CN103081869A - 一种冬虫夏草低海拔人工培殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种冬虫夏草低海拔人工培殖方法，包括寄主幼虫孵化前准备，寄主幼虫的孵化放养，寄主幼虫的饲养，寄主幼虫中后期饲养和冬虫夏草有性阶段的培殖；所述寄主幼虫的饲养寄主幼虫的饲养为人工控制饲养温度为-30℃～-5℃的冻土低温休眠培育和饲养温度为6℃～18℃的生长发育培育两个饲养步骤；本发明申请通过人工控制温度、光照等饲养条件，不仅解决了冬虫夏草寄主低海拔饲养的问题；同时，本发明方法还缩短了冬虫夏草寄主幼虫的生长时间；为在低海拔地区培殖冬虫夏草创造了条件。

Description

一种冬虫夏草低海拔人工培殖方法

技术领域

本发明涉及一种真菌培殖方法，更具体的说涉及冬虫夏草低海拔人工培殖方法。 

技术背景

冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]别名虫草、冬虫草、夏草冬虫。根据最近的分类系统，冬虫夏草隶属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)、肉座菌目、麦角菌科(Clavicipifaceae)、虫草属（Cordyceps)。是麦角菌科真菌冬虫夏草菌[Cordycepssinensis(Berk.)Sacc.]寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。人工繁殖和饲养蝙蝠娥幼虫是冬虫夏草人工培育的重要环节。迄今报道的蝙蝠蛾昆虫超过60种，其中云南20种，西藏17种，四川12种，青海9种，甘肃9种。蝙蝠蛾幼虫为杂食昆虫，在土壤中营隧道式穴居生活，以植物嫩根为食物。不同种类的蝙蝠蛾在生物学和生态学上虽然有一定的差异，但其特点是需要经历较漫长的幼虫期，并具有明显的世代交替现象，蝙蝠蛾具有典型的垂直分布特征，其分布下限在纬度偏南地区海拔3000m,而在纬度偏北地区海拔2500m；分布上限为海拔5100m；最适合的生长海拔3600-5000m；最适宜的生长土壤为高寒草甸和高寒灌木丛土。由于蝙蝠蛾完成一个生命周期需经历卵、幼虫、蛹、成虫四个阶段，在每年10月至次年4月冻土期蝙蝠蛾幼虫在土壤中处于休眠状态，蝙蝠蛾幼虫需要经历6-8龄的生长发育期才能化蛹，具体因种类而异，如玉树蝙蝠蛾幼虫需要996天，康定蝙蝠蛾越1000天，贡嘎蝙蝠蛾875-1040天，而且终年可以在土中找到不同龄起的蝙蝠蛾幼虫。自然环境中蝙蝠蛾属昆虫的繁育受到生态地理分布、食物、植被、土壤结构、温度、湿度和自然天敌等多种生态因子的综合制约控制，蝙蝠蛾幼虫在自然环境中的繁育速率已成为制约青藏高原冬虫夏草产量的关键因素。 

中国专利申请（公开号：CN19700734A）公开了一种冬虫夏草的生产方法，中国专利申请（公开号：CN1970733A）公开了一种在蝠蛾圈养场培育冬虫夏草的方法，中国专利申请（公开号：CN1948456A）公开了一种提高青藏高原冬虫夏草产量的方法，中国专利申请（公开号：CN19484757A）公开了一种提高青藏高原冬虫夏草产量的方法，所述四种方法公开的就似乎内容均为在青藏高原野生环境下改造环境建立温棚圈养蝙蝠娥幼虫，增加圈养区域成虫或幼虫的数量，以提高蝙蝠蛾幼虫的存活率，在蝙蝠蛾幼虫发育至6-8龄时，通过向整个圈养场地施用染菌孢液的方式，对蝙蝠蛾幼虫进行感染，蝙蝠蛾幼虫完全感染去掉温湿保护设置让其恢复到自然温湿。整冬虫夏草的生长过程都在同一地域中进行。据专利申请文件公开的数据，该方法蝙蝠蛾幼虫从1龄生长发育至6-8龄仅需要365-380天；最终冬虫夏草的感染成 功率能够达到50%左右。 

自1970年代末，申请人即开展了冬虫夏草人工培殖的研究，先后承担“七五”、“八五”国家重点科技攻关项目“冬虫夏草人工培殖研究”课题中，确立了室内人工培殖冬虫夏草的模式后，继而又承担了“九五”国家重点科技攻关项目“西藏那曲冬虫夏草半野生抚育及开发研究”，且获得了重大突破——首次在西藏那曲海拔4700多米的藏北高原，培殖出了半野生抚育的冬虫夏草，从而确立了冬虫夏草半野生抚育的新模式。“十一五”期间承担国家科技支撑计划项目“冬虫夏草人工培殖关键技术优化研究”，在四川康定又对半野生抚育新模式的关键技术进行了优化，进一步提高了产量，简化了操作环节，且降低了成本。申请人在通过研究冬虫夏草寄主幼虫的生长特性，获得了在低海拔室内饲养寄主幼虫的重大突破，该技术不仅可以缩短幼虫的生长期还可提高其成活率，本发明即提供冬虫夏草寄主幼虫（感菌和非感菌幼虫，下同）在低海拔室内饲养的主要技术环节。推出了低海拔培殖冬虫夏草的新模式。 

发明内容

高原环境培殖冬虫夏草环境与低海拔的主要差异在于温度、光照、气压、土质以及植被，研究发现，高原土质在低海拔地区可以实现重现，而作为冬虫夏草寄主幼虫饲料的高原植物也完全可以被低海拔植被胡萝卜、红薯和人参果所替代；同时研究还发现，冬虫夏草寄主蝙蝠蛾幼虫是生活在土层中，气压对其的影响是非常微小的；所以本发明提供了一种主要通过模拟高海拔冬虫夏草寄主幼虫生长的温度，并对寄主幼虫的生长期间和冬虫夏草有性阶段的生长条件进行优化，得到一种冬虫夏草低海拔人工培殖方法，包括寄主幼虫孵化前准备，寄主幼虫的孵化放养，寄主幼虫的饲养，寄主幼虫中后期饲养和冬虫夏草有性阶段的培殖；所述寄主幼虫的饲养寄主幼虫的饲养为人工控制饲养温度为-30℃～-5℃的冻土低温休眠培育和饲养温度为6℃～18℃的生长发育培育两个饲养步骤。 

所述冻土低温休眠阶段的饲养时间为5～30d。 

所述冻土低温休眠阶段的饲养温度为-10℃～-5℃。 

所述的生长发育培育寄主幼虫4龄以内8～18℃条件下饲养，寄主幼虫5～8龄5～14℃条件下饲养。 

所述生长发育培育为： 

4龄以内寄主幼虫在温度8～18℃条件下饲养，基质湿度35%～45%；每天紫外光消毒2～5次，每次15～30分钟。每月消毒培养室2～4次； 

5～8龄寄主幼虫在温度5～14℃条件年下饲养，基质湿度25%～45%；光照强度0.5～10万lx；每天紫外光消毒3～4次计：30～60分钟。每月3次用300～500PPM的次氯酸钠消毒液进行养虫室间消毒。 

所述寄主幼虫的孵化放养为：将95%已经发育成熟的虫卵，用55～75%的乙醇液做消毒处理，滤干消毒液，用无菌水冲洗干净，吸水，将卵粒摊放在滤纸上，将卵分散于纸面，待卵表面水分吸至半干后，换用新的无菌干燥滤纸，将半干的卵粒摊放其上左右筛动，不断变换卵在滤纸上的位置，待全部卵粒能在滤纸上自如翻滚梭动后，收集于培养皿或其他容器内备用；将卵播撒入盒内饲料与基质的表面，在其表面撒放一层0.2～1.2cm厚的湿润基质。 

所述冬虫夏草有性阶段的培殖为：发现僵虫后，将其集中移栽入事先布置好基质的养虫盒内；僵虫头向上，斜植于基质中，头部距土表0.1～1.2cm，白天揭开盒盖，紫外光照2～4次，每次10～15分钟；其余时间保持0.5～100lx的白光光照强度；温度-2～9℃，空气相对湿度控制在45%～98%，培养时间为15～25天。 

本发明的有益技术效果是：本发明申请通过人工控制温度、光照等饲养条件，不仅解决了冬虫夏草寄主低海拔饲养的问题；同时，本发明方法还缩短了冬虫夏草寄主幼虫的生长时间；为在低海拔地区培殖冬虫夏草创造了条件。 

具体实施方式

实施例1温度对冬虫夏草寄主幼虫的生长的影响 

实验准备 

在海拔200～1200米的范围内，模拟冬虫夏草（含其寄主昆虫各虫态）生长发育所需的生态环境，修建人工气候室（即培殖车间或培殖室、养虫室等，下同）。对人工气候室的几项主要参数要求是：洁净无菌，温度、湿度可控，光照强弱可调。具体指标如下：空气洁净度级别30万级到100级；空气相对湿度15%～98%；光照强弱度：0.5～10万lx；温度为零下30℃至零上28℃；室内安装紫外光灯管（高度2～2.3米）每立方米不少于1.5至4.5w。室内层架饲养。养虫室外应有标准更衣室、缓冲间。 

将同一批次的卵去除杂物、洗净、充分混匀，随机数5个100粒，分别摊放在有保湿滤纸的5个培养皿中，编号贴上标签后，置8～16℃条件下保湿培养，待幼虫开始孵化时，每天早、中、晚各一次将孵出的幼虫清点记数，记录好每个编号每天孵出的幼虫数。待每个编号连续3天无幼虫孵化，视为幼虫孵化结束。统计每个编号幼虫孵化率，并求得该批卵幼虫的平均孵化率。本发明涉及的寄主昆虫种为比如蝠蛾（Hepialua biruensis.Sp.nov、贡嘎蝠蛾(Hepialus gonggaensis S.Q.Fu＆T.F.Fuang)、石渠一种蝠蛾（Hepialus sp）、小金一种蝠蛾（Hepialus sp）、虫草蝠蛾，门源蝠蛾（Hepialus minyuancus）、斜脉蝠蛾（Hepialus oblifurcns）、玉树蝠蛾，拉脊蝠蛾（Hepialus lagii Yan）。 

通过镜检幼虫胚胎发育情况，在幼虫孵化前的2～3天内做好饲养幼虫的一切准备。 

做好养虫室的清洁卫生，使室内环境达到设计要求的各项指标。 

清水洗净、滤干，65～75%的乙醇溶液浸泡消毒2～5分钟（或300～900PPM的次氯酸钠溶液浸泡10～30分钟）后，滤干残液，洁净水冲洗衣2～3次，用灭过菌的薄膜包装封存备用； 

以珠牙蓼、园穗蓼、人参果、理塘黄芪、小大黄、雪山黄芪、羊角天麻、白马雪山黄芪、香海仙报春、鹅黄灯苔报春、靛蓝穗花报春、钟花报春、景天点地梅、偏花钟报春、山丽报春、云南报春等的地下部分为好，要求新鲜洁净，洗尽泥沙，去除须根叶片、木质老化及腐烂变质部分，用55%～75%乙醇、1%～7%的次氯酸钠消毒3～30分钟后，滤干残液，用清水冲洗2～3次、滤干水分、加工成黄豆般大小的粒状封存待用。或制成干粉饲料：即将其洗净消毒处理好的饲料晒干，粉碎，磨成粉状，装袋备用（用时加洁净水及适量食品防腐剂拌湿投放饲养幼虫）。饲料植物种类还涉及红薯、胡罗卜、苹果、土豆等代用品。 

采用腐殖质含量高、呈黑褐色的高山草甸土、亚高山草甸土、黑钙土、栗钙土制作而成的自然基质或用珍珠岩、蛭石、泥碳、草碳、水晶泥等新材料制作的人造基质（以下统称基质），晒干碾细、10～20目的筛孔过筛、加水拌湿（基质湿度25%～45%）、装于塑料袋内、封扎袋口、85～120℃温度（袋中心）条件下消毒35～90分钟，冷却后置培殖室内备用。寄主幼虫的收集和放养 

在幼虫临孵化的前1～2天或当天，将饲料基质在无菌或有菌条件下装于养虫盒内：饲料、基质按1比1.5的比例配置拌匀，每盒装拌匀的饲料2.0～4.5kg，盖好盒盖备用。 

通过检查发现95%以上的幼虫已发育健全，并有数条幼虫已破壳而出时，就应立即作好投放工作。 

在投放卵粒的当天早上，将当天要投放的卵粒集中放在200～500毫升的小烧杯内将卵粒，用55～75%的乙醇液中浸泡2～3分钟做消毒处理，其间稍作搅动，使卵粒的表面充分与消毒液接触。消毒结束后，在超净工作抬上，滤干消毒液，用洁净水冲洗干净，紧接着用干燥的滤纸吸水：将冲洗干净的卵粒摊放在滤纸上，用干燥毛笔将卵分散于纸面，并不时用毛笔轻轻扫动卵粒，使卵的表面不停的与干燥滤纸接触。待卵表面水分吸至半干后，换用新的干燥滤纸，将半干的卵粒摊放其上，用双手握住滤纸的左右两边在空中轻轻左右筛动，不断变换卵在滤纸上的位置，待全部卵粒能在滤纸上轻松自如翻滚梭动后，收集于培养皿或其他容器内备用。 

将吸干水分（卵壳表面水分）的卵粒，用事先准备好的量卵器具（准备有10粒、20粒、50粒、100粒等各种量具），按每盒饲养幼虫60～300头（根据幼虫孵化率折算）的标准将其分好后，揭开盒盖（事先已准备好饲料、基质的养虫盒），轻轻而均匀将卵播撒入盒内饲料与基质的表面，此时再在其表面撒放一层0.2～1.2cm厚的湿润基质，盖好盒盖，搬入饲养室内， 3天左右幼虫即可全部孵化，并入土取食。 

寄主幼虫的前期饲养 

在卵的中后期，将卵洗净消毒处理好后，将其均匀轻轻的撒播入已布置好饲料和基质的养虫盒内，待其孵化即可进入基质取食。将虫卵2万枚平均分为2组，其中1组，每盒子可放幼虫20～80条（以幼虫孵化率60%折算，下同）作为小盒组；将消毒处现后的卵，摊放在垫有湿润滤纸的培养皿内，置7～13℃的条件下，待其幼虫孵化后，清点数量，均匀放养于已布置好饲和基质的养虫盒内，每盒20～80头，待其全部钻入基质后，再在其上撒放一层湿润的细基质。 

另外1组，用大的盒子每盒投放100～600头，先集中饲养20～60天后，再分盒饲养，每盒20～60条，作为大盒组。每盒投放幼虫60～500条，置5～10℃条件下先集中饲养30～60天后，再分盒（每盒30～50条）饲养。 

将大盒组和小盒组，分别置于温度8～18℃条件下实行变温饲养。基质湿度35%～45%；每天紫外光消毒2～5次，每次15～30分钟。每月2～4次用前述消毒液进行室内墙壁、地面、养虫架及养虫盒表面喷洒或擦拭消毒。饲养期间避免轻易揭开盒盖和随意开关门窗，有必要时必须穿好工作服、帽、鞋，戴上手套，用已消毒好的工具才能进入养室内进行操作。 

前期幼虫个体小、活动范围窄，取食量较少，视情况添加1～2次饲料即可。其方法为：经检查，养虫盒内幼虫原有饲料已取食85%～95%时，即应添加饲料，以圆穗蓼珠芽蓼等天然饲或红薯、胡罗卜等代用品饲料均可，质量及消毒处理同实验准备，加工切碎成块状装袋（每袋1千克）备用；添加前先用前述消毒液对需添加饲料的养虫盒进行表面擦拭消毒处理，其后，在无菌工作台上揭开盒盖，用特制工具刮弃养虫盒内1～2cm表层基质、捡除腐烂变质饲料及取食剩下残存边角部分、粪便及其他废物（此时要特别小心不要伤及盒内幼虫）后添加新鲜饲料，每盒0.6～2.8千克饲添加），轻轻均匀平铺于养虫盒内，再在其上掩盖1cm左右的湿润基质，盖上盒盖即可。也可添加实验准备中所述的制成的干粉饲料，每盒0.5～1.3千克。 

寄主幼虫的中后期饲养 

在冬虫夏草寄主幼虫生长到4龄时，将大盒、小盒组的饲养温度调整到5～14℃条件下，实行变温饲养（所述变温实验为在5～14℃）。基质湿度控制在25%～45%以内；光照强度0.5～10万lx；每天紫外光消毒3～4次计：30～60分钟。每月3次用300～500PPM的次氯酸钠消毒液进行养虫室内墙壁、地面、养虫架及养虫盒表面喷洒擦拭消毒。饲养期间避免轻易揭开盒盖和随意开关门窗，有必要时必须穿好工作服、帽、鞋，戴上手套及已消过毒的工具才能进入养室内进行操作。 

饲料的准备：饲料的质量及消毒处理与实验准备相同，加工制作时切成较蚕豆更大的块状，装袋（每袋1千克）备用。养虫盒及基质的准备：按实验准备的要求分别处理好养虫盒和基质。在养虫室内的工作台上，首先在已准备好的养虫盒内装入饲料与基质（饲料与基质的比例为1:1.8）。同时，用前述消毒液对将换饲料的养虫盒的外表进行擦拭消毒。 

添加时，先将需换饲料的大盒、小盒组（连同基质、幼虫及残存的饲）轻轻倒在无菌的工作台上（台上垫有灭过菌的塑料膜），用灭过菌摄子轻轻挑拨，将活幼虫移入新的装有饲料与基质的养虫盒内，均匀分布，每盒20～60头。待幼虫全部进入基质后，掩盖一层湿润基质，盖好盒盖放回养虫架上。 

在添加饲料过程中，如发现病害，遂及时用无菌塑料袋密封，并讯速将其移出养虫室，置专用的病害处理室进行处理：将病虫及其盒中的残存饲料、基质及养虫盒作灭菌处理，将活幼虫作单头饲养，如20～30天内未见发病者，再将其集中饲养。8龄时统计存活率，大盒组的冬虫夏草寄主幼虫平均存活率达到62.3%，小盒组的冬虫夏草寄主幼虫存活率达到61.9%。 

实施例2冻土条件处理对冬虫夏草寄主幼虫的生长的影响 

采用实施例1相同的饲养条件，在0～4龄以内寄主幼虫在温度8～18℃条件下饲养，基质湿度35%～45%；每天紫外光消毒2～5次，每次15～30分钟；每月消毒培养室2～4次；任选寄主幼虫450头，均分为3组，分别在寄主幼虫完成第3次蜕皮后1周（3～4龄期间），调整人工气候室温度为冻土温度，第1组控制温度为–30～–20，第2组控制温度为–20～﹣10，第三组控制温度为–10～﹣5。冻土温度为25天。完成冻土条件处理后分别将上述3组置于实施例1所述的饲养条件继续饲养，待到寄主幼虫8龄时，统计寄主幼虫存活率；具体结果如表1所示。 

表1不同冻土温度对冬虫夏草寄主幼虫存活率的影响 

从表1的结果可知，在冻土温度低于-20℃时，寄主幼虫的存活率低于实施例1所述的未经冻土温度处理的饲养条件。但是在温度在-20～-5时，寄主幼虫蛾存活率高于实施例1所述的饲养条件，尤其是温度为-10～-5时时，寄主幼虫的存活率达到73.33%。 

采用实施例1相同的饲养条件，在0～4龄以内寄主幼虫在温度8～18℃条件下饲养，基质湿度35%～45%；每天紫外光消毒2～5次，每次15～30分钟；每月消毒培养室2～4次；任选寄主幼虫450头，均分为3组，分别在寄主幼虫完成第3次蜕皮后1周（3～4龄期间）， 调整人工气候室温度为冻土温度–10～﹣5。第Ⅰ组在的冻土温度条件饲养时间为30天，第Ⅱ组在的冻土温度条件饲养时间为20天，第Ⅲ组在的冻土温度条件饲养时间为15天，第Ⅳ组在的冻土温度条件饲养时间为10天，第Ⅴ组在的冻土温度条件饲养时间为5天，第Ⅴ组在的冻土温度条件饲养时间为2天,完成冻土条件处理后分别将上述5组置于实施例1所述的饲养条件继续饲养，待到寄主幼虫8龄时，统计寄主幼虫存活率；具体结果如表2所示。 

表2不同冻土处理时间对冬虫夏草寄主幼虫存活率的影响 

从表2的结果可知冻土处理5-30天内对冬虫夏草寄主幼虫的存活率影响不大，从饲养成本上考虑采用5-10天冻土处理较为适宜。 

Claims (6)

1.一种冬虫夏草低海拔人工培殖方法，包括寄主幼虫孵化前准备，寄主幼虫的收集放养，寄主幼虫控温饲养和冬虫夏草有性阶段的培殖；其特征在于：所述寄主幼虫控温饲养分为人工控温饲养温度为8～18℃条件的1～4龄寄主幼虫前期饲养阶段和5～14℃条件5～8龄寄主幼虫中后期饲养阶段。

2.根据权利要求1所述的冬虫夏草低海拔人工培殖方法，其特征在于：所述1～4龄寄主幼虫前期饲养阶段中还包括时间长度为5～30d的降低培养温度至-30℃～-5℃的冻土低温休眠饲养阶段。

3.根据权利要求2所述的冬虫夏草低海拔人工培殖方法，其特征在于：所述冻土低温休眠阶段的为虫龄3～4龄，饲养环境温度为-10℃～-5℃。

4.根据权利要求3所述的冬虫夏草低海拔人工培殖方法，其特征在于：所述寄主幼虫控温饲养为：

1～4龄以内寄主幼虫在温度8～18℃条件下饲养，基质湿度35%～45%；每天紫外光消毒2～5次，每次15～30分钟；每月消毒培养室2～4次； 3～4龄阶段中，任选5～30天时间，降低培养温度至-10℃～-5℃，培养基形成冻土，每天紫外光消毒2～5次，每次15～30分钟；

5～8龄寄主幼虫在温度5～14℃条件下饲养，基质湿度25%～45%；光照强度0.5～10万lx；每天紫外光消毒3～4次计：30～60分钟；每月3次用300～500PPM的次氯酸钠消毒液进行养虫室间消毒。

5.根据权利要求1所述的冬虫夏草低海拔人工培殖方法，其特征在于：所述寄主幼虫的孵化放养为：将95%已经发育成熟的虫卵，用55～75%的乙醇液或1%~7%次氯酸钠溶液、1%~5%甲醛溶液、0.1%的升汞溶液做消毒处理，滤干消毒液，用洁净水冲洗干净，吸水，将卵粒摊放在滤纸上，并分散于纸面，待卵表面水分吸至半干后，换用新的干燥滤纸，将半干的卵粒摊放其上左右筛动，不断变换卵在滤纸上的位置，待全部卵粒能在滤纸上自如翻滚梭动后，收集于培养皿或其他容器内备用；将卵播撒入盒内饲料与基质的表面，在其表面撒放一层0.2～1.2cm厚的湿润基质。

6.根据权利要求1所述的冬虫夏草低海拔人工培殖方法，其特征在于：所述冬虫夏草有性阶段的培殖为：发现僵虫后，将其集中移栽入事先布置好基质的养虫盒内；僵虫头向上，斜植于基质中，头部距土表0.1～1.2cm，白天揭开盒盖，紫外光照2～4次，每次10～15分钟；其余时间保持0.5～100lx的白光光照强度；温度-2～9℃，空气相对湿度控制在45%～98%，培养时间为15～25天。