CN114438108A - 猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法 - Google Patents

猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114438108A
CN114438108A CN202210176427.1A CN202210176427A CN114438108A CN 114438108 A CN114438108 A CN 114438108A CN 202210176427 A CN202210176427 A CN 202210176427A CN 114438108 A CN114438108 A CN 114438108A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aapg18
fruit
gene
kiwi
kiwi fruit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210176427.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114438108B (zh
Inventor
齐秀娟
李玉阔
黄海雷
顾红
林苗苗
孙雷明
钟云鹏
王然
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Original Assignee
Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS filed Critical Zhengzhou Fruit Research Institute CAAS
Priority to CN202210176427.1A priority Critical patent/CN114438108B/zh
Publication of CN114438108A publication Critical patent/CN114438108A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114438108B publication Critical patent/CN114438108B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一个猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法。猕猴桃AaPG18基因序序列如SEQ ID No.1所示。所述转基因猕猴桃的单果验证方法，以转基因瞬时表达系统为技术基础，首先构建重组的pBI121‑AaPG18过表达载体，并制备侵染液，随后从猕猴桃果实左右两侧注射侵染液。总体上，本申请基于瞬时表达技术，结合猕猴桃果实特点，一方面对AaPG18基因功能进行了初步明确，另一方面设计提供了一种可对猕猴桃果实相关功能基因进行快速且严格的单果对照验证法，且其验证结果高效、直观、重复性强，且可较好克服果实异质性问题，从而减少相关功能基因验证的工作量和误差。

Description

猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法
技术领域
本申请属于基因工程技术领域，具体涉及一个猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法。
背景技术
基因工程技术开发过程中，适时对转基因后生物体进行检测和验证，是改进和调整相关转基因技术操作的重要组成部分。但实际操作中，因为生物对象不同，针对转基因后生物体的检测和验证方式也有明显不同。
对于常用的模式植物例如拟南芥等而言，由于其生长周期短、易于繁殖，因此，对于目的基因的功能验证往往可以通过本物种转基因和突变体同义弥补得以实现。但对于生长周期长、生长速度慢的多年生植物例如果树研究而言，受限于遗传转化体系的固有的概率性和随机性缺陷、以及突变体系构建的困难性等因素，常规的转基因操作后的目的基因功能验证方法，很难在果树等植物中直接应用。
实际转基因功能验证中，瞬时表达系统是一种快速验证转基因是否成功、验证目的基因功能的验证方法。其技术原理为：在将外源基因导入植物细胞后，转移至细胞中的外源DNA和宿主细胞染色体DNA不发生整合，外源DNA借助于基因导入过程中质粒启动子在植物细胞内即可进行快速表达，一般在导入外源基因后12h左右即可形成稳定的表型变化，并可持续数天，此时，通过检测检测表达部位的生理指标、分子效应或者观察产生表型差异即可达到基因功能验证的目的。由于这种方法简单快速、安全有效、结果直观且无基因漂移的风险，因此在生长周期长、生长速度慢的多年生植物尤其是果树的转基因研究中被广泛应用。
但实际应用中，针对果实性状进行目的基因功能鉴定时，由于每个果实均是独立的繁殖个体，且每个果实的生长发育状态并不完全一致，这就导致果实个体间存在明显差异，因此，为减少个体间差异给基因功能验证带来的影响，就需尽量采集果实生长状态相对一致的果实进行验证，但由于果实生长状态无法采用仪器进行统一判定，这也就导致基因功能验证过程中所采集果实个体间一致性缺乏科学标准，进而容易导致验证结果误差较大。而为减少个体间差异对验证工作所带来影响，实际验证中，就需扩大果实采集规模，并一一进行检测筛选和鉴定，这又无形中增加了工作量和验证成本。因此，如何改善相关验证方法，对于提高转基因工作效率具有重要的技术价值。
发明内容
针对猕猴桃果实特点，本申请目的在于提供一个猕猴桃AaPG18基因，以及提供一种针对该基因的转基因的单果验证方法，从而为猕猴桃功能基因研究中如何克服转基因后猕猴桃单果间异质性差异提供一定借鉴和参考。
本申请所采取的技术方案详述如下。
猕猴桃AaPG18基因，其基因序列长度为1191bp，序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
AtgacaatggtgcaaccactgacttctcttcttctcactctacctctcttcataatcttccgccaatcaacattggcaatagcaacaacatacaacgtggttagtttaggagccaaaggagatggcacgtccgactcaaccaagcccttcctcagcgcgtgggctttggcttgcggctcggctatgccggcctcgatctacgtgcccagagggaggtacttgcttggcaagaccgagttcggaggcgaaaattgcaagaataaggccatcaccattcgtattgacggcactctcgtgagtcccgccgattatcgggtcttgggaaatgccggtaactggattgtatttaggggtgtcagtggtgtgtctatttatggtgggaccctcgatggtcgtggacagggtttgtgggcttgcaaggcttccggcaagagttgccctcttggaactacgacgctacaattcagcaattcaaacaacgtatttattagtggattaacctccctgaatagtcagatgtttcactttgtcatctacaattgcaacaatgtcaacgtacaaggagccaagatattggcctcaggcaacagcccaaacactgatggcatccacgtcgcatcgtcgtctggcgtcacgattatgaactctaggatcggtacaggggacgattgtgtctcgattggttcgggcaccacggatttgtggattgagaatgtcgcttgtggccctggccacggtatcagcattgggagtctgggccagaacttgcaggaagatggtgtgcaaaatgtgacggttaagacggttacgtttaccggtacacaaaatggtgttaggataaagacatgggcaaagcctagcaatggatttgttcggggtgtgctcttccagcatgctactatggtcaatgtccaaaaccccatcattatcgatcaaaattattgcccagacaacaaaaattgccccaatcaagtctcaggtgtaaagatcagcggtgtgacgtatcaggatattcatgggtcatcagcgacacaagttgcgattaaattcaattgtagcaaaaaatatccatgcagcaggataacattggaagatgtaaatctcacctacaataatcaaccagcccaatcttcatgttctaatgctggaggaagtgcttctggtttagttaagccctcaagttgcttgTAG。
所述猕猴桃AaPG18基因在猕猴桃新品种培育中应用，猕猴桃AaPG18基因与猕猴桃果实软化成熟相关，通过超表达猕猴桃AaPG18基因可以促进猕猴桃果实的软化成熟；所述猕猴桃具体例如为软枣猕猴桃品种；
所述超表达，具体方式可参考为：首先利用含有35S强启动子过表达载体pBI121来构建含有AaPG18基因的重组过表达载体pBI121-AaPG18，然后将该重组过表达载体pBI121-AaPG18转染猕猴桃以对AaPG18基因进行超表达。
针对所述猕猴桃AaPG18基因的转基因猕猴桃的单果验证方法，该方法以转基因瞬时表达系统为技术基础，针对猕猴桃单果进行转基因目的验证，以具体的AaPG18目的基因验证为例，具体包括如下步骤：
（一）构建过表达重组载体
以植物双元表达载体pBI121为载体，构建重组的pBI121-AaPG18过表达载体，具体步骤包括：
（1）获得目的基因
首先，提取猕猴桃单果果实总RNA，并反转录为cDNA备用；
随后，针对目的基因AaPG18设计PCR扩增用引物，并以上述cDNA为模板进行PCR扩增；
PCR扩增过程中，PCR扩增用引物对设计如下：
AaPG18-F：5’- ATGACAATGGTGCAACCACT-3’，
AaPG18-R：5’-CTACAAGCAACTTGAGGGCTTA-3’；
PCR扩增过程中，25µl扩增体系设计如下：
KOD Plus Neo高保真酶，0.5µl；
cDNA模板，2µl；
上游引物，0.5µl；
下游引物，0.5µl；
MgSO4，1.5µl；
dNTPs，2.5µl；
KOD Plus Neo Buffer，2.5µl；
水，15µl；
PCR扩增程序设置为：94℃、2 min；98℃、10s，60℃、30 s，72℃ 1 min，34个循环；72℃、5 min；
最后，对PCR扩增产物电泳检测后提纯备用；
具体AaPG18基因序列，如SEQ ID No.1所示；
（2）连接和转化
利用T4连接酶，将步骤（1）中所制备目的基因AaPG18与pED-T载体进行连接，随后，将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，并进行筛选、验证，确保转化正确，并提取转化正确质粒备用；
（3）同源重组
利用步骤（2）中重组质粒，采用同源重组的方法，将AaPG18连接到植物双元表达载体pBI121上，以构建获得重组质粒pBI121-AaPG18；
同源重组过程中，PCR引物对设计如下：
pBI121-F：gagaacacgggggactctagaAAGATGACAATGGTGCAACCACT，（其中：“gagaacacgggggactctaga”部分序列为同源臂）
pBI121-R：gcccttgctcaccatggatccCAAGCAACTTGAGGGCTTAACTAA；（其中“gcccttgctcaccatggatcc”部分序列为同源臂）
具体“同源重组”过程参考如下：
首先利用双酶切（酶切位点选用Xba I和BamH I）的方法对载体（原始载体pBI121）进行线性化；之后在上述正反向扩增引物的5’端引入线性化载体两末端的同源序列，确保扩增后的插入片段最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应一致的同源序列；
具体同源重组反应体系参考设计为：
线性化载体，5μL，
插入片段，5μL，
5×CEⅡBuffer，4μL，
Exnase I，1μL，
ddH2O，5μL；
操作时，使用移液器将上述反应体系轻轻吸打混匀，短暂离心后将反应液收集至管底，37℃反应30 min，之后立即置于冰上冷却；
（4）转化和筛选鉴定
将步骤（3）中所构建的含有重组质粒pBI121-AaPG18的重组体系进一步转化大肠杆菌DH5α感受态细胞以进行进一步筛选，并进行进一步测序验证，确保重组正确，并提取重组正确质粒备用；
（二）制备转染液
将步骤（一）中所构建重组质粒pBI121-AaPG18转化GV3101农杆菌感受态细胞，筛选转化正确的菌株，并进一步扩增培养至OD600=0.6-1.0；
将上述培养液离心后收集菌体（室温、4000 r/min离心5min），随后用侵染液（10mM MES，10 mM MgCl2和 200 µM AS）重悬菌体并调整OD600=0.6-1.0，室温静置不小于2h后用于后续侵染；
（三）单果验证
采集猕猴桃果实，利用带针头的注射器分别从果实左右两侧注射侵染液，注射时，注射力度应轻柔缓慢，确保侵染液在果实中得以渗透；
所述猕猴桃果实，考虑注射液渗透效果和表型效果的直观性观察因素，具体例如为转色前（约花后80天）的软枣猕猴桃‘RB-4’果实；
注射完成后，室温（18~30℃）条件下放置不小于48h后观察载体表型变化情况。
注射时，注射于果皮下（即皮下的果肉组织），注射量为0.2-0.5mL（根据果实硬度情况适当调整）；
注射后，室温（18~25℃）放置2-3天即可进行观察判断（时间太短过表达效果不能显现，时间太长果子快速软化影响观察评断结果）。
现有技术中，对于猕猴桃中相关PG基因已有部分研究，并且在猕猴桃全基因组水平上初步鉴定明确了PG家族的51个成员。 而由于软枣猕猴桃作为一种新的即食型新类型猕猴桃，对于其基因组中关键的PG基因尚未充分研究，而考虑软枣猕猴桃成熟软化机理对于猕猴桃新品种培育的重要技术意义，有针对性的对软枣猕猴桃中相关PG基因进行深入研究，对于猕猴桃新品种培育显然是具有重要的理论意义和技术意义的。
本申请中，以软枣猕猴桃果实成熟相关的功能基因AaPG18（多聚半乳糖醛酸酶编码基因，一个果实成熟相关的功能基因）作为具体研究对象，通过克隆AaPG18的cDNA全长序列，并构建含有35S强启动子的瞬时过表达载体pBI121-AaPG18。以此为基础，一方面对该基因功能进行了初步明确，另一方面，设计了一种快速且严格的验证果实发育相关功能基因的单果对照验证法。具体验证操作中，通过对同一个离体软枣猕猴桃果实的左右两侧分别注射侵染液（一侧注射过表达载体，另一侧注射对照），从而较好克服因果实发育状态不同的个体间差异给实际功能基因验证工作所带来的工作量大、误差大大技术缺陷。
总体上，本申请基于瞬时表达技术，结合猕猴桃果实特点，一方面对AaPG18基因功能进行了初步明确，另一方面设计提供了一种可对猕猴桃果实相关功能基因进行快速且严格的单果对照验证法，且其验证结果高效、直观、重复性强，且可较好克服果实异质性问题，从而减少相关功能基因验证的工作量和误差。基于这些结果，一方面可为猕猴桃其他PG研究提供一定借鉴和参考，另一方面也可为其他果树转基因功能鉴定和验证提供一定借鉴和参考。
附图说明
图1为针对AaPG18基因的PCR扩增结果；
图2为瞬时过表达之后的果实表型变化和基因表达分析，其中左侧上图A为单果验证中注射目的基因侧果实表型，左侧下图B为单果验证中空白对照侧果实表型，右侧图C为基因表达量变化情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
生物材料：
红肉软枣猕猴桃品种‘RB-4’，种植于国家园艺种质资源库猕猴桃种植资源圃（河南郑州），采摘果实植株树龄6年左右，该品种盛花期每年4月中下旬，果实成熟期为8月中旬；试验用的果实采摘时间为7月上旬，此时果实仍为绿色，质地偏硬，测定表明：可溶性固形物4%-5%，口感较涩，未达到商业采摘标准。
pED-T载体，购自近岸蛋白质科技有限公司（上海）；
大肠杆菌DH5α感受态细胞，擎科生物科技有限公司（北京）产品；
质粒载体pBI121，购自武汉淼灵生物科技有限公司；
实验试剂：
多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，北京华越洋生物科技有限公司产品；
反转录试剂盒、KOD-Plus-Neo 高保真酶，东洋纺生物科技有限公司（大阪，日本）产品。
实施例1
考虑PG家族基因在猕猴桃果实成熟中的重要作用，结合软枣猕猴桃果实独特性，前期工作基础上，发明人选择软枣猕猴桃中AaPG18作为研究对象。本实施例就该基因的克隆获得过程简介如下。
首先，利用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，提取猕猴桃单果（转色后成熟期果实）果实总RNA；
随后，参考反转录试剂盒说明书，将所提取总RNA反转录为cDNA备用。
针对目的基因AaPG18，设计PCR扩增用引物，以上述cDNA为模板进行PCR扩增；
PCR扩增过程中，PCR扩增用引物对设计如下：
AaPG18-F：5’- ATGACAATGGTGCAACCACT-3’，
AaPG18-R：5’-CTACAAGCAACTTGAGGGCTTA-3’；
PCR扩增过程中，25µl扩增体系设计如下：
KOD Plus Neo高保真酶，0.5µl；
cDNA模板，2µl；
上游引物，0.5µl；
下游引物，0.5µl；
MgSO4，1.5µl；
dNTPs，2.5µl；
KOD Plus Neo Buffer，2.5µl；
水，15µl；
PCR扩增程序设置为：94℃、2 min；98℃、10s，60℃、30 s，72℃ 1 min，34个循环；72℃、5 min；
最后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（电泳结果如图1所示）检测后提纯备用。
对扩增所得产物进一步进行测序后，扩增所得AaPG18基因序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
AtgacaatggtgcaaccactgacttctcttcttctcactctacctctcttcataatcttccgccaatcaacattggcaatagcaacaacatacaacgtggttagtttaggagccaaaggagatggcacgtccgactcaaccaagcccttcctcagcgcgtgggctttggcttgcggctcggctatgccggcctcgatctacgtgcccagagggaggtacttgcttggcaagaccgagttcggaggcgaaaattgcaagaataaggccatcaccattcgtattgacggcactctcgtgagtcccgccgattatcgggtcttgggaaatgccggtaactggattgtatttaggggtgtcagtggtgtgtctatttatggtgggaccctcgatggtcgtggacagggtttgtgggcttgcaaggcttccggcaagagttgccctcttggaactacgacgctacaattcagcaattcaaacaacgtatttattagtggattaacctccctgaatagtcagatgtttcactttgtcatctacaattgcaacaatgtcaacgtacaaggagccaagatattggcctcaggcaacagcccaaacactgatggcatccacgtcgcatcgtcgtctggcgtcacgattatgaactctaggatcggtacaggggacgattgtgtctcgattggttcgggcaccacggatttgtggattgagaatgtcgcttgtggccctggccacggtatcagcattgggagtctgggccagaacttgcaggaagatggtgtgcaaaatgtgacggttaagacggttacgtttaccggtacacaaaatggtgttaggataaagacatgggcaaagcctagcaatggatttgttcggggtgtgctcttccagcatgctactatggtcaatgtccaaaaccccatcattatcgatcaaaattattgcccagacaacaaaaattgccccaatcaagtctcaggtgtaaagatcagcggtgtgacgtatcaggatattcatgggtcatcagcgacacaagttgcgattaaattcaattgtagcaaaaaatatccatgcagcaggataacattggaagatgtaaatctcacctacaataatcaaccagcccaatcttcatgttctaatgctggaggaagtgcttctggtttagttaagccctcaagttgcttgTAG。
实施例2
在实施例1基础上，发明人进一步构建了一个瞬时超表达载体，利用该载体，一方面对AaPG18基因功能进行初步明确，另一方面考虑现有猕猴桃果实成熟相关基因验证过程中单果品质差异较大特点，设计获得了一种单果验证方法。具体过程简介如下。
（一）构建过表达重组载体
以植物双元表达载体pBI121为载体，构建重组的pBI121-AaPG18过表达载体，具体过程简介如下。
（1）连接和转化
首先，利用T4连接酶，将实施例1制备所得目的基因AaPG18与pED-T载体进行连接（16℃连接30min）；
随后，将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，并将转化液置于含有Amp抗生素的LB培养基上，倒扣、37℃培养16h，以进行筛选，并挑取阳性单菌落进行菌液PCR和测序验证，确保转化正确，并提取转化正确质粒备用。
相关操作中，具体连接体系（10 μL体系）参考如下：
目的基因，5 μL，
2×Quick Ligation Buffer， 2 μL，
Easy Digestion T-vector， 2μL，
T4连接酶，1 μL，
PCR仪中，16 ℃连接30 min。
具体转化、筛选操作过程参考如下：
首先，将上述连接产物转入大肠杆菌感受态细胞冰浴30 min，之后转移至预热好的水浴锅中42℃水浴90 s，再置于冰上冰浴1 min；
随后，加600 μL的LB液体培养基，轻打混匀后置于恒温振荡器中（振荡条件：37℃，180 r/min）复苏培养30 min；
再后，室温4000 r/min离心5min，用枪头吸取上清液丢弃，留下150 μL上清液用枪头来回吸打混匀制成重悬液，随后将其涂布到含有Amp（100 ng/mL）的LB固体培养基上，37℃倒扣培养16 h；
挑取单菌落于600 μL含有Amp的LB液体培养基中，随后置于恒温振荡器中（振荡条件：37 ℃，180 r/min）培养6 h。
具体菌液PCR验证操作参考如下：
20 μL体系设计如下：
Master Mix（近岸蛋白质科技有限公司，上海），10 μL；
上、下游引物（即前述PCR扩增用引物），各0.5 μL
菌液模板，1 μL；
ddH2O， 8 μL；
PCR具体程序为：98℃、30 s，98℃、30 s，60℃、30s，72℃、60 s，30个循环；72 ℃ 5min。
菌液PCR验证后，抽取100μL阳性克隆的菌液于5 mL含Amp的LB液体培养基中，恒温振荡器培养（振荡条件：37 ℃，180 r/min）16 h，委托生工生物工程股份有限公司（上海）进一步进行测序验证，确保序列的准确性，并进一步应用质粒抽提试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）提取重组正确质粒备用。
（2）同源重组
利用上述步骤（1）中重组质粒，采用同源重组的方法，将AaPG18连接到植物双元表达载体pBI121上，以构建获得重组质粒pBI121-AaPG18；
同源重组过程中，PCR引物对设计如下：
pBI121-F：gagaacacgggggactctagaAAGATGACAATGGTGCAACCACT，（其中：“gagaacacgggggactctaga”部分序列为同源臂）
pBI121-R：gcccttgctcaccatggatccCAAGCAACTTGAGGGCTTAACTAA；（其中“gcccttgctcaccatggatcc”部分序列为同源臂）
具体“同源重组”过程参考如下：
首先利用双酶切（酶切位点选用Xba I和BamH I）的方法对载体（原始载体pBI121）进行线性化；之后在上述正反向扩增引物的5’端引入线性化载体两末端的同源序列，确保扩增后的插入片段最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应一致的同源序列；
具体同源重组反应体系参考设计为：
线性化载体，5μL，
插入片段，5μL，
5×CEⅡBuffer，4μL，
Exnase I，1μL，
ddH2O，5μL；
操作时，使用移液器将上述反应体系轻轻吸打混匀，短暂离心后将反应液收集至管底，37℃反应30 min，之后立即置于冰上冷却。
（3）转化和筛选鉴定
将步骤（2）中所构建的重组质粒pBI121-AaPG18进一步转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并进一步筛选、测序验证，确保重组正确，并提取重组正确质粒备用（具体操作参考前述内容以及现有技术，不再赘述）。
（二）制备转染液
将步骤（一）中所构建重组质粒pBI121-AaPG18转化GV3101农杆菌感受态细胞，筛选转化正确的菌株，并进一步扩增培养至OD600=0.6-1.0。具体操作简介如下。
将重组质粒转化GV3101农杆菌感受态细胞，具体转化操作参考为：
首先，吸取5 μL重组质粒加入到提前冻融的200μL的GV3101农杆菌感受态细胞，枪头来回吸打混匀之后冰浴30 min，再液氮速冻1 min，水浴（37 ℃）水浴5 min，之后立即冰浴2 min；
随后，加入600μL 的LB液体培养基混匀后置于恒温振荡器中（28℃，220 r/min）培养4 h；
再后，10000 r/min离心30s，丢弃上清液，加入200μL的LB液体培养基，来回吸打菌体进行悬浮，重悬后将菌液涂布于含有Kna（50 ng/mL）和Rif（30 ng/mL）的LB固体培养基上，28℃倒扣培养72 h；
再后，挑取阳性单菌落于600 μL含有Kna和Rif的LB液体培养基中，恒温振荡器中（28 ℃，220 r/min）振荡培养6h；进一步进行菌液PCR鉴定和测序鉴定。
将鉴定正确的农杆菌菌株进一步转接至含有Kna和Rif的LB固体培养基上划线活化，28℃倒扣培养72 h；
挑取单菌落于含有Kna和Rif的LB液体培养基中，恒温振荡器（28℃，220 r/min）振荡培养16 h；
4000 r/min常温离心5 min收集菌体，之后用侵染液（10 mM MES，10 mM MgCl2和200 µM AS）重悬菌体并调整OD600=0.689（实施例中所采用为此数值，实践中，OD600=0.6~1.0均可）。室温静置2h后用于后续侵染。
作为对照，同时将未携带目的基因的空载体pBI121转化GV3101，并制备侵染液备用。
（三）单果验证
采集猕猴桃果实，利用1 mL带针头的注射器分别从果实左右两侧注射侵染液，注射时，注射力度应轻柔缓慢，确保侵染液在果实中得以渗透；
所述猕猴桃果实，为转色前（花后约80天）的软枣猕猴桃‘RB-4’果实；
注射完成后，室温（25℃左右）条件下放置48h后观察载体表型变化情况并对AaPG18表达量情况进行检测。
注射时，注射于果皮下（即皮下的果肉组织），注射量为0.2mL左右。
结果如图1所示。具体分析可以看出：
就相关表型结果而言：注射菌液两天后，注射pBI121-AaPG18的一侧，渗透区域内果实表面呈现明显的红色（图2A），此颜色标红作为红肉软枣猕猴桃由生涩转向成熟的标志，红色的显现表明果实进入成熟进程；而注射pBI121的一侧，渗透区域内果实与之前相比表型无显著变化（图2B），说明仅注射空载不能促进果实成熟。
也即，基于此结果，也可以初步表明AaPG18基因与猕猴桃果实成熟相关，且基于这种颜色变化，表明该基因与花色苷含量应该具有直接关联性。
就基因表达量变化结果而言：采用荧光定量PCR方法，以猕猴桃β-actin为内参基因，对AaPG18基因表达量检测结果表明（图2C），注射pBI121-AaPG18的果实样品中AaPG18的表达水平显著高于对照样品，表明注射pBI121-AaPG18以后，AaPG18能够在果实中渗透并完成基因的超表达进程，从而发挥应有的功能基因功能。
通过上述结果可以看出，一方面初步表明AaPG18基因与猕猴桃果实成熟直接相关，另一方面所设计的单果对照法可较好克服因果实发育状态不同导致的个体间差异，可以直观地观察到由基因引起的表型变化，能够有效地实现基因功能的验证。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院郑州果树研究所
<120> 猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法
<130> none
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1191
<212> DNA
<213> Actinidia arguta
<400> 1
atgacaatgg tgcaaccact gacttctctt cttctcactc tacctctctt cataatcttc 60
cgccaatcaa cattggcaat agcaacaaca tacaacgtgg ttagtttagg agccaaagga 120
gatggcacgt ccgactcaac caagcccttc ctcagcgcgt gggctttggc ttgcggctcg 180
gctatgccgg cctcgatcta cgtgcccaga gggaggtact tgcttggcaa gaccgagttc 240
ggaggcgaaa attgcaagaa taaggccatc accattcgta ttgacggcac tctcgtgagt 300
cccgccgatt atcgggtctt gggaaatgcc ggtaactgga ttgtatttag gggtgtcagt 360
ggtgtgtcta tttatggtgg gaccctcgat ggtcgtggac agggtttgtg ggcttgcaag 420
gcttccggca agagttgccc tcttggaact acgacgctac aattcagcaa ttcaaacaac 480
gtatttatta gtggattaac ctccctgaat agtcagatgt ttcactttgt catctacaat 540
tgcaacaatg tcaacgtaca aggagccaag atattggcct caggcaacag cccaaacact 600
gatggcatcc acgtcgcatc gtcgtctggc gtcacgatta tgaactctag gatcggtaca 660
ggggacgatt gtgtctcgat tggttcgggc accacggatt tgtggattga gaatgtcgct 720
tgtggccctg gccacggtat cagcattggg agtctgggcc agaacttgca ggaagatggt 780
gtgcaaaatg tgacggttaa gacggttacg tttaccggta cacaaaatgg tgttaggata 840
aagacatggg caaagcctag caatggattt gttcggggtg tgctcttcca gcatgctact 900
atggtcaatg tccaaaaccc catcattatc gatcaaaatt attgcccaga caacaaaaat 960
tgccccaatc aagtctcagg tgtaaagatc agcggtgtga cgtatcagga tattcatggg 1020
tcatcagcga cacaagttgc gattaaattc aattgtagca aaaaatatcc atgcagcagg 1080
ataacattgg aagatgtaaa tctcacctac aataatcaac cagcccaatc ttcatgttct 1140
aatgctggag gaagtgcttc tggtttagtt aagccctcaa gttgcttgta g 1191

Claims (4)

1.猕猴桃AaPG18基因，其特征在于，该基因序列长度为1191bp，序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述猕猴桃AaPG18基因在猕猴桃新品种培育中应用，其特征在于，猕猴桃AaPG18基因与猕猴桃果实软化成熟相关。
3.针对权利要求1所述猕猴桃AaPG18基因的转基因猕猴桃的单果验证方法，其特征在于，该方法以转基因瞬时表达系统为技术基础，针对猕猴桃单果进行转基因目的验证，具体包括如下步骤：
（一）构建过表达重组载体
以植物双元表达载体pBI121为载体，构建重组的pBI121-AaPG18过表达载体，具体步骤包括：
（1）获得目的基因
首先，提取猕猴桃单果果实总RNA，并反转录为cDNA备用；
随后，针对目的基因AaPG18设计PCR扩增用引物，并以上述cDNA为模板进行PCR扩增；
PCR扩增过程中，PCR扩增用引物对设计如下：
AaPG18-F：5’- ATGACAATGGTGCAACCACT-3’，
AaPG18-R：5’-CTACAAGCAACTTGAGGGCTTA-3’；
最后，对PCR扩增产物电泳检测后提纯备用；
（2）连接和转化
利用T4连接酶，将步骤（1）中所制备目的基因AaPG18与pED-T载体进行连接，随后，将连接产物转化，并进行筛选、验证，确保转化正确，并提取转化正确质粒备用；
（3）同源重组
利用步骤（2）中重组质粒，采用同源重组的方法，将AaPG18连接到植物双元表达载体pBI121上，以构建获得重组质粒pBI121-AaPG18；
同源重组过程中，PCR引物对设计如下：
pBI121-F：gagaacacgggggactctagaAAGATGACAATGGTGCAACCACT，
pBI121-R：gcccttgctcaccatggatccCAAGCAACTTGAGGGCTTAACTAA；
（4）转化和筛选鉴定
将步骤（3）中所构建的含有重组质粒pBI121-AaPG18的重组体系进一步转化、筛选，并进行进一步测序验证，确保重组正确，并提取重组正确质粒备用；
（二）制备转染液
将步骤（一）中所构建重组质粒pBI121-AaPG18转化GV3101农杆菌感受态细胞，筛选转化正确的菌株，并制备侵染液；
（三）单果验证
采集猕猴桃果实，利用带针头的注射器分别从果实左右两侧注射侵染液，确保侵染液在果实中得以渗透；
注射后，室温18~25℃放置2-3天进行观察判断。
4.如权利要求3所述针对猕猴桃AaPG18基因的转基因猕猴桃的单果验证方法，其特征在于，步骤（三）中，所述猕猴桃果实，具体选择花后80天‘RB-4’ 猕猴桃果实。
CN202210176427.1A 2022-02-25 2022-02-25 猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法 Active CN114438108B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210176427.1A CN114438108B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210176427.1A CN114438108B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114438108A true CN114438108A (zh) 2022-05-06
CN114438108B CN114438108B (zh) 2023-07-21

Family

ID=81372930

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210176427.1A Active CN114438108B (zh) 2022-02-25 2022-02-25 猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114438108B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105755018A (zh) * 2016-05-13 2016-07-13 中国农业科学院特产研究所 软枣猕猴桃l-半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法
KR101640586B1 (ko) * 2015-06-02 2016-07-18 주식회사 바이오메딕 키위 유래 화분 또는 화분관 특이적 프로모터 및 이의 용도
