JP2022024348A - イソマルトオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 効率的なイソマルトオリゴ糖の製造方法を提供することを課題とする。【解決手段】 澱粉又は澱粉部分分解物に作用し、そのα－１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース残基の６位水酸基にグルコース重合度２以上のα－１，６グルカンがα－１，６結合した分岐構造を有する分岐α－グルカンを生成する活性を有するα－グルコシル転移酵素と、イソプルラナーゼとを組合せ、澱粉又は澱粉部分分解物に作用させることによりイソマルトオリゴ糖を生成させる工程と、生成したイソマルトオリゴ糖を採取する工程を含んでなるイソマルトオリゴ糖の製造方法を提供することにより上記課題を解決する。【選択図】 図１

Description

本発明は、イソマルトオリゴ糖の製造方法、詳細には、糖転移酵素とイソプルラナーゼとを組合せた澱粉又は澱粉部分分解物からのイソマルトオリゴ糖の製造方法に関するものである。

イソマルトオリゴ糖とは、２分子以上のＤ－グルコースがα－１，６グルコシド結合（以下、「α－１，６結合」と略す場合がある。）を介して鎖状に連結したオリゴ糖の総称であり、グルコース重合度２乃至８のイソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオース、イソマルトヘキサオース、イソマルトヘプタオース、イソマルトオクタオースなどを含み、また、パノース（６^２－α－Ｄ－グルコシル－マルトース）やイソパノース（６－α－マルトシル－Ｄ－グルコース）などの分岐糖を含む場合がある。通常、これら複数のイソマルトオリゴ糖の混合物の形態にある糖質を「イソマルトオリゴ糖」と呼称している。イソマルトオリゴ糖は、耐酸性、耐熱性、まろやかな甘味を有し、保湿性、澱粉の老化防止作用を有することから各種食品に用いられている。また、イソマルトオリゴ糖は、ビフィズス菌を選択的に増加させ、腸内環境を良好に保つなどの生理機能を発揮することから、厚生労働省が定める特定保健用食品の成分として認められている。

イソマルトオリゴ糖の製造方法としては、澱粉をβ－アミラーゼで加水分解して得られるマルトース（麦芽糖）に麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）由来のα－グルコシダーゼ（別名「トランスグルコシダーゼ」）を作用させ、その糖転移反応によりイソマルトース、イソマルトトリオース、パノース、イソマルトテトラオースなどのイソマルトオリゴ糖を生成させる方法が知られている（特許文献１）。しかしながら、この方法で得られるイソマルトオリゴ糖含有糖質（特許文献１では「分岐オリゴ糖」と記載）の糖組成中、約５０質量％はマルトースの加水分解物としてのＤ－グルコースであり、含まれるイソマルトオリゴ糖を合計した含量は最大でも４６質量％程度に過ぎない。そして、このイソマルトオリゴ糖含有糖質をクロマト分画することにより混在するＤ－グルコースや未反応のマルトースなどを除去すれば、イソマルトオリゴ糖含量を９０質量％以上に高めることができるものの、収率は低いものとならざるを得ない。

一方、イソマルトオリゴ糖の別の製造方法としては、Ｄ－グルコースが主としてα－１，６結合を介して連結した高分子多糖であるデキストランを原料基質とし、これを適宜の酸又は酵素（デキストラナーゼ）で加水分解した後、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどで分画、回収する方法がある。しかしながら、原料とするデキストランは、通常、ショ糖（スクロース）を原料として乳酸菌に属するロイコノストック・メセンテロイデス(Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）を培養し、当該微生物由来のデキストランスクラーゼ（ＥＣ ２．４．１．５）により培地中に生成するデキストランを採取する方法で製造されており、スクロースからの収率が低く、また、粘性が高いため精製操作が煩雑で、コスト高になるという不都合があることから、デキストランを原料とする上記方法は、イソマルトオリゴ糖を工業的に製造する方法として採用されていない。

また、イソマルトオリゴ糖の別の製造方法としては、澱粉又は澱粉部分分解物（デキストリン）に、デキストリンからデキストランを生成するデキストリンデキストラナーゼ（ＥＣ ２．１．１．２、例えば、非特許文献１を参照）を作用させデキストランを生成させるとともに、デキストラナーゼを併用することにより、デキストリンを原料としてイソマルトオリゴ糖を製造する方法が考えられるものの、従来から知られている酢酸菌であるアセトバクター・カプスラタム(Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ)由来のデキストリンデキストラナーゼは、デキストランの生成効率が低く、酵素自体の安定性が低いなどの問題点があり、実用的な方法とは言えない。

このような状況下、安価な澱粉又は澱粉部分分解物を原料として、より効率よくイソマルトオリゴ糖を製造する方法が求められている。

特開昭６１－２１９３４５号公報

山本一也ら、「バイオサイエンス・バイオテクノロジー・バイオケミストリー」、第５６巻、(１９９２年)、第１６９頁乃至１７３頁

本発明は、効率的なイソマルトオリゴ糖の製造方法を提供することを課題とする。

本発明者らは、イソマルトオリゴ糖の製造に有用な酵素として、本願と同じ出願人が国際公開第２００２／０１０３６１号パンフレットに開示したα－グルコシル転移酵素に着目した。当該α－グルコシル転移酵素は、澱粉又は澱粉部分分解物（α－１，４グルカン）に作用し、そのα－１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース残基を他のα－１，４グルカン分子の非還元末端グルコース残基の６位水酸基に転移し、転移したグルコース残基の６位水酸基にさらにグルコース残基を転移する作用を有しており、この糖転移反応を繰り返すことにより、分子内に複数個のグルコースがα－１，６結合を介して連結した構造（イソマルトオリゴ糖構造、α－１，６グルカン構造）を有する分岐α－グルカン混合物を生成する作用を有している。加えて、本発明者らは、Ｄ－グルコースがα－１，６結合を介して連結したイソマルトオリゴ糖（α－１，６グルカン）の還元末端グルコースの１位にＤ－グルコースがα－１，４結合を介して結合した構造を有する糖質のα－１，４結合を特異的に加水分解し、イソマルトオリゴ糖を遊離させる活性を有する酵素として、イソプルラナーゼに着目した。そして、上記したそれぞれの活性を有する上記２種類の酵素を組合せて澱粉又は澱粉部分分解物に作用させる酵素反応を試みたところ、意外にも、従来公知の方法よりも顕著に効率よくイソマルトオリゴ糖を製造できることを新たに見出し、α－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼとを組合せて用いる効率的なイソマルトオリゴ糖の製造方法を確立して本発明を完成した。

すなわち、本発明は、澱粉又は澱粉部分分解物に作用し、そのα－１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース残基の６位水酸基にＤ－グルコース若しくはグルコース重合度２以上のα－１，６グルカンがα－１，６結合した分岐構造を有する分岐α－グルカンを生成する活性を有するα－グルコシル転移酵素と、イソプルラナーゼとを組合せ、澱粉又は澱粉部分分解物に作用させることによりイソマルトオリゴ糖を生成させる工程と、生成したイソマルトオリゴ糖を採取する工程を含んでなるイソマルトオリゴ糖の製造方法を提供することにより上記課題を解決するものである。

本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法によれば、澱粉又は澱粉部分分解物を原料としてイソマルトオリゴ糖を効率よく製造することができ、工業的規模でのイソマルトオリゴ糖の生産が可能となる。また、このイソマルトオリゴ糖の製造方法の確立により、イソマルトオリゴ糖の還元物であるイソマルトオリゴ糖アルコールの製造も容易となることから、イソマルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖アルコールをより安価に市場に供給できることとなる。

本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法におけるイソマルトオリゴ糖生成反応の概要を示す模式図である。 各種酵素を組合せて澱粉部分分解物に作用させて得た反応物のＴＬＣクロマトグラムである。 澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素、イソプルラナーゼ、イソアミラーゼ及びα－アミラーゼを組合せて作用させ得た反応物をさらにグルコアミラーゼ処理して得た糖質組成物のＨＰＬＣクロマトグラムである。

本発明は、澱粉又は澱粉部分分解物に作用し、そのα－１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース残基の６位水酸基にＤ－グルコース若しくはグルコース重合度２以上のα－１，６グルカンがα－１，６結合した分岐構造を有する分岐α－グルカンを生成する活性を有するα－グルコシル転移酵素と、イソプルラナーゼとを組合せ、澱粉又は澱粉部分分解物に作用させることによりイソマルトオリゴ糖を生成させる工程と、生成したイソマルトオリゴ糖を採取する工程を含んでなるイソマルトオリゴ糖の製造方法に係るものである。

本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法におけるイソマルトオリゴ糖生成反応の概要を模式図として図１に示した。この方法は、本願と同じ出願人が国際公開第２００２／０１０３６１号パンフレットに開示したα－グルコシル転移酵素と、イソプルラナーゼとを組合せた新規なイソマルトオリゴ糖生成反応である。α－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼとを組合せ澱粉又は澱粉部分分解物に作用させると、α－グルコシル転移酵素の作用により、α－１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース残基の６位水酸基にＤ－グルコース若しくはグルコース重合度２以上のα－１，６グルカンがα－１，６結合した分岐構造を有する分岐α－グルカンが生成し、次いで、その末端のイソマルトシル基若しくはグルコース重合度３以上のα－１，６グルカンが結合したα－１，４結合をイソプルラナーゼが特異的に加水分解することによりグルコース重合度２以上のイソマルトオリゴ糖が生成する。図１には、イソマルトトリオース及びイソマルトテトラオースが生成する反応機構が例示されているものの、α－１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース残基の６位水酸基にＤ－グルコースがα－１，６結合した分岐構造を有する分岐α－グルカンが生成した場合には、その末端のイソマルトシル基が結合したα－１，４結合をイソプルラナーゼが特異的に加水分解することによりグルコース重合度２のイソマルトースが生成し、α－１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース残基の６位水酸基にグルコース重合度４のα－１，６グルカンがα－１，６結合した分岐構造を有する分岐α－グルカンが生成した場合には、イソプルラナーゼの作用によりグルコース重合度５のイソマルトペンタオースが生成することになる。そして、反応液中でこれらの反応が繰り返されることにより、反応液中にイソマルトース、イソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、イソマルトペンタオースなどのイソマルトオリゴ糖が蓄積することとなる。

本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法において用いることのできる前記α－グルコシル転移酵素は、前記酵素活性を有するかぎり特に限定されないものの、好適な酵素としては、例えば、本願と同じ出願人が国際公開第２００２／０１０３６１号パンフレットに開示した、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ） ＰＰ７１０由来のα－グルコシル転移酵素、及び、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ） ＰＰ３４９由来のα－グルコシル転移酵素が挙げられる。本発明で用いるα－グルコシル転移酵素は、その精製度により限定されず、目的とするイソマルトオリゴ糖生成反応に支障とならない限り、粗酵素、部分精製酵素及び精製酵素のいずれであってもよい。

本発明で用いるα－グルコシル転移酵素の酵素活性は、本願と同じ出願人が国際公開第２００２／０１０３６１号パンフレットに開示した、基質としてマルトースを用い、α－グルコシル転移酵素がマルトースの非還元末端側のグルコシル基を転移した際に残存するＤ－グルコースを定量する方法で測定することができる。具体的には、マルトースを最終濃度１％（ｗ／ｖ）となるように２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて基質液とし、その基質液５ｍＬに、酵素液０．５ｍＬを加え４０℃で３０分間酵素反応させ、その反応液０．５ｍＬと５ｍＬの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）とを混合し、沸騰水浴中で１０分間加熱することにより反応停止させた後、反応液中のグルコース量を、常法に従ってグルコースオキシダーゼ－パーオキシダーゼ法で測定し、酵素反応によって生成したＤ－グルコース量を算出する。α－グルコシル転移酵素の活性１単位（Ｕ）は、上記の条件下で１分間に１μモルのＤ－グルコースを生成する酵素量と定義する。

本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法において用いることのできる前記イソプルラナーゼは、パノースを加水分解してイソマルトースとＤ－グルコースとを生成する活性、及び、プルランを加水分解してイソパノースを生成する活性を有し、且つ、イソマルトトリオース及びデキストランに作用しない酵素である限り、特に給源によって限定されるものではないが、例えば、アスベルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のイソプルラナーゼは酵素剤が市販されており、本発明の製造方法において有利に用いることができる。

また、本願と同じ出願人は、特開２００４－２６１１３２号公報において、プルラン生産菌でもあるオーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属微生物が培養上清中にプルランを加水分解しイソパノースを生成する「プルラン分解酵素」、すなわち、イソプルラナーゼを産生することを見出した。このオーレオバシディウム属微生物が産生するイソプルラナーゼも、本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法において有利に用いることができる。

本発明で用いるイソプルラナーゼの活性測定法は特に限定されず、イソプルラナーゼが有する上記活性に基づき、パノースを基質として用い、パノースを加水分解してイソマルトースとＤ－グルコースとを生成する活性を測定することも、また、プルランを基質として用い、プルランを加水分解してイソパノースを生成する活性を測定することもできる。本願明細書に記載したイソプルラナーゼの酵素活性は、基質としてのプルランを濃度１．０％（ｗ／ｖ）となるように濃度１００ｍＭのギ酸緩衝液（ｐＨ３．５）に溶解させて基質溶液とし、その基質溶液に同緩衝液で希釈、調製した酵素液を加えて４０℃で反応させ、プルランの加水分解により生成するイソパノースの還元力をＤ－グルコースを標準品としてＤ－グルコース換算で測定した。イソプルラナーゼの活性１単位（Ｕ）は、上記の条件下で１分間に１μモルのＤ－グルコースに相当する還元力を生成する酵素量と定義した。

本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法において、原料基質としては、例えば、とうもろこし澱粉、米澱粉、小麦澱粉などの地上澱粉、馬鈴薯澱粉、甘藷澱粉、タピオカ澱粉などの地下澱粉及びそれらの部分加水分解物（澱粉部分分解物）を好適に用いることができる。前記澱粉部分分解物は、通常、上記した地上又は地下澱粉を水に懸濁して、通常、濃度１０質量％以上、より好ましくは、１５質量％乃至６５質量％、更に好ましくは、２０質量％乃至５０質量％の澱粉乳とし、これを加熱して糊化し、次いで、酸或いは耐熱性α－アミラーゼにより液化（部分分解）して得ることができる。液化の程度は、比較的低く設定するのがよく、通常、ＤＥ（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ、グルコース当量）１５未満、好ましくは、ＤＥ１０未満、より好ましくは、ＤＥ９乃至０．１の範囲とするのが望ましい。酸で液化する場合には、例えば、塩酸、燐酸、蓚酸などの酸剤により液化した後、通常、炭酸カルシウム、酸化カルシウム、炭酸ナトリウムなどのアルカリ剤を用いて所望のｐＨに中和する方法を採用する。

本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法のイソマルトオリゴ糖生成反応において、反応液における澱粉又は澱粉部分分解物の濃度は特に限定されないものの、固形物濃度で、通常、４０質量％以下、望ましくは、３５質量％以下が好適であり、この条件下でイソマルトオリゴ糖を有利に製造できる。反応温度はα－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼによるイソマルトオリゴ糖生成反応が進行する温度、すなわち４０℃までで行えばよい。好ましくは３５℃以下、より好ましくは３０℃付近の温度を用いる。反応ｐＨは、通常、４．０乃至６．０の範囲、好ましくはｐＨ５．０乃至５．５の範囲に調整するのがよい。酵素の使用量と反応時間とは密接に関係しており、目的とする酵素反応の進行により酵素の使用量と反応時間を適宜調整すればよい。

なお、本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法の前記イソマルトオリゴ糖を生成させる工程においては、さらに、必要に応じて、イソアミラーゼやプルラナーゼなどの澱粉枝切酵素、α－アミラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）及びグルコアミラーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を併用することも有利に実施できる。とりわけ、澱粉枝切酵素は、原料とする澱粉又は澱粉部分分解物におけるα－１，６結合を介した分岐構造のα－１，６結合を特異的に加水分解（枝切り）する酵素であるため、併用することによりα－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼとを組合せたイソマルトオリゴ糖の生成反応の効率を高め、イソマルトオリゴ糖の生成量を顕著に高める効果を奏する。また、α－アミラーゼやＣＧＴａｓｅは澱粉又は澱粉部分分解物を加水分解する作用を有することから、高分子澱粉質の残存による反応液の濁りを抑制することができる。

さらに、本発明は、上記のイソマルトオリゴ糖の製造方法に、さらにイソマルトオリゴ糖を水素添加することにより還元しイソマルトオリゴ糖アルコールに変換する工程と、変換されたイソマルトオリゴ糖アルコールを採取する工程とを付加してなるイソマルトオリゴ糖アルコールの製造方法に係るものでもある。上記のイソマルトオリゴ糖の製造方法で得られるイソマルトオリゴ糖を、還元触媒下で水素添加して還元することにより、イソマルトオリゴ糖アルコールに変換することができ、イソマルトオリゴ糖アルコール又はイソマルトオリゴ糖アルコール含有物を高収率で得ることができる。具体的には、例えば、固形物濃度４０乃至６０質量％のイソマルトオリゴ糖含有水溶液にラネーニッケル触媒を加え、これを耐圧性容器内に入れ、この容器内に水素を充填し、加圧し、温度１００乃至１２０℃にて水素が消費されなくなるまで攪拌して水素添加する。この際、イソマルトオリゴ糖中に含まれるイソマルトースはイソマルチトールに、イソマルトトリオースはイソマルトトリイトールに、イソマルトテトラオースはイソマルトテトライトールに、イソマルトペンタオースはイソマルトペンタイトールにそれぞれ変換されるとともに、イソマルトオリゴ糖含有糖質中に含まれる場合がある他の還元性糖質、例えば、Ｄ－グルコース、マルトース、マルトトリオース、他の還元性澱粉部分加水分解物も同様に還元されそれぞれ対応する糖アルコールとなる。得られたイソマルトオリゴ糖アルコール含有物をラネーニッケル触媒と分離し、常法にしたがって活性炭により脱色し、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂等で脱塩し、精製し、濃縮してシラップ状物とするか、更に、これを乾燥して粉末状物とする。必要ならば、更に、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコール及びアセトンなど有機溶媒を用いる分別、膜分離法等の１種又は２種以上の方法を適宜組み合わせて精製し、高純度のイソマルトオリゴ糖アルコールとすることもできる。

上記した本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法によって得られた反応物、又は、本発明のイソマルトオリゴ糖アルコールの製造方法によって得られた反応物は、そのままイソマルトオリゴ糖含有糖液、イソマルトオリゴ糖アルコール含有液として用いることができるものの、一般的には、さらに精製して用いられる。精製方法としては、糖及び糖アルコールの精製に用いられる通常の方法を適宜採用すればよく、例えば、活性炭による脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂による脱塩、イオン交換カラムクロマトグラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーによる分画、アルコールおよびアセトンなど有機溶媒による分別、適度な分離性能を有する膜による分離、更には、イソマルトオリゴ糖やイソマルトオリゴ糖アルコールを利用せず夾雑糖質を資化、分解する微生物、例えば酵母などによる発酵処理などの精製方法が適宜採用できる。

とりわけ、大量生産方法としては、イオン交換カラムクロマトグラフィーの採用が好適であり、例えば、特開昭５８－２３７９９号公報、特開昭５８－７２５９８号公報などに開示されている強酸性カチオン交換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィーにより夾雑糖類を除去し、目的物の含量を向上させたイソマルトオリゴ糖含有糖質、イソマルトオリゴ糖アルコール含有物を有利に製造することができる。この際、固定床方式、移動床方式、擬似移動床方式のいずれの方式を採用することも随意である。

このようにして得られたイソマルトオリゴ糖含有糖質、イソマルトオリゴ糖アルコール含有物を含む水溶液は、通常、濃縮してシラップ状製品とすることができる。このシラップ状製品は、更に、乾燥して非晶質固状物製品又は非晶質粉末製品にすることも随意である。

本発明の製造方法で得られるイソマルトオリゴ糖含有糖質、イソマルトオリゴ糖アルコール含有物は、甘味料、呈味改良剤、品質改良剤、安定剤、変色防止剤、賦形剤などとして、他の成分と組合せ、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、化粧品、医薬品、工業用品などの各種組成物に有利に利用できる。

なお、上記のような各種組成物に、本発明の製造方法で得られるイソマルトオリゴ糖含有糖質、イソマルトオリゴ糖アルコール含有物を含有させる方法としては、その製品が完成するまでの工程に含有せしめればよく、例えば、混和、混捏、溶解、融解、浸漬、浸透、散布、塗布、被覆、噴霧、注入、晶析、固化など公知の方法が適宜選ばれる。その量は、通常０．１質量％以上、望ましくは１質量％以上含有せしめるのが好適である。

以下、実験により本発明を詳細に説明する。

＜実験：α－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼを組合せた澱粉部分分解物からのイソマルトオリゴ糖の製造＞
市販のイソプルラナーゼ酵素剤を、本願と同じ出願人が国際公開第２００２／０１０３６１号パンフレットに開示した、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ） ＰＰ７１０由来α－グルコシル転移酵素と組合せて澱粉部分分解物に作用させ、イソマルトオリゴ糖の製造を試みた。

＜実験１：イソマルトオリゴ糖生成反応における各種酵素の併用効果＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を原料基質とし、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に終濃度１０質量％になるよう溶解し基質溶液とした。次いで、これに基質固形物１ｇ当たり１０Ｕのα－グルコシル転移酵素（株式会社林原調製品）、１０Ｕの市販のイソプルラナーゼ（アスペルギルス・ニガー由来、メガザイム社販売）、１，０００ｆｕのイソアミラーゼ（株式会社林原調製品）、及び、１．０Ｕのα－アミラーゼ（商品名『クライスターゼＥ５ＣＣ』、天野エンザイム株式会社販売）を、それぞれ表１に示す組合せで添加し、さらに防腐剤としてヒノキチオールを終濃度６０ｐｐｍになるよう添加した後、３０℃で７２時間反応させた。反応終了後、１００℃で１０分間加熱して酵素を失活させた後、各反応液を下記条件による薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供し、各反応液に含まれる糖質を予備的に分析した。ＴＬＣクロマトグラムを図２に示す。

＜ＴＬＣ分析条件＞
ＴＬＣプレート：シリカゲルアルミニウムプレート（商品名『シリカゲル６０Ｆ２５４』、１０×２０ｃｍ、メルク社製）
展開溶媒：ｎ－ブタノール：ピリジン：水混液（容量比６：４：１）
展開方法：上昇法、２回展開
検出方法：硫酸－メタノール法

図２に見られるとおり、原料基質とした澱粉部分分解物（図２のレーン０）、α－グルコシル転移酵素反応物（図２のレーン１）及びイソプルラナーゼ反応物（図２のレーン２）では、それぞれのＴＬＣクロマトグラムにおいて、いずれも試料をスポットした原点以外に明瞭な糖質のスポットは認められず、同時にＴＬＣを行ったマルトオリゴ糖マーカー（図２の「Ｇｎ」）、イソマルトオリゴ糖マーカー（図２の「ＩＧｎ」）のクロマトグラムと対比すると、少なくともグルコース重合度（ＤＰ、Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）１０以下のマルトオリゴ糖やグルコース重合度４以下のイソマルトオリゴ糖は実質的に存在しないことが分った。一方、澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼを作用させて得た反応物（図２のレーン３）、α－グルコシル転移酵素、イソプルラナーゼ及びイソアミラーゼを作用させて得た反応物（図２のレーン４）、及び、α－グルコシル転移酵素、イソプルラナーゼ、イソアミラーゼ及びα－アミラーゼを作用させて得た反応物（図２のレーン５）のクロマトグラムには、Ｄ－グルコース、イソマルトース、イソマルトトリオース及びイソマルトテトラオースのスポットが認められ、また、これら試料にもＤＰ１０以下のマルトオリゴ糖のスポットは認められなかった。この結果から、これら３種の反応物中にはＤＰ１０以下のマルトオリゴ糖は実質的に存在しないと考えられた。

さらに、各反応液の糖組成を下記条件のＨＰＬＣにて測定するとともに、ＤＰ２～ＤＰ８のイソマルトオリゴ糖の含量の合計値を求めた。また、上記４種の酵素全てを作用させて得た反応液についてはさらに固形物１ｇ当たり１０Ｕのグルコアミラーゼ(リゾプス属由来、富士フィルム和光純薬株式会社販売)を添加し、ｐＨ５．０、５０℃で１８時間処理し、得られたグルコアミラーゼ処理物についても同様に糖組成及びＤＰ２～ＤＰ８のイソマルトオリゴ糖の含量の合計値を求めた。結果を表１に示す。

＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム；『ＭＣＩｇｅｌ ＣＫ０４ＳＳ』（三菱ケミカル株式会社製造）
カラム２本を直列に連結して使用；
溶離液：超純水
カラム温度：８０℃
流速：０．４ｍＬ／分
検出：示差屈折計ＲＩＤ－１０Ａ（株式会社島津製作所製）

表１に見られるとおり、原料とした澱粉部分分解物（対照）、α－グルコシル転移酵素反応物（試料１）及びイソプルラナーゼ反応物（試料２）では、ＤＰ１１以上の糖質がほぼ９０質量％以上を占め、ＤＰ１０以下の糖質はごく少量であった。一方、澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼを作用させて得た反応物（試料３）は、ＤＰ１１以上の糖質が４６．８質量％まで低減し、ＤＰ１～ＤＰ１０の糖質の生成が認められ、その合計は５３．２質量％であり、ＤＰ２～ＤＰ８のイソマルトオリゴ糖（イソマルトース～イソマルトオクタオース）が合計で４２．４質量％含まれていた。さらに、澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼに加えさらに澱粉枝切酵素であるイソアミラーゼを作用させて得た反応物（試料４）ではＤＰ１１以上の糖質が１０．９質量％まで低減し、ＤＰ１～ＤＰ１０の糖質が合計で８９．１質量％を占めており、ＤＰ２～ＤＰ８のイソマルトオリゴ糖（イソマルトース～イソマルトオクタオース）が合計で７３．２質量％含まれていた。またさらに、澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素、イソプルラナーゼ、イソアミラーゼに加え、さらにα－アミラーゼを添加し作用させて得た反応物（試料５）ではＤＰ１１以上の糖質が５．８質量％まで低減し、ＤＰ１～ＤＰ１０の糖質が合計で９６．２質量％を占めており、ＤＰ２～ＤＰ８のイソマルトオリゴ糖（イソマルトース～イソマルトオクタオース）が合計で７７．７質量％含まれていた。

また、澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素、イソプルラナーゼ、イソアミラーゼ及びα－アミラーゼを作用させて得た反応物（試料５）をさらにグルコアミラーゼ処理して得た反応物（試料６）のＨＰＬＣクロマトグラムを図３に示すとともに、分析により得られた糖組成を表１に併記した。図３に見られるとおり、ＨＰＬＣクロマトグラムでは、ＤＰ１のＤ－グルコースからＤＰ１０までの糖質がそのグルコース重合度の違いによって分離された一連のピークが認められ、その糖組成は表１の試料６の欄に見られるとおりであった。グルコアミラーゼ処理前（試料５）の糖組成と比べ、グルコアミラーゼ処理後（試料６）の糖組成は、Ｄ－グルコースが４質量％増加していたものの大きな変化はなかった。試料５において、仮に原料澱粉部分分解物由来のマルトオリゴ糖が未反応物として僅かに混在していたとしても、それらは試料６ではグルコアミラーゼにより分解されることから、試料６のＤ－グルコース以外の糖質はほぼ全てイソマルトオリゴ糖と見なすことができる。なお、当該試料６のＤＰ２～ＤＰ８のイソマルトオリゴ糖の合計値は７４．２質量％であった。

さらに、上記で得られた試料３～５において新たに生成した糖質の大部分がイソマルトオリゴ糖であることを確認する目的で、各試料を常法のメチル化分析に供し、各試料中の糖質を構成するグルコースの結合様式を調べた。原料とした澱粉部分分解物（対照）及び各酵素反応物（試料１～５）について、常法に従って部分メチル化アルジトールアセテートを調製し、ガスクロマトグラフィー法で定量し、各グルコシド結合にかかわるグルコースの含量を調べた。結果を表２にまとめた。

表２に見られるとおり、メチル化分析により、原料とした澱粉部分分解物（対照）では、非還元末端グルコース（１位の水酸基のみを介して他のグルコースと結合したグルコース）が５．２％、α－１，４結合したグルコース（１位と４位の水酸基を介して他のグルコースと結合したグルコース）が９０．３％、α－１，４，６結合したグルコース（１位、４位及び６位の水酸基を介して他のグルコースと結合したグルコース、すなわち、澱粉において本来的に存在するα－１，４グルカンがα－１，６結合で分岐した分岐点のグルコース）が４．５％存在し、他の結合様式で結合したグルコースは存在しないことが確認された。また、イソプルラナーゼ反応物（試料２）では、原料とした澱粉部分分解物と変わらない結果となり、このことは、イソプルラナーゼは単独では澱粉部分分解物に実質的に作用しないことを示している。一方、α－グルコシル転移酵素反応物（試料１）では、α－１，４結合したグルコースが５７．１％まで減少した一方、α－１，６結合したグルコース（１位と６位の水酸基を介して他のグルコースと結合したグルコース）が新たに２８．３％認められ、α－１，３結合したグルコース（１位と３位の水酸基を介して他のグルコースと結合したグルコース）及びα－１，３，６結合したグルコース（１位、３位及び６位の水酸基を介して他のグルコースと結合したグルコース）もそれぞれ僅かに（０．７％と０．９％）認められた。

一方、澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼを作用させて得た反応物（試料３）では、α－１，４結合したグルコースが２７．９％まで減少し、α－１，６結合したグルコースが４７．１％認められた。さらに、澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼに加えさらにイソアミラーゼを作用させて得た反応物（試料４）では、α－１，４結合したグルコースが５．７％まで減少し、α－１，６結合したグルコースが６３．４％認められた。なお、本試料では、イソアミラーゼを作用させ澱粉部分分解物に本来的に存在する分岐点のα－１，６結合を分解したため、α－１，４，６結合したグルコースは０．５％まで低下した。またさらに、澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素、イソプルラナーゼ、イソアミラーゼに加え、さらにα－アミラーゼを添加し作用させて得た反応物（試料５）ではα－１，４結合したグルコースが２．８％まで減少し、α－１，６結合したグルコースが６１．７％認められた。

また、表２に示す通り、非還元末端グルコース（遊離のＤ－グルコースをも含む）を除いた全グルコース中に占めるα－１，６結合したグルコース（１位と６位の水酸基のみを介して他のグルコースと結合したグルコース）の割合を算出すると、澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素、イソプルラナーゼ及びイソアミラーゼを作用させて得た反応物（試料４）では８８．３％、澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素、イソプルラナーゼ、イソアミラーゼ及びα－アミラーゼを作用させて得た反応物（試料５）では９１．７％となり、試料中に存在している糖質中の大部分のグルコースがα－１，６結合したグルコースであることが分った。このことから、試料３～５において生成した糖質の大部分がイソマルトオリゴ糖であることが確認された。

本実験の結果は、α－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼとを組合せて澱粉又は澱粉部分分解物に作用させると、ＤＰ２のイソマルトースからＤＰ８のイソマルトオクタオースまでのイソマルトオリゴ糖を合計で４２質量％以上含むイソマルトオリゴ糖混合物が製造でき、さらにイソアミラーゼやα－アミラーゼを併用することで、ＤＰ２のイソマルトースからＤＰ８のイソマルトオクタオースまでのイソマルトオリゴ糖を合計で７３質量％以上含むイソマルトオリゴ糖混合物を澱粉又は澱粉部分分解物を原料として効率よく製造できることを物語っている（表１を参照）。

＜実験２：イソマルトオリゴ糖生成反応における基質濃度の影響＞
イソマルトオリゴ糖の生成反応に用いる基質濃度を５、１０、２０又は３０質量％と変えたこと、及び、実験１で用いた４種類の酵素を全て作用させた以外は実験１と同じ条件で酵素反応を行い、得られた各反応液の糖組成を前述したＨＰＬＣ分析により測定し、実験１と同様に、ＤＰ２のイソマルトースからＤＰ８のイソマルトオクタオース）までのイソマルトオリゴ糖の合計値を算出した。結果を表３に示す。

表３に見られるとおり、基質濃度を５、１０，２０又は３０質量％と変化させても生成物の糖組成は大きく変化することなく、Ｄ－グルコースを約１３質量％、イソマルトースを約１９質量％、イソマルトトリオースを約１７質量％、イソマルトテトラオースを約１４質量％、イソマルトペンタオースを約１１質量％、イソマルトヘキサオースを約８．５質量％、イソマルトヘプタオースを約６質量％、及び、イソマルトオクタオースを約４質量％含有するイソマルトオリゴ糖混合物が得られた。また、ＤＰ２のイソマルトースからＤＰ８のイソマルトオクタオースまでの合計値は７８～８１質量％を示した。

実験１及び実験２の結果は、α－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼを組合せて用いる本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法によれば、比較的基質濃度が高い条件においても、澱粉枝切酵素やα－アミラーゼなどの他の酵素も適宜併用することにより、固形物当たりの、ＤＰ２のイソマルトースからＤＰ８のイソマルトオクタオースまでのイソマルトオリゴ糖の合計の含量が少なくとも７３質量％以上の糖組成物が得られ、澱粉又は澱粉部分分解物を原料として効率よくイソマルトオリゴ糖混合物を製造できることを物語っている。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかしながら、本発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。

＜澱粉からのイソマルトオリゴ糖の製造＞
とうもろこし澱粉を濃度約３０質量％の澱粉乳とし、これに炭酸カルシウムを０．１質量％加え、ｐＨ６．５に調整し、耐熱性α－アミラーゼ（商品名『ターマミール６０Ｌ』、ノボ社製）を澱粉当たり０．３質量％加え、９５℃で１５分間反応させ、次いで１２０℃で２０分間オートクレーブし、更に約４０℃まで冷却してＤＥ約４の澱粉液化液を調製した。この澱粉液化液をｐＨ５．５に調整し、澱粉固形物１ｇ当たり１０Ｕのα－グルコシル転移酵素（バチルス・サーキュランス ＰＰ７１０由来、株式会社林原調製品）、１０Ｕのイソプルラナーゼ（アスペルギルス・ニガー由来、メガザイム社販売）、１，０００ｆｕの澱粉枝切り酵素（イソアミラーゼ、株式会社林原調製品）、及び、１．０Ｕのα－アミラーゼ（商品名『クライスターゼ Ｅ５ＣＣ』、天野エンザイム株式会社販売）を添加し、さらに防腐剤としてピロ亜硫酸ナトリウムを終濃度０．０１質量％になるよう添加した後、３０℃で７２時間反応させた。反応終了後、９６℃で３０分間加熱して酵素を失活させた後、反応液の糖組成をＨＰＬＣにて測定したところ、Ｄ－グルコース１２．１質量％、イソマルトース１７．０質量％、イソマルトトリオース１６．３質量％、イソマルトテトラオース１３，４質量％、イソマルトペンタオース１０．５質量％、イソマルトヘキサオース８．５質量％、イソマルトヘプタオース以上の糖２２．２質量％であった。このイソマルトオリゴ糖含有糖液は脱色、脱塩、濃縮した後、イソマルトオリゴ糖高含有シラップとして、甘味料、発酵用炭素源、試薬、化学品、医薬品の原料及び中間体などとして有利に利用できる。

＜澱粉部分分解物からのイソマルトオリゴ糖の製造＞
澱粉部分分解物（商品名『パインデックス＃１００』、松谷化学工業株式会社販売）を、１ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に終濃度２０質量％になるよう溶解し、これに基質固形物１ｇ当たりα－グルコシル転移酵素（アルスロバクター・グロビホルミス ＰＰ３４９由来、株式会社林原調製品）を１０Ｕ、オーレオバシディウム・プルランス ＩＦＯ６３５３を常法により培養し、培養液を遠心分離し、部分精製して得たイソプルラナーゼ酵素液をイソプルラナーゼとして５Ｕ、イソアミラーゼ（株式会社林原調製品）を１，０００ｆｕ、及び、１．０Ｕのα－アミラーゼ（商品名『クライスターゼ Ｅ５ＣＣ』、天野エンザイム株式会社販売）を添加し、さらに防腐剤としてピロ亜硫酸ナトリウムを終濃度０．０１質量％になるよう添加した後、３０℃で７２時間反応させた。反応終了後、９６℃で３０分間加熱して酵素を失活させた後、反応液の糖組成をＨＰＬＣにて測定したところ、Ｄ－グルコース１１．１質量％、イソマルトース１５．５質量％、イソマルトトリオース１４．９質量％、イソマルトテトラオース１２．６質量％、イソマルトペンタオース１０．３質量％、イソマルトヘキサオース９．０質量％、イソマルトヘプタオース以上の糖２６．６質量％であった。このイソマルトオリゴ糖含有糖液を冷却し、濾過して得られる濾液を、常法に従って、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩して精製し、更に濃縮し、乾燥し、ＤＰ２（イソマルトース）以上のイソマルトオリゴ糖含量が８８．９質量％のイソマルトオリゴ糖含有粉末を得た。本品は、優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。

＜イソマルトオリゴ糖組成物＞
実施例１の方法で得られたイソマルトオリゴ糖高含有シラップを水で希釈し、強酸性カチオン交換樹脂（商品名『アンバーライトＣＲ－１３１０』、Ｎａ^＋型、オルガノ株式会社製）を用いてカラムクロマトグラフィーを行なった。即ち、前記樹脂を内径１２．５ｃｍのジャケット付きステンレス製カラム１０本に充填し、これらカラムを直列接続して樹脂層全長を１６ｍとした。カラム内温度を４０℃に維持しつつ、前記希釈液を樹脂量に対して１．５％（ｖ／ｖ）加え、これに４０℃の温水をＳＶ０．２で流して分画し、溶出液の糖組成をＨＰＬＣ法でモニターしながら、Ｄ－グルコース画分及びＤＰ７以上のイソマルトオリゴ糖画分を除去してＤＰ２～ＤＰ６のイソマルトオリゴ糖画分を採取し、これを精製し、イソマルトオリゴ糖含有液を固形物当たりの収率約６５％で得た。本液を常法に従って、脱色、脱塩、濃縮して、濃度約７５％のイソマルトオリゴ糖シラップを得た。本品は、難結晶性で優れた保湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。

＜イソマルトオリゴ糖アルコール含有シラップ＞
実施例３で得たイソマルトオリゴ糖シラップに活性化したラネーニッケルを加え、常法により水素添加した後、ラネーニッケルを除去し、活性炭で脱色し、Ｈ型及びＯＨ型イオン交換樹脂により脱塩、精製し、固形物当たりイソマルチトール２５．８質量％、イソマルトトリイトール２４．０質量％、イソマルトテトライトール２０．１質量％、イソマルトペンタイトール１６．１質量％、イソマルトヘキサイトール１０．６質量％、その他の糖アルコールを３．４質量％含有するイソマルトオリゴ糖アルコール含有シラップを固形物当たり約９０％の収率で得た。本イソマルトオリゴ糖アルコール含有シラップを濃度約７５質量％に濃縮し、缶に充填し製品とした。本品は、非還元性、非吸湿性、低甘味性、浸透圧調節性、賦形性、照り付与性、保湿性、粘性付与性、糖質晶出防止性、難醗酵性、澱粉の老化防止性等を有していることから、各種飲食品、健康食品、健康補助食品、飼料、餌料、化粧品、医薬品、嗜好品などに有利に用いることができる。

