弃去上清酒精；⑤将所得沉淀溶于浓度为3％－5％的氯化钠溶液中，用碱调节pH值至10－13，加入双氧水，氧化12－20小时，高速离心，弃去不溶杂质；⑥将所得溶液pH值调节至6－7，再加入溶液重量的0.4－0.7倍的酒精，沉淀，弃去上清酒精；⑦将所得沉淀加水用微孔滤膜进行过滤，真空冷冻干燥得到精品肝素钠；上述聚合硅酸铝盐质量是所得澄清液的0.02％—0.08％。

2.根据权利要求1所述的一种粗品肝素钠的提纯工艺，其特征在于硅藻土粒径在250目以上，将所得沉淀加水用0.22um的微孔滤膜进行过滤。

3.根据权利要求1所述的一种粗品肝素钠的提纯工艺，其特征在于双氧水是溶液重量的0.8％—1.5％。

4.根据权利要求1所述的一种粗品肝素钠的提纯工艺，其特征在于硅藻土质量是所得溶液的0.02％—0.08％。