CN109207494A - 黑穗醋栗l-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法 - Google Patents
黑穗醋栗l-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109207494A CN109207494A CN201811180146.3A CN201811180146A CN109207494A CN 109207494 A CN109207494 A CN 109207494A CN 201811180146 A CN201811180146 A CN 201811180146A CN 109207494 A CN109207494 A CN 109207494A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- elements
- black currant
- galactolipin
- dehydrogenase gene
- expression
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
- C12Y103/02—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with a cytochrome as acceptor (1.3.2)
- C12Y103/02003—L-Galactonolactone dehydrogenase (1.3.2.3)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
黑穗醋栗L‑半乳糖‑1,4‑内酯脱氢酶基因及其表达方法属于生物技术领域，该方法所用的黑穗醋栗品种为“黑丰”。本发明包括(1)克隆黑穗醋栗L‑半乳糖‑1,4‑内酯脱氢酶基因；(2)提供该基因及其编码蛋白的序列。通过对黑穗醋栗L‑半乳糖‑1,4‑内酯脱氢酶基因的研究，获得该基因的序列，可为进一步为开展黑穗醋栗代谢分子机制奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，主要涉及黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法。
背景技术
抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)，亦称维生素C，是植物和大多数动物体内合成的一类高丰度己糖内酯化合物。由于人类缺乏其合成关键酶无法自身合成与储存抗坏血酸而只能从食物中获取,因此AsA含量已成为衡量农产品品质的重要指标。前人研究表明植物AsA可能存在4条合成途径：L-半乳糖途径、糖醛酸途径、L-古洛糖途径和肌醇途径,其中以Smirnoff-Wheeler提出的L-半乳糖途径占主导地位。该途径中,L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)直接氧化半乳糖内酯形成AsA,起着关键酶的作用,是所有合成相关酶中研究的比较多的一个，但黑穗醋栗中该基因还未被克隆。
黑穗醋栗(Ribes nigrum L.)在植物学分类上属双子叶植物纲虎耳草科(Saxifragaceae)茶藨子属(Subgen Ribes)的茶藨子亚属，其果实为黑色浆果，有光泽，近球形，味酸甜，清香，营养价值丰富，高富含维C，是苹果和草莓的几十倍，是重要的AsA植物源，抗氧化能力强，能预防多种疾病，由其制成的果酱、果酒、饮料等无公害或绿色食品备受欢迎。但目前关于黑穗醋栗中存在的抗坏血酸合成途径以及调控抗坏血酸代谢的机理还不是很清楚，因此通过对黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因的研究，获得该基因的序列，对开展黑穗醋栗代谢分子机制具有重要意义。
该方法所用的黑穗醋栗品种为“黑丰”。本发明包括(1)克隆黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因；(2)提供该基因及其编码蛋白的序列。通过对黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因的研究，获得该基因的序列，可为进一步为开展黑穗醋栗代谢分子机制奠定基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，达到获得该基因及其编码蛋白的序列的目的。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
1、黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法,其特征在于,所述L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因的核苷酸序列如NO：1所示，表达方法包括以下步骤：
(1)提取黑穗醋栗总RNA，以此为模板进行反转录得到第一链cDNA；
(2)根据Genbank中已登录的植物L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守序列设计引物，以所述第一链cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物测序得到黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因保守区序列；
(3)根据所述黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因保守区序列设计3’-RACE引物和5’-RACE引物，以黑穗醋栗总DNA为模板，利用cDNA末端快速扩增技术进行扩增，将扩增产物测序后与3’-RACE和5’-RACE测序结果拼接获得cDNA序列；
(4)通过生物信息学对获得的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶cDNA序列进行开放阅读框分析从而得到目的基因所编码蛋白质的氨基酸序列。
2、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，提取缓冲液配置：3％CATB(十六烷基三甲基溴化铵)，2％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，100mmol/L Tris-HCl(PH8.0)，25mmol/L EDTA，2.0mol/L NaCl；SSTE缓冲液：1.0mol/LNaCl，0.5％SDS，10mmol/LTris-HCl(PH8.0)，1mmol/L EDTA(PH8.0)；10mol/L LiCl沉淀RNA。
3、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，提取缓冲液使用前65℃预热,加入3％的β-疏基乙醇。通过CATB-PVP法提取RNA，RNA质量对反转录反应的影响很大。
4、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如NO：2所示。
5、扩增权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，该基因引物对的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如NO：3和NO：4所示。
黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法属于生物技术领域，该方法所用的黑穗醋栗品种为“黑丰”。本发明包括(1)克隆黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因；(2)提供该基因及其编码蛋白的序列。通过对黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因的研究，获得该基因的序列，可为进一步为开展黑穗醋栗代谢分子机制奠定基础。
附图说明
附图1黑穗醋栗总RNA电泳图
附图2技术路线图
具体实施方式
下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述：
1、黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法,其特征在于,所述L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因的核苷酸序列如NO：1所示，表达方法包括以下步骤：
(1)提取黑穗醋栗总RNA，以此为模板进行反转录得到第一链cDNA；
(2)根据Genbank中已登录的植物L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守序列设计引物，以所述第一链cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物测序得到黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因保守区序列；
(3)根据所述黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因保守区序列设计3’-RACE引物和5’-RACE引物，以黑穗醋栗总DNA为模板，利用cDNA末端快速扩增技术进行扩增，将扩增产物测序后与3’-RACE和5’-RACE测序结果拼接获得cDNA序列；
(4)通过生物信息学对获得的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶cDNA序列进行开放阅读框分析从而得到目的基因所编码蛋白质的氨基酸序列。
2、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，提取缓冲液配置：3％CATB(十六烷基三甲基溴化铵)，2％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，100mmol/L Tris-HCl(PH8.0)，25mmol/L EDTA，2.0mol/L NaCl；SSTE缓冲液：1.0mol/LNaCl，0.5％SDS，10mmol/L Tris-HCl(PH8.0)，1mmol/L EDTA(PH8.0)；10mol/L LiCl沉淀RNA。
3、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，提取缓冲液使用前65℃预热,加入3％的β-疏基乙醇。通过CATB-PVP法提取RNA，RNA质量对反转录反应的影响很大。
4、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如NO：2所示。
5、扩增权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，该基因引物对的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如NO：3和NO：4所示。
实施例1：
1、黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法,其特征在于,所述L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因的核苷酸序列，表达方法包括以下步骤：
(1)提取黑穗醋栗总RNA，以此为模板进行反转录得到第一链cDNA；
(2)根据Genbank中已登录的植物L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守序列设计引物，以所述第一链cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物测序得到黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因保守区序列；
(3)根据所述黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因保守区序列设计3’-RACE引物和5’-RACE引物，以黑穗醋栗总DNA为模板，利用cDNA末端快速扩增技术进行扩增，将扩增产物测序后与3’-RACE和5’-RACE测序结果拼接获得cDNA序列；
(4)通过生物信息学对获得的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶cDNA序列进行开放阅读框分析从而得到目的基因所编码蛋白质的氨基酸序列。
2、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，提取缓冲液配置：3～5％CATB(十六烷基三甲基溴化铵)，2～4％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，100～200mmol/L Tris-HCl(PH8.0)，25～30mmol/L EDTA，2.0～3.0mol/L NaCl；SSTE缓冲液：1.0～2.0mol/L NaCl，0.5％SDS，10～20mmol/L Tris-HCl(PH8.0)，1～2mmol/L EDTA(PH8.0)；10～20mol/L LiCl沉淀RNA。
3、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，提取缓冲液使用前65℃预热,加入3％的β-疏基乙醇。通过CATB-PVP法提取RNA，RNA质量对反转录反应的影响很大。
4、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，获得蛋白的氨基酸序列。