＜水羊羹＞
４００ｍＬの水道水に棒寒天１本を入れ、火にかけ沸騰させた後、黒砂糖２５ｇ、上白糖５０ｇ及び実施例１の方法で調製したイソマルトオリゴ糖含有シラップを固形分として２０ｇ加え、さらに漉し餡約３００ｇを加えた後、中火で煮ながらあくを取り、沸騰させて５分後に火を止め、適量の食塩を加えよく撹拌した後、型に流し込み、室温に３０分間保持して固め、さらに冷蔵庫で冷却して水ようかんを作成した。本品はイソマルトオリゴ糖を含有し、上品な甘さを有する水羊羹である。

＜乳酸飲料＞
実施例２の方法で調製したイソマルトオリゴ糖含有粉末を１００ｇとり、これに牛乳３００ｍＬを加えた後、加熱沸騰させ、火を止めてあくを取り、自然冷却した。品温が３７℃以下になったことを確認した後、適量のクエン酸、乳酸、乳酸エッセンス及びレモンエッセンスを入れて良く撹拌し、ビンに詰め蓋をして冷蔵庫で冷却し、乳酸飲料を作成した。本品はイソマルトオリゴ糖を含有し、甘さとカロリーを低減した乳酸飲料である。

＜乳液＞
下記の配合に基づき乳液を調製した。
（配合成分） 質量％
スクワラン ５．０
オリーブ油 ５．０
ホホバ油 ５．０
セチルアルコール １．５
グリセリンモノステアレート ２．０
ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル ３．０
ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレート ２．０
１，３－ブチレングリコール １．０
グリセリン ２．０
実施例４の方法で得たイソマルトオリゴ糖アルコール ７．０
防腐剤（パラオキシ安息香酸エステル） 適量
香料 適量
精製水 １００とする残余

α－グルコシル転移酵素とイソプルラナーゼとを組合せて用いる本発明のイソマルトオリゴ糖の製造法の確立は、澱粉又は澱粉部分分解物を原料とした工業的規模でのイソマルトオリゴ糖の生産、さらにはイソマルトオリゴ糖アルコールの生産を可能にするものであり、製糖産業のみならず、これに関連する食品、化粧品、医薬品産業における意義が極めて大きい。

図２において、
Ｇ１：Ｄ－グルコース
Ｇ２：マルトース
Ｇ３：マルトトリオース
Ｇ４：マルトテトラオース
Ｇ５：マルトペンタオース
Ｇ６：マルトヘキサオース
Ｇ７：マルトヘプタオース
Ｇ８：マルトオクタオース
ＩＧ２：イソマルトース
ＩＧ３：イソマルトトリオース
ＩＧ４：イソマルトテトラオース
Ｇｎ：マルトオリゴ糖マーカー
ＩＧｎ：イソマルトオリゴ糖マーカー
レーン０：澱粉部分分解物（原料基質）
レーン１：澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素を作用させて得た反応物
レーン２：澱粉部分分解物にイソプルラナーゼを作用させて得た反応物
レーン３：澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素及びイソプルラナーゼを作用させて得た反応物
レーン４：澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素、イソプルラナーゼ及びイソアミラーゼを作用させて得た反応物
レーン５：澱粉部分分解物にα－グルコシル転移酵素、イソプルラナーゼ、イソアミラーゼ及びα－アミラーゼを作用させて得た反応物
図３において、
Ｇ１：Ｄ－グルコース
ＩＧ２：イソマルトース
ＩＧ３：イソマルトトリオース
ＩＧ４：イソマルトテトラオース
ＩＧ５：イソマルトペンタオース
ＩＧ６：イソマルトヘキサオース
ＩＧ７：イソマルトヘプタオース
ＩＧ８：イソマルトオクタオース
ＩＧ９：イソマルトノナオース
ＩＧ１０：イソマルトデカオース

Claims (5)

1. 澱粉又は澱粉部分分解物に作用し、そのα－１，４グルカン鎖の非還元末端グルコース残基の６位水酸基にＤ－グルコース若しくはグルコース重合度２以上のα－１，６グルカンがα－１，６結合した分岐構造を有する分岐α－グルカンを生成する活性を有するα－グルコシル転移酵素と、イソプルラナーゼとを組合せ、澱粉又は澱粉部分分解物に作用させることによりイソマルトオリゴ糖を生成させる工程と、生成したイソマルトオリゴ糖を採取する工程を含んでなるイソマルトオリゴ糖の製造方法。
2. 前記α－グルコシル転移酵素が、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物又はアルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属微生物由来の酵素である請求項１記載のイソマルトオリゴ糖の製造方法。
3. 前記イソプルラナーゼが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物又はオーレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属微生物由来の酵素である請求項１又は２記載のイソマルトオリゴ糖の製造方法。
4. 前記イソマルトオリゴ糖を生成させる工程において、さらに、澱粉枝切酵素、α－アミラーゼ、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ及びグルコアミラーゼから選ばれる１種又は２種以上の酵素を併用する請求項１乃至３のいずれかに記載のイソマルトオリゴ糖の製造方法。
5. 請求項１乃至４のいずれかに記載のイソマルトオリゴ糖の製造方法に、さらにイソマルトオリゴ糖を水素添加することにより還元しイソマルトオリゴ糖アルコールに変換する工程と、変換されたイソマルトオリゴ糖アルコールを採取する工程とを付加してなるイソマルトオリゴ糖アルコールの製造方法。

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