CN108152383A - 一种野生冬虫夏草产品的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明所要解决的技术问题是提供一种野生冬虫夏草的鉴别方法。本发明建立在冬虫夏草中砷及砷形态日常检测的基础上，直接将不同砷形态的相对丰度应用于冬虫夏草的掺伪鉴别。本发明提供了一种野生冬虫夏草的鉴别方法，包括以下步骤：a、不同砷形态标准溶液的配制及标准曲线绘制；b、冬虫夏草中不同砷形态相对丰度的测定；c、被测样品中不同砷形态相对丰度与步骤b中测得的不同砷形态的相对丰度对比。本发明在对冬虫夏草中有害物质(砷)超标情况检测的同时，还能进行掺伪鉴别，省时省力，成本低。

Description

一种野生冬虫夏草产品的鉴别方法

技术领域

本申请涉及一种产品鉴别方法，特别是一种用于鉴别野生冬虫夏草产品的方法。

背景技术

冬虫夏草为麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草菌的子座及其寄主蝙蝠蛾科昆虫虫草蝙蝠蛾的幼虫尸体的复合物，为我国名贵中药材。主产于西藏、青海、四川、云南等海拔一的高山草甸土中，系我国传统的珍惜名贵药材和滋补品。冬虫夏草中含有的化学成分有甾醇类、核苷类、多糖类、甘露醇、氨基酸等功效成分。具有调节免疫、调节内分泌、抗肿瘤、抗疲劳、降血糖、抗菌等多种功效。由于其生活史复杂、对生长环境要求苛刻，加上盲目的开采，野生冬虫夏草资源严重萎缩，这一系列因素导致其价格飙升，也导致了市场上伪品的泛滥。因此冬虫夏草掺伪研究及质量控制已经越来越受人关注。

目前，用于掺伪鉴别的检测方法是主要分为四类：(1)性状鉴别：比如从外观形态、颜色质地、气味等方式，建立在冬虫夏草主要成分的检测；(2)显微鉴别：通过显微镜观察其显微特征，包括体壁细胞表面、体壁细胞侧面、短刚毛等特征；(3)理化鉴别：理化鉴别相对而言能更准确、直观地得出鉴别结果，分辨能力较强。化学研究表明冬虫夏草中含核苷类、多醇类、多糖，另外还含有机酸、维生素、无机元素及其它化合物，基于这些化合物的组成，现在应用于冬虫夏草的理化鉴别方法主要有：紫外吸收光谱、薄层色谱、高效液相色谱(或联用质谱)、近红外光谱等；(4)分子鉴别：目前运用较广的是基于ITS序列的同源性对冬虫夏草进行掺伪鉴别。

然而，随着现代科学技术的发展，性状鉴别和显微鉴别这两类鉴别方法已经不能满足冬虫夏草与其混淆品的鉴别，特别是对一些已经加工成胶囊或片剂的冬虫夏草制品，这两种基于形态学的鉴别方法已经完全不能适用。而理化鉴别和分子鉴别都需要对待测冬虫夏草进行专项检测，因此，需要耗额外的人力物力。

自2016年初，冬虫夏草被爆出砷含量超标事件，因此目前各大检测机构加强了冬虫夏草的砷及砷形态的检测。本发明建立在冬虫夏草中砷及砷形态日常检测的基础上，惊奇地发现，砷形态的相对丰度被用作标记来区分掺假的野生冬虫夏草。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种用于鉴别野生冬虫夏草产品的方法。本发明建立在冬虫夏草中砷及砷形态日常检测的基础上，直接将砷形态的相对丰度应用于冬虫夏草的掺伪鉴别，通过一次检测，做到在对冬虫夏草中有害物质(砷)超标情况检测的同时，还能进行掺伪鉴别。因此，本发明省时省力，成本低。

为实现本发明的目的，在一个实施方案中，提供了一种野生冬虫夏草的鉴别方法，包括以下步骤：

a、不同砷形态标准溶液的配制及标准曲线绘制；

b、冬虫夏草中不同砷形态相对丰度的测定；

c、被测样品中不同砷形态相对丰度与步骤b中测得的不同砷形态的相对丰度对比，并且被测样品中不同砷形态相对丰度与步骤b中对应的砷形态的相对丰度的差值Δγ≤±0.8％，则被测冬虫夏草样品为真品。

进一步地，不同砷形态为三价砷(AsIII)、五价砷(AsV)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷甜菜碱(ASB)。

进一步地，不同砷形态标准溶液配制方法如下：

(1)准确称取不同形态的砷标准溶液适量于标准溶液瓶中，配制成不同形态的砷标准溶液使用液浓度；

(2)吸取适量砷标准溶液使用液适量，用浓度为0.1-0.4mol/L的硝酸溶液逐级稀释配制不同浓度的砷标准溶液，备用。

进一步地，步骤b中冬虫夏草为多个不同产地的标准冬虫夏草样品，样品经处理后采用ICP-MS和HPLC-ICP-MS检测、归一化处理得到样品中不同砷形态的相对丰度，所有样品中各不同砷形态的平均值作为冬虫夏草中不同砷形态的标准相对丰度。

进一步地，冬虫夏草的样品处理步骤包括样品粉碎、样品消解、抽提的步骤。

进一步地，样品消解采用的消解液为浓度为0.1-0.4mol/L的硝酸溶液。

本发明选取不同产地的冬虫夏草为典型样本，确定了冬虫夏草中不同砷形态的相对丰度，通过被检测样品中不同砷形态相对丰度的对比，可以客观，准确，简便，快速地对样品进行鉴别。

本发明建立在冬虫夏草中砷及砷形态日常检测的基础上，直接将砷形态的相对丰度应用于冬虫夏草的掺伪鉴别，通过一次检测，做到在对冬虫夏草中有害物质(砷)超标情况检测的同时，还能进行掺伪鉴别。因此，本发明省时省力，成本低。

附图说明

图1冬虫夏草样品中不同砷形态的相对丰度

具体实施方式

本申请中采用的仪器、试剂以及含砷标准品的来源：

7700X电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)，美国安捷伦科技公司；1260高效液相色谱仪，美国安捷伦科技公司，恒温干燥箱，德国宾得公司；Milli-Q超纯水系统，德国默克公司。

砷酸根(五价砷)标准溶液为0.233μmol/g，亚砷酸根(三价砷)标准溶液为1.011μmol/g，一甲基砷标准溶液为0.355μmol/g，二甲基砷标准溶液为0.706μmol/g，砷甜菜碱标准溶液为0.518μmol/g，均购于中国计量科学研究院；硝酸(优级纯)购于德国默克公司；实验用水均为超纯水(电阻率为18.2M Ω.cm)；双氧水(30％，优级纯)购于广州化学试剂厂。

开启仪器预热稳定后，采用美国安捷伦科技公司提供的ICP-MS Stock TuningSolution(Ce、Co、Li、T1、Y)对仪器进行最佳化调谐，使仪器各项参数达到测定要求，控制仪器氧化物和双电荷产率达到仪器厂家要求。HPLC分离流动相为10mmol/L无水乙酸钠、3mmol/L硝酸钾、10mmol/L磷酸二氢钠、0.2mmol/L乙二胺四乙酸二钠的缓冲液，氨水调节pH为10；流动相流速为1.0mL/min；HPLC色谱柱保护柱为：赛默飞世尔(PROD,COL,IP,AG19,4×50MM)，离子色谱柱：赛默飞世尔(PROD,COL,IP,AS19,4×250MM)。具体ICP-MS仪器工作条件参考表1。

表1仪器工作条件

以下，通过实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不因这些实施例而受到任何的限定。

实施例1不同砷形态标准溶液的配置和标准曲线的绘制、不同地区冬虫夏草中不同砷形态相对丰度的测定、以及被测样品中不同砷形态相对丰度与步骤b中测得的不同砷形态的相对丰度对比。

1)不同砷形态标准溶液的配制及标准曲线绘制；

准确称取五种形态的砷标准溶液(砷酸根、亚砷酸根、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜碱)适量于标准溶液瓶中，配制成五种形态的砷混合标准溶液使用液浓度为1.0mg/L(mg/kg)。吸取适量砷混合标准使用液适量，用0.15mol/L硝酸溶液逐级稀释配制成以下标准系列：五种形态的砷标准溶液浓度为0.00，2.50，5.00，10.0，50.0，100μg/L(μg/kg)。

然后，以保留时间定性，峰高峰面积定量。根据峰面积绘制标准曲线、得到回归方程。

2)样品来源及预处理

样品准备：本发明选三个典型地区理塘、那曲和玉树作为采样点，每个地点收集20-30个相似大小的冬虫夏草样本，每个样本约0.3-0.4g。将所有样品冷冻干燥以达到恒重，将这些样品批次用研钵和研杵单独粉碎以降低粒度，然后将细粉末通过孔径为0.25mm的筛子，并在4℃下保存在密封塑料袋中以备分析。

样品的处理：分别选取三个典型地区的样品进行处理，每个样品称取平行样品1.0g左右(精确至1mg)于50mL离心管中，加0.15mol/L硝酸20mL，放置过夜。于90℃恒温烘箱中热浸提2.5h，每0.5h振摇1min。提取完毕取出冷却至室温，8000r/min离心15min。取上清液经0.22μm的有机滤膜过滤及C18小柱净化，得滤液备用；

3)不同地区冬虫夏草中不同砷形态及相对丰度的检测

将步骤(2)中的滤液的总砷用ICP-MS检测，砷形态及含量用HPLC-ICP-MS检测。根据步骤1)中得到的回归方程，计算出各样品中的不同砷形态的浓度；进一步，将得到的不同砷形态的浓度进行归一化处理，得到样品中不同砷形态的相对丰度，如表2所示，并根据相对丰度绘制折线图，如图1所示。

