KR20160126116A - Ｐｃｒ을 이용한 진딧물의 ｐｖｙ 보독여부 진단 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감자 Y 바이러스 (PVY; Potato virus Y) 진단용 프라이머 세트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 i) 감자 Y 바이러스 보독 여부를 진단하기 위한 진딧물 및 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계; ii) 상기 가열된 혼합물을 식힌 후, 진딧물을 제거하는 단계; 및 iii) PCR을 수행하는 단계; 를 포함하는 감자 Y 바이러스의 진단 방법 에 관한 것이다. 본 발명은 또한 감자 Y 바이러스 진단 키트에 관한 것이다.

Description

ＰＣＲ을 이용한 진딧물의 ＰＶＹ 보독여부 진단 방법 {DETECTING METHOD of POTATO VIRUS Y FROM AN APHID BY USING PCR }

본 발명은 PCR을 이용한 진딧물의 PVY 보독여부 진단 방법에 관한 것이다.

바이러스　진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법 (ELISA)을 주로 사용하였다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을　정확히 진단하기는 불가능하다. 혈청학적 방법 중 ELISA 방법은 가장 일반적으로 사용하여온　진단방법이나 PCR　진단법보다 검출감도가 약 1,000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로　진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다.

현재 RNA 바이러스의　진단에서는 높은 검출감도와 편리성을 가지고 있는 RT-PCR 방법을 가장 일반적으로 사용되고 있다. 병원체의 PCR　진단을 위해서는 종 특이　프라이머의 개발이 가장 중요하다.

한편, 영양 번식을 하는 감자는 병리적 퇴화에 의하여 생산량 감소가 크며 그 원인 중 가장 주요한 요인은 바이러스병으로 밝혀져 있다. 감자를 기주로 하는 바이러스는 세계적으로 40여종이 보고되어 있으며 우리나라에서는 15여종이 보고되었다. 이들 중 감자에 피해를 많이 주는 바이러스로는 Potyvirus 속의 대표 바이러스인 감자 Y 바이러스(PVY)가 있다. PVY(Potyviridae: potyvirus)는 씨감자 생산에 영향을 미치는 가장 중요한 감자 바이러스 중 하나이다. 그리고 PVY는 진딧물(aphid)을 통해 비지속적(non-persistent)으로 전파되는 것을 특징으로 한다. 일반적으로 국내 추백이나 대서 품종은 PVY 에 의한 심한 모자이크 증상 및 황화 반점이 뚜렷이 나타나고, 대지 품종에서는 연한 모자이크 증상을 나타내며 가장 많이 재배되는 수미 품종에서는 모자이크 증상이 나타난다.

현재까지 PVY를　진단하기 위하여 주로 ELISA 방법을 사용하고 있으나, 식물체 추출물과 항혈청의 비특이적 반응으로 오진단하는 경우가 종종 있다. 또한 검사할 종자에서 PVY의 감염율이 낮을 경우 ELISA　진단법으로는 검사에 실패할 가능성이 높다.

이에 본 발명자들은 PVY 벡터로 알려진 진딧물을 사용하여 감자Y 바이러스 보독 여부 진단방법을 개발하기에 이르렀다.

Res. Plant Dis. 19(2) : 90-94 (2013)

본 발명의 목적은 감자 Y 바이러스 (PVY; Potato virus Y) 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용한 감자 Y 바이러스의 진단방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 감자 Y 바이러스 (PVY; Potato virus Y) 진단용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 올리고뉴클레오티드 또는 이의 상보적 올리고뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 것일 수 있다.

감자 Y 바이러스 (PVY; Potato virus Y, Potyviridae: potyvirus)는 씨감자 생산에 영향을 미치는 가장 중요한 감자 바이러스 중 하나이다. 그리고 PVY는 진딧물(aphid)을 통해 비지속적(non-persistent)으로 전파되는 것을 특징으로 한다. 따라서 본 발명의 상기 프라이머 세트는 바람직하게 진딧물에서 감자 Y 바이러스 보독 여부를 진단하기 위한 것일 수 있다. 상기 진딧물은 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게 감자 Y 바이러스 보독이 가능 한 것으로 잘 알려진 복숭아혹진딧물(Myzus persicae), 감자수염진딧물(Macrosiphum euphorbiae) 또는 목화진딧물(Aphis gossypii)을 포함하는 것일 수 있으며, 감자 Y 바이러스 보독 여부를 진단하기 위한 진딧물 종 어느 것이든지 사용할 수 있다.

본 발명은 또한,

i) 감자 Y 바이러스 보독 여부를 진단하기 위한 진딧물 및 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계;

ii) 상기 가열된 혼합물을 식힌 후, 진딧물을 제거하는 단계; 및

iii) PCR을 수행하는 단계;

를 포함하는 감자 Y 바이러스의 진단 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 PCR 수행 단계는 RT-PCR(reverse transcription PCR)으로 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 RNA 추출과정 없이 또한 cDNA합성과 PCR반응을 한꺼번에 할 수 있는 원스텝 RT-PCR(one step RT-PCR)로 수행할 수 있다.

본 발명의 용어, “원스텝 RT-PCR(ONE-STEP RT-PCR)”은 total RNA 또는 mRNA 주형으로부터 first-strand cDNA의 합성과 PCR 반응을 하나의 튜브내에서 연속적으로 수행할 수 있는 RT-PCR 방법을 말한다. 종래 RT-PCR방법은 역전사효소를 이용한 cDNA합성 과정과 DNA중합효소를 이용한 PCR과정을 각각 다른 튜브에서 순차적으로 반응하였다. 그러나 이런 방법은 매우 번거로우며, 시료의 캐리오버(carry over)에 의한 교차오염(cross contamination)의 단점이 있다. 따라서 본 발명의 방법은 원스텝 RT-PCR을 이용하고, 별도의 RNA 추출과정이 없이 한번에 보독 여부의 진단이 가능한바, 시간이 30~40분 단축되는 효과가 있다.

본 발명의 방법은 종래 PCR을 이용한 감자 Y 바이러스 진단방법에서 사용되는 RNA 추출과정이 없이 수행하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 방법은 종래 바이러스 진단방법에서 필수적으로 수행되었던 RNA 추출과정이 제외되는바, 시간이 단축되는 장점이 있다.

상기 진단방법에 있어, 혼합물의 가열단계는 이에 제한되는 것은 아니나 90 내지 110 ℃ 에서 2 내지 15분간 수행되는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게 약 94℃ 내외에서 약 5분 내외로 수행되는 것일 수 있다.

또한 상기 가열된 혼합물을 식히는 단계는 이에 제한되는 것은 아니나 0 내지 5℃ 에서 1 내지 10분간 식히는 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 약 4℃ 내외에서 약 3분 내외로 수행되는 것일 수 있다. 상기 온도가 영하로 떨어지는 경우, RNA가 손상받을 수 있다.

상기 혼합물은 보독 여부를 진단하기 위한 진딧물 및 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 외에 멸균수 및 MgCl₂를 추가로 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. MgCl₂의 첨가로 PCR 효율이 높아지고, DNA의 안정성을 높일 수 있다. 상기 MgCl₂의 첨가량은 이에 제한되는 것은 아니나, 1~5mM로 첨가할 수 있으며, 가장 바람직하게 약 2.5mM로 첨가될 수 있다. 첨가 농도가 높으면, 증폭 효율은 올라가나 비특이적 반응 역시 증가하는바, 상기 범위 내에서 첨가되는 것이 바람직하다.

상기 진단방법에 사용되는 진딧물은 이에 제한되는 것은 아니나 바람직하게 복숭아혹진딧물(Myzus persicae), 감자수염진딧물(Macrosiphum euphorbiae) 또는 목화진딧물(Aphis gossypii)을 사용하는 것일 수 있다.

또한 본 발명은, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 감자 Y 바이러스를 진단하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약 및 필요에 따라 제한효소를 포함할 수 있으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한 상기 키트는 이에 제한되는 것은 아니나 원스텝 RT-PCR 키트를 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는 본 발명의 진단방법을 수행하기 위한 본 발명의 프라이머 세트 외에 멸균수에 MgCl₂를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 감자 Y 바이러스를 진단하기 위한 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 상기 프라이머 세트 외에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소 등으로 구성될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 키트는 이에 제한되는 것은 아니나 원스텝 RT-PCR을 수행하기 위한 본 발명의 프라이머 세트 외에 멸균수에 MgCl₂를 추가로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 구체 예에서, 진딧물을 이용해 원스텝 RT-PCR을 수행하여 감자 Y 바이러스 외피단백질 유전자에 특이적인 프라이머로 증폭하였다. 따라서 종래 RNA 추출 단계를 생략하고 매우 짧은 시간에 원스텝 RT-PCR 방법을 사용하여 진딧물의 보독여부를 확인할 수 있었다. 본 발명에서는 감자 Y 바이러스(PVY) 벡터로 알려진 세 가지 진딧물 종(Myzus persicae , Macrosiphum euphorbiae , Aphis gossypii)을 사용해 PVY 탐지 방법을 확인하였다.

본 발명의 진단방법은 한 마리 진딧물에서 감자 Y 바이러스 보독 여부를 확인할 수있으며, RNA 추출 과정이 없어 진단 시간이 단축되면서 정밀한 진단이 가능하다. 본 발명의 신속하고 정확한 바이러스 진단을 통해 우량 씨감자를 생산할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 진딧물의 PVY 보독여부 진단 프라이머로 PCR을 수행한 후의 전기영동 결과를 나타낸다 (M: 100bp 마커, 1: negative control, 2: PVY positive control, 3~5: PVY 보독 진딧물 (3: 복숭아혹진딧물 Myzus persicae, 4: 감자수염진딧물 Macrosiphum euphorbiae, 5: 목화진딧물 Aphis gossypii)

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 진딧물에서 감자 Y 바이러스 보독 여부를 검출하기 위한 프라이머 개발

진딧물에서 감자 Y 바이러스 보독 여부를 검출하기 위한 프라이머 개발하였다. 본 발명의 프라이머는 알려진 대부분의 PVY계통(N, O, NTN, N:O 등)을 검출 할 수 있도록 유전자은행(GenBank)에 등록되어 있는 염기서열(Genbank　Accession no.　AJ889866, AJ890342, EF026074, EF026076)을 정렬(alignment)하여 상동성이 매우 높은 부분을 확인한 후 100% 매치되는 부분의 서열을 바탕으로 제작하였다. 따라서 본 발명의 프라이머를 이용하면, 가능한 PVY 계통을 제한없이 한 번에 검출할 수 있으며, 본 발명의 프라이머는 일반유전자증폭장치와 실시간유전자증폭장치에서 모두 사용 가능하다. (최종산물의 길이: 273bp)

본 발명의 프라이머 서열은 다음과 같다.

PVY-CP-qF: GGCACATTTCTCAGATGTTGCA (서열번호 1)

PVY-CP-qR: GTGGTGTGCCTCTCTGTGT (서열번호 2)

실시예 2: 원스텝(one-step) RT- PCR 을 이용한 진딧물 보독 여부 진단

본 발명에서는 감자 Y 바이러스 벡터로 알려진 세가지 진딧물 종(Myzus persicae , Macrosiphum euphorbiae , Aphis gossypii)을 사용해 PVY 탐지 방법을 확인하였다.

먼저 진단하고자 하는 세가지 진딧물 종(Myzus persicae , Macrosiphum euphorbiae , Aphis gossypii)을 각각 멸균수, 실시 예 1에 따른 PVY 진단용 프라이머, 2.5mM MgCl₂를 넣은 후 94℃에서 5분간 반응시켰다. 그 후, 얼음에서 3분간 식힌 다음 진딧물을 꺼냈다. 이 후 one-step(cDNA 합성과정과 일반 PCR을 한꺼번에 진행하는 방법) RT-PCR을 수행하였다. PCR수행 시에는 해당 키트(Enzynomics, Korea)를 구입해서 사용하였다. PCR조건은 55℃에서 20분간 1cycle, 94℃에서 1분간 1cycle; 94℃에서 10초간, 55℃에서 10초간, 72℃에서 20초간 50cycles; 72℃에서 3분간 1cycle로 하여 수행하였다. PCR 산물은 1.8% 아가로즈 젤(agarose gel)에서 분석하였다.

본 발명의 상기 방법에서는 진딧물 구침(aphid stylet)으로부터 바이러스 RNA를 MgCl₂가 포함된 멸균수에 방출(releasing)되도록 한 후, 바이러스 외피단백질 유전자에 특이적인 실시예 1의 프라이머로 증폭하였다. 따라서 종래 RNA 추출 단계를 생략하고 매우 짧은 시간에 원스텝 RT-PCR 방법을 사용하여 추출된 PVY의 RNA로부터 PVY 바이러스 외피 유전자의 cDNA 를 합성할 수 있었다.

PCR 산물 분석 결과, 예상되는 위치에서 특이적인 밴드가 나타나는 것을 확인하였다(도 1). 따라서 본 발명의 프라이머 및 상기 진단방법을 통해 진딧물의 PVY 보독 여부를 명확히 판단할 수 있었다. 이와 같은 본 발명의 진단방법은 우량 씨감자 생산을 위해 적용할 수 있다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Republic Of Korea <120> DETECTING METHOD of POTATO VIRUS Y FROM AN APHID BY USING PCR <130> P14R12D0418 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY-CP-qF primer <400> 1 ggcacatttc tcagatgttg ca 22 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PVY-CP-qR primer <400> 2 gtggtgtgcc tctctgtgt 19

Claims (10)

1. 서열번호 1 및 서열번호 2로 기재되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 감자 Y 바이러스 (PVY; Potato virus Y) 진단용 프라이머 세트.
2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 진딧물에서 감자 Y 바이러스 보독 여부를 진단하기 위한 것을 특징으로 하는 감자 Y 바이러스 진단용 프라이머 세트.
3. 제2항에 있어서, 상기 진딧물은 복숭아혹진딧물(Myzus persicae), 감자수염진딧물(Macrosiphum euphorbiae) 또는 목화진딧물(Aphis gossypii)인 것을 특징으로 하는 감자 Y 바이러스 진단용 프라이머 세트.
4. i) 감자 Y 바이러스 보독 여부를 진단하기 위한 진딧물 및 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 혼합물을 가열하는 단계;
   ii) 상기 가열된 혼합물을 식힌 후, 진딧물을 제거하는 단계; 및
   iii) PCR을 수행하는 단계;
   를 포함하는 감자 Y 바이러스의 진단 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 PCR 수행 단계는 RT-PCR(reverse transcription PCR)로 수행하는 것을 특징으로 하는 감자 Y 바이러스의 진단 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 PCR 수행 단계는 RNA 추출과정 없이 원스텝 RT-PCR(ONE-STEP RT-PCR)로 수행하는 것을 특징으로 하는 감자 Y 바이러스의 진단 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 혼합물의 가열단계는 90 내지 110 ℃ 에서 2 내지 15분간 수행되는 것을 특징으로 하는 감자 Y 바이러스의 진단 방법.
8. 제4항에 있어서, 상기 혼합물은 멸균수에 MgCl₂를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 감자 Y 바이러스의 진단 방법.
9. 제4항에 있어서, 상기 진딧물은 복숭아혹진딧물(Myzus persicae), 감자수염진딧물(Macrosiphum euphorbiae) 또는 목화진딧물(Aphis gossypii)인 것을 특징으로 하는 감자 Y 바이러스의 진단 방법.
10. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 감자 Y 바이러스의 진단 키트.

Images