CN111197111B - 用于检测葱属作物病毒的引物组、试剂、试剂盒、应用和检测葱属作物病毒的方法 - Google Patents

用于检测葱属作物病毒的引物组、试剂、试剂盒、应用和检测葱属作物病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测葱属作物病毒的引物组、试剂、试剂盒、应用和检测葱属作物病毒的方法，涉及生物技术领域，本发明提供的用于检测葱属作物病毒的引物组，包括用于检测SVX的引物对、用于检测SLV的引物对、用于检测SYSV的引物对和用于检测OYDV的引物对。在同一个检测体系中加入本发明提供的引物组，能够实现对多种靶标基因的同时检测，并且显著提高了检测效率。本发明提供的检测葱属作物病毒的方法，利用多重PCR同时进行多个病毒的鉴定，既高效又准确，且节约资本，能够为葱属作物组培脱毒奠定基础，为葱属作物生产中的农药减施和安全生产提供技术保障。

Description

用于检测葱属作物病毒的引物组、试剂、试剂盒、应用和检测 葱属作物病毒的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测葱属作物病毒的引物组、试剂、试剂盒、应用和检测葱属作物病毒的方法。
背景技术
病毒对植物的危害十分严重，病毒检测是预防的前提。分蘖洋葱(Allium cepavar.aggregatum)，又称分蘖葱头，俗称毛葱、鬼子葱，为百合科葱属两年生草本植物，是北方地区特色经济作物，具有降血脂、降血压、抗癌、抑菌、消炎等保健功能。近年来，毛葱种植面积逐年增加，吉林省2018年种植面积约为15万亩。分蘖洋葱一般采用无性繁殖，在栽培繁殖时期通常感染多种病毒，造成鳞茎内病毒的大量积累，严重影响其产量和质量。要想有效的控制这类病毒的危害，首先必须建立有效的病原鉴定体系，并明确它们的种类。迄今为止，葱属作物上约有15种病毒被发现，多为马铃薯Y病毒属(Potyvirus)、香石竹浅隐病毒属(Carlavirus)和葱属X病毒属(Allxivirus)。其中洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarfvirus，OYDV)、葱黄条病毒(Shallot yellow stripe virus，SYSV)、香石竹潜隐病毒(Shallot latent virus，SLV)和葱X病毒(Shallot virus X，SVX)四种病毒较为常见，这四种病毒形态结构相似，往往呈复合感染。
OYDV和SYSV隶属于马铃薯Y病毒属，该病毒属较保守。OYDV于1916年由Giddings在美国西弗吉尼亚州发现，1935年，Henderson将此病毒定名为洋葱黄矮病毒。OYDY感染植株后，存在于感病植株的根、叶和鳞茎等各个部分，表现为植株矮化，叶片扭曲变形退绿、叶尖枯萎，后期整个叶片发黄、向下卷曲、起皱及萎缩等症状，OYDV通过蚜虫传播。SYSV为分蘖洋葱感染的主要病毒，感染植株后，通常显现纵向黄色长条纹，植物细胞中可见由柱状内含体组成的“风轮体”和“薄层集结体”。SLV隶属于麝香石竹潜隐病毒，1978年，Bos等在荷兰的青葱中发现SLV，其在寄主上一般隐症，或显现出较轻症状，可由蚜虫以非持久性传播，但寄主范围较狭窄，通常只侵染大蒜和一些葱属植物，分蘖洋葱即为其中之一。SVX为葱属X病毒属最具代表性的病毒，1998年，葱属X病毒属被确立为植物病毒属，其病毒属成员均可侵染分蘖洋葱，且只侵染葱属作物。其侵染的作物症状与麝香石竹潜隐病毒相似，均无明显症状，但是通常危害极大，该属的病毒有可能是通过蜗虫传播，不能通过蚜虫传播。
自然界中环境复杂，受病毒侵染的植物通常都呈现复合侵染。为了保障葱属作物的安全生产，快速、准确地检测葱属作物被病毒侵染的情况尤为重要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种用于检测葱属作物病毒的引物组，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
本发明的第二个目的在于提供一种包含上述引物组的试剂。
本发明的第三个目的在于提供一种包含上述引物组或试剂的试剂盒。
本发明的第四个目的在于提供上述引物组、试剂或试剂盒在检测葱属作物中SVX、SLV、SYSV和OYDV中的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种检测葱属作物病毒的方法，能够为葱属作物中SVX、SLV、SYSV和OYDV的检测提供快速有效的手段。
本发明提供了一种用于检测葱属作物病毒的引物组，所述引物组包括用于检测SVX的引物对、用于检测SLV的引物对、用于检测SYSV的引物对和用于检测OYDV的引物对；
所述用于检测SVX的引物对包括SVX-8130s和SVX-8418a；
所述SVX-8130s包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述SVX-8418a包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测SLV的引物对包括Slv-7084s以及，Slv-8000a或Slv-7583a；
所述Slv-7084s包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述Slv-8000a包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述Slv-7583a包括如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测SYSV的引物对包括SYSV9921s和SYSV10430a，或者SYSV9993s和SYSV10177a，或者Univ10020s和Univ10225a；
所述SYSV9921s包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述SYSV10430a包括如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述SYSV9993s包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述SYSV10177a包括如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述Univ10020s包括如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述Univ10225a包括如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测OYDV的引物对包括OYDV9570s和OYDV10225a，或者OYDV9570s和OYDV10274a，或者Univ10020s和Univ10225a；
所述OYDV9570s包括如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述OYDV10225a包括如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述OYDV10274a包括如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
进一步地，所述SVX-8130s和SVX-8418a扩增产物的大小为250-300bp，优选为288bp；和/或，
所述Slv-7084s和Slv-8000a扩增产物的大小为900-950bp，优选为916bp；和/或，
所述Slv-7084s和Slv-7583a扩增产物的大小为450-550bp，优选为499bp；和/或，
所述SYSV9921s和SYSV10430a扩增产物的大小为450-550bp，优选为509bp；和/或，
所述SYSV9993s和SYSV10177a扩增产物的大小为150-200bp，优选为184bp；和/或，
所述OYDV9570s和OYDV10225a扩增产物的大小为600-700bp，优选为655bp；和/或，
所述OYDV9570s和OYDV10274a扩增产物的大小为250-300bp，优选为288bp；和/或，
所述Univ10020s和Univ10225a扩增产物的大小为150-250bp，优选为205bp。
进一步地，所述用于检测SLV的引物对包括Slv-7084s和Slv-8000a；
优选地，所述用于检测SYSV的引物对包括SYSV9921s和SYSV10430a；
优选地，所述用于检测OYDV的引物对包括OYDV9570s和OYDV10225a。
进一步地，所述SVX-8130s和SVX-8418a的用量独立地为0.05-0.075μmol/μL，优选为0.075μmol/μL；
优选地，所述Slv-7084s和Slv-8000a的用量独立地为0.025-0.05μmol/μL，优选为0.025μmol/μL；
优选地，所述SYSV9921s和SYSV10430a的用量独立地为0.05-0.1μmol/μL，优选为0.0625μmol/μL；
优选地，所述OYDV9570s和OYDV10225a的用量独立地为0.05-0.075μmol/μL，优选为0.0625μmol/μL。
进一步地，葱属作物包括分蘖洋葱或大蒜。
本发明还提供了一种用于检测葱属作物病毒的试剂，所述试剂包括商述的引物组。
本发明还提供了一种用于检测葱属作物病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组或试剂。
本发明还提供了上述的引物组、试剂或试剂盒在检测葱属作物中SVX、SLV、SYSV和OYDV中的应用。
另外，本发明还提供了一种检测葱属作物病毒的方法，以葱属作物待测样本的基因组cDNA为模板，应用上述的引物组、试剂或试剂盒进行多重PCR扩增，根据扩增产物中特异性DNA片段的长度，判断葱属作物中病毒的感染情况。
进一步地，所述多重PCR的退火温度为50-62℃，优选为58℃。
本发明提供的用于检测葱属作物病毒的引物组，包括用于检测SVX的引物对、用于检测SLV的引物对、用于检测SYSV的引物对和用于检测OYDV的引物对。在同一个检测体系中加入本发明提供的引物组，能够实现对多种靶标基因的同时检测，并且显著提高了检测效率。同时，本发明提供的引物组特异性强、灵敏度高，且扩增能力稳定，能够简便、快速、准确地检测葱属作物中SVX、SLV、SYSV和OYDV病毒。
