JPS62208278A - アミラ−ゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （技術分野） 本発明は、新規なアミラーゼＨ及びその製造法に関し、
更に詳しくは、バチルス（［３ａｃｉｌｌｕｓ）　ｖ％
に属するマルトヘキサオース生成アミラーゼトＩ生産菌
を培養し、その培養物より当該アミラーゼＨを分離、採
取する方法に関する。

（発明の背景及び従来技術） 従来、アミラーゼとしては、でん粉からブドウ糖、麦芽
糖あるいは両糖を多く含むデンプン粘を製造するだめの
酵素として、グルコアミラーゼ、β−アミラーゼ、糖化
型α−アミラーゼ、及びこれら酵素を作用させるための
でん粉の前処理酵素として液化型α−アミラーゼなどが
開発され利用されてきた。しかし、最近、マルトトリオ
ース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マル
トヘキサオースなどのα−１，４−グルコシド結合でグ
ルコビラノースが直鎖状に結合したオリゴ糖の有用性が
注目されている。即ち、マルトオリゴ糖は甘味度、甘味
資質、粘度、吸湿性、賦形性などにすぐれた特性をもつ
ことから食品工業において、又、それ以外に医薬品や工
業原料としての用途にも注目されている。そのため、こ
れらオリゴ糖を特異的に生成するアミラーゼを開発、製
造することが期待されている。

従来、マルトヘキサオース生成アミラーゼについては、
アエロバクタ−・アエロバクタ（八ｅｒａｂａｃｔｅｒ
　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）　　の生産する酵素（特開昭４
８−３９６８８号、バイオケミ力・エト・バイオフィシ
カーアクタ（口ｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ＾ｃｔａ）　　、ｖｏｌ、　４１０　、３３
３　（１９７５）参照）、バチルス・サーキュランス（
口ａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）Ｇ−６の生産
する酵素（特開昭５７−１４６５９０号、特開昭５７−
１４６５９１号、アグリカルチュラル・バイオロジカル
・ケミストリー （＾ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　　［ｌｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　　［：ｈｅｍｉｓｔｒｙ）　　、　　ｖｏｌ。

４６．１５３９　（１９８２）参照）及びバチルス０サ
ーキニランス（口ａｃｉｌｌｕｓ　ｃｉｒｃｕｌａｎｓ
　）　Ｆ　−２の生産する酵素（アグリカルチュラル・
バイオロジカル・ケミストリーｖｏ１．　４７　、　５
１１　　（１９８３）参照）が知られているが、本酵素
の如く高アルカリ側（ｐＨ１０−１１）に、その最適作
用ｐＨを有し、且つ熱安定性の高いマルトヘキサオース
生成アミラーゼについては、知られていなかった。本発
明者らは、マルトオリゴ糖生成能の強いアミラーゼを生
産する方法について鋭意研究の結果、土壌より新たに単
離したバチルス属に属する新規微生物が、でん粉又はそ
の部分分解物をマルトヘキサオースを主成分とする糖化
物に分解し、且つ高アルカリ側にその最適作用ｐｌ＋を
有し、熱安定性の高いアミラーゼを菌体外に著量に生産
することを見出した。

（発明の目的） 本発明の目的はバチルス（［１ａｃｉｌｌｕｓ　）　Ｗ
？ｆｒに属し、ρ１１７−１２の培地で生育しうる好ア
ルカリ性細菌を培養し、培養物より安定ｐＨ範囲がρ１
１５−１２と極めて広い耐アルカリ性の新規なマルトヘ
キサオース生成アミラーゼおよびその製造法を提供する
ことにある。

（発明の構成） まず、本発明において用いる微生物は、埼玉県で採取さ
れた土壌より単離された微生物であり、第１表に示す組
成の培地において良好に生育し、且つ、後述の本発明の
マルトヘキサオース生成アミラーゼの生産能を有するバ
チルス属に属する微生物である。

第１表　アルカリ性培地組成 組成　　１已 可溶性でん粉　　　　２０ ポリペプトン　　　　５ 酵母エキス　　　　　５ に、ＩＩＰＯ，ｌ Ｍｇ５Ｏ・７１１．０　　　　　　０．２ｐＨ１０（Ｎ
ａａＣＯｉにて調節） （必要に応じ、上記組成培地に寒天２０ｇ／ｌを加えて
もよい） 本菌株は、それぞれ次の菌学的性質を有する。

なお、以下記載の菌学的性質の試験は、「パージエイズ
・マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・ハクテリオ
ロジー第８版〔“Ｂｅｒｇｅｙｓ　Ｍｏｎｕａｌｏｆ　
Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ”　ｇｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７４））Ｊ及び「
ザ・ジーガス・バチルス［”Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　’　（１９７３）　）　Ｊに記載の方法
に基づいて行なったものであり、特に記載°しない限り
、すべて炭酸ナトリウムを１％添加してｐｌｌを約１０
に調整した培地を使用した。

〔ａ〕形態；単桿菌、大きさく０．４〜（１，７）　Ｘ
（２，０〜３．０）μｍ、ダラム陰性、運動性を有する
。

球形〜楕円形の胞子を形成する。

〔ｂｌ培地における生育状態 イ）　肉汁寒天平板培養；集落の形状は円形、集落の表
面は凸円状に隆起し、周縁は耳状、粘稠性を有し、色調
は白色。

口）　肉汁寒天斜面培養；生育は良好で圧伏に生育。表
面は平滑で不透明白色。

ハ）　肉汁液体培地；菌生育にともないい（ぶん混濁を
呈し、粘稠性のある軟らかい沈滞を生ずる。

二）　肉汁ゼラチン培養；ゼラチンを液化する。

ホ）　　リドマスミルク：ミルクを凝固しない。

（Ｃ）生理学的性質 イ）　硝酸塩の還元：陽性 口）　脱窒反応；陰性 ハ）　■Ｐテスト：陰性 二）　インドールの生成：陰性 ホ）　硫化水素の生成：陰性 へ）　でん粉の加水分解：陽性 ト）　カゼインの加水分解：陽、性 チ）　無機窒票の利用：陰性 り）　色素の産生：陽性 ヌ）　ウレアーゼ：陰性 ル）　オキシターゼ：陽性 オ）　カタラーゼ：陽性 ワ）　酸素に対する態度：好気性 力）　くえん酸の利用：陰性 ヨ）　０−Ｆテスト：好気的および嫌気的に酸を生成。

り）　耐塩性：１２％食塩濃度で生育。

し）　生育範囲（ｐｌｌ及び温度）　：１８７−１２；
最適ｐＨ９−１（１゜温度２０−５２℃；最適温度３５
−４５℃。

ン）　炭素源の利用：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノー
ス、Ｄ−キシロース、マルトース、シュクロース及びソ
ルビトールより好気的及び嫌気的に酸を生成する。しか
し、ガスの発生はない。

ツ）　核酸（ＤＮＡ）塩基組成：ＤＮＡのＧＣ含有量［
ｍｏ　１　％］は４６．３％。

以上の菌学的性質をもとに、前記文献中に本菌株を検索
したところ、好気性を胞子桿菌のバチルス属に属する微
生物であることが明らかになったが、上記のとおり種々
の特徴的な菌学的性質、特に生育ｐｉｔ範囲がｐＨ７，
１２％最適ｐＨ範囲がｐＨ９−１０とアルカリ側に存在
することから判断して明らかに公知の菌種と区別される
ため、これを新菌種として設定することが妥当であると
の結論に達し、本菌株をバチルス・エスピー・Ｈ−１６
７（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　Ｈ−１６７）　　（以
下“Ｈ−１６７株”という）と命名した。Ｈ−１６’７
株は、昭和６１年３月５日付にて工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託され、その受託番号は、微工研閑寄第
８６８３号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−８６８３）である。

次に、本酵素生産のための微生物の培養方法について述
べる。

本発明による酵素生産のための微生物の培養は、固体又
は液体培地のいずれでもよい。栄養源としては、従来バ
チルス属の培養に利用される公知のものが使用できる。

例えば、炭素源としては、でン粉、デキストリン、グル
コース、マルトース、シュクロースなどの糖質原料を、
窒素源としては、酵母エキス、ポリペプトン、カヂミノ
酸、脱脂大豆粉末などの有機物を利用することが望まし
い。

その他、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩など
の無機塩類を添加するとよい。そして、本菌株の生育及
び目的物の新規酵素、マルトヘキサオース生成アミラー
ゼＨの生産のためには上記の栄養源を含む培地に炭酸ナ
トリウム、炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を加えρ１
１を９−１０にすることが必要であり、特に炭酸水素ナ
トリウムを２〜３％添加し培地ｐ）１９．５　付近にす
るのが最適である。

培養は好気的条件下で行なわれ、培養に適当な温度は３
５〜４５℃であるが、多くの場合３７℃付近で培養する
。かくして、本菌株からのマルトヘキサオース生成アミ
ラーゼの生産は振の培養で２〜３日で最高に達する。

本酵素は菌体外に生産される酵素であるので、培養終了
後、濾過又は遠心分離して除菌し、上澄液を回収するこ
とにより粗酵素液を得ることができる。この粗酵素液は
、そのまま使用してもよいが、硫安塩析法、溶剤沈殿法
、透析法、イオン交換樹脂による選択的吸着と溶出法な
ど公知の方法を適宜組合わせて適用することによって粗
酵素を得てもよい。