5、扩增权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，该基因引物对的正向引物和反向引物的核苷酸序列。
实施例2：
1、黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法,其特征在于,所述L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因的核苷酸序列，表达方法包括以下步骤：
(1)提取黑穗醋栗总RNA，以此为模板进行反转录得到第一链cDNA；
(2)根据Genbank中已登录的植物L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守序列设计引物，以所述第一链cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物测序得到黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因保守区序列；
(3)根据所述黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因保守区序列设计3’-RACE引物和5’-RACE引物，以黑穗醋栗总DNA为模板，利用cDNA末端快速扩增技术进行扩增，将扩增产物测序后与3’-RACE和5’-RACE测序结果拼接获得cDNA序列；
(4)通过生物信息学对获得的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶cDNA序列进行开放阅读框分析从而得到目的基因所编码蛋白质的氨基酸序列。
2、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，提取缓冲液配置：3～5％CATB(十六烷基三甲基溴化铵)，2～4％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，100～200mmol/L Tris-HCl(PH8.0)，25～30mmol/L EDTA，2.0～3.0mol/L NaCl；SSTE缓冲液：1.0～2.0mol/L NaCl，0.5％SDS，10～20mmol/L Tris-HCl(PH8.0)，1～2mmol/L EDTA(PH8.0)；10～20mol/L LiCl沉淀RNA。
3、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，提取缓冲液使用前65℃预热,加入3％的β-疏基乙醇。通过CATB-PVP法提取RNA，RNA质量对反转录反应的影响很大。
4、根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，获得蛋白的氨基酸序列。
5、扩增权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，该基因引物对的正向引物和反向引物的核苷酸序列。
NO：1
TTCATCATCATCATCATCATCACCGTCGCATTTACCGTCTTCCGATGCTGAAATACGCAAGTACTTGGGCTATTCCGTCCTCCTTCTCGGCTGCGCCGTTGCCACTTACTACTCTTTCCCATTCCCTGACAATGCCAAGCATAAGAAAGCTCAAATCTTTCGATACGCACCATTACCTGAAGACCTTCACACTGTCTCCAATTGGAGCGGCACGCACGAAGTCCAGACTCGTGTTTTCAGGCAGCCCGAGAGTCTAGAAGAATTGGAAGGAATTGTTAAAGAAGCGCACGAGAAGAAGACAAAGGTTCGGCCAGTTGGGTCGGGATTGTCGCCTAACGGGATCGGGTTAACGAGGGCGGGGATGGTGAATTTGGCATTGATGGATAGGGTTTTGGAAGTGGATAAGGAGAAGAAAATAGTAAGGGTTCAGGCTGGGATTAGGGTCCAGCAATTGGTGGATGGGATCAAGGATTACGGGATTACGCTGCAGAATTTTGCGTCGATTCGAGAACAACAGATTGGTGGCATTGTTCAGGTCGGTGCCCATGGTACTGGTGCAAGATTGCCTCCTATTGATGAGCAGGTCATCAGCATGAAACTGGTAACTCCTGCAAAGGGAACAATAGAGATATCAAAAGAGAAAGACCCAGAACTGTTTTATTTAGCTCGCTGTGGTCTTGGGGGCCTTGGAGTTGTTGCTGAAGTCACCCTACAATGTGTTGAGAGACAAGAGCTTGTGGAGCACACATTTGTTTCAAATATGAAAGAGATTAAGAAAAACCACAAGTAACTCTCTGTCCTCTTTTTAATGATGCAAGTAATTGTATAATGCCTTCTTTGGAAAGTTTTGAATGTGAATACTCCAGTCCAATCAAAAATCTGATTGTCTTATGAATAGATTAAAGTTGCAAGTTTAAAATATAGAGCCAATAATTAGTTAATTTGGTTAGGGCTAAAACTATGTATATATATAAATATATATTACATGGTTCTAAATTTAAAATGTCGAAGGCTGTGGCACCCGCATACACAATACAAGTGAGTCTCTAGTGGAAGTTATTAATATTTCTTCGCTTTATTGTTAAGTAGAAAGACAACAGCTCTCTCTCTCTCTGTAATAGACTGTACATTACAATTTTTTATCTGATGACGCAGTGTGGAAATTGTCGTGTGTCTTTGTCTTGTCTTGTTCTTTTGCAGGAAATTGCTATCTGAGAATAAGCATGTCAAGTACCTGTATATTCCATATACCGACACTGTCGTGGTAGTGAGTTGCAACCCTGTTTCGAAATGGAAAGGTGCGCCCAAGTTCAAACCCAAATATAGTAATGATGAAGCTATACAGCACGTTCGTGATCTCTACCGGGAGTCACTCAATAGGTACAGAGCTGGAGGAACCACTGCTAAATCGTTAGATGACAATGAACCAGATGTAGAGGAGCTTTCATTTACAGAGTTACGGGACAAACTACTTGCCCTTGATCCTCTTAATAAAGACCATGTCATAAAGGTCAATCAAGCTGAGGCTGAGTTCTGGAAGAAGTCAGAAGGATACAGAGTAGGATGGAGTGATGAAATTTTGGGATTTGATTGTGGCGGTCAACAGTGGGTTTCAGAGACGTGTTTTCCAGCTGGAACCTTAGCAAAGCCAAGTATGAAAGACCTTCAATATATAGAAGACGTAAAGCAGCTCATAGAGAAGGAAAAGATACCCGCTCCTGCTCCTATAGAGCAGCGGTGGACAGCTTGCAGTAAGAGCCCTATGAGTCCAGCTTCAAGCTCAGCAGAGGATGATATTTTTTCATGGGTTGGTATAATCATGTACCTTCCTACAATGGATGCTCGCCAGAGGAAAGAAATAACGGAGGAGTTCTTCCATTATAGACGTTTGACTCAATCGCGGTTGTGGGATCAGTATTCTGCTTATGAACATTGGGCTAAAATTGAGGTTCCAAAAGACAAGGAAGAGCTTGCAGCTCTTCAAACAAGGCTAAGGAAGCGTTTTCCAGTGGACGCATACAATAAAGCACGAAAGGAATTGGATCCGAACAAGATTCTTTCTAATAACATGCTGGAGAAGCTGTTCCCGTTATCGGATAACGTTTGAGCACTGTTGCTCTTCGGTTAGTCAATCTTAACTTTGTTGAATTTGTTCATCTTCATTTATTTTCCGGTTATGCATCTGTCCTGTGATCTTGATTGTACATTAAAAGTTGTGTCTAAGGATTTGAATACATGACATATTATTAAGGTTATTTAAAGCAATAAAGCCTTCAAATAATTTGCAAACCCG
NO：2
SSSSSSSPSHLPSSDAEIRKYLGYSVLLLGCAVATYYSFPFPDNAKHKKAQIFRYAPLPEDLHTVSNWSGTHEVQTRVFRQPESLEELEGIVKEAHEKKTKVRPVGSGLSPNGIGLTRAGMVNLALMDRVLEVDKEKKIVRVQAGIRVQQLVDGIKDYGITLQNFASIREQQIGGIVQVGAHGTGARLPPIDEQVISMKLVTPAKGTIEISKEKDPELFYLARCGLGGLGVVAEVTLQCVERQELVEHTFVSNMKEIKKNHK
NO：3
F：TA/TCAAC/GAAT/CCACTA/GGACTGGT
NO：4
R：CTGAG/CAT/ACAGCCA/TAA/GACACTC
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2293
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
ttcatcatca tcatcatcat caccgtcgca tttaccgtct tccgatgctg aaatacgcaa 60
gtacttgggc tattccgtcc tccttctcgg ctgcgccgtt gccacttact actctttccc 120
attccctgac aatgccaagc ataagaaagc tcaaatcttt cgatacgcac cattacctga 180
agaccttcac actgtctcca attggagcgg cacgcacgaa gtccagactc gtgttttcag 240
gcagcccgag agtctagaag aattggaagg aattgttaaa gaagcgcacg agaagaagac 300
aaaggttcgg ccagttgggt cgggattgtc gcctaacggg atcgggttaa cgagggcggg 360
gatggtgaat ttggcattga tggatagggt tttggaagtg gataaggaga agaaaatagt 420
aagggttcag gctgggatta gggtccagca attggtggat gggatcaagg attacgggat 480
tacgctgcag aattttgcgt cgattcgaga acaacagatt ggtggcattg ttcaggtcgg 540
tgcccatggt actggtgcaa gattgcctcc tattgatgag caggtcatca gcatgaaact 600
ggtaactcct gcaaagggaa caatagagat atcaaaagag aaagacccag aactgtttta 660
tttagctcgc tgtggtcttg ggggccttgg agttgttgct gaagtcaccc tacaatgtgt 720
tgagagacaa gagcttgtgg agcacacatt tgtttcaaat atgaaagaga ttaagaaaaa 780
ccacaagtaa ctctctgtcc tctttttaat gatgcaagta attgtataat gccttctttg 840
gaaagttttg aatgtgaata ctccagtcca atcaaaaatc tgattgtctt atgaatagat 900
taaagttgca agtttaaaat atagagccaa taattagtta atttggttag ggctaaaact 960
atgtatatat ataaatatat attacatggt tctaaattta aaatgtcgaa ggctgtggca 1020
cccgcataca caatacaagt gagtctctag tggaagttat taatatttct tcgctttatt 1080
gttaagtaga aagacaacag ctctctctct ctctgtaata gactgtacat tacaattttt 1140
tatctgatga cgcagtgtgg aaattgtcgt gtgtctttgt cttgtcttgt tcttttgcag 1200
gaaattgcta tctgagaata agcatgtcaa gtacctgtat attccatata ccgacactgt 1260
cgtggtagtg agttgcaacc ctgtttcgaa atggaaaggt gcgcccaagt tcaaacccaa 1320
atatagtaat gatgaagcta tacagcacgt tcgtgatctc taccgggagt cactcaatag 1380
gtacagagct ggaggaacca ctgctaaatc gttagatgac aatgaaccag atgtagagga 1440
gctttcattt acagagttac gggacaaact acttgccctt gatcctctta ataaagacca 1500
tgtcataaag gtcaatcaag ctgaggctga gttctggaag aagtcagaag gatacagagt 1560
aggatggagt gatgaaattt tgggatttga ttgtggcggt caacagtggg tttcagagac 1620
gtgttttcca gctggaacct tagcaaagcc aagtatgaaa gaccttcaat atatagaaga 1680
