CN113789406A - 可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法 - Google Patents
可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113789406A CN113789406A CN202111129093.4A CN202111129093A CN113789406A CN 113789406 A CN113789406 A CN 113789406A CN 202111129093 A CN202111129093 A CN 202111129093A CN 113789406 A CN113789406 A CN 113789406A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- isothermal amplification
- loop
- mediated isothermal
- visualized
- mung bean
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 240000004922 Vigna radiata Species 0.000 title claims abstract description 31
- 235000010721 Vigna radiata var radiata Nutrition 0.000 title claims abstract description 30
- 235000011469 Vigna radiata var sublobata Nutrition 0.000 title claims abstract description 30
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 19
- 241001157813 Cercospora Species 0.000 claims abstract description 31
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 25
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 241000587986 Zasmidium citri-griseum Species 0.000 claims description 12
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 11
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 6
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L magnesium sulphate Substances [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 claims description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 102100025287 Cytochrome b Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010075028 Cytochromes b Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 4
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 3
- 241000223211 Curvularia lunata Species 0.000 description 3
- IIUZTXTZRGLYTI-UHFFFAOYSA-N Dihydrogriseofulvin Natural products COC1CC(=O)CC(C)C11C(=O)C(C(OC)=CC(OC)=C2Cl)=C2O1 IIUZTXTZRGLYTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXWOXTQWVMFRSE-UHFFFAOYSA-N Griseoviridin Natural products O=C1OC(C)CC=C(C(NCC=CC=CC(O)CC(O)C2)=O)SCC1NC(=O)C1=COC2=N1 UXWOXTQWVMFRSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DDUHZTYCFQRHIY-UHFFFAOYSA-N Negwer: 6874 Natural products COC1=CC(=O)CC(C)C11C(=O)C(C(OC)=CC(OC)=C2Cl)=C2O1 DDUHZTYCFQRHIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- DDUHZTYCFQRHIY-RBHXEPJQSA-N griseofulvin Chemical compound COC1=CC(=O)C[C@@H](C)[C@@]11C(=O)C(C(OC)=CC(OC)=C2Cl)=C2O1 DDUHZTYCFQRHIY-RBHXEPJQSA-N 0.000 description 3
- 229960002867 griseofulvin Drugs 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 2
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- VVSWDMJYIDBTMV-ORWNZLQRSA-N (2s,4ar,6s,7s,8s,8ar)-6-methoxy-2-phenyl-4,4a,6,7,8,8a-hexahydropyrano[3,2-d][1,3]dioxine-7,8-diol Chemical compound C1([C@H]2OC[C@H]3O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]3O2)O)OC)=CC=CC=C1 VVSWDMJYIDBTMV-ORWNZLQRSA-N 0.000 description 1
- 241000213004 Alternaria solani Species 0.000 description 1
- 101150001086 COB gene Proteins 0.000 description 1
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 description 1
- 241000906476 Cercospora canescens Species 0.000 description 1
- 241000947067 Cercospora zeae-maydis Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241001149475 Gaeumannomyces graminis Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 241000167880 Hirundinidae Species 0.000 description 1
- 241000258195 Holothuria Species 0.000 description 1
- 101000978544 Homo sapiens MAP3K12-binding inhibitory protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023728 MAP3K12-binding inhibitory protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150053771 MT-CYB gene Proteins 0.000 description 1
- 241001344131 Magnaporthe grisea Species 0.000 description 1
- 241001330975 Magnaporthe oryzae Species 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000006002 Pepper Substances 0.000 description 1
- 241000233614 Phytophthora Species 0.000 description 1
- 241000233629 Phytophthora parasitica Species 0.000 description 1
- 241000948155 Phytophthora sojae Species 0.000 description 1
- 235000016761 Piper aduncum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017804 Piper guineense Nutrition 0.000 description 1
- 244000203593 Piper nigrum Species 0.000 description 1
- 235000008184 Piper nigrum Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 101150006264 ctb-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 101150088166 mt:Cyt-b gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，根据变灰尾孢菌细胞色素b的特异性DNA区域设计环介导等温扩增引物，并优化等温扩增体系和扩增反应程序，建立了一种特异、快速、灵敏度高且可视化的变灰尾孢菌分子检测方法，可用于田间快速检测监测绿豆叶斑病的发生。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法。
背景技术
变灰尾孢菌(Cercospora canescens)是引起绿豆叶斑病的主要真菌病原体，但目前关于这种病原菌的分子检测方法尚未发展起来。
记载在2015年《植物保护》第6期期刊上，由刘昌燕撰写的《绿豆叶斑病病原鉴定及生物学特性研究》，公开了绿豆叶斑病病原的分子鉴定方法，但该方法使用的扩增引物为真菌核糖体rDNA的通用引物，还需测定分离物的序列，其研究目的在于确定绿豆叶斑病病原，无法特异性检测变灰尾孢菌，且操作复杂费时。
本研究中，我们开发了一种基于细胞色素b(cytb)基因的可视化实时环介导等温扩增(LAMP)技术检测绿豆组织中的变灰尾孢菌的方法。
发明内容
针对上述问题，本发明提出可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法。
本发明所述可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，根据变灰尾孢菌细胞色素b的特异性DNA区域设计4条环介导等温扩增引物，包括两条外源引物F3和B3以及两条内源引物FIP和BIP，具体包括以下步骤：
S1.提取检测样品基因组，得DNA模板；
S2.取1μLDNA模板加入到等温扩增反应体系中，设置反应程序，完成反应后，分析DNA扩增结果。
进一步的，所述F3的序列为5’—AAGCAAGAAGAAATGAAGATGA—3’。
进一步的，所述B3的序列为5’—GTATAAAGACCACGGTGTACT—3’。
进一步的，所述FIP的序列为5’—TACAAGAGCGATCGCTGGTAGAACTCAGTGTTTATGGTCAAG—3’。
进一步的，所述BIP的序列为5’—GGAAAGTGAAAAACAGGCCGTTGCAGCCTATACACGTTAA—3’。
进一步的，所述等温扩增反应体系包括：0.8μLFIP和50μM BIP，0.5μL F3和10μMB3，10×不含镁离子的Thermopol缓冲液，1.2mM dNTP，6mM MgSO4，8U Bst DNA聚合酶，0.8MBetamine，0.4μL
dye(20×in water)。
进一步的，所述步骤S2中，所述反应程序为在65℃扩增60～90min后，在85℃处理2min终止反应。
进一步的，所述分析DNA扩增结果的方法包括：分析方法1、分析方法2和/或分析方法3。
进一步的，所述分析方法1为绘制实时环介导等温扩增的扩增曲线。
进一步的，所述分析方法1的结果判定方法为在等温扩增的反应时间内出现扩增曲线，则样品含有变灰尾孢菌，扩增曲线出现的时间越快，变灰尾孢菌数量越多。
进一步的，所述分析方法2为用溴化乙锭染色后进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。
进一步的，所述分析方法2的结果判定方法为当电泳结果呈阳性时，样品含有变灰尾孢菌。
进一步的，所述分析方法3为用SYBR Green I染色后直接目视观察环介导等温扩增产物。
进一步的，所述分析方法3的结果判定方法为当扩增产物的颜色呈绿色时，样品含有变灰尾孢菌。
进一步的，所述检测方法的最低检测浓度为100pg/μL。
进一步的，所述检测方法在田间检测变灰尾孢菌引起的病害中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供了可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，根据变灰尾孢菌细胞色素b的特异性DNA区域设计环介导等温扩增引物，并优化等温扩增体系和扩增反应程序，建立了一种特异、快速、灵敏度高且可视化的变灰尾孢菌的分子检测方法，可用于田间快速检测监测绿豆叶斑病的发生。
附图说明
图1为本发明引物的序列及其在基因组中的位置示意图，图中箭头表示用于引物设计的特定序列及其在基因组中的相对位置；
图2为本发明实施例1环介导等温扩增产物的特异性检测结果，图中a为实时环介导等温扩增的扩增曲线，y轴上以毫伏(mV)为单位的荧光，x轴上以分钟为单位的时间；b为用溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶电泳图；c为SYBR Green I染色后的环介导等温扩增产物；
图3为本发明实施例2灵敏度检测结果，图中a为实时环介导等温扩增的扩增曲线，y轴上以毫伏(mV)为单位的荧光，x轴上以分钟为单位的时间；b为用溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶电泳图；c为SYBR Green I染色后的环介导等温扩增产物；
图4为本发明实施例3检测变灰尾孢菌感染的绿豆组织中变灰尾孢菌的结果，图中1-8为不同变灰尾孢菌感染绿豆组织的DNA；9为正常绿豆植物组织的阴性对照；10为无菌蒸馏水的阴性对照；11为变灰尾孢菌基因组DNA的阳性对照；图中a为实时环介导等温扩增的扩增曲线，y轴上以毫伏(mV)为单位的荧光，x轴上以分钟为单位的时间；b为用溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶电泳图；c为SYBR Green I染色后的环介导等温扩增产物；
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明，以下说明并不用以限制本发明。
实施例1环介导等温扩增产物的特异性检测
供试菌种：3株变灰尾孢菌，玉米灰斑病菌(Cercospora zeae-maydis)、芹菜尾孢霉(Cercospora apii)、辣椒灰斑病菌(Cercospora capsici)、新月弯孢菌(Curvularialunata)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、马铃薯早疫病病原菌(Alternaria solani)、大豆疫病菌(Phytophthora megasperma)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminsis)各1株；
菌种来源：
表1病原菌种类及来源
检测方法：
S1.从BHU(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/wgs/？val＝ANSM01&display＝contigs&page＝1)下载变灰尾孢菌的基因组数据，利用BioEdit软件构建本地核酸和蛋白质数据库，利用已知的细胞色素b蛋白(BAG12892.1)对变灰尾孢菌的蛋白质数据库进行搜索，利用ClustalX1.83软件对变灰尾孢菌(登录号:ANSM01006775.1)及其相应的细胞色素b的核酸序列进行分析，利用环介导等温扩增引物软件PrimerExplorer V4(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html；Eiken Chemical Co.,Japan)根据变尾灰孢菌细胞色素b的特异性DNA区域设计了F3、B3、FIP和BIP 4条引物；
F3：5’—AAGCAAGAAGAAATGAAGATGA—3’。
B3：5’—GTATAAAGACCACGGTGTACT—3’。
FIP：5’—TACAAGAGCGATCGCTGGTAGAACTCAGTGTTTATGGTCAAG—3’。
BIP：5’—GGAAAGTGAA AAACAGGCCGTTGCAGCCTATACACGTTAA—3’
S2.采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)分别提取变灰尾孢菌、玉米灰斑病菌、芹菜尾孢霉、辣椒灰斑病菌、新月弯孢菌、灰葡萄孢、稻瘟病菌、马铃薯早疫病病原菌、大豆疫病菌、尖孢镰刀菌和小麦全蚀病菌的基因组，作为等温扩增反应的DNA模板；
S3.取各菌株1μLDNA模板分别加入到等温扩增反应体系[0.8μLFIP和50μMBIP，0.5μL F3和10μM B3，10×不含镁离子的Thermopol缓冲液，1.2mM dNTP，6mM MgSO4，8U BstDNA聚合酶，0.8M Betamine，0.4μL
dye(20×in water)]中，在65℃扩增60min后，在85℃处理2min终止反应，完成反应后，采用绘制实时环介导等温扩增的扩增曲线、溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I染色的方法对扩增产物进行分析，分析结果见图2，使用无菌蒸馏水作为阴性对照组进行特异性检测。
绘制实时环介导等温扩增的扩增曲线的结果显示，3株变灰尾孢菌环介导等温扩增反应的荧光强度在40min后即可检测到，3株变灰尾孢菌的扩增曲线分别在46、54、56min(图2a，1-3)进入平台期，而其他菌株均未能检测到荧光信号(图2a，4-14)，表明本发明设计的引物组对变灰尾孢菌具有较高的特异性。
2％琼脂糖凝胶电泳的结果表示，3株变灰尾孢菌样本扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳结果呈阳性，阳性样本的电泳带型呈现典型的梯状结构(图2b)。
SYBR Green I染料的结果显示，观察到变灰尾孢菌的LAMP扩增产物的颜色呈绿色，而其他真菌和阴性对照仍保持原来的橙色(图2c)。
实施例2灵敏性检测
采用10倍梯度稀释的方法稀释变灰尾孢菌DNA，控制浓度在100ng/μL到1fg/μL之间，使用无菌蒸馏水作为阴性对照组，在荧光定量PCR仪器上于65℃培养90分钟，进行灵敏度检测，实时环介导等温扩增反应按实施例1的方法完成，然后通过实时环介导等温扩增曲线、凝胶电泳和SYBR Green I染色观察对扩增产物进行检测。
从图3a中可以看出，在100ng/μL、10ng/μL、1ng/μL、100pg/μL均可检测到变灰尾孢菌的荧光信号，而其他5个浓度均未能检测到荧光信号，表明实时环介导等温扩增技术对变灰尾孢菌基因组样品的灵敏度极限为100pg/μL。
从图3b中可以看出，在100ng/μL-100pg/μL范围内，变灰尾孢菌的电泳结果呈阳性。
从图3c中可以看出，添加SYBR Green I染料后，在100ng/μL-100pg/μL范围内可以清楚地观察到变灰尾孢菌的LAMP扩增产物的颜色呈绿色。环介导等温扩增检测结果与琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳和荧光检测结果一致，表明本发明的环介导等温扩增技术可以更快速、准确地检测检测变灰尾孢菌。
实施例3田间样品的检测
为了进一步验证环介导等温扩增技术在大田样品中的应用效果，从中国黑龙江省大庆市田间采集了8个不同的疑似变灰尾孢菌侵染症状的绿豆样品田间和无侵染绿豆样品，并用环介导等温扩增技术对样品进行了检测，环介导等温扩增方法同实施例1，以纯化的变灰尾孢菌DNA作为阳性对照，用无菌蒸馏水作为阴性对照。
从图4中可以看出，8株患有叶斑病的绿豆中有5株被检测出荧光信号，即实时环介导等温扩增检测阳性样品率为62.5％，正常的绿豆样品没有显示任何荧光信号(图4a)；琼脂糖凝胶电泳分析环介导等温扩增产物，1-5有明显条带(图4b)，在添加SYBR Green I染料后观察到阳性样品中有5个由原来的橙色变为绿色(图4c)。
实时环介导等温扩增检测的结果与琼脂糖凝胶电泳和荧光检测结果一致，证明了本发明的可视化实时环介导等温扩增法适用于田间样品的检测，表示本发明的环介导等温扩增法可以有效地检测出变灰尾孢菌侵染的田间病害植物样品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于，根据变灰尾孢菌细胞色素b的特异性DNA区域设计4条环介导等温扩增引物，包括两条外源引物F3和B3以及两条内源引物FIP和BIP，引物序列如下所示：
F3：5’—AAGCAAGAAGAAATGAAGATGA—3’；
B3：5’—GTATAAAGACCACGGTGTACT—3’；
FIP：5’—TACAAGAGCGATCGCTGGTAGAACTCAGTGTTTATGGTCAAG—3’；
BIP：5’—GGAAAGTGAA AAACAGGCCGTTGCAGCCTATACACGTTAA—3’。
2.如权利要求1所述的可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取检测样品基因组，得DNA模板；
S2.取1μLDNA模板加入到等温扩增反应体系中，设置反应程序，完成反应后，分析DNA扩增结果。
3.如权利要求2所述的可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述等温扩增反应体系包括：0.8μLFIP和50μM BIP，0.5μL F3和10μM B3，10×不含镁离子的Thermopol缓冲液，1.2mM dNTP，6mM MgSO4，8U Bst DNA聚合酶，0.8M Betamine，0.4μLEva
dye(20×in water)。
4.如权利要求2所述的可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述反应程序为在65℃扩增60～90min后，在85℃处理2min终止反应。
5.如权利要求2所述的可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述分析DNA扩增结果的方法包括：分析方法1、分析方法2和/或分析方法3。
6.如权利要求5所述的可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述分析方法1为绘制实时环介导等温扩增的扩增曲线；所述分析方法1的结果判定方法为在等温扩增的反应时间内出现扩增曲线，则样品含有变灰尾孢菌，扩增曲线出现的时间越快，变灰尾孢菌数量越多。
7.如权利要求5所述的可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述分析方法2为用溴化乙锭染色后进行2％琼脂糖凝胶电泳检测；所述分析方法2的结果判定方法为当电泳结果呈阳性时，样品含有变灰尾孢菌。
8.如权利要求5所述的可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述分析方法3为用SYBR Green I染色后直接目视观察环介导等温扩增产物；所述分析方法3的结果判定方法为当扩增产物的颜色呈绿色时，样品含有变灰尾孢菌。
9.如权利要求1所述的可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法，其特征在于，所述检测方法的最低检测浓度为100pg/μL。
10.如权利要求1-9任一项所述的可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法的应用，其特征在于，所述检测方法在田间检测由变灰尾孢菌引起的病害中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111129093.4A CN113789406A (zh) | 2021-09-26 | 2021-09-26 | 可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111129093.4A CN113789406A (zh) | 2021-09-26 | 2021-09-26 | 可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113789406A true CN113789406A (zh) | 2021-12-14 |
Family
ID=79184332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111129093.4A Pending CN113789406A (zh) | 2021-09-26 | 2021-09-26 | 可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113789406A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113897453A (zh) * | 2021-11-11 | 2022-01-07 | 天津市农业科学院 | 一种快速检测芹菜尾孢菌的引物组及检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107815504A (zh) * | 2017-11-30 | 2018-03-20 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法 |
| CN111100947A (zh) * | 2020-01-22 | 2020-05-05 | 青岛农业大学 | 快速检测苹果褐斑病菌的lamp引物及其检测方法和试剂盒 |
-
2021
- 2021-09-26 CN CN202111129093.4A patent/CN113789406A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107815504A (zh) * | 2017-11-30 | 2018-03-20 | 福建省农业科学院植物保护研究所 | 一种桃炭疽病菌环介导等温扩增检测引物及其检测方法 |
| CN111100947A (zh) * | 2020-01-22 | 2020-05-05 | 青岛农业大学 | 快速检测苹果褐斑病菌的lamp引物及其检测方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ZHEN LIU ET AL.: ""Real-time and visual detection of Cercospora canescens based on the cytb gene using loop-mediated isothermal amplification (LAMP)"", 《CANADIAN JOURNAL OF PLANT PATHOLOGY》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113897453A (zh) * | 2021-11-11 | 2022-01-07 | 天津市农业科学院 | 一种快速检测芹菜尾孢菌的引物组及检测方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cruz-Perez et al. | Detection and quantitation of Aspergillus fumigatus in pure culture using polymerase chain reaction | |
| CN107988325A (zh) | 虾肝肠胞虫（ehp）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN112877410B (zh) | 一种优化的基于crispr介导的核酸检测系统及其检测方法 | |
| Reddy et al. | Development of specific markers for identification of Indian isolates of Fusarium oxysporum f. sp. ricini | |
| CN107988426A (zh) | 对虾桃拉病毒（tsv）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN113789406A (zh) | 可视化绿豆叶斑病病菌环介导等温扩增检测方法 | |
| CN109385488B (zh) | 同时检测中药材污染三类产毒真菌的多重pcr引物、方法及试剂盒 | |
| CN110724752B (zh) | 多重pcr检测人鱼共患病病原菌的方法 | |
| CN112280898A (zh) | 一种高效二联检测兔瘟和兔瘟2型的引物以及试剂盒 | |
| CN109811073B (zh) | 双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用 | |
| CN111850155A (zh) | 特有靶标引物在同时快速鉴定草莓感染两种病原菌的应用 | |
| CN114958875B (zh) | 柑橘黄龙病菌内参基因metG筛选和应用 | |
| CN113481310B (zh) | 一种检测生姜腐烂病病原的lamp引物组、lamp试剂盒及其应用 | |
| CN110735003A (zh) | 细胞制品中真菌污染检测的通用引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN105018486A (zh) | 一种检测水稻细菌性条斑病菌的hda试剂盒及检测方法 | |
| CN109628625B (zh) | 鉴定六妹羊肚菌的特异性引物、试剂盒、方法及其应用 | |
| CN112048573A (zh) | 用于检测棉花曲叶病毒的rpa引物、试剂盒及其检测方法与应用 | |
| CN104894272A (zh) | 一种茶炭疽病病叶的分子检测方法 | |
| CN105039600A (zh) | 一种检测辣椒黄脉病毒的rt-lamp引物及试剂盒 | |
| CN116970735B (zh) | 玉米锈病重组聚合酶快速检测方法和试剂盒 | |
| CN113293235B (zh) | 一种用于蛙病毒检测的引物及其应用 | |
| KR20150057681A (ko) | 벼 붉은곰팡이병 검출용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| CN113444839B (zh) | 制备检测ep病原和er病原试剂的试剂盒及其应用 | |
| CN116144660B (zh) | 基于新crispr靶点的mrsa菌检测 | |
| CN110205400B (zh) | 一种检测小麦叶锈菌的试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211214 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |