CN106755207A - 一种壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法。所述的方法包括将原料壳聚糖粉末与水解酶液混合在球磨式搅拌器滚筒内，同时进行球磨与酶解生成窄分子量活性壳寡糖。具体为：将原料壳寡糖粉末与水按质量比1:10‑30加入到球磨式搅拌器滚筒内并加热至40‑60℃，在此温度下加入水解酶溶液并持续搅拌2‑5h得水解液，将水解液经后处理即得窄分子量活性壳寡糖粉末。本发明通过内湿法球磨粉碎壳寡糖，在球磨过程中加入水解酶，在极高浓度壳寡糖原料中同步进行球磨粉碎与水解，使制得的壳寡糖有效成分高，其聚合度高主要为5‑10，收率达30‑80％，分子量活性窄，且整个生产的有机废水量低。

Description

一种壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法
技术领域
本发明涉及一种壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法。
背景技术
壳寡糖(Chitooligosaccharides，COS)，是几丁质(Chitin)壳聚糖部分水解的产物，一般是指聚合度在3～12的N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc)聚合物。该产物有较好水溶性、独特的生物学活性和可观的经济效益，可广泛应用于医药食品、饲料添加和绿色农业等领域。
工业上用高浓度的盐酸水解壳聚糖，主要得到其单糖产品，而寡糖含量相对很低。随着盐酸浓度增大、温度升高，水解速率也越快；若采用温和条件酸水解，可得一系列不同聚合度壳聚糖，其他一些无机酸如乙酸、磷酸等弱酸，也能得到一些寡糖。酸水解由于反应剧烈不易控制，产物寡糖的分子量分布很宽。近年来，还发展了H2O2氧化水解法，速度相对快，产品分子量低且分布较窄，无残毒，成本低，易实现工业化。但水解后期会发生羰氧化反应，常常伴有产品褐变。几丁质的酶水解工艺，由于反应条件温和，无污染，水解过程易于控制，越来越成为国内外研究的热点，相关文献资料非常丰富。几丁质酶(Chitinase)，能专一性水解线性结构的乙酰氨基葡萄糖糖苷键；此外，还有纤维素酶、溶菌酶和某些脂肪酶，都能对其进行非专一性水解。
目前，壳寡糖的酶水解主要是采用搅拌式水解，产物聚合度在1-4，且酶解产物含水量非常高，造成后期纯化步骤多、成本昂贵，有机废水量高。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提出了一种酶解壳寡糖的方法，制得的酶解产物聚合度高、分子量活性窄、整个生产的有机废水量低。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法，所述的方法包括将原料壳聚糖粉末与水解酶溶液混合在球磨式搅拌器滚筒内，同时进行球磨与酶解生成窄分子量活性壳寡糖。
本发明采用内湿法球磨粉碎原料壳寡糖，且水解酶在球磨时加入，粉碎与球磨同步进行，可以进一步粉碎壳寡糖，使水解面积更大，进一步促进水解，提高壳寡糖的收率。而现有中一般的搅拌水解中并不能粉碎原料壳寡糖。
在上述壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法中，球磨式搅拌器滚筒的转轴与水平线夹角为0-90°。转动夹角的调整同转速结合，可以调整得到不同研磨效果。
在上述壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法中，球磨式搅拌器中含有直径为1-30cm的珠磨球。本发明中的研磨是靠球之间的碰撞，如果珠磨球的直径过小或者过大，都无法进行研磨。
在上述壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法中，所述的珠磨球由陶瓷、玻璃或铁合金制成。
本发明采用湿法球磨粉碎原料壳聚糖，且水解酶在球磨时加入酶解反应器，原料进行同步水解，避免底物粒径分布过散所导致的低活性寡糖含量的增加。通过控制水解时间和球磨转筒的转速，可以增加5-10聚合度的壳寡糖含量。而现有的工艺主要采取高浓度冰醋酸溶液溶解壳聚糖，且一般的搅拌水解中并不能有效同步粉碎原料壳寡糖，造成底物的不同步水解，从而使得壳寡糖产物的分子量分布范围过宽。
作为优选，所述的方法具体为：将原料壳寡糖粉末与水按质量比1:10-30加入到球磨式搅拌器滚筒内并加热至40-60℃，在此温度下加入水解酶溶液并持续搅拌2-5h得水解液，将水解液经后处理即得窄分子量活性壳寡糖粉末。
进一步优选，在加入壳寡糖粉末与水前，球磨式搅拌器滚筒中的珠磨球先用水润湿。
进一步优选，加入水解酶溶液持续搅拌时，球磨式搅拌器滚筒的转轴转速为10转/min-150转/min。
球磨式搅拌器滚筒中原料壳寡糖粉末与所有水的质量比为1:10-40。现有技术中的搅拌式水解中壳寡糖原料与水的质量比基本在1:50-100，一般酶解反应器中水的比例约为98-99％，而本发明中采用湿法球磨粉碎原料壳聚糖，边酶解边球磨，且在加料前珠磨球先用水润湿，大大降低了用水量。
作为优选，所述的水解酶溶液通过如下方法配制：将水解酶用缓冲溶液调pH值至4.0-5.5，然后加入硫酸镁粉末，搅拌至完全溶解，得水解酶溶液。
进一步优选，所述的水解酶为纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶中的一种或多种。
再进一步优选，所述的纤维素酶可以为市购的纤维素酶粉末，也可以为绿色木霉产的液体经发酵得到的纤维素酶液。所述的蛋白酶可以为木瓜蛋白酶。
进一步优选，所述的缓冲溶液为乙酸-乙酸钠溶液、柠檬酸-柠檬酸钠溶液、乳酸溶液、柠檬酸溶液、磷酸二氢钾溶液、磷酸二氢钠溶液中的一种或多种。也还可以由磷酸、盐酸和硫酸溶液添加到壳聚糖水解液中，利用溶液本身的缓冲力调至到所需pH。
进一步优选，硫酸镁粉末的加入量为(占调pH值后的水解酶总体积)0.5-2.5g/L。所述的硫酸镁可以为MgSO4·7H2O也可以为MgSO4·H2O或MgSO4粉末。加入适量的硫酸镁能提高酶活性。
所述的壳寡糖原料可以来源于蟹壳、虾壳以及其他昆虫类。
作为优选，水解液后处理包括离心去除沉淀、超滤、纳滤、活性炭过滤、喷雾干燥。
与现有技术相比，本发明通过内湿法珠磨粉碎壳寡糖，在珠磨过程中加入水解酶，在极高浓度壳寡糖原料中同步进行珠磨粉碎与水解，使制得的壳寡糖有效成分高，其聚合度主要为5-10，收率达30-80％。且本发明制得的壳寡糖呈粥状，能大大节约后期纯化和喷雾的成本，减少废水排放。
附图说明
图1为本发明实施例3中聚糖粘度下降图。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例结合附图说明，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
所用商品壳聚糖来源于蟹壳，重要指标为灰分测定为2.6％、水分8％、脱乙酰度为94％，粉状。
将商品纤维素酶粉末于室温下溶解于pH为5.0的20mM浓度的乙酸酸-乙酸钠溶液中，配置成纤维素酶活为40FPA IU/mL的酶溶液。并向酶溶液中加入2g/L的七水硫酸镁粉末，搅拌至完全溶解，得水解酶溶液。
球磨式搅拌器总容积为200L，内置直径为1-2cm的玻璃珠15公斤，并用1公斤去离子水提前润湿。准备商品壳聚糖粉末4公斤，与去离子水按1:20的比例加入到于水平轴转动的球磨式搅拌器内。开动机器按转速20转/min混匀30min，并将搅拌器内混合液温度加热至50℃。在此温度下倒入上述水解酶溶液30L，在50℃条件下保温，搅拌器水平轴转速调至30转/min，水解过程开始，并持续3小时至溶液变稀得水解液，将水解液经经连续离心去除沉淀、再经5-15kDa超滤、200-500kDa纳滤，分别除去大分子壳聚糖、蛋白、无机盐和缓冲液组分，然后活性炭过滤除色素，所得透明澄清溶液即可喷雾干燥得壳寡糖粉末。在该实施例中壳聚糖粘度下降率可达到95％以上。
实施例2
所用商品壳聚糖来源于蟹壳，重要指标为灰分测定为4％、水分10％、脱乙酰度为65％，条状物。先用粉碎机粉碎壳聚糖粗品至100目左右的粉状。
将商品纤维素酶粉末于室温下溶解于pH为5.4的20mM浓度的柠檬酸酸-柠檬酸钠溶液中，配置成纤维素酶活为20FPA IU/mL的酶溶液。并向酶溶液中加入2g/L的七水硫酸锰粉末，搅拌至完全溶解，得水解酶溶液。
球磨式搅拌器总容积为100L，内置直径为2-3cm的陶瓷珠10公斤，并用1公斤去离子水提前润湿。准备商品壳聚糖粉末2.0公斤，与去离子水按1:15的比例加入到于水平轴转动的球磨式搅拌器内。将搅拌器内混合液温度加热至50℃。倒入上述水解酶溶液20L，在50℃条件下保温，搅拌器水平轴转速调至50转/min，水解过程开始，并持续2.5小时至溶液变稀得水解液，将水解液经经连续离心去除沉淀、再经5-15kDa超滤、200-500kDa纳滤，分别除去大分子壳聚糖、蛋白、无机盐和缓冲液组分，然后活性炭过滤除色素，所得透明澄清溶液即可喷雾干燥得壳寡糖粉末。在该实施例中壳聚糖粘度下降率可达到97％以上。
实施例3
所用商品壳聚糖来源于蟹壳，重要指标为灰分测定为2.6％、水分8％、脱乙酰度为94％，粉状。
所用纤维素酶为绿色木霉产的液体发酵产复合酶液。其主要参数为总纤维素酶活为16FPA IU/mL，内切葡聚糖酶活为75IU/mL，β-葡萄糖苷酶活为23IU/mL，木聚糖酶活为205IU/mL。将发酵产复合酶液调至pH5.0，并加入2g/L的七水硫酸锰粉末至完全溶解，得水解酶溶液。
准备商品壳聚糖粉末3公斤，与去离子水按1:25的比例加入到于水平轴转动的球磨式搅拌器内。球磨式搅拌器总容积为100L，内置直径为2～3cm的铁珠10公斤，并用1公斤去离子水提前润湿。将搅拌器内混合液温度加热至50℃。倒入上述水解酶溶液40L，在50℃条件下保温，搅拌器水平轴转速调至30转/min，水解过程开始，并持续5小时至溶液变稀得水解液，将水解液经经连续离心去除沉淀、再经5-15kDa超滤、200-500kDa纳滤，分别除去大分子壳聚糖、蛋白、无机盐和缓冲液组分，然后活性炭过滤除色素，所得透明澄清溶液即可喷雾干燥得壳寡糖粉末。在该实施例中壳聚糖粘度下降率图如图1所示，从图中可知，壳聚糖粘度下降率达到97％以上。
实施例4
所用商品壳聚糖来源于蟹壳，重要指标为灰分测定为2.6％、水分8％、脱乙酰度为94％，粉状。
所用纤维素酶为用绿色木霉产的液体发酵产复合酶液。其主要参数为总纤维素酶活为44FPA IU/mL，内切葡聚糖酶活为147IU/mL，木聚糖酶活为375IU/mL，无β-葡萄糖苷酶活。将发酵产复合酶液用20mM浓度的乙酸酸-乙酸钠溶液调pH至5.2，得水解酶溶液。
准备商品壳聚糖粉末5公斤，与去离子水按1:12的比例加入到球磨式搅拌器内，滚筒的转轴与水平线夹角为90°。球磨式搅拌器总容积为200L，内置直径为3-4cm的玻璃珠10公斤，将搅拌器内混合液温度加热至50℃。倒入上述水解酶溶液20L，在50℃条件下保温，搅拌器水平轴转速调至40转/min，水解过程开始，并持续2.5小时至溶液变稀得水解液，将水解液经经连续离心去除沉淀、再经5-15kDa超滤、200-500kDa纳滤，分别除去大分子壳聚糖、蛋白、无机盐和缓冲液组分，然后活性炭过滤除色素，所得透明澄清溶液即可喷雾干燥得壳寡糖粉末。在该实施例中壳聚糖粘度下降率可达到97％以上。
实施例5
所用商品壳聚糖来源于蟹壳，重要指标为灰分测定为2.6％、水分8％、脱乙酰度为94％，粉状。
将商品纤维素酶粉末(标注活力单位为40000U/g)和木瓜蛋白酶粉末(标注活力单位为80000U/g)以2:1的比例混合，于室温下溶解于pH为5.5的20mM浓度的乙酸酸-乙酸钠溶液中，配置成含有纤维素酶10g/L和木瓜蛋白酶5g/L的溶液，并加入2g/L的一水硫酸锰粉末，搅拌至完全溶解，得水解酶溶液。
球磨式搅拌器总容积为200L，内置直径为3～4cm的玻璃珠10公斤，并用1公斤去离子水提前润湿。准备商品壳聚糖粉末5公斤，与去离子水按1:15的比例加入到球磨式搅拌器内，滚筒的转轴与水平线夹角为60°。开动机器按转速20转/min混匀30min，并将搅拌器内混合液温度加热至50℃。倒入上述水解酶溶液20L，在50℃条件下保温，搅拌器滚筒的转速调至30转/min，水解过程开始，并持续4.5小时至溶液变稀得水解液，将水解液经经连续离心去除沉淀、再经5-15kDa超滤、200-500kDa纳滤，分别除去大分子壳聚糖、蛋白、无机盐和缓冲液组分，然后活性炭过滤除色素，所得透明澄清溶液即可喷雾干燥得壳寡糖粉末。在该实施例中壳聚糖粘度下降率可达到95％以上。
实施例6
所用商品壳聚糖来源于蟹壳，重要指标为灰分测定为4％、水分5％、脱乙酰度为90％，粉状。
将商品脂肪酶粉末(标注酶活力≥10000U/g)0.2公斤于室温下溶解于20L的pH为4.0的20mM浓度的乙酸酸-乙酸钠溶液中，搅拌至完全溶解，得酶溶液。
珠磨式搅拌器总容积为200L，内置直径为3～4cm的玻璃珠10公斤，并用1公斤去离子水提前润湿。准备商品壳聚糖粉末4公斤，与去离子水按1:30的比例加入到珠磨式搅拌器内，滚筒的转轴与水平线夹角为45°。开动机器按转速50转/min混匀30min，并将搅拌器内混合液温度加热至45℃。倒入上述酶溶液20L，在45℃条件下保温，搅拌器滚筒的转速调至60转/min，水解过程开始，并持续2.5小时至溶液变稀得水解液，将水解液经经连续离心去除沉淀、再经5-15kDa超滤、200-500kDa纳滤，分别除去大分子壳聚糖、蛋白、无机盐和缓冲液组分，然后活性炭过滤除色素，所得透明澄清溶液即可喷雾干燥得壳寡糖粉末。在该实施例中壳聚糖粘度下降率可达到97％以上。
在上述实施例及其替换方案中，水解酶用缓冲溶液调pH值可以调至4.0、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5以及4.0-5.5中的任意值。
在上述实施例及其替换方案中，壳寡糖原料与水的质量比可以为1:10、1:12、1:14、1:15、1:16、1:18、1:20以及1：10-20中的任意比。
在上述实施例及其替换方案中，球磨式搅拌器中加热的温度可以为40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、52℃、55℃、58℃、60℃以及40-60℃中的任意值，搅拌时间可以为2h、2.2h、2.5h、2.8h、3.0h、3.2h、3.5h、3.8h、5.0h以及2-5h中的任意值。在上述实施例及其替换方案中，硫酸镁粉末的加入量可以为1.2g/L、1.4g/L、1.5g/L、1.8g/L、2.0g/L、2.2g/L、2.4g/L、2.5g/L以及1.2-2.5g/L中的任意值。
在上述实施例及其替换方案中，球磨式搅拌器中滚筒的转轴与水平线夹角可以为0°、10°、20°、30°、40°、50°、60°、70°、80°、90°以及0-90°中的任意值。
在上述实施例及其替换方案中，球磨式搅拌器中球磨球的直径为1cm、5cm、10cm、15cm、20cm、25cm、30cm以及1-30cm中的任意值。
在上述实施例及其替换方案中，球磨与水解过程中，球磨式搅拌器中壳寡糖原料与所有水的质量比可以为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30以及1:10-30中的任意比。
另外，本发明要求保护的技术范围中点值未穷尽之处以及在实施例技术方案中对单个或者多个技术特征的同等替换所形成的新的技术方案，同样都在本发明要求保护的范围内；同时本发明方案所有列举或者未列举的实施例中，在同一实施例中的各个参数仅仅表示其技术方案的一个实例(即一种可行性方案)。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域熟练技术人员来说，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (10)

1.一种壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法，其特征在于，所述的方法包括将原料壳聚糖粉末与水解酶溶液混合在球磨式搅拌器滚筒内，同时进行球磨与酶解生成窄分子量活性壳寡糖。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法，其特征在于，球磨式搅拌器滚筒的转轴与水平线夹角为0-90°。
3.根据权利要求1或2所述的壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法，其特征在于，球磨式搅拌器中含有直径为1-30cm的珠磨球。
4.根据权利要求3所述的壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法，其特征在于，所述的珠磨球由陶瓷、玻璃或铁合金制成。
5.根据权利要求1所述的壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法，其特征在于，所述的方法具体为：将原料壳寡糖粉末与水按质量比1:10-30加入到球磨式搅拌器滚筒内并加热至40-60℃，在此温度下加入水解酶溶液并持续搅拌2-5h得水解液，将水解液经后处理即得窄分子量活性壳寡糖粉末。
6.根据权利要求5所述的壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法，其特征在于，加入水解酶溶液持续搅拌时，球磨式搅拌器滚筒的转轴转速为10转/min-150转/min。
7.根据权利要求5所述的壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法，其特征在于，球磨式搅拌器滚筒中原料壳寡糖粉末与所有水的质量比为1:10-40。
8.根据权利要求1或5所述的壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法，其特征在于，所述的水解酶溶液通过如下方法配制：将水解酶用缓冲溶液调pH值至4.0-5.5，然后加入硫酸镁粉末，搅拌至完全溶解，得水解酶溶液。
9.根据权利要求8所述的壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法，其特征在于，所述的水解酶为纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、几丁质酶中的一种或多种。
10.根据权利要求5所述的壳聚糖高固含量酶解生成窄分子量活性壳寡糖的方法，其特征在于，水解液后处理包括离心去除沉淀、超滤、纳滤、活性炭过滤、喷雾干燥。
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