CN113897462A - 一种定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物和方法，属于植物病害检测技术领域。本发明所用引物基于芜菁花叶病毒CP基因序列AB701704、KC119189和AP017831保守区域设计，所述引物如下：上游引物TuMV‑F:5’‑CGACCATACATGCCACGACA‑3’，下游引物TuMV‑R：5’‑TCCATCCAAGCCGAACGAA‑3’，无论是RT‑PCR还是RT‑qPCR扩增均可用此引物。用于定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的方法，包括以下步骤：提取勿忘我感病叶片总RNA；将总RNA反转录成cDNA，一次为模板进行普通PCR和实时荧光定量PCR。本发明设计的引物灵敏度高、特异性强、重复度好，本发明建立了一套能快速灵敏检测芜菁花叶病毒的方法，可为勿忘我TuMV的早期监测和预警提供技术支持。

Description

一种定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物和方法
技术领域
本发明属于植物病害检测技术领域，具体地说，涉及一种快速定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物和方法。
背景技术
勿忘我又名杂种补血草(Limonium sinuatum)。该种花色丰富，有紫、粉、白、蓝、黄等多种颜色，观赏性较高，其花瓣呈蜡质，可用作鲜切花和干花，在世界各地广泛种植。自1991年将勿忘我引入昆明栽培后，勿忘我产业迅速发展，已成为云南省花卉栽培产业的主力军之一。目前，大批量生产的勿忘我主要来自于组织培养，病毒在多次继代培养中不断积累，大大制约了勿忘我产业的发展。病毒病的频繁发生导致勿忘我种质退化，产量和品质大不如前。采用高效、准确的检测方法对勿忘我病毒进行及时诊断，是解决勿忘我产业发展问题的关键。
国内外关于补血草属植物病毒的报道主要集中在上世纪90年代。陈燕芳等报道了勿忘我上存在蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)侵染，张仲凯记载了一种云南昆明地区发生的“勿忘我皱缩病”，经电镜负染后，观察到球形病毒粒体(直径约20nm)，但目前仍不清楚其具体病原。据国外的一些报道，黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、三叶草黄脉病毒(Clover yellow vein virus，ClYVV)、补血草病毒(Statice virusY，StaVY)、芜菁花叶病毒(TuMV)、番茄斑萎病毒(TSWV)、凤仙花坏死斑病毒(Impatiensnecrotic spot virus，INSV)和葡萄属阿尔及利亚潜伏病毒(Grapevine Algerian latentvirus，GALV)均能侵染补血草。近年来，在云南昆明勿忘我主栽区(云南省晋宁县和宜良县等地)，多次发现勿忘我新型病株，主要表现出典型的病毒病症状，如矮化、叶片皱缩、花叶等。在此之前，本发明人已通过酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)以及普通RT-PCR对采自云南昆明勿忘我主栽区的感病植株进行了病毒种类的检测，发现云南勿忘我主栽区主要存在TuMV侵染。
TuMV隶属于马铃薯Y病毒科，有文献报道，TuMV可侵染多达43科156属的300多种植物，其寄主范围非常广泛，自然条件下，主要通过蚜虫或植株的汁液传播。植株一旦感病，便难以恢复正常的生长。因此，在勿忘我种苗生产中对其进行及时有效的检测具有非常重要的意义。当前用于病毒检测的常用方法主要有生物学、显微形态观察、免疫学、分子生物学等方法。生物学方法存在周期长，操作繁琐的问题，且待植物表现出相应的症状时，已造成无法挽救的伤害。显微观察的方法能直观的看到病毒粒体，但操作相对复杂，且耗时较长。免疫学方法如ELISA则存在灵敏度低、特异性差等特点。普通PCR只能对病毒进行定性或半定量分析，不能排除假阳性的结果的出现。荧光实时定量PCR(real-time fluorescencequantitative PCR)是一种新的病毒检测技术，具有良好的发展前景。采用该方法，可实现病毒的定量检测，并且灵敏度较高。但目前还没有TuMV实时荧光定量PCR检测方法的相关技术研究及应用报道。
发明内容
针对现有技术中存在的勿忘我芜菁花叶病毒尚无有效运用实时荧光定量PCR技术进行检测的问题，本发明以芜菁花叶病毒外壳蛋白(coat protein，CP)基因保守序列设计引物，建立了一套能快速灵敏检测TuMV的方法，该方法能检测到373copies·μL-1的病毒，是普通RT-PCR检测浓度的100倍，感病植株有明显的扩增曲线，而阴性对照、TMV、TSWV均没有明显的扩增曲线，组内和组间实验也表明该检测方法具有可重复性。因此，该方法在田间样品的检测中展现出高灵敏度、强特异性等优点，同时本发明的方法可以在1d之内就可得到准确的检测结果，不仅适用于田间样品的快速检测，也适用于组培苗的检测，可为勿忘我TuMV的早期监测和预警提供技术支持。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供如下的技术方案：
一种定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物，所述的引物基于GenBank中芜菁花叶病毒CP基因序列AB701704、KC119189和AP017831保守区域设计；所述的引物如下所示：
上游引物TuMV-F:5’-CGACCATACATGCCACGACA-3’，
下游引物TuMV-R：5’-TCCATCCAAGCCGAACGAA-3’。
根据所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物，其中由上下游引物扩增出的电泳条带如图1所示。
根据所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物，其中所述电泳条带大小为180bp。
本发明同时提供了所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物在定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒中的应用。
本发明还提供了一种定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的方法，该方法包括以下步骤：
(1)采集田间感病样品；
(2)提取样品总RNA；
(3)将步骤(2)提取的总RNA反转录成cDNA；
(4)以步骤(3)中的cDNA作为待检测模板，采用如下引物进行普通PCR或实时荧光定量PCR，
上游引物TuMV-F:5’-CGACCATACATGCCACGACA-3’，
下游引物TuMV-R：5’-TCCATCCAAGCCGAACGAA-3’；
(5)分析普通PCR扩增产物或实时荧光定量PCR扩增产物。
根据所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的方法，步骤(2)中普通扩增反应的反应体系或实时荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括为如下所示的引物：
上游引物TuMV-F:5’-CGACCATACATGCCACGACA-3’，
下游引物TuMV-R：5’-TCCATCCAAGCCGAACGAA-3’。
根据所述的定量检测勿忘我上芜菁花叶病毒的方法，步骤(2)中普通PCR扩增反应如下，其反应体系为25μL：cDNA 1μL，2×PCR Taq Plus MasterMix with dye 11μL，前后引物各0.75μL(10μM)，ddH2O 11.5μL；步骤(2)中普通PCR反应程序如下：95℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火40s，72℃延伸55s，共35个反应循环；72℃延伸7min。
根据所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的方法，其中芜菁花叶病毒cDNA检测下限为3.73×104copies·μL-1。
根据所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的方法，其中，步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应如下，其反应体系为25μL：TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ12.5μL，前后引物(10μM)各1μL，模板2μL，ddH2O 8.5μL；步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应程序为：95℃变性30s；循环参数为95℃5s，60℃30s，40个循环；融解曲线参数为95℃10s，60℃30s，95℃1min。
根据所述的定量检测勿忘我上芜菁花叶病毒的方法，其中芜菁花叶病毒cDNA检测下限为3.73×102copies·μL-1。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明在TuMV的CP基因序列上设计特异性引物，首次建立了以SYBR Green I为基础的TuMV实时荧光定量检测体系。最后得出的灵敏度数据表明，该方法能检测到373copies·μL-1的病毒，是普通RT-PCR检测浓度的100倍。该定量检测体系在田间样品的检测中展现出高灵敏度，强特异性等优点。该检测方法可以在1d之内就可得到准确的检测结果，不仅适用于田间样品的快速检测，也适用于组培苗的检测，能为勿忘我TuMV的早期监测和预警提供技术支持，也为后期探究勿忘我组培苗继代次数与病毒积累之间的关系提供重要依据。
附图说明：
图1普通PCR检测得到的引物电泳条带。图中1-8:质粒浓度为3.73×109-3.73×102copies·μL-1,9:ddH2O对照,M:Marker；
图2勿忘我感病叶片及花茎的症状；
图3TuMV实时荧光定量PCR标准曲线；
图4TuMV实时荧光定量PCR扩增曲线，图中1-7:质粒浓度为3.73×109～3.73×103copies·μL-1；
图5TuMV实时荧光定量PCR熔解曲线，图中1-7:质粒浓度为3.73×109～3.73×103copies·μL-1；
图6实时荧光定量PCR的灵敏度检验，图中1-8:质粒浓度为3.73×109-3.73×102copies·μL-1；
图7实时荧光定量PCR的特异性试验，图中1:TuMV 2:TSWV 3:TMV 4:ddH2O。
具体实施方式：
下面结合附图，对本发明的实施例作详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下面的具体实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照同领域常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：
2019年在云南地区勿忘我主栽区采集了50余份感染芜菁花叶病毒(TuMV)的勿忘我叶片样品，在田间感病植株的早期症状表现为叶片皱缩、花叶，晚期则出现畸形、矮化、花茎难以开花等现象(见图2)。随机抽取15份样品进行检测。
样品检查前在GenBank中筛选出TuMV CP基因序列AB701704、KC119189和AP017831，在基因保守区域设计引物。在Premier 5.0上设计引物出多对引物，根据多次PCR实验的结果挑选出一对效果最好、最稳定的引物，即：上游引物TuMV-F:5’-CGACCATACATGCCACGACA-3’，下游引物TuMV-R：5’-TCCATCCAAGCCGAACGAA-3’，利用该引物扩增出的产物大小为180bp。
随后利用通用植物总RNA提取试剂盒提取勿忘我感病叶片的RNA，再将RNA反转录成cDNA，将所得的cDNA作为普通PCR模板进行后续的实验。PCR反应25μL体系如下：cDNA 1μL，2×PCR Taq Plus MasterMix with dye(ABM公司)11μL，前后引物各0.75μL(10μM)，ddH2O 11.5μL。PCR反应程序如下：95℃预变性3min；95℃变性45s，55℃退火40s，72℃延伸55s，共35个反应循环；72℃延伸7min。反应结束后取10μL产物电泳30min。在紫外灯下观察琼脂糖凝胶条带，并挑选单一的目的条带进行切割，称重后将其置于干净的2ml离心管中，进行后续的产物纯化实验。得到纯化产物后，将其连接在pMD19-T载体上，并转入大肠杆菌以克隆目的基因，挑选饱满、泛白、光滑的单菌落，经PCR筛选出阳性菌落后送至昆明擎科公司测序。测序结果显示与TuMV序列一致性为100％，表明TuMV CP基因的部分片段已成功插入到克隆载体中。
选择测序结果为阳性的菌液，提取质粒。在核酸蛋白测定仪(ND2000C，ThermoNano Drop，美国)上测定质粒标准品的浓度，得到阳性质粒浓度为117.5ng·μL-1，再根据以下公式计算得到标准质粒的拷贝数为3.73×1010copies·μL-1。
质粒拷贝数(copies·μL-1)＝(质粒浓度(ng·μL-1)/质粒总碱基数)×9.12×1011
随后将3.73×1010copies·μL-1的质粒DNA进行10倍梯度稀释，得到3.73×102～3.73×109copies·μL-1的质粒标准品，此为模板进行荧光定量PCR，每个样品设置三个重复，并以添加ddH2O的处理作为对照。荧光定量PCR 25μL反应体系如下：TB GreenTM PremixEx TaqTMⅡ12.5μL，前后引物(10μM)各1μL，模板2μL，ddH2O 8.5μL。荧光定量PCR程序在CFX96实时荧光定量PCR仪(BIO-RAD)上进行，具体程序设置如下：95℃变性30s；循环参数为95℃5s，60℃30s，40个循环；融解曲线参数为95℃10s，60℃30s，95℃1min。最后在Excel中，以质粒拷贝数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标，在Excel中建立标准曲线(见图3)，得到标准曲线方程y＝-3.425x+45.413(R2＝0.998)，所得方程中，相关系数R2>0.98，计算可得扩增效率为96％，在90％～120％之间，符合理想标准曲线的要求(本试验当Ct值>35时，视为阴性)。对田间15份疑似感病的勿忘我叶片样品进行检测，结果发现了6份样品感染了TuMV，其扩增曲线良好(见图4)，熔解曲线单一(见图5)，Ct值分别为：14.17、13.56、28.84、16.04、27.25和20.06，由标准曲线方程可得其病毒拷贝数分别为：1.32×109、2.00×109、6.90×104、3.77×108、2.00×105、2.53×107copies·μL-1。
灵敏度评价以10倍梯度稀释的质粒标准品(102～109copies·μL-1)为荧光定量和普通PCR模板，比较二者的灵敏度。实验结果显示，普通PCR检测下限为3.73×104copies·μL-1(见图1)，而荧光定量PCR能检测到3.73×102copies·μL-1(Ct值为34.73)的质粒样品(见图6)，比普通PCR高约100倍。
重复性评价以4组标准质粒标准品(浓度梯度104～107copies·μL-1)为模板，同一浓度分别做3次组内重复和组间重复。由表1可知，组内重复变异系数为0.56％～1.53％，组间重复变异系数为0.13％～1.94％，二者均在可接受范围内，说明该检测方法具有重复性。
表1实时荧光定量PCR重复性试验
Figure BDA0003361691130000061
特异性评价是通过选择2种较为常见的植物病毒，一种曾经被报道可侵染勿忘我，即番茄斑萎病毒(TSWV)，另一种为烟草花叶病毒(TMV)，可侵染多种寄主植物。以感染TuMV的叶片的cDNA为模板进行荧光定量PCR特异性实验。特异性实验结果如图7。TSWV、TMV样品和ddH2O都没有明显的扩增曲线，只有TuMV有明显的扩增曲线。
序列表
<110> 中国科学院昆明植物研究所
<120> 一种定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物和方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 勿忘我(Limonium sinuatum)
<400> 1
cgaccataca tgccacgaca 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 勿忘我(Limonium sinuatum)
<400> 2
tccatccaag ccgaacgaa 19

Claims (10)

1.一种定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物，其特征在于：所述的引物基于GenBank中芜菁花叶病毒CP基因序列AB701704、KC119189和AP017831保守区域设计；所述的引物如下所示：
上游引物TuMV-F: 5’-CGACCATACATGCCACGACA-3’，
下游引物TuMV-R：5’-TCCATCCAAGCCGAACGAA-3’。
2.根据权利要求1所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物，其特征在于：由上下游引物扩增出的电泳条带如图1所示。
3.根据权利要求1或2所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物，其特征在于：所述电泳条带大小为180bp。
4.权利要求1或2或3所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的引物在定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒中的应用。
5.一种定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的方法，该方法包括以下步骤：
（1）采集田间感病样品；
（2）提取样品总RNA；
（3）将步骤（2）提取的总RNA反转录成cDNA；
（4）以步骤（3）中的cDNA作为待检测模板，采用如下引物进行普通PCR或实时荧光定量PCR，
上游引物TuMV-F: 5’-CGACCATACATGCCACGACA-3’，
下游引物TuMV-R：5’-TCCATCCAAGCCGAACGAA-3’；
（5）分析普通PCR扩增产物或实时荧光定量PCR扩增产物。
6.根据权利要求5所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的方法，其特征在于：步骤(2)中普通扩增反应的反应体系或实时荧光定量PCR扩增反应的反应体系包括为如下所示的引物：
上游引物TuMV-F: 5’-CGACCATACATGCCACGACA-3’，
下游引物TuMV-R：5’-TCCATCCAAGCCGAACGAA-3’。
7.根据权利要求5所述的定量检测勿忘我上芜菁花叶病毒的方法，其特征在于：步骤(2)中普通PCR扩增反应如下，其反应体系为25μL：cDNA 1 μL，2× PCR Taq PlusMasterMix with dye11 μL，前后引物各0.75 μL（10 μM），ddH2O 11.5 μL；步骤（2）中普通PCR反应程序如下：95℃预变性3 min；95℃变性45 s，55℃退火40 s，72℃延伸55 s，共35个反应循环；72℃延伸7 min。
8.根据权利要求5所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的方法，其特征在于：芜菁花叶病毒cDNA检测下限为3.73×104 copies·μL-1。
9.根据权利要求5所述的定量检测勿忘我中芜菁花叶病毒的方法，其特征在于：步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应如下，其反应体系为25μL：TB GreenTM Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，前后引物（10μM）各1μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL；步骤(2)中实时荧光定量PCR扩增反应的反应程序为：95℃变性30 s；循环参数为95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；融解曲线参数为95℃ 10s，60℃ 30s，95℃ 1min。
10.根据权利要求5所述的定量检测勿忘我上芜菁花叶病毒的方法，其特征在于：芜菁花叶病毒cDNA检测下限为3.73×102copies·μL-1。
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