cgtaaagcag ctcatagaga aggaaaagat acccgctcct gctcctatag agcagcggtg 1740
gacagcttgc agtaagagcc ctatgagtcc agcttcaagc tcagcagagg atgatatttt 1800
ttcatgggtt ggtataatca tgtaccttcc tacaatggat gctcgccaga ggaaagaaat 1860
aacggaggag ttcttccatt atagacgttt gactcaatcg cggttgtggg atcagtattc 1920
tgcttatgaa cattgggcta aaattgaggt tccaaaagac aaggaagagc ttgcagctct 1980
tcaaacaagg ctaaggaagc gttttccagt ggacgcatac aataaagcac gaaaggaatt 2040
ggatccgaac aagattcttt ctaataacat gctggagaag ctgttcccgt tatcggataa 2100
cgtttgagca ctgttgctct tcggttagtc aatcttaact ttgttgaatt tgttcatctt 2160
catttatttt ccggttatgc atctgtcctg tgatcttgat tgtacattaa aagttgtgtc 2220
taaggatttg aatacatgac atattattaa ggttatttaa agcaataaag ccttcaaata 2280
atttgcaaac ccg 2293
Claims (5)
1.黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法,其特征在于,所述L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因的核苷酸序列如NO：1所示，表达方法包括以下步骤：
(1)提取黑穗醋栗总RNA，以此为模板进行反转录得到第一链cDNA；
(2)根据Genbank中已登录的植物L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守序列设计引物，以所述第一链cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物测序得到黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因保守区序列；
(3)根据所述黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因保守区序列设计3’-RACE引物和5’-RACE引物，以黑穗醋栗总DNA为模板，利用cDNA末端快速扩增技术进行扩增，将扩增产物测序后与3’-RACE和5’-RACE测序结果拼接获得cDNA序列；
(4)通过生物信息学对获得的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶cDNA序列进行开放阅读框分析从而得到目的基因所编码蛋白质的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，提取缓冲液配置：3％CATB(十六烷基三甲基溴化铵)，2％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，100mmol/L Tris-HCl(PH8.0)，25mmol/L EDTA，2.0mol/L NaCl；SSTE缓冲液：1.0mol/LNaCl，0.5％SDS，10mmol/L Tris-HCl(PH8.0)，1mmol/L EDTA(PH8.0)；10mol/L LiCl沉淀RNA。
3.根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，提取缓冲液使用前65℃预热,加入3％的β-疏基乙醇。通过CATB-PVP法提取RNA，RNA质量对反转录反应的影响很大。
4.根据权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如NO：2所示。
5.扩增权利要求1所述的黑穗醋栗L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法，其特征在于，该基因引物对的正向引物和反向引物的核苷酸序列分别如NO：3和NO：4所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811180146.3A CN109207494A (zh) | 2018-10-10 | 2018-10-10 | 黑穗醋栗l-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201811180146.3A CN109207494A (zh) | 2018-10-10 | 2018-10-10 | 黑穗醋栗l-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109207494A true CN109207494A (zh) | 2019-01-15 |
Family
ID=64983272
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201811180146.3A Pending CN109207494A (zh) | 2018-10-10 | 2018-10-10 | 黑穗醋栗l-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109207494A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100077503A1 (en) * | 2007-03-08 | 2010-03-25 | The New Zealand Institute For Plant And Food Research Limited | Transferases, Epimerases, Polynucleotides Encoding These and Uses Thereof |
| CN105755018A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-07-13 | 中国农业科学院特产研究所 | 软枣猕猴桃l-半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法 |
| CN106497947A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-03-15 | 重庆大学 | 一种番茄抗坏血酸合成基因slgpp 及其应用 |
| CN106520718A (zh) * | 2016-11-23 | 2017-03-22 | 广东省农业科学院茶叶研究所 | 茶树类黄酮3‑o‑半乳糖基转移酶CsF3GalT蛋白及其编码基因和应用 |
-
2018
- 2018-10-10 CN CN201811180146.3A patent/CN109207494A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100077503A1 (en) * | 2007-03-08 | 2010-03-25 | The New Zealand Institute For Plant And Food Research Limited | Transferases, Epimerases, Polynucleotides Encoding These and Uses Thereof |
| CN105755018A (zh) * | 2016-05-13 | 2016-07-13 | 中国农业科学院特产研究所 | 软枣猕猴桃l-半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法 |
| CN106497947A (zh) * | 2016-11-04 | 2017-03-15 | 重庆大学 | 一种番茄抗坏血酸合成基因slgpp 及其应用 |
| CN106520718A (zh) * | 2016-11-23 | 2017-03-22 | 广东省农业科学院茶叶研究所 | 茶树类黄酮3‑o‑半乳糖基转移酶CsF3GalT蛋白及其编码基因和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GENBANK: "PREDICTED: Quercus suber L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase,mitochondrial (LOC112012043), mRNA", 《GENBANK》 * |
| MARTA RODRÍGUEZ-RUIZ ET AL.,: "Characterization of the galactono-1,4-lactone dehydrogenase from pepper fruits and its modulation in the ascorbate biosynthesis. Role of nitric oxide", 《REDOX BIOLOGY》 * |
| 苑志明等: "黄瓜L-半乳糖-1，4-内酯脱氢酶cDNA全长的克隆和遗传转化", 《东北农业大学学报》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109666658B (zh) | 用于制备nmn的烟酰胺磷酸核糖转移酶、编码基因、重组载体及应用 | |
| CN110607286B (zh) | 灰树花麦角硫因基因Gfegt1和Gfegt2在合成麦角硫因中的应用 | |
| CN105671010B (zh) | 一种醛酮还原酶突变体、基因、工程菌及其应用 | |
| WO2021170097A1 (zh) | 新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用 | |
| CN106164260B (zh) | 一种假丝酵母羰基还原酶及用于制备(r)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法 | |
| CN111100832B (zh) | 合成丙酮酸与d-丙氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN108841844B (zh) | 一种高效生产苯丙酮酸的方法 | |
| TW200305645A (en) | Novel carbonyl reductase, gene encoding the same and process for producing optically active alcohols using the same | |
| CN106929459A (zh) | 一种重组大肠杆菌及其构建方法与通过代谢工程生产葡萄糖二酸的方法 | |
| CN112574897B (zh) | 一种用于生产香紫苏二醇的菌株组合、应用及生产香紫苏二醇的方法 | |
| CN109207494A (zh) | 黑穗醋栗l-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶基因及其表达方法 | |
| JP7072809B2 (ja) | 組換え微生物、その製造方法及び補酵素ｑ１０の生産における使用 | |
| CN111690549A (zh) | 利用木糖生产原人参二醇的重组解脂耶氏酵母菌株及构建方法和应用 | |
| CN116376995B (zh) | 一种利用苏氨酸制备甘氨酸、乙酰辅酶a及乙酰辅酶a衍生物的方法 | |
| JPH11505710A (ja) | アシロインの生成方法、これに適するピルビン酸−デカルボキシラーゼ並びにその産生方法及びこの酵素をコードするｐｄｃ−遺伝子のｄｎａ−配列 | |
| CN115873881A (zh) | 一种产1,3-丁二醇的基因工程菌及其应用 | |
| US12110494B2 (en) | Method for biologically producing sugar alcohol from agar | |
| CN112708602B (zh) | 盾叶薯蓣来源的薯蓣皂素合成相关蛋白及编码基因与应用 | |
| CN108424859B (zh) | 生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用 | |
| CN108753802B (zh) | 一个苹果酸脱氢酶基因cimdh1及其重组表达载体 | |
| CN111041040A (zh) | 产左旋海松二烯和左旋海松酸的重组酿酒酵母及构建方法 | |
| CN116162644B (zh) | 一种苯丙氨酸解氨酶基因pal的新用途 | |
| CN116376989B (zh) | 一种制备酮酸的方法及该方法在制备氨基酸或氨基酸衍生物中的应用 | |
| CN104342408B (zh) | 重组蛹虫草超氧化物歧化酶的制备方法 | |
| CN118240735B (zh) | 一种能表达外源蛋白的菌株、重组人源胶原蛋白及合成方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20190115 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |