CN102978285B

CN102978285B - 用于检测黄瓜疫霉的lamp引物及含有该引物的试剂盒

Info

Publication number: CN102978285B
Application number: CN201210492602.4A
Authority: CN
Inventors: 孙翔; 郭良栋; 季妞妞
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2012-11-27
Filing date: 2012-11-27
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2032-11-27
Also published as: CN102978285A

Abstract

本发明提供一种用于检测黄瓜疫霉（Phytophthora melonis）的LAMP引物及含有该引物的试剂盒，所述引物包括FIP和BIP以及F3和B3（如Seq ID No.1-4所示）。本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于黄瓜疫霉病菌的快速检测，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境准确地检测出黄瓜疫霉。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，可对黄瓜疫霉的各种形态的繁殖体如菌丝、卵孢子和游动孢子等进行检测，对黄瓜疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

Description

用于检测黄瓜疫霉的LAMP引物及含有该引物的试剂盒

技术领域

本发明涉及黄瓜疫霉的检测，具体地说，涉及用于检测黄瓜疫霉的LAMP引物及含有该引物的试剂盒。

背景技术

植物病原卵菌是一类重要的植物病原菌，可侵染危害多种植物，导致多种植物的毁灭性病害，如致病疫霉（Phytophthora infestans）、辣椒疫霉（P.capsici）、大豆疫霉（P.sojae）、寄生疫霉（P.parasitic）、樟疫霉（P.cinnamomi）及冬生疫霉（P.hibemalis）分别引起马铃薯、辣椒、大豆、烟草、樟树及柑橘的重要疫病，严重年份乃至绝产。该类病菌主要以菌丝体或卵孢子在病残体或土壤中渡过不良环境而作为初侵染源，在适宜条件下，菌丝体或卵孢子均可萌发产生孢子囊-释放游动孢子，再借助雨水或气流进行传播、侵染而导致植物病害。因此，对该类病菌的初侵源或侵染寄主早期进行适时监控，利于控制病害的发生，传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主要在病害爆发乃至产生明显危害时才实施，忽视了对初侵染源或侵染寄主早期适时采取综合防控和高效治理措施，因而事倍功半，防效甚微，最终很难控制病害的发生与流行。

黄瓜疫霉(P.melonis)是我国乃至亚洲常见黄瓜病害种类，多在温室等低温高湿低光照环境下侵染黄瓜（Cucumis sativus），造成黄瓜根腐病，导致生产损失，此病还在台湾地区、日本和韩国等地也均有报道。此外，黄瓜疫霉在亚洲地区也有侵染西瓜（Citrullus lanatus，韩国）、香瓜（Cucumis melo，韩国和日本）开心果（Pistacia vera，伊朗）、异株栝楼（Trichosanthes dioica，印度）等多种作物的报道。因此，它是我国和亚洲地区的重要作物病害，开发黄瓜疫霉的早期快速检测技术，对相关作物生产中的病害防控和无公害化具有重要的意义。

近年来，PCR技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，主要利用核糖体rDNA/ITS序列设计特异性引物来对植物致病菌进行快速检测。ITS+5.8S区域由编码真核细胞rRNA 5.8S亚基的基因和该基因两侧的转录间序列(InterTranscribedSpacer,ITS)组成，由于ITS+5.8S区域具有较高的变异速率，因此常被用于真菌种水平的鉴定和分子系统学研究。

目前大多采用常规PCR方法进行植物病原菌检测，对仪器设备（如PCR仪、凝胶成像系统）要求高，投入大，给技术的基层推广造成了极大障碍。

发明内容

本发明的目的是提供一种便于基层推广使用的，用于检测黄瓜疫霉的LAMP引物及含有该引物的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测黄瓜疫霉（Phytophthora melonis）的LAMP引物组，其包括：

外侧正向引物F3：5’-CGGCGACTGGCTGCTA-3’；

外侧反向引物B3：5’-ATTACGTATCGCAGTTCGCA-3’；以及

内侧正向引物FIP：5’-CAAGAATGGGTTTAAAAGGTGGGCATGGCGATTGGTTTGGG-3’；

内侧反向引物BIP：5’-TTACTGAATATACTGTGGGGACGAAAGTCTTTCCTAGACATCCACTGCTGAAAG-3’。

本发明还提供含有上述LAMP引物组的用于检测黄瓜疫霉的试剂盒，其中所述试剂盒包括引物FIP、BIP、F3和B3。

前述试剂盒中还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明进一步提供上述LAMP引物组或试剂盒在检测黄瓜疫霉中的应用，包括步骤：1）提取样品中的DNA；2）以步骤1）中提取的DNA为模板，进行LAMP-PCR扩增反应；3）分析PCR产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是否含有黄瓜疫霉。

LAMP-PCR反应体系以40μl计为：

其中，检测基础液成分为：Tris-HCl(pH8.8)50mM，KCl 25mM，MgSO₄ 20mM，(NH₄)₂SO₄ 25mM，吐温20 0.2%，甜菜碱（Betaine）2M，dNTPs各3.5mM；稳定液为矿物油。

LAMP-PCR反应步骤为：1）按上述①-⑦各组分配好反应体系，向每个反应管中加入稳定液⑧；置于65℃60分钟，80℃2分钟，冰上终止反应。反应结束后，向每个管加入显色液(SYBR Green I)1μl。

用上述引物组对待测样品DNA进行恒温扩增，若电泳检测结果出现梯状DNA条带，则该样品含有黄瓜疫霉病菌，若没有扩增出条带，则该样品中不含黄瓜疫霉病菌。

本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于黄瓜疫霉病菌的快速检测，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境准确地检测出黄瓜疫霉。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，可对黄瓜疫霉的各种形态的繁殖体如菌丝、卵孢子和游动孢子等进行检测，对黄瓜疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使用。

附图说明

图1为本发明实施例2中LAMP引物组恒温扩增结果；其中，1-2为黄瓜疫霉病菌，C为黄瓜DNA样品，3-10分别为辣椒疫霉、致病疫霉、大豆疫霉、荔枝疫霉、终极腐霉、畸雌腐霉、地生腐霉、镰刀菌，NC为阴性对照，L为DNA标尺。

图2为本发明实施例2中LAMP引物组恒温扩增反应体系显色反应目测效果；其中，1-2（管中液体呈绿色）为黄瓜疫霉病菌，C为黄瓜DNA样品，3-10（管中液体呈橙色）分别为辣椒疫霉、致病疫霉、大豆疫霉、荔枝疫霉、终极腐霉、畸雌腐霉、地生腐霉、镰刀菌，NC为阴性对照。

图3为本发明实施例3中将黄瓜疫霉和其他对照菌株创伤接种黄瓜幼苗7天后的发病状况；其中1-2为创伤接种黄瓜疫霉病菌，3-6分别为创伤接种辣椒疫霉、致病疫霉、荔枝疫霉、大豆疫霉，BC为创伤接种空白培养基作为阴性对照。

图4本发明实施例3中黄瓜疫霉回接试验的LAMP引物组恒温扩增反应结果；其中，1-2为黄瓜疫霉病菌，3-6分别为辣椒疫霉、致病疫霉、荔枝疫霉、大豆疫霉，C为阴性对照，L为DNA标尺。

图5本发明实施例3中黄瓜疫霉回接试验的LAMP引物组恒温扩增反应体系显色反应目测效果；其中，1-4（管中液体呈橙色）分别为辣椒疫霉、致病疫霉、荔枝疫霉、大豆疫霉，5-6（管中液体呈绿色）为黄瓜疫霉病菌，C为阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press,1989），或Draper等（Blackwell科学出版社，1988），郑小波（疫霉菌及其研究技术，中国农业出版社，1997）中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例1用于检测黄瓜疫霉的LAMP引物组的合成

1.1黄瓜疫霉（Phytophthora melonis）ITS+5.8S区域的获得

供试疫黄瓜霉菌（P.melonis）在燕麦平板培养基上于25℃培养5-7天，用CTAB法提取菌丝DNA，于-20℃保存备用。

扩增ITS+5.8S区采用引物对ITS1和ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，White等，1990)。扩增反应在25μL反应体系中进行。反应体系如下：PCR缓冲液(20mM KCl,10mM(NH₄)₂SO₄,2mM MgCl₂,20mM Tris-HCl,pH8.4)，4种三磷酸脱氧核糖核酸各200μM，引物各15pmol，DNA模板约100ng，Taq DNA聚合酶2.5U(Biocolor BioScience & Technolgy Company,Shanghai,China)。热循环反应程序设置如下：95℃初始变性3分钟；然后94℃变性40秒，52℃退火50秒，72℃延伸1分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR产物使用引物对ITS 1和ITS4在ABI 3730-XL DNA sequencer(Applied Biosystems,Inc.,USA)上直接测序。测序结果如Seq ID No.5所示。

1.2用于检测黄瓜疫霉的LAMP引物组的合成

根据黄瓜疫霉（P.melonis）ITS+5.8S区域的基因序列，设计用于检测黄瓜疫霉的LAMP引物组，其包括：

外侧正向引物F3：5’-CGGCGACTGGCTGCTA-3’；

外侧反向引物B3：5’-ATTACGTATCGCAGTTCGCA-3’；

内侧正向引物FIP：5’-CAAGAATGGGTTTAAAAGGTGGGCATGGCGATTGGTTTGGG-3’；

引物合成由上海英潍捷基生物技术有限公司完成。

实施例2利用LAMP引物组检测黄瓜疫霉的特异性分析

1.1试剂和设备

水浴锅，LAMP-PCR试剂盒购自广东华锋生物科技有限公司。

1.2样本来源

本实施例中采用的黄瓜疫霉病菌两个株系、辣椒疫霉、致病疫霉、大豆疫霉、荔枝疫霉、终极腐霉、畸雌腐霉、地生腐霉、镰刀菌等（表1）保存于中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室和中国农业大学刘西莉教授实验室，部分病菌由山东农业大学张修国教授实验室惠赠。

表1用于LAMP-PCR检测的样本来源

1.3DNA提取

参照Wang等（Nucleic Acids Research,1993,21:4153-4154）中描述的NaOH法，略加修改提取植物组织DNA：向1mg植物组织中加入0.5mol/L NaOH 10μl，充分研磨后转至1.5mL离心管中，10,000rpm离心5分钟，取5μl上清液加入0.1mmol/L Tris（pH 8.0）495μl，于-20℃保存备用。提取健康辣椒的茎、果实、叶片的混合DNA为对照。

供试疫霉菌和腐霉菌在燕麦平板培养基上于25℃培养5-7天，供试真菌在PDA平板培养基上于25℃培养5-7天，用CTAB法提取菌丝DNA，于-20℃保存备用。

1.4LAMP-PCR反应及检测

LAMP-PCR反应体系以40μl计为：

其中，检测基础液成分为：Tris-HCl(pH8.8)50mM，KCl 25mM，MgSO₄ 20mM，(NH₄)₂SO₄ 25mM，Tween20 0.2%，Betaine 2M，dNTPs各3.5mM。稳定液为矿物油。

LAMP-PCR反应步骤为：1）按上述①-⑦各组分配好反应体系，向每个反应管中加入稳定液⑧；置于65℃60分钟，80℃2分钟，冰上终止反应。反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳。电泳使用2%琼脂糖凝胶，TAE缓冲液，取2μl反应液在120V下电泳40分钟。同时向每个反应管加入显色液(SYBR Green I)1μl，在黑色背景下观察结果。

1.5结果

电泳检测结果如图1所示，泳道1-2为黄瓜疫霉病菌样品，均表现出典型的LAMP-PCR产物条带，管C、管3-10及管NC为对照，在电泳中不产生条带。其中，管3-10为疫霉属的其他种、腐霉属菌种和镰刀菌，管C为黄瓜DNA基因组样品，管NC为阴性对照。

LAMP引物组恒温扩增反应体系显色反应目测效果如图2所示，管1-2为黄瓜疫霉病菌，反应体系出现绿色显色反应，显示反应为阳性。而同属其他种、腐霉属菌种、镰刀菌、黄瓜基因组DNA以及空白对照等反应体系呈橙色，显示反应为阴性。该结果表明本发明引物组的特异性强。

实施例3利用LAMP引物组检测发病组织黄瓜疫霉的感染情况

1.1黄瓜疫病组织DNA的提取

将供试黄瓜疫霉菌转至燕麦培养基平板上，25℃黑暗培养2-3天后，用打孔器从菌落边缘取菌落块（1cm×2cm），创伤接种于黄瓜幼苗（4-6片叶）叶片和茎基部，接种7天后，发病效果如图3所示。然后分别切取不同发病组织，参照Wang等（Nucleic Acids Research,1993,21:4153-4154）中描述的NaOH法，略加改进提取植物组织DNA：分别取一段适量的病叶、茎，1mg病组织中加入0.5mol/L NaOH10μl，充分研磨后转至1.5mL离心管中，10,000rpm离心5分钟，取5μl上清液加入0.1mmol/L Tris（pH 8.0）495μl，混匀后直接用于LAMP-PCR扩增。

分别用辣椒疫霉、致病疫霉、荔枝疫霉、大豆疫霉和空白燕麦培养基以相同方法为黄瓜幼苗接种，并在接种部位按相同方法提取黄瓜茎、叶片的混合DNA为对照。

1.2LAMP引物组对不同回接组织DNA的特异性检测

LAMP-PCR反应体系、反应条件、反应结果检测方法同实施例2。

1.3结果

电泳检测结果如图4所示，泳道1-2为黄瓜疫霉病菌样品，均能表现出典型的LAMP-PCR产物条带，管3-6及管C为对照，在电泳中不产生条带。其中，管3-6为疫霉属的其他种，管C为空白对照。

LAMP引物组恒温扩增反应体系显色反应目测效果如图5所示，管5-6为黄瓜疫霉病菌，反应体系出现绿色显色反应，显示反应为阳性。而同属其他种及空白对照等反应体系呈橙色，显示反应为阴性。该结果表明本发明引物组的特异性强，且可直接用于田间病害的检测

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.用于检测黄瓜疫霉（Phytophthora melonis）的LAMP引物组，其特征在于，其包括：

外侧正向引物F3：5’-CGGCGACTGGCTGCTA-3’；

外侧反向引物B3：5’-ATTACGTATCGCAGTTCGCA-3’；以及

内侧正向引物FIP：5’-CAAGAATGGGTTTAAAAGGTGGGCATGGCGATTGGTTTGGG-3；’

2.含有权利要求1所述LAMP引物组的用于检测黄瓜疫霉的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

5.权利要求1所述LAMP引物组或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测黄瓜疫霉中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取样品中的DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，进行LAMP-PCR扩增反应；

3）分析PCR产物。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，PCR反应体系以40μl计为：

其中，检测基础液成分为：pH8.8的Tris-HCl50mM，KCl25mM，MgSO₄20mM，(NH₄)₂SO₄25mM，吐温200.2%，甜菜碱2M，dNTPs各3.5mM；稳定液为矿物油。

8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，LAMP-PCR反应条件为：65℃60分钟，80℃2分钟，冰上终止反应。