若亚砷酸根与其他形态的砷无法分离，可在提取液中加2～3滴过氧化氢溶液，把提取液中的亚砷酸根氧化成砷酸根，即能准确定量测定无机砷总量，通过无机砷总量和砷酸根含量相减，间接得出亚砷酸根含量。

未知形态的有机砷含量可通过总砷含量与已鉴定出的五种砷形态含量相减得出。

表2冬虫夏草各样品中各砷形态的相对丰度

其中样品1和2来自那区地区，样品3和4来自理塘地区，样品5和6来自玉树地区；DMA为一甲基砷，MMA为二甲基砷，AsB为砷甜菜碱，AsIII为亚砷酸根，AsV为砷酸根。

由表1和图1可以看出，尽管从位置相差甚远的生产地区收集了冬虫夏草，但是在所有样品中砷形态的相对丰度相似，图1生动地呈现了不同样品中MMA、DMA、ASB、未知有机砷、AsIII和AsV的相对丰度的变化，所有曲线与其他曲线一致。这种巧合可能是由于所有冬虫夏草样品中同样的代谢机制，表明As形态的相对丰度可能被突破性地用作冬虫夏草市场认证的标志。

4)冬虫夏草与已报道的大型真菌替代品中各种砷形态相对丰度的比较，如表3所示。由表3中内容可知，冬虫夏草中As形态的相对含量的独特性可以用于将冬虫夏草与其他替代物区分开来。

表3冬虫夏草与已报道的大型真菌替代品中各种砷形态相对丰度值

种类

MMA

DMA

AsB

未知有机砷

As(III)

As(V)

总量％

Pleurotus citrinipileatus

7％

1％

0％

4％

21％

66％

99.94％

Agrocybe aegirit

0％

1％

0％

0％

4％

97％

102.57％

Hypsizygus marmoreus

10％

1％

0％

4％

16％

67％

100.07％

Cantharellus cibariusFr

0％

46％

6％

15％

11％

23％

100.00％

Abalone mushroom

15％

1％

1％

4％

15％

64％

99.98％

Tremel1a

0％

0％

9％

0％

43％

51％

103.02％

Hericium erinaceus

0％

46％

11％

0％

8％

36％

101.58％

Wild mushroom

64％

8％

4％

7％

7％

10％

100.00％

Armillaria mellea

0％

15％

14％

31％

4％

36％

99.85％

Russula virescens

0％

4％

9％

7％

10％

69％

99.76％

Pleurotus nebrodensis

9％

18％

17％

5％

28％

24％

99.92％

Mini shiitake mushroom

0％

5％

1％

9％

34％

52％

99.92％

Pholiota namek-1

0％

6％

2％

13％

46％

33％

100.17％

Pholiota nameko

0％

8％

3％

21％

30％

39％

100.06％

Pholiota namek-2

0％

31％

24％

16％

0％

30％

100.16％

Lentinus edodes-1

0％

0％

0％

15％

28％

57％

100.09％

Lentinus edodes-2

0％

3％

93％

5％

0％

0％

100.01％

Yellow boletus

0％

16％

24％

31％

3％

26％

99.95％

Black boletus

94％

0％

0％

6％

0％

0％

100.00％

冬虫夏草

0.00％

0.00％

2.05％

90.65％

5.02％

2.28％

100.00％

Claims (6)

1.一种野生冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

a、不同砷形态标准溶液的配制及标准曲线绘制；

b、冬虫夏草中不同砷形态相对丰度的测定；

c、被测样品中不同砷形态相对丰度与步骤b中测得的不同砷形态的相对丰度对比，并且被测样品中不同砷形态相对丰度与步骤b中对应的砷形态的相对丰度的差值Δγ≤±0.8％，则被测冬虫夏草样品为真品。

2.根据权利要求1所述的野生冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于：所述不同砷形态为三价砷(AsIII)、五价砷(AsV)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)、砷甜菜碱(ASB)。

3.根据权利要求1或2所述的野生冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于：不同砷形态标准溶液配制方法如下：

(1)准确称取不同形态的砷标准溶液适量于标准溶液瓶中，配制成不同形态的砷标准溶液使用液浓度；

(2)吸取适量砷标准溶液使用液适量，用浓度为0.1-0.4mol/L的硝酸溶液逐级稀释配制不同浓度的砷标准溶液，备用。

4.根据权利要求1-3任一项所述的野生冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于：步骤b中冬虫夏草为多个不同产地的标准冬虫夏草样品，样品经处理后采用ICP-MS和HPLC-ICP-MS检测、归一化处理得到样品中不同砷形态的相对丰度，所有样品中各不同砷形态的平均值作为冬虫夏草中不同砷形态的标准相对丰度。

5.根据权利要求4所述的野生冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于：冬虫夏草的样品处理步骤包括样品粉碎、样品消解、抽提的步骤。

6.根据权利要求4所述的野生冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于：样品消解采用的消解液为浓度为0.1-0.4mol/L的硝酸溶液。