CN104829751A - 一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法,以粗品肝素钠为原料,在一定条件下经过纯化和降解获得高纯度、高质量的低分子量肝素钠。本发明的粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法的优点是低分子量肝素钠制备成本低,所得低分子量肝素钠蛋白含量低、纯度高,而且收率高。
Description
技术领域
本发明涉及医药制剂肝素钠的制备方法领域,具体涉及一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法。
背景技术
肝素钠是粘多糖硫酸酯类抗凝血药,属粘多糖类物质。其药物功能主要体现在:治疗各种疾病并发的播散性血管内早期凝血;预防动、静脉血栓和肺栓塞;治疗动、静脉血栓和肺栓塞,缺血性脑卒中,不稳定型心绞痛,急性心肌梗塞;人工心肺、腹膜透析或血液透析时作为抗凝血药物;作为溶血栓疗法的维持治疗,用于输血时预防血液凝固及血库保存鲜血等体外抗凝剂。
低分子量肝素是从普通肝素通过降解得到的小分子肝素制品,具有生物利用率高、血浆半衰期长等优点,特别是其引起的出血副作用大幅降低。目前,低分子量肝素(钠)的生产制备多是以精品肝素钠作为起始原料,制得低分子量肝素钠的成本较高;现有技术CN103214596A公开了一种由肝素钠粗品直接生产低分子量肝素钠的方法,该方法采用肝素钠粗品为原料制备低分子量肝素钠,但是其制备工艺中仅使用超滤器对肝素中的蛋白等大分子物质进行截留,这样的处理工艺难免会使肝素钠成品中残留一定量的小分子蛋白等杂质,使得最终低分子量肝素钠的蛋白含量偏高,从而影响低分子量肝素钠的质量。
发明内容
针对现有技术不足,本发明提供了一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法,目的是降低低分子量肝素钠的生产成本,获得高纯度、高质量的低分子量肝素钠。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案为:一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法,具体包括以下步骤:
(1)取一定量粗品肝素钠溶于浓度为2%的NaCl溶液中,得粗品肝素钠溶液,加入碱性蛋白酶,于40~50℃下保温酶解4~5h;
(2)将步骤(1)所得酶解液升温至92~94℃灭活,降温至40~50℃,滴加NaOH溶液调节pH为11~12,加入蒙脱土,搅拌后高速离心,取上层清液;
(3)将所得澄清液降温至0~4℃之间,加入聚合硅酸铝盐,用HCl溶液调节 pH 值至2~3,高速离心,弃去不溶杂质;
(4)步骤(3)所得清液加NaOH溶液调节pH为6~7,加入0.3~0.5倍溶液体积的无水乙醇沉淀,调整温度至0~4℃,放置6~15h,收集沉淀物,并将沉淀物溶于6~12倍体积的蒸馏水中,完全溶解后,加入溶液体积 0.5~1v%的过氧化氢氧化8~12h,用滤膜过滤,加入溶液体积2倍量的乙醇沉淀,沉淀放置6~15h,得到沉淀物;
(5)将步骤(4)所得沉淀物溶于蒸馏水中,搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠,直至降解反应结束,加入用氢氧化钠,再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原,还原结束后使用超滤膜过滤,所得滤液加入2倍的乙醇并充分搅拌,用乙醇脱水,浓缩并冷冻干燥后即得低分子量肝素钠。
进一步地,步骤(1)中,所述粗品肝素钠溶液的浓度为8~10%,所述碱性蛋白酶用量为粗品肝素钠溶液的0.5~1%。
进一步地,步骤(2)中,所述蒙脱土的量为步骤(1)所得酶解液质量的0.10~0.15%,所述蒙脱土的目粒度为200~800目。
进一步地,步骤(5)中,所述沉淀物溶于蒸馏水中所得溶液的浓度为6~8%。
进一步地,步骤(5)中,所述亚硝酸钠降解肝素钠的反应条件为:HCl溶液调节 pH 值2.5~3.0,温度15~18℃,添加亚硝酸钠直至使用淀粉指示剂检测溶液不变蓝色为止。
进一步地,步骤(5)中,所述超滤膜过滤条件为:过滤前调节需要过滤的溶液pH为6~7,温度20~25℃,超滤膜为5000D的超滤膜。
本发明采用粗品肝素钠作为原料制备低分子量肝素钠,制备成本低;在制备低分子量肝素钠的工艺中,使用碱性蛋白酶酶解粗品肝素钠中含有的蛋白质,目的是进一步纯化肝素钠;在肝素钠粗品中,有部分肝素分子是和蛋白质分子通过一定的化学键连接在一起的,在碱性蛋白酶的作用下,能水解这种连接,从而使肝素游离出来,进一步提高产品的收率,并且,有助于除去这部分蛋白质,获得纯度更高的肝素钠;使用蒙脱土对碱性蛋白进行加速吸附沉淀,蒙脱土对蛋白质有吸附作用;选用絮凝剂中的聚合硅酸铝盐对酸性蛋白进行加速吸附沉淀,在低pH值条件下,聚合硅酸铝盐能快速吸附溶液中的酸性蛋白,采用蒙脱土及聚合硅酸铝盐吸附蛋白质后再通过高速离心,能很好且更迅速的除去溶液中的各种蛋白成分;综上所述,该粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法的优点是低分子量肝素钠制备成本低,所得低分子量肝素钠蛋白含量低、纯度高,而且收率高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1:一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法,具体包括以下步骤:
(1)取10g粗品肝素钠溶于100mL浓度为2%的NaCl溶液中,得粗品肝素钠溶液,加入1g碱性蛋白酶,于45℃下保温酶解4h;
(2)将步骤(1)所得酶解液升温至92℃灭活,降温至45℃,滴加NaOH溶液调节pH为12,加入蒙脱土,搅拌后高速离心,取上层清液;
(3)将所得澄清液降温至2℃,加入聚合硅酸铝盐,用HCl溶液调节 pH 值至2,高速离心,弃去不溶杂质;
(4)步骤(3)所得清液加NaOH溶液调节pH为6,加入0.5倍溶液体积的无水乙醇沉淀,调整温度至2℃,放置10h,收集沉淀物,并将沉淀物溶于8倍体积的蒸馏水中,完全溶解后,加入溶液体积1v%的过氧化氢氧化10h,用滤膜过滤,加入溶液体积2倍量的乙醇沉淀,沉淀放置10h,得到沉淀物;
(5)将步骤(4)所得沉淀物溶于蒸馏水中,搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠,直至降解反应结束,加入用氢氧化钠,再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原,还原结束后使用超滤膜过滤,所得滤液加入2倍的乙醇并充分搅拌,用乙醇脱水,浓缩并冷冻干燥后即得低分子量肝素钠。
本实施例步骤(2)中,所述蒙脱土的量为步骤(1)所得酶解液质量的0.10%,所述蒙脱土的目粒度为200~800目;步骤(5)中,所述沉淀物溶于蒸馏水中所得溶液的浓度为7%;步骤(5)中,所述亚硝酸钠降解肝素钠的反应条件为:HCl溶液调节 pH 值3.0,温度15℃,添加亚硝酸钠直至使用淀粉指示剂检测溶液不变蓝色为止;步骤(5)中,所述超滤膜过滤条件为:过滤前调节需要过滤的溶液pH为6,温度20℃,超滤膜为5000D的超滤膜。
实施例2:一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法,具体包括以下步骤:
(1)取10g粗品肝素钠溶于90mL浓度为2%的NaCl溶液中,得粗品肝素钠溶液,加入0.5g碱性蛋白酶,于50℃下保温酶解4.5h;
(2)将步骤(1)所得酶解液升温至93℃灭活,降温至48℃,滴加NaOH溶液调节pH为11,加入蒙脱土,搅拌后高速离心,取上层清液;
(3)将所得澄清液降温至0℃,加入聚合硅酸铝盐,用HCl溶液调节 pH 值至2,高速离心,弃去不溶杂质;
(4)步骤(3)所得清液加NaOH溶液调节pH为7,加入0.4倍溶液体积的无水乙醇沉淀,调整温度至3℃,放置6h,收集沉淀物,并将沉淀物溶于12倍体积的蒸馏水中,完全溶解后,加入溶液体积 1v%的过氧化氢氧化11h,用滤膜过滤,加入溶液体积2倍量的乙醇沉淀,沉淀放置7h,得到沉淀物;
(5)将步骤(4)所得沉淀物溶于蒸馏水中,搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠,直至降解反应结束,加入用氢氧化钠,再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原,还原结束后使用超滤膜过滤,所得滤液加入2倍的乙醇并充分搅拌,用乙醇脱水,浓缩并冷冻干燥后即得低分子量肝素钠。
本实施例步骤(2)中,所述蒙脱土的量为步骤(1)所得酶解液质量的0.12%,所述蒙脱土的目粒度为200~800目;步骤(5)中,所述沉淀物溶于蒸馏水中所得溶液的浓度为6%;步骤(5)中,所述亚硝酸钠降解肝素钠的反应条件为:HCl溶液调节 pH 值3.0,温度16℃,添加亚硝酸钠直至使用淀粉指示剂检测溶液不变蓝色为止;步骤(5)中,所述超滤膜过滤条件为:过滤前调节需要过滤的溶液pH为6,温度25℃,超滤膜为5000D的超滤膜。
Claims (6)
1.一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)取一定量粗品肝素钠溶于浓度为2%的NaCl溶液中,得粗品肝素钠溶液,加入碱性蛋白酶,于40~50℃下保温酶解4~5h;
(2)将步骤(1)所得酶解液升温至92~94℃灭活,降温至40~50℃,滴加NaOH溶液调节pH为11~12,加入蒙脱土,搅拌后高速离心,取上层清液;
(3)将所得澄清液降温至0~4℃之间,加入聚合硅酸铝盐,用HCl溶液调节 pH 值至2~3,高速离心,弃去不溶杂质;
(4)步骤(3)所得清液加NaOH溶液调节pH为6~7,加入0.3~0.5倍溶液体积的无水乙醇沉淀,调整温度至0~4℃,放置6~15h,收集沉淀物,并将沉淀物溶于6~12倍体积的蒸馏水中,完全溶解后,加入溶液体积 0.5~1v%的过氧化氢氧化8~12h,用滤膜过滤,加入溶液体积2倍量的乙醇沉淀,沉淀放置6~15h,得到沉淀物;
(5)将步骤(4)所得沉淀物溶于蒸馏水中,搅拌下缓慢加入亚硝酸钠降解肝素钠,直至降解反应结束,加入用氢氧化钠,再加入硼氢化钠对肝素钠进行还原,还原结束后使用超滤膜过滤,所得滤液加入2倍的乙醇并充分搅拌,用乙醇脱水,浓缩并冷冻干燥后即得低分子量肝素钠。
2.根据权利要求1所述的一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法,其特征在于:步骤(1)中,所述粗品肝素钠溶液的浓度为8~10%,所述碱性蛋白酶用量为粗品肝素钠溶液的0.5~1%。
3. 根据权利要求1所述的一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法,其特征在于:步骤(2)中,所述蒙脱土的量为步骤(1)所得酶解液质量的0.10~0.15%,所述蒙脱土的目粒度为200~800目。
4. 根据权利要求1所述的一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法,其特征在于:步骤(5)中,所述沉淀物溶于蒸馏水中所得溶液的浓度为6~8%。
5. 根据权利要求1所述的一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法,其特征在于:步骤(5)中,所述亚硝酸钠降解肝素钠的反应条件为:HCl溶液调节 pH 值2.5~3.0,温度15~18℃,添加亚硝酸钠直至使用淀粉指示剂检测溶液不变蓝色为止。
6.根据权利要求1所述的一种由粗品肝素钠生产低分子量肝素钠的方法,其特征在于:步骤(5)中,所述超滤膜过滤条件为:过滤前调节需要过滤的溶液pH为6~7,温度20~25℃,超滤膜为5000D的超滤膜。
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