次に、本発明のマルトヘキサオース生成アミラーゼＨの
分離精製方法および酵素の理化学的性質について説明す
る。

本菌株から得られた粗酵素の精製方法は、イオン交換樹
脂を用いたカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過法を用
いたカラムクロマトグラフィーを適宜組合わせて行なう
ことができる。

例えば、ＤＥＡＥ−）ヨパール（商標）６５０Ｍカラム
クロマトグラフィー、トヨパールＨＷ−５５カラムクロ
マトグラフィー、及びセファデックス（商Ｊｆｉ）Ｇ−
１００カラムクロマトグラフイー、あるいはウルトロゲ
ル（商標）ＡｃＡ３４カラムクロマトグラフイーにより
目的の酵素を精製することができる。かくして得られる
精製酵素は下記の如き理化学的性質を有する。

なふ、本酵素を「アミラーゼトＩ」と称する。

〔アミラーゼＨの理化学的性質〕

（１）作用及び基質特異性 でん粉、アミロース、アミロペクチン、デキス）　ＩＪ
ン又はその部分分解物に特異的に作用し、マルトヘキサ
オースを主成分とする糖分解物を生成する。

（２）作用ρ１１及び最適ｐＨ範囲 作用ｐＨはｐＨ５−１２にあり、最適作用ｐＨはｐＨ１
０−１１にある。

（３）安定ｐＨ範囲 安定ｐＨはｐＨ５−１２にある。（５０ｍＭ、緩衝液下
、５０℃、３０分処理の場合） （４）力価の測定法 ・　基質として５ＱｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ１９，０
）に溶解させた１％可溶性でん粉溶液３００μβに本酵
素を含む試料５０μｌを加え４０℃で１０分間反応させ
、生成した還元糖を３．５−ジニトロサリチル酸試薬法
により定量し、１分間に１μｍｏｌ　のグルコースに相
当する還元力を生成する酵素量を１単位とする。

（５）作用温度及び最適作用温度範囲 ｐｌ＋９．０において約８０℃まで作用し、最適作用温
度は５５−６０℃にある。

（６）熱安定性 ５ＱｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９，０）あるいは５０ｍ
Ｍ　）リス緩衝液（ρ１１９．０）下、各温度下３０分
間加熱後、残存活性を測定した。その結果、５５℃まで
安定で、６０℃、３０分間の加熱で約３０％失活する。

（７）阻　害 水銀イオン、亜鉛イオンにより阻害される。

（８）安定化 カルシウムイオンにより熱安定性の増加は認められない
。

（９）精製法及び分子】 粗酵素粉末をｐＨ７，０の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液に
溶解し、ＤＥＡＥ−）コパール６５０Ｍカラムにかけ、
塩化ナトリウム水溶液で溶出し、得られた２つの両分を
さらに、トヨバールＨＷ−５５カラムによるゲル濾過で
精製後、セファデックスＧ−１００カラムまたはウルト
ロゲルΔｃＡ３４カラムによるゲルｔａで精製する。

上記精製法により、本酵素は３成分に分離される。各成
分の分子量は、それぞれ、約６万、７万３千、８万であ
り、又、等電点はそれぞれｐ１３．５．４．１，４Ｊで
あるが、他の理化学的性質において差異は認められなか
った。

本発明に係る酵素はでん粉性基質からマルトヘキサオー
スを主成分とする糖化物を生成し、反応初期よりマルト
ヘキサオース以外にマルトース、マルトテトラオース、
マルトペンフォースを生成する点において、バチルス属
アミラーゼＧ６（特開昭５７−１４６５．９０号、特開
昭５７−１４６５９１号及びアグリカルチユラル・バイ
オロジカル・ケミ　ス　ト　リ　−（＾ｇｒｉｃ、　　
Ｂｉｏｌ　、　Ｃｈｅｍ、）　　　、　第　４６　巻、
１５３９頁（１９８２年））と類似しているが、本発明
の酵素はバチルス属アミラーゼＧ６と比べよりアルカリ
性側で安定であり、作用ｐＨ範囲もｐＨ５−１２、最適
作用ｐＨ１Ｏ−１１とよりアルカリ性側である点が特徴
的に異なる。また熱安定性はバチルス属アミラーゼＧ６
が５５℃１０分間の加熱で約５０％失活するに対し、本
酵素は安定であり、６０℃３０分間の加熱でも約７０％
の活性が残存している点においても著しい相異が見られ
、従来の酵素とは相違する。

以上の理化学的性質を比較した結果を第２表に示す。

以下に本発明方法を実施例によって説明する。

実施例１ 可溶性でん粉１％、ポリペプトン０．５％、酵母エキス
０．５％、に２１１Ｐ口、０．１％、ＭｇＳＯ４・７１
１□００．０２％を含む培地に別殺菌で準備した炭酸す
）ＩＪ☆ム水溶液及び炭酸水素す）　ＩＪウム水溶液を
最終濃度０−３．０　％になるように無菌的に添加し、
ｐＨを各々調整した。

上記培地５０−を予め殺菌してふいた３００−容三角フ
ラスコに入れ、Ｈ−１６７株（微工研菌寄第８６８３号
）の前培養液０．５−を接種し、３７℃で３日間回転振
盪培養した。培養後、培養液を遠心分離して除菌し上澄
液を回収しこれを粗酵素液とした。活性を比較した結果
を第３表に示す。

第　　３　　表 実施例２ ばれいしょでん粉１％、ポリペプトン２％、酵母エキス
０．１　　％、Ｋ２＋１１１０．０．１％、ＭｇＳシ’
　７１１２００．０２％、Ｃａ（Ｊ、　・２１１２（］
　０．０２　　％及び１２．５％Ｎａ１ｌＣ口。

２．５％を含む培地６１にアミラーゼＨ生産菌（微工研
菌寄ｆｆｊ　８６８３号）を接種し、３７℃で好気的に
５０時間培養後、培養液を遠心分離し菌体を除去し、得
られた上澄的６βに冷アセトン約１８１を加えてたんば
くを沈殿させ、これを脱水乾燥して粗酵素粉末を得た。

これをｐＨ７，０の２０ｍＭ）リス塩酸緩衝液に溶解し
、ＤＥＡＥ−）コバール６５０Ｍカラム（１，６φＸ４
０Ｃｍ）により精製を行なったところ２つの活性画分を
得た。すなわち、塩化ナトリウム濃度２８０〜３００ｍ
Ｍで溶出した両分（Ｈ−１）と３００〜３２０ｍＭで溶
出した両分（Ｈ−２）を得、これら２つの両分をそれぞ
れ集め、濃縮した。更に、Ｈ−１、Ｈ−２画分をそれぞ
れ２．６　　φＸ７Ｑｅｍのトヨパール　ＨＷ−５５カ
ラム（ｐＨ７，０）によるゲル濾過で精製後、Ｈ−１画
分については、■、６　　φＸ７Ｑｃｍのセファデック
スＧ−１００カラム（ｐｌ＋７．０）によりゲル濾過、
Ｈ−２画分については１．６　　φＸ７０ＣＩ１１のウ
ルトロゲルＡｃＡ３４カラム（ｐｌ＋７．０）によるゲ
ル濾過を行なったところ、Ｈ−１画分から更に２つの活
性画分（Ｈ−１−１，Ｈ−１−２）、Ｈ−２画分からは
単一活性画分が得られた。各活性画分をそれぞれ集め濃
縮することにより精製標品を得た。精製標品は、ディス
ク電気泳動で各々単一なバンドを示し、分子量、等電点
は、Ｈ−１−１が約７万３千、ｐ１４．１、Ｈ−１−２
が約６万、ｐ１３．５　、Ｈ−２が約８万、ｐ１４Ｊで
あった。

試験例 可溶性でん粉１．０ｇを含む５０ｍＭグリシン緩衝液（
ｐＨＩＯ，４）　　１０ｒＩｉに本酵素液４単位を加え
、５０℃にて１時間反応させ、高速液体クロマトグラフ
ィー（カラム：　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ　５ＮＩ１２、溶
出液アセトニトリル６０％：水４０％）を用いて分析し
たところ、第１図に示すようにマルトヘキサオースを主
とする糖分解物を得た。上記反応条件で、反応後４時間
目のマルトヘキサオースの収】は０．２５ｇであった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本酵素をでん粉に作用させた場合の糖分解物
の高速液体クロマトグラフィーによるクロマトグラムを
示す図であり、第２図は、本酵素の最適ｐＨ及び安定ｐ
Ｈを示す図であり、第３図は、本酵素の作用適温及び熱
安定性を示す図である。 第１図 イ丞↑毎時間　（分） 第２図 Ｈ

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有するアミラーゼＨ＿ｏ １、作用及び基質特異性でん粉、アミロース、アミロペ
   クチン、デキストリン又はその部分分解物に特異的に作
   用し、マルトヘキサオースを主成分とする糖分解物を生
   成する。 ２、作用ｐＨ及び最適ｐＨ範囲作用ｐＨは、ｐＨ５−１
   ２にあり、最適作用ｐＨは、ｐＨ１０−１１にある。 ３、安定ｐＨ範囲安定ｐＨは、ｐＨ５−１２にある。
2. （２）バチルス属に属するアミラーゼＨ生産菌を培養し
   、その培養物よりアミラーゼＨを分離採取することを特
   徴とするアミラーゼＨの製造法。
3. （３）バチルス属に属するアミラーゼＨ生産菌が、バチ
   ルス・エスピー・Ｈ−１６７（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、
   Ｈ−１６７）である特許請求の範囲第（２）項記載の製
   造法。