本发明提供的检测葱属作物病毒的方法，以葱属作物待测样本的基因组cDNA为模板，应用本发明提供的引物组进行多重PCR扩增，根据扩增产物中特异性DNA片段的长度，即可判断葱属作物中病毒的感染情况。利用多重PCR同时进行多个病毒的鉴定，既高效又准确，且节约资本。并且，该方法还具有操作方便，工艺简单，临床应用范围广等优点，能够为葱属作物组培脱毒奠定基础，为葱属作物生产中的农药减施和安全生产提供技术保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的第一组引物单重PCR扩增电泳图，其中M：DNA Maker；1-16：以第一组特异性引物进行扩增；1-4：以SYSV引物分别在54、56、58、60℃四种退火温度下进行扩增；5-8：以SVX引物分别在54、56、58、60℃四种退火温度下进行扩增；9-12：以OYDV引物分别在54、56、58、60℃四种退火温度下进行扩增；13-16：以SLV引物分别在54、56、58、60℃四种退火温度下进行扩增；
图2为本发明实施例提供的第二组引物单重PCR扩增电泳图，其中M：DNA Maker；1-16：以第二组特异性引物进行扩增；1-4：以SYSV引物分别在54、56、58、60℃四种退火温度下进行扩增；5-8：以SVX引物分别在54、56、58、60℃四种退火温度下进行扩增；9-12：以OYDV引物分别在54、56、58、60℃四种退火温度下进行扩增；13-16：以SLV引物分别在54、56、58、60℃四种退火温度下进行扩增；
图3为本发明实施例提供的第三组引物单重PCR扩增电泳图，其中M：DNA Maker；1-12：以第三组特异性引物进行扩增；1-4：以Univ引物分别在54、56、58、60℃四种退火温度下进行扩增；5-8：以SVX引物分别在54、56、58、60℃四种退火温度下进行扩增；9-12：以SLV引物分别在54、56、58、60℃四种退火温度下进行扩增；
图4为本发明实施例提供的第一组引物多重PCR扩增电泳图，其中M：DNA Maker；阴：阴性对照；1-6：两重PCR扩增条带；1：以OYDV/SYSV引物进行扩增；2：以OYDV/Slv引物进行扩增；3：以OYDV/SVX引物组合进行扩增；4：以SYSV/Slv引物组合进行扩增；5：以SYSV/SVX引物组合进行扩增；6：以Slv/SVX引物组合进行扩增；7-10：三重PCR扩增条带；7：以OYDV/SYSV/Slv引物组合进行扩增；8：以OYDV/SYSV/SVX引物组合进行扩增；9：以OYDV/SLV/SVX引物组合进行扩增；10：以SYSV/SLV/SVX引物组合进行扩增；11：四重PCR扩增条带，以OYDV/SYSV/Slv/SVX引物组合进行扩增；
图5为本发明实施例提供的第二组引物多重PCR扩增电泳图，其中M：DNA Maker；1-6：两重PCR扩增条带；1：以OYDV/SYSV引物进行扩增；2：以OYDV/SLV引物进行扩增；3：以OYDV/SVX引物组合进行扩增；4：以SYSV/SLV引物组合进行扩增；5：以SYSV/SVX引物组合进行扩增；6：以SLV/SVX引物组合进行扩增；7-10：三重PCR扩增条带；7：以OYDV/SYSV/SVX引物组合进行扩增；8：以OYDV/SYSV/SLV引物组合进行扩增；9：以SYSV/SLV/SVX引物组合进行扩增；10：以OYDV/SLV/SVX引物组合进行扩增；11：四重PCR扩增条带，以OYDV/SYSV/SLV/SVX引物组合进行扩增；
图6为本发明实施例提供的第三组引物多重PCR扩增电泳图，其中M：DNA Maker；1-3：两重PCR扩增条带；1：以Univ/SVX引物进行扩增；2：以Univ/SLV引物进行扩增；3：以SLV/SVX引物组合进行扩增；4：以Univ/SVX/SLV三重PCR扩增条带；
图7为本发明实施例提供的第一组引物多重PCR退火温度优化扩增电泳图，其中M：DNA Maker；1-5：稀释引物SVX-8130s/SVX-8418a，SLV-7084s/SLV-8000a，SYSV9921s/SYSV10430a，OYDV9570s/OYDV10225a引物组合分别在50℃、52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃退火温度下进行扩增；阴：阴性对照；
图8为本发明实施例提供的第一组引物多重PCR四种引物比例优化扩增电泳图，其中M：DNA Maker；1-11：按照表4中各引物量添加PCR扩增体系产物电泳图；
图9为本发明实施例提供的多重PCR方法检测出分蘖洋葱扩增电泳图，其中M：DNAMaker；1-15：1-15号样品多重PCR鉴定结果。
具体实施方式
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
SLV、OYDV、SYSV和SVX四种病毒均为单链正义RNA，病毒粒子成弯曲的线条状，无包膜，螺旋对称结构，四种病毒通常复合侵染分蘖洋葱，使其质量和产量都收到巨大影响，造成重大的经济损失。由于这几种病毒粒子形态、细胞病理特征、症状及寄主范围相似，因此在病原鉴定中常发生混淆。基于此，本发明提供了一种用于检测葱属作物病毒的引物组，所述引物组包括用于检测SVX的引物对、用于检测SLV的引物对、用于检测SYSV的引物对和用于检测OYDV的引物对；
所述用于检测SVX的引物对包括SVX-8130s和SVX-8418a；
所述SVX-8130s包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述SVX-8418a包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测SLV的引物对包括Slv-7084s以及，Slv-8000a或Slv-7583a；
所述Slv-7084s包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述Slv-8000a包括如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述Slv-7583a包括如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测SYSV的引物对包括SYSV9921s和SYSV10430a，或者SYSV9993s和SYSV10177a，或者Univ10020s和Univ10225a；
所述SYSV9921s包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述SYSV10430a包括如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述SYSV9993s包括如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述SYSV10177a包括如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述Univ10020s包括如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述Univ10225a包括如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述用于检测OYDV的引物对包括OYDV9570s和OYDV10225a，或者OYDV9570s和OYDV10274a，或者Univ10020s和Univ10225a；
所述OYDV9570s包括如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述OYDV10225a包括如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；
所述OYDV10274a包括如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
本发明提供的用于检测葱属作物病毒的引物组，包括用于检测SVX的引物对、用于检测SLV的引物对、用于检测SYSV的引物对和用于检测OYDV的引物对。在同一个检测体系中加入本发明提供的引物组，能够实现对多种靶标基因的同时检测，并且显著提高了检测效率。同时，本发明提供的引物组特异性强、灵敏度高，且扩增能力稳定，能够简便、快速、准确地检测检测葱属作物中SVX、SLV、SYSV和OYDV病毒。
需要进行说明的是，本发明中的术语“同一性”指的是序列之间的相似性。“同一性”包括与本发明所述的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列具有至少80％(例如可以为，但不限于80％、82％、85％、88％、90％、92％、95％或者更高)同一性的核苷酸序列。
用于检测SLV的引物对包括Slv-7084s以及，Slv-8000a或Slv-7583a，例如用于检测SLV的引物对可以包括Slv-7084s和Slv-8000a，或者包括Slv-7084s和Slv-7583a。
Univ10020s和Univ10225a为用于检测SYSV和OYDV的通用引物对，能够同时检测SYSV和OYDV，根据扩增长度的不同即可判断检出病毒种类。
上述用于检测SVX、SLV、SYSV和OYDV病毒的引物对可以任意组合，本发明对组合方式不做限定，例如可以为SVX-8130s和SVX-8418a、Slv-7084s和Slv-8000a、SYSV9921s和SYSV10430a，以及OYDV9570s和OYDV10225a；或者为SVX-8130s和SVX-8418a、Slv-7084s和Slv-7583a、SYSV9993s和SYSV10177a，以及OYDV9570s和OYDV10274a；或者为SVX-8130s和SVX-8418a、Slv-7084s和Slv-8000a，以及Univ10020s和Univ10225a。根据本发明的试验研究结果，当选择SVX-8130s和SVX-8418a、Slv-7084s和Slv-8000a、SYSV9921s和SYSV10430a，以及OYDV9570s和OYDV10225a作为引物组时，结果条带更为清晰，检测效果更好。
在一些优选的实施方式中，所述SVX-8130s和SVX-8418a扩增产物的大小为250-300bp，例如可以为，但不限于250bp、260bp、270bp、280bp、290bp或300bp，优选为288bp；和/或，
所述Slv-7084s和Slv-8000a扩增产物的大小为900-950bp，例如可以为，但不限于900bp、910bp、920bp、930bp、940bp或950bp，优选为916bp；和/或，
所述Slv-7084s和Slv-7583a扩增产物的大小为450-550bp，例如可以为，但不限于450bp、460bp、470bp、480bp、490bp、500bp、510bp、520bp、530bp、540bp或550bp，优选为499bp；和/或，
所述SYSV9921s和SYSV10430a扩增产物的大小为450-550bp，例如可以为，但不限于450bp、460bp、470bp、480bp、490bp、500bp、510bp、520bp、530bp、540bp或550bp，优选为509bp；和/或，
所述SYSV9993s和SYSV10177a扩增产物的大小为150-200bp，例如可以为，但不限于150bp、160bp、170bp、180bp、190bp或200bp，优选为184bp；和/或，
所述OYDV9570s和OYDV10225a扩增产物的大小为600-700bp，例如可以为，但不限于600bp、620bp、650bp、680bp或700bp，优选为655bp；和/或，
所述OYDV9570s和OYDV10274a扩增产物的大小为250-300bp，例如可以为，但不限于250bp、260bp、270bp、280bp、290bp或300bp，优选为288bp；和/或，
所述Univ10020s和Univ10225a扩增产物的大小为150-250bp，例如可以为，但不限于150bp、180bp、200bp、220bp或250bp，优选为205bp。
通过对扩增产物的大小进行限定，能够进一步避免假阳性的检测结果，增强检测结果的准确性。当扩增引物的大小恰好为上述优选限定值时，说明检测结果最准确，结果可信度最高。
需要说明的是，本文中，“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生。
在一些优选的实施方式中，所述SVX-8130s和SVX-8418a的用量独立地为0.05-0.075μmol/μL，例如可以为，但不限于0.05μmol/μL、0.06μmol/μL、0.07μmol/μL或0.075μmol/μL，优选为0.075μmol/μL；
优选地，所述Slv-7084s和Slv-8000a的用量独立地为0.025-0.05μmol/μL，例如可以为，但不限于0.025μmol/μL、0.03μmol/μL、0.04μmol/μL或0.05μmol/μL，优选为0.025μmol/μL；
优选地，所述SYSV9921s和SYSV10430a的用量独立地为0.05-0.1μmol/μL，例如可以为，但不限于0.05μmol/μL、0.06μmol/μL、0.07μmol/μL、0.08μmol/μL、0.09μmol/μL或0.1μmol/μL，优选为0.0625μmol/μL；
优选地，所述OYDV9570s和OYDV10225a的用量独立地为0.05-0.075μmol/μL，例如可以为，但不限于0.05μmol/μL、0.06μmol/μL、0.07μmol/μL或0.075μmol/μL，优选为0.0625μmol/μL。
不同比例的引物用量扩增的结果有所不同，引物用量较低时，会出现目标条带未被扩增的现象。而当引物用量过高时，会导致单一目标条带过于明亮且弥散。本实施方式通过对引物用量进行优化，使得应用上述用量检测病毒的结果准确，用时较短，可用于葱属作物病株的鉴定。
本发明还提供了一种用于检测葱属作物病毒的试剂，所述试剂包括上述的引物组。
本发明还提供了一种用于检测葱属作物病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组或试剂。
基于本发明提供的引物组相同的发明构思，本发明还提供了试剂或试剂盒，因此，本发明提供的试剂或试剂盒具有与本发明提供的引物组全部的有益效果，在此不再赘述。
本发明还提供了上述的引物组、试剂或试剂盒在检测葱属作物中SVX、SLV、SYSV和OYDV中的应用。
另外，本发明还提供了检测葱属作物病毒的方法，以葱属作物待测样本的基因组cDNA为模板，应用上述的引物组、试剂或试剂盒进行多重PCR扩增，根据扩增产物中特异性DNA片段的长度，判断葱属作物中病毒的感染情况。
本发明提供的检测葱属作物病毒的方法，利用多重PCR同时进行多个病毒的鉴定，既高效又准确，且节约资本。并且，该方法还具有操作方便，工艺简单，临床应用范围广等优点，能够为分蘖洋葱组培脱毒奠定基础，为分蘖洋葱生产中的农药减施和安全生产提供技术保障。
在一些优选的实施方式中，所述多重PCR的退火温度为50-62℃，例如可以为，但不限于50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃或62℃，优选为58℃。
退火温度是影响PCR特异性的较重要因素，本实施方式通过对退火温度的进一步优化，能够使得应用本发明提供的多重PCR方法进行葱属作物病毒的检测时，特异性更强，检测结果更加准确。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：
实验所用分蘖洋葱植株为实验室种植；
Primix TaqTM、1st strand cDNA Syn-thesis Kit反转录试剂盒购自TAKARA公司。
实施例1引物的设计及合成
根据GeneBank中收录的SVX、SLV、SYSV和OYDV基因序列，分别设计病毒特异性引物(见表1、表2和表3)。引物由吉林省库美生物科技有限公司合成。
表1第一组病毒特异性引物
Figure BDA0002424141700000151
表2第二组病毒特异性引物
Figure BDA0002424141700000152
表3第三组病毒特异性引物
Figure BDA0002424141700000153
实施例2引物筛选及扩增体系的优化
取感病的分蘖洋葱植株叶片于液氮中充分研磨，以TRIzol法提取叶片的总RNA，所得产物为模板，用1st strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂以SLV、OYDV、SYSV、SVX四种病毒引物混合物合成cDNA第一条链。以反转录合成cDNA为模板，利用上述三组特异性引物，分别进行两重、三重、四重PCR扩增，其中第三组Univ引物为OYDV、SYSV通用引物。
PCR反应体系：Primix TaqTM 10μL，上游引物、下游引物各0.5μL(10μM)，模板DNA1μL，ddH2O补充体积至20μL。反应程序为：94.0℃预变性10min；94.0℃变性10s；设置54、56、58、60四个退火温度；72.0℃延伸1min，25个循环；最后72.0℃延伸10min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
根据电泳结果筛选最优引物组合，选取最适引物进行多重PCR检测体系的建立及优化。
1、引物的筛选
以感病分蘖洋葱总RNA为模板，分别以第一组、第二组、第三组引物进行RT-PCR检测，RT-PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析(图1、2、3)，三组引物均能在四种退火温度下从发病样品中扩增出特异性条带。
以合成的cDNA为模板，将三组引物组合分别进行两重、三重以及四重RT-PCR检测体系，产物经2％琼脂糖凝胶电泳分析(图4、5、6)；综合三组引物扩增效果，选择第一组引物建立多重PCR检测方法，并优化引物用量及退火温度。
2、扩增体系的优化
多重PCR扩增结果受dNTP浓度、引物、Mg2+浓度、Taq聚合酶、扩增条件等诸多因素影响，针对退火温度及引物添加量的优化结果如图7和图8。
为确定多重PCR反应体系的最佳引物配比方式及退火温度，首先表1中的四种引物以相等分量设置50、52、54、56、58、60、62℃六个退火温度扩增，选择最佳退火温度。结果显示(图7)，六种退火温度均能扩增出四条目的条带，选择58℃退火温度下进行引物比例优化。
设置体系中引物用量(表4)，以反转录所得cDNA为模板优化多重PCR扩增引物条件，以能扩增出均一、清晰、特异性良好的条带为标准，建立多重PCR检测方法。
表4引物添加量及组合体系
Figure BDA0002424141700000171
按照表4引物用量，在20μL体系中分别加入所示引物的物质的量，以SVX-8130s/SVX-8418a：1.5μmol；SLV-7084s/SLV-8000a:0.5μmol；SYSV9921s/SYSV10430a：1.25μmol；OYDV9570s/OYDV10225a：1.25μmol用量进行的多重PCR目的条带均匀且信号强，以此条件建立多重PCR检测体系。
实施例3多重PCR检测方法的应用
利用建立的多重PCR方法对15份分蘖洋葱样品进行检测，结果显示(图9)，其中同时携带SLV、OYDV的样品有13份，仅携带OYDV的有1份，仅携带SLV的有1份；样品中未检测出携带有SVX、SYSV的样品。
由此可以说明，应用本发明提供的引物组及扩增体系，能够准确、有效地检测出分蘖洋葱中病毒的复合感染情况。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林省农业科学院
吉林省锦瀛麻业生物科技有限公司
<120> 用于检测葱属作物病毒的引物组、试剂、试剂盒、应用和检测葱属作物病毒
的方法
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacaacagaa gaaacctcct gc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aratcgtggg gatgcatcag aa 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttggttcact ttaggtttac agc 23
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gyttgatcaa catcgattct c 21
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgccggctgt agtgcaatac at 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
agtgacgcag ctgaagcgta cat 23
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gtctccctaa caaaacgtac aacac 25
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgaaacttaa gagaatacag c 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tgtcgttctg tgttctcatc atc 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcagctgaag crtacattga ata 23
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gttaccatcc argccaaaca 20
<210> 12
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gatgcagcag cacaatcaag cac 23
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gttaccatcc aggccaaaca 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gtatgtcttt ccgtgtcctc t 21

Claims (9)

1.一种用于检测葱属作物病毒的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于检测SVX的引物对、用于检测SLV的引物对、用于检测SYSV的引物对和用于检测OYDV的引物对；
所述用于检测SVX的引物对包括SVX-8130s和SVX-8418a；
所述SVX-8130s如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
所述SVX-8418a如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述用于检测SLV的引物对包括Slv-7084s和Slv-8000a，或者Slv-7084s和Slv-7583a；
所述Slv-7084s如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述Slv-8000a如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
所述Slv-7583a如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
所述用于检测SYSV的引物对包括SYSV9921s和SYSV10430a，或者SYSV9993s和SYSV10177a，或者Univ10020s和Univ10225a；
所述SYSV9921s如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
所述SYSV10430a如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；
所述SYSV9993s如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
所述SYSV10177a如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；
所述Univ10020s如SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
所述Univ10225a如SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列；
所述用于检测OYDV的引物对包括OYDV9570s和OYDV10225a，或者OYDV9570s和OYDV10274a，或者Univ10020s和Univ10225a；
所述OYDV9570s如SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列；
所述OYDV10225a如SEQ ID NO.13所示的核苷酸序列；
所述OYDV10274a如SEQ ID NO.14所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述用于检测SLV的引物对包括Slv-7084s和Slv-8000a；
所述用于检测SYSV的引物对包括SYSV9921s和SYSV10430a；
所述用于检测OYDV的引物对包括OYDV9570s和OYDV10225a。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，葱属作物包括分蘖洋葱或大蒜。
4.一种用于检测葱属作物病毒的试剂，其特征在于，所述试剂包括权利要求1-3任一项所述的引物组。
5.一种用于检测葱属作物病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3任一项所述的引物组，或权利要求4所述的试剂。
6.如权利要求1-3任一项所述的引物组，或权利要求4所述的试剂，或权利要求5所述的试剂盒在检测葱属作物中SVX、SLV、SYSV和OYDV中的应用。
7.一种检测葱属作物病毒的方法，其特征在于，以葱属作物待测样本的基因组cDNA为模板，应用权利要求1-3任一项所述的引物组、或权利要求4所述的试剂、或权利要求5所述的试剂盒进行多重PCR扩增，根据扩增产物中特异性DNA片段的长度，判断葱属作物中病毒的感染情况。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述多重PCR的退火温度为50-62℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多重PCR的退火温度为58℃。
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