CN102703402B

CN102703402B - 来自辣椒疫霉菌的阿魏酸酯酶pcfae1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102703402B
Application number: CN 201210164121
Authority: CN
Inventors: 张修国
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2012-05-24
Filing date: 2012-05-24
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2032-05-24
Also published as: CN102703402A

Abstract

本发明公开了来自辣椒疫霉菌的阿魏酸酯酶PCFAE1及其编码基因与应用。本发明所提供的阿魏酸酯酶PCFAE1，是如下a）或b）或c）的蛋白质：a）由序列表中序列2第20-601位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c）将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第20-601位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与辣椒疫霉菌致病性相关的由a）衍生的蛋白质。本发明为进一步研制辣椒疫霉病菌分子检测技术、辣椒疫霉菌所导致的多种植物病害的防治与研究提供了技术基础。

Description

来自辣椒疫霉菌的阿魏酸酯酶PCFAE1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种阿魏酸酯酶及其编码基因与应用，特别涉及来自辣椒疫霉菌的阿魏酸酯酶PCFAE1及其编码基因与应用。

背景技术

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）属真菌门、鞭毛菌亚门、卵菌纲、霜霉目。辣椒疫霉菌是一种寄主范围广的致病菌，除侵染辣椒外，还侵染其它作物。周启明等报道侵染9科21种栽培植物和杂草；任光驰等试验结果认为该菌可危害茄子、黄瓜、番茄、豇豆、菜豆、白菜、甘蓝、萝卜、胡萝卜、桃、杏、苹果等。对葱、蒜侵染力弱，对柑桔及马铃薯茎、叶不侵染。对辣椒的致病力最强。

辣椒疫病是由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leonian）所引起的一种土传病害，可经雨水、土壤、气流等多种途径传播，除了引起大面积死秧外，还可造成叶片枯萎、果实腐烂、茎杆出现坏死斑，以及萎蔫死亡等多种症状。中国首次于20世纪40年代在江苏报道此病的发生，此后陆续有相关报道,且表现为逐年加重的趋势。80年代以来，辣椒疫病在全国各地普遍发生，新疆、北京、黑龙江、贵州、上海、青海、云南、陕西、甘肃、广东以及长江流域尤为严重。辣椒疫病是辣椒栽培及生产上一种世界性分布较广的毁灭性病害，该病发病周期短，流行速度快，给生产上带来严重的经济损失。深入开展辣椒疫霉菌致病基因的分离及鉴定对辣椒疫霉菌所导致的多种植物病害的防治与研究具有重要的实践意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种阿魏酸酯酶。

本发明所提供的阿魏酸酯酶，名称为PCFAE1，来源于辣椒疫霉菌（Phytophthoracapsici)SD33，是如下a）或b）或c）的蛋白质：

a）由序列表中序列2第20-601位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c）将序列表中序列2所示的氨基酸序列或序列2第20-601位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与辣椒疫霉菌致病性相关的由a）衍生的蛋白质。

其中，序列表中序列2由601个氨基酸残基组成，第1-19位氨基酸组成信号肽。a）所述的蛋白质是阿魏酸酯酶的成熟蛋白，b）所述的蛋白质是阿魏酸酯酶的前体蛋白。

为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的PCFAE1可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的PCFAE1的编码基因可通过将序列表中序列1自5′端第1至1806位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码阿魏酸酯酶PCFAE1的核酸分子也属于本发明的保护范围。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述核酸分子具体可为如下1）或2）或3）所示的基因：

1）其编码序列是序列表中序列1的第58-1806位核苷酸的DNA分子；

2）其编码序列是序列表中序列1的第1-1806位核苷酸的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列表中的序列1由1806个核苷酸组成，编码序列表中序列2所示的蛋白质。

下述1）-4）中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：

1）含有编码阿魏酸酯酶PCFAE1的核酸分子的表达盒；

2）含有编码阿魏酸酯酶PCFAE1的核酸分子的重组表达载体；

3）含有编码阿魏酸酯酶PCFAE1的核酸分子的重组微生物；

4）含有编码阿魏酸酯酶PCFAE1的核酸分子的转基因细胞系。

上述生物材料中，1）所述的含有编码阿魏酸酯酶PCFAE1的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达阿魏酸酯酶PCFAE1的DNA，该DNA不但可包括启动阿魏酸酯酶PCFAE1基因转录的启动子，还可包括终止阿魏酸酯酶PCFAE1转录的终止子。进一步，所述含有阿魏酸酯酶PCFAE1表达盒还可包括增强子序列。2）所述的含有编码阿魏酸酯酶PCFAE1的核酸分子的重组表达载体具体可为在载体pGR106的多克隆位点插入阿魏酸酯酶PCFAE1编码基因得到的重组表达载体。3）所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。4）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。

本发明的又一个目的是提供一种制备阿魏酸酯酶PCFAE1的方法。

本发明所提供的制备阿魏酸酯酶PCFAE1的方法，包括将阿魏酸酯酶PCFAE1编码基因在生物细胞中进行表达得到阿魏酸酯酶的步骤；所述生物细胞可为微生物细胞、植物细胞或非人动物细胞。

本发明的再一个目的是提供一种制备表达阿魏酸酯酶PCFAE1的重组微生物的方法。

本发明所提供的制备表达阿魏酸酯酶PCFAE1的重组微生物的方法，包括将阿魏酸酯酶PCFAE1的编码基因导入宿主微生物细胞，得到表达阿魏酸酯酶PCFAE1的重组微生物的步骤。

其中，所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。

扩增编码阿魏酸酯酶PCFAE1的核酸分子全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

阿魏酸酯酶PCFAE1在作为阿魏酸酯酶中的应用，以及编码阿魏酸酯酶PCFAE1的核酸分子或含有编码阿魏酸酯酶PCFAE1的核酸分子的生物材料在制备阿魏酸酯酶中的应用也属于本发明的保护范围。

阿魏酸酯酶PCFAE1在调控辣椒疫霉菌致病性中的应用也属于本发明的保护范围。其中，所述调控辣椒疫霉菌致病性包括如下步骤：调控阿魏酸酯酶PCFAE1的表达，或调控阿魏酸酯酶PCFAE1的编码基因的转录。所述调控阿魏酸酯酶PCFAE1的表达具体可为提高阿魏酸酯酶PCFAE1的表达水平以提高辣椒疫霉菌致病性，或降低阿魏酸酯酶PCFAE1的表达水平以降低辣椒疫霉菌致病性。

如下以阿魏酸酯酶PCFAE1或其编码基因为靶点的鉴定辣椒疫霉菌杀菌剂的方法也属于本发明的保护范围。

该鉴定辣椒疫霉菌杀菌剂的方法，包括如下a）-e）中的任一步骤：

a）鉴定所述待检测物质是否抑制阿魏酸酯酶PCFAE1的表达，如所述待测物质能抑制阿魏酸酯酶PCFAE1的表达，则所述待测物质为候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制权阿魏酸酯酶PCFAE1的表达，则所述待测物质为非候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；

b）鉴定所述待检测物质是否降低阿魏酸酯酶PCFAE1的表达水平，如所述待测物质能降低阿魏酸酯酶PCFAE1的表达水平，则所述待测物质为候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；如所述待测物质不能降低阿魏酸酯酶PCFAE1的表达水平，则所述待测物质为非候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；

c）鉴定所述待检测物质是否抑制阿魏酸酯酶PCFAE1的编码基因的转录，如所述待测物质能抑制阿魏酸酯酶PCFAE1的编码基因的转录，则所述待测物质为候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；如所述待测物质不能抑制阿魏酸酯酶PCFAE1的编码基因的转录，则所述待测物质为非候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；

d）鉴定所述待检测物质是否降低阿魏酸酯酶PCFAE1的编码基因的转录水平，如所述待测物质能降低阿魏酸酯酶PCFAE1的编码基因的转录水平，则所述待测物质为候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；如所述待测物质不能降低阿魏酸酯酶PCFAE1的编码基因的转录水平，则所述待测物质为非候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；

e）鉴定所述待检测物质是否使阿魏酸酯酶PCFAE1失活，如所述待测物质能使阿魏酸酯酶PCFAE1失活，则所述待测物质为候选的辣椒疫霉菌杀菌剂；如所述待测物质不能使阿魏酸酯酶PCFAE1失活，则所述待测物质为非候选的辣椒疫霉菌杀菌剂。

具有如下1）-5）中至少一种功能的物质在制备辣椒疫霉菌杀菌剂中的应用也属于本发明的保护范围：

1）抑制阿魏酸酯酶PCFAE1的表达；

2）抑制阿魏酸酯酶PCFAE1的编码基因的转录；

3）降低阿魏酸酯酶PCFAE1的表达水平；

4）降低阿魏酸酯酶PCFAE1的编码基因的转录水平；

5）使阿魏酸酯酶PCFAE1失活。

实验证明，阿魏酸酯酶PCFAE1基因有效的参与了辣椒疫霉菌侵染寄主及导致辣椒疫病病程发生的过程，是辣椒疫霉菌的一个重要致病基因，本发明为进一步研制辣椒疫霉病菌分子检测技术、辣椒疫霉菌所导致的多种植物病害的防治与研究提供了技术基础。

附图说明

图1为PCFAE1在辣椒叶片中瞬时表达照片。

图中，A：重组农杆菌pGR106-PCFAE1/GV3101；B：重组农杆菌pGR106/GV3101；C：双蒸水。

图2为PCFAE1在烟草叶片中瞬时表达照片。

图3为pHAM34-antiPCFAE1转化子中PCFAE1的相对表达量。

图中，A为pHAM34-antiPCFAE1转化子,B为SD33，C为pHAM34转化子。

图4为pHAM34-PCFAE1转化子中PCFAE1的相对表达量。

图中，A为pHAM34-PCFAE1转化子,B为SD33，C为pHAM34转化子。

图5为pHAM34-antiPCFAE1转化子对辣椒叶片的致病效果。

图中，A为pHAM34-antiPCFAE1转化子;B为SD33;C为pHAM34转化子;D为无菌水。

图6为pHAM34-PCFAE1转化子对辣椒叶片的致病效果。

图中，A为pHAM34-PCFAE1转化子;B为SD33;C为pHAM34转化子;D为无菌水。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、阿魏酸酯酶PCFAE1基因的克隆及PCFAE1的致病性

1.PCFAE1基因克隆

设计克隆辣椒疫霉阿魏酸酯酶PCFAE1基因的引物：

2946-FP:ATGAAGTTGCTCCGAGGTGTC；2946-RP:CTATGCCTTTGTTGGCGCG。

以辣椒疫霉菌株SD33（山东农业大学）（J.Phytopathol 157:585-591,2009)基因组DNA作为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增产物回收后分别与pGEM-T Easy Vector（Promega）连接，并转化大肠杆菌DH5α，通过蓝白斑筛选、质粒DNA的酶切鉴定筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒进行测序，测序结果表明，该PCR产物的核苷酸序列是序列表中的序列1，编码序列表中序列2的蛋白质辣椒疫霉阿魏酸酯酶PCFAE1。其中，序列表中序列1由1806个脱氧核苷酸组成，序列表中序列2由601个氨基酸残基组成。

2．辣椒疫霉阿魏酸酯酶PCFAE1的致病性

2.1辣椒疫霉阿魏酸酯酶PCFAE1基因瞬时表达致病性

2.1.1辣椒疫霉阿魏酸酯酶PCFAE1瞬时表达载体构建

为将克隆的PCFAE1基因在农杆菌中瞬时表达，根据PVX载体pGR106，选择NotⅠ和SalⅠ两个酶切位点，将PCFAE1的成熟蛋白编码序列（扩增的序列是序列1的第58-1806位，）连入载体pGR106（序列表中的序列4）。

构建PVX载体所需引物序列为：

P-2946-FP:ATAAGAATGCGGCCGCCTTAACTTCGAGACCGAC；P-2946-RP:ACGCGTCGACCTATGCCTTTGTTGGCGC。其中，带下划线的碱基为限制性内切酶的识别位点。

以辣椒疫霉菌株SD33基因组DNA作为模板，用上述引物进行PCR扩增，用NotⅠ和SalⅠ双酶切PCR产物，然后将其插入pGR106的NotⅠ和SalⅠ位点间，将经过测序验证在pGR106的NotⅠ和SalⅠ位点间插入序列1的第58-1806位核苷酸的重组载体命名为pGR106-PCFAE1。利用冻融法将pGR106-PCFAE1转入根癌农杆菌GV3101得到重组农杆菌pGR106-PCFAE1/GV3101。同时按照相同方法将pGR106转入根癌农杆菌GV3101得到重组农杆菌pGR106/GV3101作为空载体对照菌株。

2.1.2转化烟草和辣椒

将重组农杆菌pGR106-PCFAE1/GV3101和重组农杆菌pGR106/GV3101分别在液体培养基(向LB液体培养基中添加卡那霉素和利福平至二者的终浓度均为50mg/ml得到的培养基)，28℃下，200rpm震荡培养24h;然后离心收集菌体在等体积MMA(10mmol/L MgCl₂、10mmol/L MES（2-N-吗啉基乙磺酸）和100mmol/L AS（乙酰丁香酮）中继续诱导培养3h。诱导后的菌体接种5-6叶期的中椒6号辣椒苗和本生烟草幼苗，用无针头5ml无菌注射器将重组农杆菌pGR106-PCFAE1/GV3101和重组农杆菌pGR106/GV3101悬浮液分别压入叶片中，接种除子叶外的所有叶片。以双蒸水（ddH₂O）处理作为对照。每个处理重复3次，接种后植物在培养箱中(22℃,75%空气湿度，黑暗)培养2天，转入人工气候室培养，接种后每天观察记录症状变化。

结果表明重组农杆菌pGR106-PCFAE1/GV3101在辣椒体内瞬时表达，在第3天接种叶片开始出现变化，重组农杆菌pGR106-PCFAE1/GV3101接种的辣椒叶片接种部位开始出现黄化，这些黄化部分逐渐加重，在第15天形成点状褐色坏死斑点；随着时间变化这些叶片褐色斑点逐渐变大连片，叶片颜色由鲜绿色变得黑暗无光，直至最后逐渐脱落。作为阴性对照的双蒸水和重组农杆菌pGR106/GV3101接种叶片直到观察期结束接种部位稍有发黄，但叶片生长没有受到影响（图1）。说明PCFAE1基因具有致病性。

重组农杆菌pGR106-PCFAE1/GV3101在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片体内瞬时表达症状出现较晚，在接种7天以后出现变色褪绿现象。随时间变化，接种部位叶片组织颜色褪绿，叶片稍有皱缩，后期叶片接种面变得透明，严重时产生坏死。作为阴性对照的ddH₂O和重组农杆菌pGR106/GV3101接种叶片稍有症状，未影响叶片生长（图2）。说明PCFAE1基因具有致病性。

2.2辣椒疫霉阿魏酸酯酶PCFAE1基因稳定过量表达和沉默表达的致病性

2.2.1PCFAE1稳定过表达载体和沉默表达载体构建

根据沉默载体pHAM34（序列表中的序列3），选择KpnⅠ酶切位点设计引物：S-2946-FP:GGGGTACCATGAAGTTGCTCCGAGGTGTC；S-2946-RP:GGGGTACCCTATGCCTTTGTTGGCGC。其中，带下划线的碱基为限制性内切酶的识别位点。

以辣椒疫霉菌株SD33基因组DNA作为模板，用上述引物进行PCR扩增，用KpnⅠ酶切PCR产物，然后与KpnⅠ酶切的pHAM34连接，将连接产物克隆至大肠杆菌JM109感受态细胞。经菌落PCR及酶切验证后送公司测序，将经过测序验证在pHAM34的KpnⅠ位点插入序列1的第1-1806位所示DNA片段的重组载体命名为pHAM34-PCFAE1（过表达载体）；将经过测序验证在pHAM34的KpnⅠ位点插入序列1的第1-1806位的反向互补序列所示DNA片段的重组载体命名为pHAM34-antiPCFAE1（沉默转化载体）。

2.2.2转化辣椒疫霉菌制备过表达转化子和沉默转化子

将pHAM34-antiPCFAE1和辅助质粒pHspNpt（山东农业大学）（Yonglin Wang,Daolong Dou,Xiaoli Wang,Aining Li,Yuting Sheng,Chenlei Hua,Binyan Cheng,Xiaoren Chen,Xiaobo Zheng,Yuanchao Wang.The PsCZF1 gene encoding a C2H2 zincfinger protein is required for growth,development and pathogenesis inPhytophthora sojae.Microbial Pathogenesis.2009,47:78–86）转化辣椒疫霉菌株SD33，将pHAM34-PCFAE1和辅助质粒pHspNpt转化辣椒疫霉菌株SD33，同时以pHAM34和辅助质粒pHspNpt转化辣椒疫霉菌株SD33作为对照，挑取转化子，放在含有G418抗性的V8蔬菜汁培养基中再次筛选培养。将生长出的转化子转入液体V8蔬菜汁培养基中28℃静置培养3天，得到转入pHAM34-antiPCFAE1的重组辣椒疫霉菌（命名为pHAM34-antiPCFAE1/SD33）、转入pHAM34-PCFAE1的重组辣椒疫霉菌（命名为pHAM34-PCFAE1/SD33）和转入pHAM34的重组辣椒疫霉菌（命名为pHAM34/SD33），收集菌丝，提取转化子RNA。反转录后，进行荧光定量PCR分子验证。

PCR反应使用引物为：

PCFAE1基因引物：2946 qRT-FP：ATGAGGACGGGAACAGAGTGATTG；2946 qRT-RP：ACTTACAGAGCCTTGGGTCGGAC。

actin基因引物：Actin-FP：ACTGCACGTTCCAGACGATC；Actin-RP：CCACCACCTTGATCTTCATG。

荧光定量PCR反应体系：2.5×SuperRealPreMix 12.5μL，正向引物（10μM）0.75μL，反向引物（10μM）0.75μL，cDNA模板2.5μL，RNase-free dd H₂O至25μL。

荧光定量PCR反应条件：95℃变性10sec，59℃退火20sec，68℃延伸30sec，共进行45个循环，最后65-95℃制备溶解曲线。

以辣椒疫霉β-actin基因为内参，每个样品做三个重复，用2^-ΔΔCt法对样本基因进行表达差异相对定量分析。△△Ct=(C_T target–C_T actin)_待测样本–(C_T target–C_T actin)_校准样本，在本研究中选择每个基因在野生型SD33中的表达为校准样本，pHAM34转化子（pHAM34/SD33）、pHAM34-antiPCFAE1转化子（pHAM34-antiPCFAE1/SD33）和pHAM34-PCFAE1转化子（pHAM34-PCFAE1/SD33）分别为待测样本。

结果表明，pHAM34-antiPCFAE1转化子中，PCFAE1的表达量是野生型SD33的0.22倍；pHAM34-PCFAE1转化子中，PCFAE1的表达量是野生型SD33的16.20倍；pHAM34转化子中，PCFAE1的表达量与野生型SD33的相同（图3和图4）。

2.2.3辣椒疫霉PCFAE1基因过表达转化子和沉默转化子的生物学性状分析

对得到的过表达转化子和沉默转化子进行生物学性状分析，包括致病性，孢子囊形态及数量，游动孢子产量，菌株的生长速率变化等。

(1)菌落形态观察及生长速率测定：将辣椒疫霉野生型菌株SD33，重组辣椒疫霉菌pHAM34/SD33、重组辣椒疫霉菌pHAM34-PCFAE1/SD33以及重组辣椒疫霉菌pHAM34-antiPCFAE1/SD33分别用打孔器取0.5mm大小的菌块于10%V8蔬菜汁培养基上培养，连续转接两次，然后再将上述菌株的同样大小菌丝块接到10%V8蔬菜汁固体平板上待第四天测量菌落半径。每次实验每个菌株三次重复，共3次重复实验，然后求其平均值计算菌丝生长速率。

(2)菌丝及孢子囊测定：辣椒疫霉野生型菌株SD33，重组辣椒疫霉菌pHAM34/SD33、重组辣椒疫霉菌pHAM34-PCFAE1/SD33以及重组辣椒疫霉菌pHAM34-antiPCFAE1/SD33分别在10%V8蔬菜汁培养基上，28℃培养5-7d，挑取菌丝于载玻片上，孢子囊产量、孢子萌发以及菌丝形态观察。同时将诱导的游动孢子在显微镜下观察形态并做记录。

(3)游动孢子的获得和萌发：将辣椒疫霉野生型菌株SD33，重组辣椒疫霉菌pHAM34/SD33、重组辣椒疫霉菌pHAM34-PCFAE1/SD33以及重组辣椒疫霉菌pHAM34-antiPCFAE1/SD33分别在10%V8蔬菜汁液体培养基中培养三天，然后再用20ml灭菌水冲洗刺激产生孢子囊，再冷刺激产生游动孢子。吸取2μl培养皿中的液体在显微镜下镜检游动孢子的数目。将游动孢子液蜗旋振荡30s，与等体积灭菌水混合。吸取50μl滴于载玻片上25℃保湿培养2h，观察休止孢的萌发情况，计算萌发的休止孢占休止孢和萌发休止孢总和的比率。在显微镜下测量萌发后形成芽管的长度。所有实验每个菌株三次重复，然后求其平均值。

实验结果表明PCFAE1对菌落形态、菌丝生长速率、孢子囊形态及数量、游动孢子产量和休止孢的萌发率等这些生物学性状没有产生影响。由于PCFAE1在寄主病原互作阶段表达变化显著，这可能暗示着该基因在侵染发过程中发挥着重要作用。游动孢子在10%的V8液体培养基中25℃孵育，静止2小时后，辣椒疫霉野生型菌株SD33，重组辣椒疫霉菌pHAM34/SD33萌发率在45.7%-57.2%之间，而重组辣椒疫霉菌pHAM34-antiPCFAE1/SD33和重组辣椒疫霉菌pHAM34-PCFAE1/SD33休止孢的平均萌发率分别为46.6%、52.4%。

2.2.5.3致病性测定

2.2.5.3.1游动孢子诱导

(1)将辣椒疫霉野生型菌株SD33，重组辣椒疫霉菌pHAM34/SD33、重组辣椒疫霉菌pHAM34-PCFAE1/SD33以及重组辣椒疫霉菌pHAM34-antiPCFAE1/SD33分别转移到10%V8蔬菜汁培养基上培养4天，从菌落边缘挑取菌丝块移至新的10%V8蔬菜汁培养基上继续培养4天备用；

(2)挑取菌落边缘菌丝块至10%V8蔬菜汁培养基上培养，25℃黑暗培养5-6天；

(3)加入灭菌水（以刚好浸没菌丝为宜），每隔1天换水直到产生游动孢子；收集游动孢子调节游动孢子浓度至1×10⁵个/ml，得到的游动孢子悬浮液可用于致病性分析。

2.2.5.3.2测定对辣椒的致病性

将诱导的重组辣椒疫霉菌pHAM34-antiPCFAE1/SD33和重组辣椒疫霉菌pHAM34-PCFAE1/SD33游动孢子分别接种培育的中椒6号（5-6叶期）叶片。游动孢子浓度调节至1×10⁵个/ml。首先将选取叶片消毒：70%乙醇处理30s,0.1%升汞处理7min,在灭菌水中冲洗3次，晾干备用。晾干后将叶片平铺在事先准备的水琼脂平板上，每个平板放3片，每个叶片接种2μl游动孢子悬浮液。每个样品接12个叶片。用辣椒疫霉野生型菌株SD33游动孢子悬浮液，重组辣椒疫霉菌pHAM34/SD33游动孢子悬浮液和无菌水接种作为对照。做3次重复实验。每天观察症状，拍照记录。

PCFAE1沉默转化子接种后1-7天的结果表明：接种辣椒疫霉野生型菌株SD33游动孢子（图5中B）的叶片很快（接种后第2天）在接种位点出现坏死腐烂斑，并且病斑有扩大趋势；接种重组辣椒疫霉菌pHAM34/SD33游动孢子（图5中C）的叶片出现相同症状；无菌水接种的辣椒叶片没有出现病斑（图5中D）；而用PCFAE1基因沉默转化子pHAM34-antiPCFAE1/SD33游动孢子（图5中A）处理后的叶片在接种后第3天在接种位点出现坏死腐烂斑，强度减弱（病斑颜色比对照浅，面积比对照小），发病面积小于接种辣椒疫霉野生型菌株SD33叶片，发病面积是接种辣椒疫霉野生型菌株SD33叶片的2/3。

PCFAE1过量表达转化子接种后1-7天的结果表明：接种野生型游动孢子（图6中B）的叶片很快（接种后第2天）在接种位点出现坏死腐烂斑，并且病斑又有扩大趋势；接种重组辣椒疫霉菌pHAM34/SD33游动孢子（图6中C）的叶片出现相同症状；无菌水接种的辣椒叶片没有出现病斑（图6中D）；而用重组辣椒疫霉菌pHAM34-PCFAE1/SD33游动孢子（图6中A）处理后的叶片出现症状的时间提前，在接种后第1天在接种位点出现坏死腐烂斑，强度增大，发病面积比对照叶片侵染面积增大，发病面积是接种辣椒疫霉野生型菌株SD33叶片的4/3倍。

上述实验说明PCFAE1基因参与了辣椒疫霉菌侵染寄主及导致辣椒疫病病程发生的过程，是重要的致病因子。