CN107446924A (zh) * 2017-08-16 2017-12-08 中国科学院华南植物园 一种基于CRISPR‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用
CN108208149A (zh) * 2018-01-31 2018-06-29 河南农业大学 多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用及其使用方法
CN113088525A (zh) * 2021-04-20 2021-07-09 四川大学 猕猴桃转录因子AcNAC4及其在果实酯类芳香物质合成中的应用
CN113604490A (zh) * 2021-08-12 2021-11-05 安徽农业大学 猕猴桃溃疡病感病基因AcBXL1及其应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101640586B1 (ko) * 2015-06-02 2016-07-18 주식회사 바이오메딕 키위 유래 화분 또는 화분관 특이적 프로모터 및 이의 용도
CN105755018A (zh) * 2016-05-13 2016-07-13 中国农业科学院特产研究所 软枣猕猴桃l-半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法
CN107446924A (zh) * 2017-08-16 2017-12-08 中国科学院华南植物园 一种基于CRISPR‑Cas9的猕猴桃基因AcPDS编辑载体及其构建方法和应用
CN108208149A (zh) * 2018-01-31 2018-06-29 河南农业大学 多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用及其使用方法
CN113088525A (zh) * 2021-04-20 2021-07-09 四川大学 猕猴桃转录因子AcNAC4及其在果实酯类芳香物质合成中的应用
CN113604490A (zh) * 2021-08-12 2021-11-05 安徽农业大学 猕猴桃溃疡病感病基因AcBXL1及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
王静毅;朱道圩;: "猕猴桃果实特异表达异戊烯基转移酶基因植物表达载体的构建", 安徽农业科学, no. 16 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114438108B (zh) 2023-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110923251B (zh) 烟草多酚氧化酶NtPPO4及其应用
CN113604490B (zh) 猕猴桃溃疡病感病基因AcBXL1及其应用
CN110028566B (zh) GhPRXR1蛋白及其编码基因在调控棉籽含油量中的应用
CN109022454A (zh) 一种棉花长纤维高表达基因GhLFHE2及其编码的蛋白质和应用
CN110819639A (zh) 烟草低温早花相关基因NtDUF599及其应用
CN108558992B (zh) 调控金针菇子实体发育的转录因子pdd1及其编码基因与应用
CN109370922B (zh) 一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌及其应用
CN114438108B (zh) 猕猴桃AaPG18基因及针对该转基因的单果验证方法
CN107815459B (zh) 一种糙皮侧耳锰过氧化物酶基因及其应用
CN114214332B (zh) 一种天目地黄花青素相关基因RcMYB1及其应用
CN103361365B (zh) 盾壳霉铁载体转运蛋白基因及制备方法和用途
CN113817039B (zh) 一种增强植物抗旱性蛋白VaPBP2-L及应用
CN102776202A (zh) 一种培育雄性不育植物的方法
CN111304240B (zh) 基于烟草瞬时表达体系快速鉴定葡萄基因功能的方法
CN114438102A (zh) 一种草莓乙烯响应FaERF13基因及其在改变草莓果实成熟期的应用
CN111533794B (zh) 烟草NtDREB-1BL1转录因子及其应用
CN111499712B (zh) 烟草NtDREB-1BL2转录因子及其应用
CN117264977B (zh) 一种黄瓜抗蚜调控基因CsRBOHD及其应用
CN111440806B (zh) 烟草NtDREB-1BL3转录因子及其应用
CN111454987B (zh) GhNAC091基因在提高植物光合利用效率和强光耐受中的应用
CN114908068B (zh) 梨胼胝质合成酶PbrCalS5及其编码基因和应用
CN110903371B (zh) 烟草纤维二糖相关蛋白NtCRP1及其应用
CN107365776A (zh) Emp基因在水稻愈伤分化发育中的应用
CN117604026A (zh) 一种基于LrMYB30的黑果枸杞果实VIGS基因沉默体系及构建方法
CN110437325B (zh) 转录因子lfc1对金针菇子实体发育的调控以及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant