CN115029366A - 一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用 - Google Patents

一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用。以大肠杆菌为原始菌株，分别扩增并构建生物被膜形成关键基因的过表达质粒并转入原始菌株获得过表达菌株，辅以改性聚氨酯纤维作为生物被膜载体，从菌株和载体两个方面加速生物被膜的生长并提高生物被膜的产量，从而改善其催化性能。本发明方法制备的生物被膜的催化效率高催化性能稳定，为其在工业生产领域的应用提供了条件。

Description

一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮 苷类化合物上的应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用。
背景技术
生物被膜是指细菌附着在有生命或非生命的载体表面，分泌大量胞外聚合物，将自身包绕在其中而形成的结构化群落。在工业生产过程中，生物被膜具有自我再生、可持续和可扩展等诸多优势，具有巨大的应用潜力（Trends Biotechnol, 2009, 27(11): 636-643.）。然而，由于生物被膜生长慢、产量低等问题，限制了其实际应用效果。因此，加速工程菌生物被膜生长，提高生物被膜产量，是改善其工业催化性能的基础。
生物被膜的形成是一个广泛、动态、复杂的过程，是多因素共同作用的结果。其中，胞外聚合物是生物被膜的骨架，细菌通过分泌胞外聚合物以维持生物被膜的稳定性和完整性（PNAS, 2015, 112(36): 11353-11358.）；鞭毛和菌毛赋予了细菌粘附和运动性能，调节细菌的趋化和表面附着等行为，控制浮游菌向生物被膜过渡（Poultry Sci, 2022, 101(4): 101757.）；群体感应系统中大肠杆菌通过分泌信号分子AI-2调控包括生物被膜形成、抗生素合成在内的群体行为，使菌群在复杂的环境中能够协调一致，提高了抗逆性和环境适应性（Sci Adv, 2018, 4(6): r7063.）。CN110467252A公开了一种基于群体感应系统调控生物被膜形成的方法，通过优化群体感应信号分子类型和添加量，以提高污水处理生物膜形成速度和稳定性；CN111548955A公开了一种促进枯草芽孢杆菌生物被膜形成的方法，通过敲除枯草芽孢杆菌生物被膜抑制基因，以提高其生物被膜产量。目前，还未有报道比较分析胞外聚合物分泌基因、细菌运动性基因和群体感应相关基因对生物被膜形成的影响，用于筛选成膜能力强的菌株。因此，通过构建上述基因的过表达菌株，有望获得生物被膜形成能力强的菌株，从而增大生物被膜形成速度与产量。
载体为细菌提供了栖息安居地场所，是生物被膜生长的基础组成元件。载体性质直接影响细菌的粘附、生物被膜的发展和反应器系统的催化效果。合适的载体不仅有助于生物被膜的附着、生长、增殖和更新，而且可以增加其在相同体积系统中的生物总量，进一步提高反应器的催化效率。研究表明，载体与细菌的润湿性差异是相互作用的驱动力，即两者润湿性的差异越大，越有利于细菌在载体表面的附着生长（Environ Technol Inno,2021, 21:101233.）。CN112960766A公开了一种好氧生物被膜材料、制备方法，在发泡的过程中加入氧化海藻酸钠粉末作为填充物，大大提高了多孔聚氨酯泡沫颗粒的亲水性能和生物相容性能；CN107252680A公开了一种生物被膜载体的制备方法，通过在载体表面改性形成羟基磷酸钙膜层，提高载体表面湿润性，降低了微生物的附着难度，缩短了挂膜时间。然而，迄今还未有报道将强化菌株自身成膜能力与改性载体相结合，用于培植生物被膜催化剂。因此将两者相结合，从菌株和载体两个方面同时提高生物被膜形成速度和产量，对改善生物被膜催化性能具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中大肠杆菌的生物被膜生长慢、产量低的问题，本发明提供一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用，通过将过表达生物被膜形成关键基因与载体改性相结合，加速大肠杆菌生物被膜的生长，提高其产量，并应用于催化黄酮苷类化合物转化，从而提高其在工业生产中的应用潜力。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，包括以下步骤：
步骤1，扩增生物被膜形成关键基因，构建含有生物被膜形成关键基因质粒的重组质粒，再将重组质粒转入重组大肠杆菌体内，构建得到生物被膜形成能力强的过表达菌株；
步骤2，对生物被膜载体材料进行改性处理，并将改性后的材料填充于组培瓶中，添加LB培养基，再接入过表达菌株，培养形成生物被膜；
步骤3，向形成的生物被膜中添加诱导剂IPTG，调节培养温度，诱导生物被膜表达α-L-鼠李糖苷酶RhaB1。
作为改进的是，所述的生物被膜形成关键基因为群体感应基因、胞外聚合物分泌基因或运动性基因。
作为改进的是，所述群体感应基因为信号分子合成蛋白基因luxS，信号分子结合蛋白基因lsrB，或细菌密度调控子酸性磷酸酶基因aphA，所述胞外聚合物分泌基因为脂多糖合成蛋白基因rfaP，胞外多糖合成亚基基因pgaA，纤维素合成酶基因bcsA，或膜外多糖输出蛋白基因wza；所述运动性基因为卷曲菌毛合成蛋白基因csgD，菌毛粘附素基因fimC或鞭毛运动蛋白基因motB。
luxS基因片段序列：
ATGCCGTTGTTAGATAGCTTCACAGTCGATCATACCCGGATGGAAGCGCCTGCAGTTCGGGTGGCGAAAACAATGAACACCCCGCATGGCGACGCAATCACCGTGTTCGATCTGCGCTTCTGCGTGCCGAACAAAGAAGTGATGCCAGAAAGAGGGATCCATACCCTGGAGCACCTGTTTGCTGGTTTTATGCGTAACCATCTTAACGGTAATGGTGTAGAGATTATCGATATCTCGCCAATGGGCTGCCGCACCGGTTTTTATATGAGTCTGATTGGTACGCCAGATGAGCAGCGTGTTGCTGATGCCTGGAAAGCGGCAATGGAAGACGTGCTGAAAGTGCAGGATCAGAATCAGATCCCGGAACTGAACGTCTACCAGTGTGGCACTTACCAGATGCACTCGTTGCAGGAAGCGCAGGATATTGCGCGTAGCATTCTGGAACGTGACGTACGCATCAACAGCAACGAAGAACTGGCACTGCCGAAAGAGAAGTTGCAGGAACTGCACATCTAG
lsrB基因片段序列：
ATGACACTTCATCGCTTTAAGAAAATCGCCTTACTTAGCGTTCTTGGCATTGCCGCAATCTCTATGAATGTGCAGGCCGCAGAGCGTATTGCATTTATTCCCAAACTGGTTGGCGTGGGATTTTTTACCAGCGGTGGCAACGGCGCACAACAAGCGGGTAAAGAGCTGGGCGTTGATGTGACCTACGACGGGCCGACAGAACCCAGTGTTTCTGGTCAGGTACAGTTGATTAATAACTTCGTCAATCAAGGTTATAACGCCATTATCGTTTCTGCGGTTTCGCCTGATGGCTTGTGTCCGGCACTGAAACGCGCCATGCAACGTGGTGTGAGAGTGCTGACCTGGGACTCTGATACTAAACCGGAGTGCCGCTCTTACTACATTAATCAGGGAACGCCCGCCCAGTTGGGAGGTATGTTGGTGGATATGGCGGCGCGTCAGGTGAATAAAGACAAAGCCAAAGTCGCGTTTTTCTACTCAAGCCCCACCGTTACGGACCAAAACCAGTGGGTGAAAGAAGCGAAAGCGAAAATCGCCAAAGAGCATCCTGGCTGGGAAATTGTCACTACGCAGTTTGGCTATAACGATGCCACTAAATCATTACAAACCGCAGAAGGAATATTAAAAGCGTATAGCGATCTCGACGCCATTATCGCCCCCGATGCCAACGCCCTGCCCGCTGCCGCACAAGCCGCAGAAAACTTGAAAAATGACAAAGTAGCGATTGTCGGATTCAGTACGCCAAACGTGATGCGTCCATATGTGGAACGCGGCACGGTGAAAGAATTTGGCCTGTGGGATGTGGTTCAGCAAGGCAAAATTTCAGTGTATGTCGCGGATGCATTATTGAAAAAAGGATCAATGAAAACGGGCGACAAGCTGGATATCCAGGGCGTAGGTCAGGTTGAAGTCTCGCCAAATAGCGTTCAGGGCTATGACTACGAAGCGGATGGTAATGGCATCGTACTGTTACCGGAGCGCGTGATATTCAACAAAGAGAATATCGGCAAATACGATTTCTGA
aphA基因片段序列：
ATGCGCAAGATCACACAGGCAATCAGTGCCGTTTGCTTATTGTTCGCTCTAAACAGTTCCGCTGTTGCCCTGGCCTCATCTCCTTCACCGCTTAACCCTGGGACTAACGTTGCCAGGCTTGCTGAACAGGCACCCATTCATTGGGTTTCGGTCGCACAAATTGAAAATAGCCTCGCAGGGCGTCCGCCAATGGCGGTGGGGGTTGATATCGATGACACGGTACTTTTTTCCAGTCCGGGCTTCTGGCGCGGCAAAAAAACCTTCTCGCCAGAAAGCGAAGATTATCTGAAAAATCCTGTGTTCTGGGAAAAAATGAACAATGGCTGGGATGAATTCAGCATTCCAAAAGAGGTCGCTCGCCAGCTGATTGATATGCATGTACGCCGCGGTGACGCGATCTTCTTTGTGACTGGTCGTAGCCCGACGAAAACAGAAACGGTTTCAAAAACGCTGGCGGATAATTTTCATATTCCTGCCACCAACATGAATCCGGTGATCTTTGCGGGCGATAAACCAGGGCAAAATACAAAATCGCAATGGCTGCAGGATAAAAATATCCGAATTTTTTATGGCGATTCTGATAATGATATTACCGCCGCACGCGATGTCGGCGCTCGTGGTATCCGCATTCTGCGCGCCTCCAACTCTACCTACAAACCCTTGCCACAAGCGGGTGCGTTTGGTGAAGAGGTGATCGTCAATTCAGAATACTGA
rfaP基因片段序列：
ATGGTTGAACTTAAAGAGCCGTTTGCCACGTTATGGCGCGGTAAAGATCCTTTTGAGGAAGTTAAAACCTTGCAGGGTGAGGTTTTTCGTGAACTGGAAACTCGCCGCACTCTGCGATTTGAAATGGCGGGCAAAAGCTATTTTCTCAAATGGCATCGCGGCACGACCCTGAAAGAGATAATCAAAAATTTACTCTCATTGCGGATGCCAGTATTAGGCGCAGACCGCGAATGGAATGCGATTCATCGACTGCGGGATGTCGGCGTTGATACTATGTATGGGGTGGCATTTGGCGAAAAAGGTATTAATCCGCTGACCAGAACCTCGTTTATTATTACCGAAGATCTGACCCCAACCATCAGTCTGGAAGATTACTGTGCTGACTGGGCGACCAACCCACCAGATGTTCGCGTAAAGCGTATGCTTATTAAGCGTGTCGCGACGATGGTGCGCGATATGCATGCTGCGGGCATTAACCACCGTGACTGTTATATCTGTCATTTCCTGCTGCACTTGCCTTTTTCCGGTAAGGAAGAGGAGTTAAAAATTTCGGTAATTGACCTGCACCGGGCGCAGCTTCGCACGCGCGTTCCACGTCGTTGGCGCGATAAAGATCTTATTGGGCTTTATTTTTCTTCGATGAATATCGGCCTGACTCAGCGGGATATCTGGCGGTTTATGAAAGTGTATTTTGCCGCCCCGCTTAAAGACATTCTCAAGCAGGAACAAGGACTGCTGTCGCAAGCAGAAGCAAAAGCCACAAAAATCAGGGAAAGAACGATTCGAAAATCGTTGTAA
pgaA基因片段序列：
ATGTATTCAAGTAGCAGAAAAAGGTGCCCGAAAACCAAATGGGCTTTGAAACTTCTTACTGCCGCATTTTTAGCAGCGAGTCCCGCGGCGAAGAGTGCTGTTAATAACGCCTATGATGCATTGATTATTGAAGCTCGCAAGGGTAATACTCAGCCAGCTTTGTCATGGTTTGCACTAAAATCAGCACTCAGCAATAACCAAATTGCTGACTGGTTACAGATTGCCTTATGGGCCGGGCAAGATAAACAGGTTATTACCGTTTACAACCGCTACCGTCATCAGCAATTACCAGCGCGTGGTTATGCAGCTGTCGCCGTCGCTTATCGTAACCTGCAACAATGGCAAAACTCGCTTACACTGTGGCAAAAGGCGCTCTCTCTGGAGCCGCAAAATAAGGATTATCAACGGGGACAAATTTTAACCCTGGCAGATGCTGGTCACTATGATACTGCGCTGGTTAAACTTAAGCAGCTTAACTCTGGAGCACCGGACAAAGCCAATTTACTCGCAGAAGCCTATATCTATAAACTGGCGGGGCGTCATCAGGATGAATTACGGGCGATGACAGAGTCATTACCTGAAAATGCATCTACGCAACAATATCCCACAGAATACGTGCAGGCATTACGTAATAATCAACTTGCTGCCGCGATTGACGATGCCAATTTAACGCCAGATATTCGCGCTGATATTCATGCCGAACTGGTCAGACTGTCGTTTATGCCTACGCGCAGTGAAAGTGAACGTTATGCCATTGCCGATCGCGCCCTCGCCCAATACGCTGCATTAGAAATTCTGTGGCACGATAACCCAGACCGCACTGCCCAGTACCAGCGTATTCAGGTTGATCATCTTGGCGCGTTATTAACTCGCGATCGTTATAAAGACGTTATTTCTCACTATCAGCGATTAAAAAAGACGGGGCAAATTATTCCGCCCTGGGGGCAATATTGGGTTGCATCGGCTTATCTCAAAGATCATCAGCCGAAAAAAGCACAGTCAATAATGACCGAGCTCTTTTATCACAAGGAGACCATTGCCCCGGATTTATCCGATGAAGAACTTGCGGATCTCTTTTACAGCCACCTGGAGAGTGAAAATTATCCGGGCGCGCTAACTGTCACCCAACATACCATTAATACTTCGCCGCCTTTCCTTCGGTTAATGGGCACGCCTACGAGCATCCCGAATGATACCTGGTTACAGGGGCATTCGTTTCTCTCAACCGTAGCAAAATATAGTAATGATCTTCCTCAGGCTGAAATGACAGCCAGAGAGCTTGCTTATAACGCACCAGGAAATCAGGGACTGCGCATTGATTACGCGAGTGTGTTACAAGCCCGCGGTTGGCCTCGTGCAGCAGAAAATGAATTAAAAAAAGCAGAAGTGATCGAGCCACGTAATATTAATCTGGAGGTTGAACAAGCCTGGACAGCATTAACGTTACAAGAATGGCAGCAGGCAGCTGTCTTAACGCACGATGTTGTCGAACGTGAACCGCAAGATCCCGGCGTTGTACGATTAAAACGTGCGGTTGATGTACATAATCTTGCAGAGCTTCGTATCGCTGGCTCAACAGGAATTGATGCCGAAGGCCCGGATAGTGGTAAACATGATGTCGACTTAACCACCATCGTTTATTCACCACCGCTGAAGGATAACTGGCGCGGTTTTGCTGGATTCGGTTATGCCGATGGACAATTTAGCGAAGGAAAAGGGATTGTTCGCGACTGGCTTGCGGGTGTTGAGTGGCGGTCACGTAATATCTGGCTCGAGGCAGAGTACGCTGAACGCGTTTTCAATCATGAGCATAAACCCGGCGCGCGCCTGTCTGGCTGGTATGATTTTAATGATAACTGGCGTATTGGTTCGCAACTGGAACGCCTCTCTCACCGCGTTCCATTACGGGCAATGAAAAATGGTGTTACAGGCAACAGTGCTCAGGCTTATGTTCGCTGGTATCAAAATGAGCGGCGTAAGTACGGTGTCTCCTGGGCTTTCACTGATTTTTCCGACAGTAACCAGCGTCATGAAGTCTCACTTGAGGGTCAGGAACGCATCTGGTCTTCACCATATTTGATTGTCGATTTCCTACCCAGTCTGTATTACGAACAAAATACAGAACACGATACCCCATACTACAACCCTATAAAAACGTTCGATATTGTTCCGGCATTTGAGGCAAGCCATTTGTTATGGCGAAGCTATGAAAATAGCTGGGAGCAAATATTCAGCGCAGGTGTTGGTGCCTCCTGGCAAAAACATTATGGCACGGATGTCGTCACCCAACTCGGCTACGGGCAACGCATTAGTTGGAATGACGTGATTGATGCTGGCGCAACGCTACGCTGGGAAAAACGACCTTATGACGGTGACAGAGAACACAACTTATACGTTGAATTCGATATGACATTCAGATTTTAA
bcsA基因片段序列：
ATGAGTATCCTGACCCGGTGGTTGCTAATCCCGCCGGTCAACGCGCGGCTGATCGGGCGTTATCGCGATTATCGTCGCCACGGTGCGTCGGCTTTCAGCGCGACGCTCGGCTGTTTCTGGATGATCCTGGCCTGGATTTTTATTCCGCTGGAGCACCCGCGCTGGCAGCGTATTCGCGCAGAACATAAAAACCTGTATCCGCATATCAACGCCTCGCGTCCGCGTCCGCTGGACCCGGTCCGTTATCTCATTCAAACATGCTGGTTATTGATCGGTGCATCGCGCAAAGAAACGCCGAAACCGCGCAGGCGGGCATTTTCAGGTCTGCAAAATATTCGTGGACGTTACCATCAATGGATGAACGAGCTGCCTGAGCGCGTTAGCCATAAAACACAGCATCTTGATGAGAAAAAAGAGCTCGGTCATTTGAGTGCCGGGGCGCGGCGGTTGATCCTCGGTATCATCGTCACCTTCTCGCTGATTCTGGCGTTAATCTGCGTTACTCAGCCGTTTAACCCGCTGGCGCAGTTTATCTTCCTGATGCTGCTTTGGGGGGTAGCGCTGATCGTACGGCGGATGCCGGGGCGCTTCTCGGCGCTAATGTTGATTGTGCTGTCGCTGACCGTTTCTTGCCGTTATATCTGGTGGCGTTACACCTCTACGCTGAACTGGGACGATCCGGTCAGCCTGGTGTGCGGGCTTATTCTGCTCTTCGCTGAAACGTACGCGTGGATTGTGCTGGTGCTCGGCTACTTCCAGGTAGTATGGCCGCTGAATCGTCAGCCGGTGCCATTGCCGAAAGATATGTCGCTGTGGCCGTCGGTGGATATCTTTGTCCCGACTTACAACGAAGATCTCAACGTGGTGAAAAATACCATTTACGCCTCGCTGGGTATCGACTGGCCGAAAGATAAGCTGAATATCTGGATCCTTGATGACGGCGGCAGGGAAGAGTTTCGCCAGTTTGCGCAAAACGTGGGGGTGAAATATATCGCCCGCACCACTCATGAACATGCGAAAGCAGGCAACATCAACAATGCGCTGAAATATGCCAAAGGCGAGTTCGTGTCGATTTTCGACTGCGACCACGTACCAACGCGATCGTTCTTGCAAATGACCATGGGCTGGTTCCTGAAAGAAAAACAGCTGGCGATGATGCAGACGCCGCACCACTTCTTCTCACCGGACCCGTTTGAACGCAACCTGGGGCGTTTTCGTAAAACACCGAACGAAGGCACGCTGTTCTATGGTCTGGTGCAGGATGGCAACGATATGTGGGACGCCACTTTCTTCTGCGGTTCCTGTGCGGTGATTCGTCGTAAGCCGCTGGATGAAATTGGCGGCATTGCTGTCGAAACCGTGACTGAAGATGCGCATACTTCTCTGCGGTTGCACCGTCGTGGCTATACCTCCGCGTATATGCGTATTCCGCAGGCGGCGGGGCTGGCGACCGAAAGTCTGTCGGCGCATATCGGTCAGCGTATTCGCTGGGCGCGCGGGATGGTACAAATCTTCCGTCTCGATAACCCGCTCACCGGTAAAGGGCTGAAGTTTGCTCAGCGGCTATGTTACGTCAACGCCATGTTCCACTTCTTGTCGGGCATTCCACGGCTGATCTTCCTGACTGCGCCGCTGGCGTTCCTGCTGCTTCATGCCTACATCATCTATGCGCCAGCGTTGATGATCGCCCTATTCGTGCTGCCGCATATGATCCATGCCAGCCTGACCAACTCCAAGATCCAGGGCAAATATCGCCACTCTTTCTGGAGTGAAATCTACGAAACGGTGCTGGCGTGGTATATCGCACCACCGACGCTGGTGGCGCTGATTAACCCGCACAAAGGCAAATTTAACGTCACCGCCAAAGGTGGACTGGTGGAAGAAGAGTACGTCGACTGGGTGATCTCGCGGCCCTACATCTTCCTTGTCCTGCTCAACCTGGTGGGCGTTGCGGTAGGCATCTGGCGCTACTTCTATGGCCCGCCAACCGAGATGCTCACCGTGGTCGTCAGTATGGTGTGGGTATTCTACAACCTGATTGTTCTTGGCGGCGCAGTTGCGGTATCGGTAGAAAGCAAACAGGTACGCCGATCGCACCGCGTGGAGATGACGATGCCCGCGGCAATTGCCCGCGAAGATGGTCACCTCTTCTCGTGTACCGTTCAGGATTTCTCCGACGGTGGTTTGGGGATCAAGATCAACGGTCAGGCGCAGATTCTGGAAGGGCAGAAAGTGAATCTGTTGCTTAAACGCGGTCAGCAGGAATACGTCTTCCCGACCCAGGTGGCGCGCGTGATGGGTAATGAAGTTGGGCTGAAATTAATGCCGCTCACCACCCAGCAACATATCGATTTTGTGCAGTGTACGTTTGCCCGTGCGGATACATGGGCGCTCTGGCAGGACAGCTATCCGGAAGATAAGCCGCTGGAAAGTCTGCTGGATATTCTGAAGCTCGGCTTCCGTGGCTACCGCCATCTGGCGGAGTTTGCGCCTTCTTCGGTGAAGGGCATATTCCGTGTGCTGACTTCTCTGGTTTCCTGGGTTGTATCGTTTATTCCGCGCCGCCCGGAGCGGAGCGAAACGGCACAACCATCGGATCAGGCTTTGGCTCAACAATGA
wza基因片段序列：
ATGATGAAATCCAAAATGAAATTGATGCCATTATTGGTGTCAGTAACCTTGATAAGCGGTTGCACAGTACTTCCGGGCAGCAATATGTCGACGATGGGCAAAGACGTCATCAAACAGCAGGACGCTGATTTCGATCTCGACAAAATGGTGAATGTTTATCCGCTGACCCCGCGCCTGATTGACCAATTACGCCCACGCCCGAATGTAGCGCGCCCCAATATGACGCTGGAAAGTGAGATCGCGAATTACCAGTATCGCGTCGGGCCGGGGGACGTTCTTAATGTCACCGTCTGGGATCACCCGGAACTCACCACGCCAGCCGGTCAGTACCGCAGCTCCAGCGACACCGGCAACTGGGTACAGCCTGACGGCACTATGTTTTACCCGTATATCGGCAAGGTTCACGTAGTCGGGAAAACGCTCGCTGAAATCCGCAGTGATATTACCGGGCGCTTAGCGACGTACATCGCTGATCCGCAGGTGGACGTTAATATCGCCGCCTTCCGCTCACAAAAGGCCTATATCTCAGGTCAGGTGAATAAATCCGGTCAACAGGCGATCACCAACGTGCCACTGACTATTCTCGACGCCATCAACGCCGCAGGTGGCCTGACCGACACCGCTGACTGGCGCAACGTAGTGCTAACACACAATGGTCGTGAAGAACGCATTTCTTTGCAGGCGCTGATGCAAAACGGCGACCTCAATCAGAACCGACTGCTTTATCCCGGCGATATTCTCTACGTGCCCCGTAATGATGATCTGAAAGTATTTGTGATGGGTGAAGTGAAGAAACAGAGCACCCTGAAAATGGACTTTAGCGGCATGACCCTGACTGAAGCCCTGGGTAATGCTGAAGGTATCGACATGACCACCTCCAACGCCAGCGGCATCTTTGTCATTCGTCCGCTGAAAGGCGAGGGCGGGCGTAACGGCAAGATTGCCAATATCTACCAGCTGGATATGTCCGATGCCACGTCGCTGGTGATGGCGACAGAATTCCGCCTGCAACCTTATGACGTGGTGTATGTCACCACCGCCCCGGTTTCCCGCTGGAACCGTCTGATCAATCAGTTGCTGCCAACTATTAGCGGTGTCCGTTACATGACGGATACAGCCAGCGACATTCATAACTGGTAA
csgD基因片段序列：
ATGTTTAATGAAGTCCATAGTATTCATGGTCATACATTATTGTTGATCACTAAACCTTCTTTGCAGGCGACAGCTCTCTTGCAGCACCTTAAACAATCGCTGGCAATTACAGGAAAATTACATAATATTCAACGTTCTCTGGACGATATCTCTTCAGGCTCTATTATTCTTCTGGATATGATGGAAGCGGATAAAAAGCTTATCCATTATTGGCAGGATACTTTGAGCAGGAAAAACAACAATATCAAAATATTGTTGCTAAATACGCCTGAAGATTACCCGTACCGCGACATTGAAAACTGGCCTCATATCAACGGCGTTTTTTATTCCATGGAGGATCAAGAACGTGTTGTCAATGGGTTGCAAGGCGTCCTGCGCGGCGAATGCTACTTTACGCAAAAGCTTGCCAGCTACCTGATTACGCATTCAGGTAACTATCGTTATAACAGCACGGAATCAGTCCTCCTTACTCATCGGGAAAAAGAGATCCTGAATAAGCTGCGTATCGGCGCGTCTAATAACGAGATCGCTCGTTCGTTGTTCATCAGCGAAAATACGGTTAAAACGCATCTTTATAATCTTTTCAAGAAGATAGCCGTAAAAAACCGGACACAAGCGGTTTCCTGGGCAAACGATAACCTCAGGCGATAA
motB基因片段序列：
ATGAAGAATCAAGCGCATCCGATTATTGTCGTCAAACGACGCAAAGCCAAAAGCCACGGGGCAGCACATGGATCGTGGAAGATTGCTTATGCCGACTTTATGACTGCGATGATGGCCTTTTTTCTGGTGATGTGGCTGATCTCCATCTCCAGCCCAAAAGAGCTGATTCAGATTGCGGAGTACTTCCGGACTCCACTGGCGACTGCGGTTACGGGCGGCGATCGCATTTCTAATAGTGAAAGCCCAATTCCCGGCGGTGGTGATGATTACACCCAAAGCCAGGGGGAAGTGAATAAGCAGCCGAACATCGAAGAGCTGAAAAAACGCATGGAGCAAAGTCGATTGCGGAAATTGCGGGGTGATCTCGACCAGTTGATAGAGTCCGATCCGAAACTGCGGGCGTTACGTCCCCATCTCAAAATCGATCTGGTCCAGGAAGGTCTACGTATTCAGATCATCGATAGCCAGAATCGCCCGATGTTTAGAACCGGCAGTGCCGATGTCGAACCCTATATGCGCGACATTCTGCGCGCCATTGCGCCTGTACTGAACGGTATTCCCAACCGTATTAGCCTTTCAGGTCATACCGATGATTTCCCCTACGCCAGCGGTGAGAAAGGATATAGCAACTGGGAGCTTTCTGCCGATCGGGCCAATGCATCCCGCCGCGAACTGATGGTCGGAGGGTTGGATAGCGGCAAAGTGTTACGTGTCGTCGGCATGGCGGCAACGATGCGCTTAAGCGATCGCGGACCTGATGATGCCGTCAACCGTCGCATCAGCCTGCTGGTACTGAACAAACAAGCCGAACAGGCCATTTTGCATGAAAACGCCGAAAGCCAGAATGAGCCAGTAAGCGCCCTGGAAAAACCTGAGGTTGCACCACAGGTCAGTGTTCCCACAATGCCATCAGCCGAACCGAGGTGA
fimC基因片段序列：
GTGAGTAATAAAAACGTCAATGTAAGGAAATCGCAGGAAATAACATTCTGCTTGCTGGCAGGTATCCTGATGTTCATGGCAATGATGGTTGCCGGACGCGCTGAAGCGGGAGTGGCCTTAGGTGCGACTCGCGTAATTTATCCGGCAGGGCAAAAACAAGTGCAACTTGCCGTGACAAATAATGATGAAAATAGTACCTATTTAATTCAATCATGGGTGGAAAATGCCGATGGTGTAAAGGATGGTCGTTTTATCGTGACGCCTCCTCTGTTTGCGATGAAGGGAAAAAAAGAGAATACCTTACGTATTCTTGATGCAACAAATAACCAATTGCCACAGGACCGGGAAAGTTTATTCTGGATGAACGTTAAAGCGATTCCGTCAATGGATAAATCAAAATTGACTGAGAATACGCTACAGCTCGCAATTATCAGCCGCATTAAACTGTACTATCGCCCGGCTAAATTAGCGTTGCCACCCGATCAGGCCGCAGAAAAATTAAGATTTCGTCGTAGCGCGAATTCTCTGACGCTGATTAACCCGACACCCTATTACCTGACGGTAACAGAGTTGAATGCCGGAACCCGGGTTCTTGAAAATGCATTGGTGCCTCCAATGGGCGAAAGCACGGTTAAATTGCCTTCTGATGCAGGAAGCAATATTACTTACCGAACAATAAATGATTATGGCGCACTTACCCCCAAAATGACGGGCGTAATGGAATAA
作为改进的是，步骤2中所用的改性剂为质量分数0.01-50%的重铬酸钾溶液，改性处理得时间为0.1-48 h。
作为改进的是，所述的培养生物被膜是通过将构建得到的过表达菌株接种于培养液中，于15-60℃下培养。
作为改进的是，所述诱导剂IPTG添加于培养液中至终浓度为0.001-20 mmol/L，同时将培养温度降低5-55℃，诱导生物被膜表达α-L-鼠李糖苷酶RhaB1。
上述方法培养得到的表达α-L-鼠李糖苷酶RhaB1的生物被膜在黄酮苷类化合物的催化体系中的应用。
作为改进的是，所述黄酮苷类化合物的浓度为0.001-100 g/L，催化反应的温度为5-60℃，反应体系的反应pH为2-10，反应时间为0.1-72 h。
作为改进的是，所述黄酮苷类化合物的为芦丁或柚皮苷。
有益效果：
针对现有技术中大肠杆菌的生物被膜生长慢、产量低限制了其催化性能等问题，本发明提供一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用，一方面通过构建生物被膜形成关键基因的过表达菌株，以提高菌株自身的成膜能力；另一方面对生物被膜的粘附载体进行改性优化，以提高其表面的生物被膜挂膜量，从菌株和载体两个方面强化生物被膜催化剂的形成速度与产量，并将诱导表达RhaB1酶的生物被膜用于催化水解黄酮类化合物的应用中。本发明方法制备生物被膜催化剂具有更高的催化效率和更稳定的催化性能，为生物被膜催化桑树黄酮苷糖基定向改造提供了新的方法与技术。
附图说明
图1为一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用的流程图；
图2为PCR验证E. coli rhaB1-OE-luxS、E. coli rhaB1-OE-bcsA和E. colirhaB1-OE-csgD、E. coli rhaB1-OE-pgaA、E. coli rhaB1-OE-rfaP、E. coli rhaB1-OE-aphA、E. coli rhaB1-OE-fimC、E. coli rhaB1-OE-wza、E. coli rhaB1-OE-lsrB、E. colirhaB1-OE-motB十株过表达菌株；
图3为十株过表达菌株内对应过表达基因的表达量测定，其中，A：luxS基因在E. coli rhaB1-OE-luxS中的表达量，B：csgD基因在E. coli rhaB1-OE-csgD中的表达量，C：rfaP基因在E. coli rhaB1-OE-rfaP中的表达量，D：aphA基因在E. coli rhaB1-OE-aphA中的表达量，E：fimC基因在E. coli rhaB1-OE-fimC中的表达量，F：wza基因在E. coli rhaB1-OE-wza中的表达量，G：lsrB基因在E. coli rhaB1-OE-lsrB中的表达量，H：motB基因在E. coli rhaB1-OE-motB中的表达量，I：bcsA基因在E. coli rhaB1-OE-bcsA中的表达量，J：pgaA基因在E. coli rhaB1-OE-pgaA中的表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明所述的表达α-L-鼠李糖苷酶的E. coli BL21-pET21a-rhaB1原始菌株，是通过将α-L-鼠李糖苷酶基因rhaB1与表达载体pET21a定向连接后转入感受态细胞E.coliBL21获得（Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2018, 93:2671–2680）。
本发明所用的培养基，其他菌株，质粒均为市售材料。
实施例1 luxS基因过表达菌株构建
提取原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1的全基因组作为模板，根据NCBI下载的luxS基因序列设计上游引物luxS-F：TTATTGGGCCCATGCCGTTGTTAGATAGCTTC和下游引物luxS-R：TTGGGAATTCCATATGCTAGATGTGCAGTTCCTGC，进行PCR扩增luxS基因片段。
PCR反应体系为：2×Taq Mix 10 μL，上游引物luxS-F、下游引物luxS-R各0.4 μL，模板1 μL，加双蒸水补足至20 μL。
PCR反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，反应30个循环；72℃终延伸8 min。
PCR结束后回收luxS目的基因片段，利用T4 DNA连接酶将luxS目的基因片段与pGEM-T Easy载体按3：1的比例混合，在室温下孵育1 h，将其T-A黏性末端连接，获得过表达质粒pGEM-T-luxS。
通过热激法将pGEM-T- luxS质粒转入E. coli DH5α感受态细胞，并均匀涂布于带有氨苄霉素抗性(50 μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆接种到带有氨苄霉素抗性(50 μg/mL)的LB液体培养基中摇菌(4 mL)至OD600值为0.6-0.8，进行菌液PCR验证，提取质粒测序鉴定，将鉴定正确的质粒通过热激法转入E. coli BL21-pET21a-rhaB1原始菌株，获得过表达菌株E. coli rhaB1-OE-luxS。菌液PCR验证过表达菌株中luxS目的基因片段长度正确（图2），荧光定量PCR检测luxS基因在E. coli rhaB1-OE-luxS中表达量为在原始菌株的8.8倍（图3（A））。
实施例2 csgD基因过表达菌株构建
提取原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1的全基因组作为模板，根据NCBI下载的csgD基因序列设计上游引物csgD-F：TTATTGGGCCCATGTTTAATGAAGTCCATAG和下游引物csgD-R：TTAAAACTGCAGTTATCGCCTGAGGTTATCG，进行PCR扩增csgD基因片段。
PCR反应体系为：2×Taq Mix 10 μL，上游引物csgD-F、下游引物csgD-R各0.4 μL，模板1 μL，加双蒸水补足至20 μL。
PCR反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，反应30个循环；72℃终延伸8 min。
PCR结束后回收csgD目的基因片段，利用T4 DNA连接酶将csgD目的基因片段与pGEM-T Easy载体按4：1的比例混合，在室温下孵育1 h，将其T-A黏性末端连接，获得过表达质粒pGEM-T-csgD。
通过热激法将pGEM-T-csgD质粒转入E. coli DH5α感受态细胞，并均匀涂布于带有氨苄霉素抗性(50 μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆接种到带有氨苄霉素抗性(50 μg/mL)的LB液体培养基中摇菌(4 mL)至OD600值为0.6-0.8，进行菌液PCR验证，提取质粒测序鉴定，将鉴定正确的质粒通过热激法转入E. coli BL21-pET21a-rhaB1原始菌株，获得过表达菌株E. coli rhaB1-OE-csgD。菌液PCR验证过表达菌株中csgD目的基因片段长度正确（图2），荧光定量PCR检测csgD基因在E. coli rhaB1-OE-csgD中表达量为在原始菌株的11.8倍（图3（B））。
实施例3 rfaP基因过表达菌株构建
提取原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1的全基因组作为模板，根据NCBI下载的rfaP基因序列设计上游引物rfaP-F：TTATTGGGCCCATGGTTGAACTTAAAGAGCCG和下游引物rfaP-R：GCAAAACTGCAGTTACAACGATTTTCGAATCG，进行PCR扩增rfaP基因片段。
PCR反应体系为：2×Taq Mix 10 μL，上游引物rfaP-F、下游引物rfaP-R各0.4 μL，模板1 μL，加双蒸水补足至20 μL。
PCR反应条件为：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，反应30个循环；72℃终延伸8 min。
PCR结束后回收rfaP目的基因片段，利用T4 DNA连接酶将rfaP目的基因片段与pGEM-T Easy载体按5：1的比例混合，在室温下孵育1 h，将其T-A黏性末端连接，获得过表达质粒pGEM-T-rfaP。
通过热激法将pGEM-T-rfaP质粒转入E. coli DH5α感受态细胞，并均匀涂布于带有氨苄霉素抗性(50 μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆接种到带有氨苄霉素抗性(50 μg/mL)的LB液体培养基中摇菌(4 mL)至OD600值为0.6-0.8，进行菌液PCR验证，提取质粒测序鉴定，将鉴定正确的质粒通过热激法转入E. coli BL21-pET21a-rhaB1原始菌株，获得过表达菌株E. coli rhaB1-OE-rfaP。菌液PCR验证过表达菌株中rfaP目的基因片段长度正确（图2），荧光定量PCR检测rfaP基因在E. coli rhaB1-OE-rfaP中表达量为在原始菌株的16.1倍（图3（C））。
实施例4 luxS基因过表达菌株生物被膜制备
将聚氨酯纤维（直径70 mm，厚度5 mm，孔径60 ppi）置于30%的重铬酸钾水溶液中浸泡改性24 h，用纯水洗涤后作为生物被膜粘附载体备用；在350 mL玻璃组培瓶内填充将聚氨酯纤维载体，并添加50 mL LB培养基后高温高压灭菌。luxS过表达菌株E. coli rhaB1-OE-luxS和原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1按1%比例分别接种于灭菌的组培瓶中，放入40℃恒温培养箱中培养生物被膜。然后取出培养完成的组培瓶，倒掉多余的培养液，用PBS缓冲液分别清洗组培瓶内的聚氨酯纤维载体3次去除浮游的细菌，将组培瓶放置在室温下晾干，紧接着再加入0.1%结晶紫染色液，室温静置染色30 min，倒掉结晶紫染色液，再用PBS缓冲液洗去结晶紫浮沫，室温干燥30 min，最后加入95%的乙醇溶解吸附于生物被膜上的结晶紫30 min，利用全波长酶标仪测其在595nm处的吸光度值（OD595），作为生物被膜形成量即产量的指标。
结果发现，原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1生物被膜产量为OD595=0.907；而luxS过表达菌株E. coli rhaB1-OE-luxS生物被膜产量为OD595=1.551，提高了1.71倍。
实施例5 csgD基因过表达菌株生物被膜制备
将聚氨酯纤维（直径70 mm，厚度5 mm，孔径60 ppi）置于15%的重铬酸钾水溶液中浸泡改性12 h，用纯水洗涤后作为生物被膜粘附载体备用；在350 mL玻璃组培瓶内填充将聚氨酯纤维载体，并添加50 mL LB培养基后高温高压灭菌。csgD过表达菌株E. coli rhaB1-OE-csgD和原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1按1%比例接种于灭菌的组培瓶中，放入30℃恒温培养箱中培养生物被膜。然后取出培养完成的组培瓶，倒掉多余的培养液，用PBS缓冲液分别清洗组培瓶内的聚氨酯纤维载体3次去除浮游的细菌，将组培瓶放置在室温下晾干，紧接着再加入0.1%结晶紫染色液，室温静置染色30 min，倒掉结晶紫染色液，再用PBS缓冲液洗去结晶紫浮沫，室温干燥30 min，最后加入95%的乙醇溶解吸附于生物被膜上的结晶紫30 min，利用全波长酶标仪测其在595nm处的吸光度值（OD595），作为生物被膜形成量即产量的指标。
结果发现，原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1生物被膜产量为OD595=0.865；而csgD过表达菌株E. coli rhaB1-OE-csgD生物被膜产量为OD595=1.297，提高了1.50倍。
实施例6 rfaP基因过表达菌株生物被膜制备
将聚氨酯纤维（直径70 mm，厚度5 mm，孔径60 ppi）置于0.01%的重铬酸钾水溶液中浸泡改性0.1 h，用纯水洗涤后作为生物被膜粘附载体备用；在350 mL玻璃组培瓶内填充将聚氨酯纤维载体，并添加50 mL LB培养基后高温高压灭菌。rfaP过表达菌株E. coli rhaB1-OE-rfaP和原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1按1%比例接种于灭菌的组培瓶中，放入20℃恒温培养箱中培养生物被膜。然后取出培养完成的组培瓶，倒掉多余的培养液，用PBS缓冲液分别清洗组培瓶内的聚氨酯纤维载体3次去除浮游的细菌，将组培瓶放置在室温下晾干，紧接着再加入0.1%结晶紫染色液，室温静置染色30 min，倒掉结晶紫染色液，再用PBS缓冲液洗去结晶紫浮沫，室温干燥30 min，最后加入95%的乙醇溶解吸附于生物被膜上的结晶紫30 min，利用全波长酶标仪测其在595nm处的吸光度值（OD595），作为生物被膜形成量即产量的指标。
结果发现，原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1生物被膜产量为OD595=0.727；而rfaP过表达菌株E. coli rhaB1-OE-rfaP生物被膜产量为OD595=0.873，提高了1.20倍。
实施例7 luxS基因过表达菌株生物被膜催化性能测定
按实施例4的条件分别培养luxS过表达菌株E. coli rhaB1-OE-luxS和原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1的生物被膜，并将IPTG添加于生物被膜培养液中至终浓度为10 mmol/L，同时将培养温度调至40℃诱导生物被膜表达α-L-鼠李糖苷酶RhaB1，倒掉LB培养基并使用PBS缓冲液清洗浮游细菌，剩余粘附在瓶内聚氨酯纤维上的生物被膜作为催化剂备用。向生物被膜催化剂内添加浓度为1 g/L，pH为6.5的底物芦丁水溶液，于40℃下，反应催化。反应结束后取1 mL反应液加入等体积的色谱级甲醇充分混合，经0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC检测产物异槲皮苷和底物芦丁的含量。
结果发现，原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1生物被膜催化得率为21.93%；而luxS过表达菌株E. coli rhaB1-OE-luxS生物被膜催化得率为28.44%，提高了1.30倍。
实施例8 csgD基因过表达菌株生物被膜催化性能测定
按实施例5的条件分别培养csgD过表达菌株E. coli rhaB1-OE-csgD和原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1的生物被膜，并将IPTG添加于生物被膜培养液中至终浓度为2mmol/L，同时将培养温度降至25℃低温诱导生物被膜表达α-L-鼠李糖苷酶RhaB1，倒掉LB培养基并使用PBS缓冲液清洗浮游细菌，剩余粘附在瓶内聚氨酯纤维上的生物被膜作为催化剂备用。向生物被膜催化剂内添加浓度为0.1 g/L，pH为5.5的底物芦丁水溶液，于30℃下，反应催化。反应结束后取1 mL反应液加入等体积的色谱级甲醇充分混合，经0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC检测产物异槲皮苷和底物芦丁的含量。
结果发现，原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1生物被膜催化得率为47.62%；而csgD过表达菌株E. coli rhaB1-OE-csgD生物被膜催化得率为63.15%，提高了1.33倍。
实施例9 rfaP基因过表达菌株生物被膜催化性能测定
按实施例6的条件分别培养rfaP过表达菌株E. coli rhaB1-OE-rfaP和原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1的生物被膜，并将IPTG添加于生物被膜培养液中至终浓度为0.001 mmol/L，同时将培养温度降至15℃低温诱导生物被膜表达α-L-鼠李糖苷酶RhaB1，倒掉LB培养基并使用PBS缓冲液清洗浮游细菌，剩余粘附在瓶内聚氨酯纤维上的生物被膜作为催化剂备用。向生物被膜催化剂内添加浓度为0.001 g/L，pH为4.5的底物芦丁水溶液，于20℃下，反应催化。反应结束后取1 mL反应液加入等体积的色谱级甲醇充分混合，经0.45 μm滤膜过滤后进行HPLC检测产物异槲皮苷和底物芦丁的含量。
结果发现，原始菌株E. coli BL21-pET21a-rhaB1生物被膜催化得率为35.44%；而rfaP过表达菌株E. coli rhaB1-OE-rfaP生物被膜催化得率为44.23%，提高了1.25倍。
综上所述，一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用，通过将过表达生物被膜形成关键基因与载体改性相结合，加速大肠杆菌生物被膜的生长，提高其产量，并应用于催化黄酮苷类化合物转化，从而提高其在工业生产中的应用潜力。
序列表
<110> 江苏科技大学
<120> 一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 516
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgccgttgt tagatagctt cacagtcgat catacccgga tggaagcgcc tgcagttcgg 60
gtggcgaaaa caatgaacac cccgcatggc gacgcaatca ccgtgttcga tctgcgcttc 120
tgcgtgccga acaaagaagt gatgccagaa agagggatcc ataccctgga gcacctgttt 180
gctggtttta tgcgtaacca tcttaacggt aatggtgtag agattatcga tatctcgcca 240
atgggctgcc gcaccggttt ttatatgagt ctgattggta cgccagatga gcagcgtgtt 300
gctgatgcct ggaaagcggc aatggaagac gtgctgaaag tgcaggatca gaatcagatc 360
ccggaactga acgtctacca gtgtggcact taccagatgc actcgttgca ggaagcgcag 420
gatattgcgc gtagcattct ggaacgtgac gtacgcatca acagcaacga agaactggca 480
ctgccgaaag agaagttgca ggaactgcac atctag 516
<210> 2
<211> 1023
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgacacttc atcgctttaa gaaaatcgcc ttacttagcg ttcttggcat tgccgcaatc 60
tctatgaatg tgcaggccgc agagcgtatt gcatttattc ccaaactggt tggcgtggga 120
ttttttacca gcggtggcaa cggcgcacaa caagcgggta aagagctggg cgttgatgtg 180
acctacgacg ggccgacaga acccagtgtt tctggtcagg tacagttgat taataacttc 240
gtcaatcaag gttataacgc cattatcgtt tctgcggttt cgcctgatgg cttgtgtccg 300
gcactgaaac gcgccatgca acgtggtgtg agagtgctga cctgggactc tgatactaaa 360
ccggagtgcc gctcttacta cattaatcag ggaacgcccg cccagttggg aggtatgttg 420
gtggatatgg cggcgcgtca ggtgaataaa gacaaagcca aagtcgcgtt tttctactca 480
agccccaccg ttacggacca aaaccagtgg gtgaaagaag cgaaagcgaa aatcgccaaa 540
gagcatcctg gctgggaaat tgtcactacg cagtttggct ataacgatgc cactaaatca 600
ttacaaaccg cagaaggaat attaaaagcg tatagcgatc tcgacgccat tatcgccccc 660
gatgccaacg ccctgcccgc tgccgcacaa gccgcagaaa acttgaaaaa tgacaaagta 720
gcgattgtcg gattcagtac gccaaacgtg atgcgtccat atgtggaacg cggcacggtg 780
aaagaatttg gcctgtggga tgtggttcag caaggcaaaa tttcagtgta tgtcgcggat 840
gcattattga aaaaaggatc aatgaaaacg ggcgacaagc tggatatcca gggcgtaggt 900
caggttgaag tctcgccaaa tagcgttcag ggctatgact acgaagcgga tggtaatggc 960
atcgtactgt taccggagcg cgtgatattc aacaaagaga atatcggcaa atacgatttc 1020
tga 1023
<210> 3
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcgcaaga tcacacaggc aatcagtgcc gtttgcttat tgttcgctct aaacagttcc 60
gctgttgccc tggcctcatc tccttcaccg cttaaccctg ggactaacgt tgccaggctt 120
gctgaacagg cacccattca ttgggtttcg gtcgcacaaa ttgaaaatag cctcgcaggg 180
cgtccgccaa tggcggtggg ggttgatatc gatgacacgg tacttttttc cagtccgggc 240
ttctggcgcg gcaaaaaaac cttctcgcca gaaagcgaag attatctgaa aaatcctgtg 300
ttctgggaaa aaatgaacaa tggctgggat gaattcagca ttccaaaaga ggtcgctcgc 360
cagctgattg atatgcatgt acgccgcggt gacgcgatct tctttgtgac tggtcgtagc 420
ccgacgaaaa cagaaacggt ttcaaaaacg ctggcggata attttcatat tcctgccacc 480
aacatgaatc cggtgatctt tgcgggcgat aaaccagggc aaaatacaaa atcgcaatgg 540
ctgcaggata aaaatatccg aattttttat ggcgattctg ataatgatat taccgccgca 600
cgcgatgtcg gcgctcgtgg tatccgcatt ctgcgcgcct ccaactctac ctacaaaccc 660
ttgccacaag cgggtgcgtt tggtgaagag gtgatcgtca attcagaata ctga 714
<210> 4
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggttgaac ttaaagagcc gtttgccacg ttatggcgcg gtaaagatcc ttttgaggaa 60
gttaaaacct tgcagggtga ggtttttcgt gaactggaaa ctcgccgcac tctgcgattt 120
gaaatggcgg gcaaaagcta ttttctcaaa tggcatcgcg gcacgaccct gaaagagata 180
atcaaaaatt tactctcatt gcggatgcca gtattaggcg cagaccgcga atggaatgcg 240
attcatcgac tgcgggatgt cggcgttgat actatgtatg gggtggcatt tggcgaaaaa 300
ggtattaatc cgctgaccag aacctcgttt attattaccg aagatctgac cccaaccatc 360
agtctggaag attactgtgc tgactgggcg accaacccac cagatgttcg cgtaaagcgt 420
atgcttatta agcgtgtcgc gacgatggtg cgcgatatgc atgctgcggg cattaaccac 480
cgtgactgtt atatctgtca tttcctgctg cacttgcctt tttccggtaa ggaagaggag 540
ttaaaaattt cggtaattga cctgcaccgg gcgcagcttc gcacgcgcgt tccacgtcgt 600
tggcgcgata aagatcttat tgggctttat ttttcttcga tgaatatcgg cctgactcag 660
cgggatatct ggcggtttat gaaagtgtat tttgccgccc cgcttaaaga cattctcaag 720
caggaacaag gactgctgtc gcaagcagaa gcaaaagcca caaaaatcag ggaaagaacg 780
attcgaaaat cgttgtaa 798
<210> 5
<211> 2424
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgtattcaa gtagcagaaa aaggtgcccg aaaaccaaat gggctttgaa acttcttact 60
gccgcatttt tagcagcgag tcccgcggcg aagagtgctg ttaataacgc ctatgatgca 120
ttgattattg aagctcgcaa gggtaatact cagccagctt tgtcatggtt tgcactaaaa 180
tcagcactca gcaataacca aattgctgac tggttacaga ttgccttatg ggccgggcaa 240
gataaacagg ttattaccgt ttacaaccgc taccgtcatc agcaattacc agcgcgtggt 300
tatgcagctg tcgccgtcgc ttatcgtaac ctgcaacaat ggcaaaactc gcttacactg 360
tggcaaaagg cgctctctct ggagccgcaa aataaggatt atcaacgggg acaaatttta 420
accctggcag atgctggtca ctatgatact gcgctggtta aacttaagca gcttaactct 480
ggagcaccgg acaaagccaa tttactcgca gaagcctata tctataaact ggcggggcgt 540
catcaggatg aattacgggc gatgacagag tcattacctg aaaatgcatc tacgcaacaa 600
tatcccacag aatacgtgca ggcattacgt aataatcaac ttgctgccgc gattgacgat 660
gccaatttaa cgccagatat tcgcgctgat attcatgccg aactggtcag actgtcgttt 720
atgcctacgc gcagtgaaag tgaacgttat gccattgccg atcgcgccct cgcccaatac 780
gctgcattag aaattctgtg gcacgataac ccagaccgca ctgcccagta ccagcgtatt 840
caggttgatc atcttggcgc gttattaact cgcgatcgtt ataaagacgt tatttctcac 900
tatcagcgat taaaaaagac ggggcaaatt attccgccct gggggcaata ttgggttgca 960
tcggcttatc tcaaagatca tcagccgaaa aaagcacagt caataatgac cgagctcttt 1020
tatcacaagg agaccattgc cccggattta tccgatgaag aacttgcgga tctcttttac 1080
agccacctgg agagtgaaaa ttatccgggc gcgctaactg tcacccaaca taccattaat 1140
acttcgccgc ctttccttcg gttaatgggc acgcctacga gcatcccgaa tgatacctgg 1200
ttacaggggc attcgtttct ctcaaccgta gcaaaatata gtaatgatct tcctcaggct 1260
gaaatgacag ccagagagct tgcttataac gcaccaggaa atcagggact gcgcattgat 1320
tacgcgagtg tgttacaagc ccgcggttgg cctcgtgcag cagaaaatga attaaaaaaa 1380
gcagaagtga tcgagccacg taatattaat ctggaggttg aacaagcctg gacagcatta 1440
acgttacaag aatggcagca ggcagctgtc ttaacgcacg atgttgtcga acgtgaaccg 1500
caagatcccg gcgttgtacg attaaaacgt gcggttgatg tacataatct tgcagagctt 1560
cgtatcgctg gctcaacagg aattgatgcc gaaggcccgg atagtggtaa acatgatgtc 1620
gacttaacca ccatcgttta ttcaccaccg ctgaaggata actggcgcgg ttttgctgga 1680
ttcggttatg ccgatggaca atttagcgaa ggaaaaggga ttgttcgcga ctggcttgcg 1740
ggtgttgagt ggcggtcacg taatatctgg ctcgaggcag agtacgctga acgcgttttc 1800
aatcatgagc ataaacccgg cgcgcgcctg tctggctggt atgattttaa tgataactgg 1860
cgtattggtt cgcaactgga acgcctctct caccgcgttc cattacgggc aatgaaaaat 1920
ggtgttacag gcaacagtgc tcaggcttat gttcgctggt atcaaaatga gcggcgtaag 1980
tacggtgtct cctgggcttt cactgatttt tccgacagta accagcgtca tgaagtctca 2040
cttgagggtc aggaacgcat ctggtcttca ccatatttga ttgtcgattt cctacccagt 2100
ctgtattacg aacaaaatac agaacacgat accccatact acaaccctat aaaaacgttc 2160
gatattgttc cggcatttga ggcaagccat ttgttatggc gaagctatga aaatagctgg 2220
gagcaaatat tcagcgcagg tgttggtgcc tcctggcaaa aacattatgg cacggatgtc 2280
gtcacccaac tcggctacgg gcaacgcatt agttggaatg acgtgattga tgctggcgca 2340
acgctacgct gggaaaaacg accttatgac ggtgacagag aacacaactt atacgttgaa 2400
ttcgatatga cattcagatt ttaa 2424
<210> 6
<211> 2619
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgagtatcc tgacccggtg gttgctaatc ccgccggtca acgcgcggct gatcgggcgt 60
tatcgcgatt atcgtcgcca cggtgcgtcg gctttcagcg cgacgctcgg ctgtttctgg 120
atgatcctgg cctggatttt tattccgctg gagcacccgc gctggcagcg tattcgcgca 180
gaacataaaa acctgtatcc gcatatcaac gcctcgcgtc cgcgtccgct ggacccggtc 240
cgttatctca ttcaaacatg ctggttattg atcggtgcat cgcgcaaaga aacgccgaaa 300
ccgcgcaggc gggcattttc aggtctgcaa aatattcgtg gacgttacca tcaatggatg 360
aacgagctgc ctgagcgcgt tagccataaa acacagcatc ttgatgagaa aaaagagctc 420
ggtcatttga gtgccggggc gcggcggttg atcctcggta tcatcgtcac cttctcgctg 480
attctggcgt taatctgcgt tactcagccg tttaacccgc tggcgcagtt tatcttcctg 540
atgctgcttt ggggggtagc gctgatcgta cggcggatgc cggggcgctt ctcggcgcta 600
atgttgattg tgctgtcgct gaccgtttct tgccgttata tctggtggcg ttacacctct 660
acgctgaact gggacgatcc ggtcagcctg gtgtgcgggc ttattctgct cttcgctgaa 720
acgtacgcgt ggattgtgct ggtgctcggc tacttccagg tagtatggcc gctgaatcgt 780
cagccggtgc cattgccgaa agatatgtcg ctgtggccgt cggtggatat ctttgtcccg 840
acttacaacg aagatctcaa cgtggtgaaa aataccattt acgcctcgct gggtatcgac 900
tggccgaaag ataagctgaa tatctggatc cttgatgacg gcggcaggga agagtttcgc 960
cagtttgcgc aaaacgtggg ggtgaaatat atcgcccgca ccactcatga acatgcgaaa 1020
gcaggcaaca tcaacaatgc gctgaaatat gccaaaggcg agttcgtgtc gattttcgac 1080
tgcgaccacg taccaacgcg atcgttcttg caaatgacca tgggctggtt cctgaaagaa 1140
aaacagctgg cgatgatgca gacgccgcac cacttcttct caccggaccc gtttgaacgc 1200
aacctggggc gttttcgtaa aacaccgaac gaaggcacgc tgttctatgg tctggtgcag 1260
gatggcaacg atatgtggga cgccactttc ttctgcggtt cctgtgcggt gattcgtcgt 1320
aagccgctgg atgaaattgg cggcattgct gtcgaaaccg tgactgaaga tgcgcatact 1380
tctctgcggt tgcaccgtcg tggctatacc tccgcgtata tgcgtattcc gcaggcggcg 1440
gggctggcga ccgaaagtct gtcggcgcat atcggtcagc gtattcgctg ggcgcgcggg 1500
atggtacaaa tcttccgtct cgataacccg ctcaccggta aagggctgaa gtttgctcag 1560
cggctatgtt acgtcaacgc catgttccac ttcttgtcgg gcattccacg gctgatcttc 1620
ctgactgcgc cgctggcgtt cctgctgctt catgcctaca tcatctatgc gccagcgttg 1680
atgatcgccc tattcgtgct gccgcatatg atccatgcca gcctgaccaa ctccaagatc 1740
cagggcaaat atcgccactc tttctggagt gaaatctacg aaacggtgct ggcgtggtat 1800
atcgcaccac cgacgctggt ggcgctgatt aacccgcaca aaggcaaatt taacgtcacc 1860
gccaaaggtg gactggtgga agaagagtac gtcgactggg tgatctcgcg gccctacatc 1920
ttccttgtcc tgctcaacct ggtgggcgtt gcggtaggca tctggcgcta cttctatggc 1980
ccgccaaccg agatgctcac cgtggtcgtc agtatggtgt gggtattcta caacctgatt 2040
gttcttggcg gcgcagttgc ggtatcggta gaaagcaaac aggtacgccg atcgcaccgc 2100
gtggagatga cgatgcccgc ggcaattgcc cgcgaagatg gtcacctctt ctcgtgtacc 2160
gttcaggatt tctccgacgg tggtttgggg atcaagatca acggtcaggc gcagattctg 2220
gaagggcaga aagtgaatct gttgcttaaa cgcggtcagc aggaatacgt cttcccgacc 2280
caggtggcgc gcgtgatggg taatgaagtt gggctgaaat taatgccgct caccacccag 2340
caacatatcg attttgtgca gtgtacgttt gcccgtgcgg atacatgggc gctctggcag 2400
gacagctatc cggaagataa gccgctggaa agtctgctgg atattctgaa gctcggcttc 2460
cgtggctacc gccatctggc ggagtttgcg ccttcttcgg tgaagggcat attccgtgtg 2520
ctgacttctc tggtttcctg ggttgtatcg tttattccgc gccgcccgga gcggagcgaa 2580
acggcacaac catcggatca ggctttggct caacaatga 2619
<210> 7
<211> 1140
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgatgaaat ccaaaatgaa attgatgcca ttattggtgt cagtaacctt gataagcggt 60
tgcacagtac ttccgggcag caatatgtcg acgatgggca aagacgtcat caaacagcag 120
gacgctgatt tcgatctcga caaaatggtg aatgtttatc cgctgacccc gcgcctgatt 180
gaccaattac gcccacgccc gaatgtagcg cgccccaata tgacgctgga aagtgagatc 240
gcgaattacc agtatcgcgt cgggccgggg gacgttctta atgtcaccgt ctgggatcac 300
ccggaactca ccacgccagc cggtcagtac cgcagctcca gcgacaccgg caactgggta 360
cagcctgacg gcactatgtt ttacccgtat atcggcaagg ttcacgtagt cgggaaaacg 420
ctcgctgaaa tccgcagtga tattaccggg cgcttagcga cgtacatcgc tgatccgcag 480
gtggacgtta atatcgccgc cttccgctca caaaaggcct atatctcagg tcaggtgaat 540
aaatccggtc aacaggcgat caccaacgtg ccactgacta ttctcgacgc catcaacgcc 600
gcaggtggcc tgaccgacac cgctgactgg cgcaacgtag tgctaacaca caatggtcgt 660
gaagaacgca tttctttgca ggcgctgatg caaaacggcg acctcaatca gaaccgactg 720
ctttatcccg gcgatattct ctacgtgccc cgtaatgatg atctgaaagt atttgtgatg 780
ggtgaagtga agaaacagag caccctgaaa atggacttta gcggcatgac cctgactgaa 840
gccctgggta atgctgaagg tatcgacatg accacctcca acgccagcgg catctttgtc 900
attcgtccgc tgaaaggcga gggcgggcgt aacggcaaga ttgccaatat ctaccagctg 960
gatatgtccg atgccacgtc gctggtgatg gcgacagaat tccgcctgca accttatgac 1020
gtggtgtatg tcaccaccgc cccggtttcc cgctggaacc gtctgatcaa tcagttgctg 1080
ccaactatta gcggtgtccg ttacatgacg gatacagcca gcgacattca taactggtaa 1140
<210> 8
<211> 651
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtttaatg aagtccatag tattcatggt catacattat tgttgatcac taaaccttct 60
ttgcaggcga cagctctctt gcagcacctt aaacaatcgc tggcaattac aggaaaatta 120
cataatattc aacgttctct ggacgatatc tcttcaggct ctattattct tctggatatg 180
atggaagcgg ataaaaagct tatccattat tggcaggata ctttgagcag gaaaaacaac 240
aatatcaaaa tattgttgct aaatacgcct gaagattacc cgtaccgcga cattgaaaac 300
tggcctcata tcaacggcgt tttttattcc atggaggatc aagaacgtgt tgtcaatggg 360
ttgcaaggcg tcctgcgcgg cgaatgctac tttacgcaaa agcttgccag ctacctgatt 420
acgcattcag gtaactatcg ttataacagc acggaatcag tcctccttac tcatcgggaa 480
aaagagatcc tgaataagct gcgtatcggc gcgtctaata acgagatcgc tcgttcgttg 540
ttcatcagcg aaaatacggt taaaacgcat ctttataatc ttttcaagaa gatagccgta 600
aaaaaccgga cacaagcggt ttcctgggca aacgataacc tcaggcgata a 651
<210> 9
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgaagaatc aagcgcatcc gattattgtc gtcaaacgac gcaaagccaa aagccacggg 60
gcagcacatg gatcgtggaa gattgcttat gccgacttta tgactgcgat gatggccttt 120
tttctggtga tgtggctgat ctccatctcc agcccaaaag agctgattca gattgcggag 180
tacttccgga ctccactggc gactgcggtt acgggcggcg atcgcatttc taatagtgaa 240
agcccaattc ccggcggtgg tgatgattac acccaaagcc agggggaagt gaataagcag 300
ccgaacatcg aagagctgaa aaaacgcatg gagcaaagtc gattgcggaa attgcggggt 360
gatctcgacc agttgataga gtccgatccg aaactgcggg cgttacgtcc ccatctcaaa 420
atcgatctgg tccaggaagg tctacgtatt cagatcatcg atagccagaa tcgcccgatg 480
tttagaaccg gcagtgccga tgtcgaaccc tatatgcgcg acattctgcg cgccattgcg 540
cctgtactga acggtattcc caaccgtatt agcctttcag gtcataccga tgatttcccc 600
tacgccagcg gtgagaaagg atatagcaac tgggagcttt ctgccgatcg ggccaatgca 660
tcccgccgcg aactgatggt cggagggttg gatagcggca aagtgttacg tgtcgtcggc 720
atggcggcaa cgatgcgctt aagcgatcgc ggacctgatg atgccgtcaa ccgtcgcatc 780
agcctgctgg tactgaacaa acaagccgaa caggccattt tgcatgaaaa cgccgaaagc 840
cagaatgagc cagtaagcgc cctggaaaaa cctgaggttg caccacaggt cagtgttccc 900
acaatgccat cagccgaacc gaggtga 927
<210> 10
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gtgagtaata aaaacgtcaa tgtaaggaaa tcgcaggaaa taacattctg cttgctggca 60
ggtatcctga tgttcatggc aatgatggtt gccggacgcg ctgaagcggg agtggcctta 120
ggtgcgactc gcgtaattta tccggcaggg caaaaacaag tgcaacttgc cgtgacaaat 180
aatgatgaaa atagtaccta tttaattcaa tcatgggtgg aaaatgccga tggtgtaaag 240
gatggtcgtt ttatcgtgac gcctcctctg tttgcgatga agggaaaaaa agagaatacc 300
ttacgtattc ttgatgcaac aaataaccaa ttgccacagg accgggaaag tttattctgg 360
atgaacgtta aagcgattcc gtcaatggat aaatcaaaat tgactgagaa tacgctacag 420
ctcgcaatta tcagccgcat taaactgtac tatcgcccgg ctaaattagc gttgccaccc 480
gatcaggccg cagaaaaatt aagatttcgt cgtagcgcga attctctgac gctgattaac 540
ccgacaccct attacctgac ggtaacagag ttgaatgccg gaacccgggt tcttgaaaat 600
gcattggtgc ctccaatggg cgaaagcacg gttaaattgc cttctgatgc aggaagcaat 660
attacttacc gaacaataaa tgattatggc gcacttaccc ccaaaatgac gggcgtaatg 720
gaataa 726
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ttattgggcc catgccgttg ttagatagct tc 32
<210> 12
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgggaattc catatgctag atgtgcagtt cctgc 35
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttattgggcc catgtttaat gaagtccata g 31
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ttaaaactgc agttatcgcc tgaggttatc g 31
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ttattgggcc catggttgaa cttaaagagc cg 32
<210> 16
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcaaaactgc agttacaacg attttcgaat cg 32

Claims (9)

1.一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，扩增生物被膜形成关键基因，构建含有生物被膜形成关键基因质粒的重组质粒，再将重组质粒转入重组大肠杆菌体内，构建得到生物被膜形成能力强的过表达菌株；
步骤2，对生物被膜载体材料进行改性处理，并将改性后的材料填充于组培瓶中，添加LB培养基，再接入过表达菌株，培养形成生物被膜；
步骤3，向形成的生物被膜中添加诱导剂IPTG，调节培养温度，诱导生物被膜表达α-L-鼠李糖苷酶RhaB1。
2.根据权利要求1所述的一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，其特征在于，所述的生物被膜形成关键基因为群体感应基因、胞外聚合物分泌基因或运动性基因。
3.根据权利要求2所述的一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，其特征在于，所述群体感应基因为luxS、lsrB或aphA，所述胞外聚合物分泌基因为rfaP、pgaA、bcsA或wza；所述运动性基因为csgD、fimC或motB。
4.根据权利要求1所述的一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，其特征在于，步骤2中所用的改性剂为质量分数0.01-50%的重铬酸钾溶液，改性处理得时间为0.1-48 h。
5.根据权利要求1所述的一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，其特征在于，所述的培养生物被膜是通过将构建得到的过表达菌株接种于培养液中，于15-60℃下培养。
6.根据权利要求1所述的一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法，其特征在于，所述诱导剂IPTG添加于培养液中至终浓度为0.001-20 mmol/L，同时将培养温度降低5-55℃，诱导生物被膜表达α-L-鼠李糖苷酶RhaB1。
7.基于权利要求1所述的方法培养得到的表达α-L-鼠李糖苷酶RhaB1的生物被膜在黄酮苷类化合物的催化体系中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述黄酮苷类化合物的浓度为0.001-100g/L，催化反应的温度为5-60℃，反应体系的反应pH为2-10，反应时间为0.1-72 h。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述黄酮苷类化合物的为芦丁或柚皮苷。
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