CN111849931A

CN111849931A - 川桑色氨酸羟化酶t5h2及其应用

Info

Publication number: CN111849931A
Application number: CN201910342321.2A
Authority: CN
Inventors: 赵爱春; 郑莎; 刘长英; 朱映雪; 张帅; 夏中强; 向仲怀
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-04-26
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2020-10-30

Abstract

本发明公开了川桑色氨酸羟化酶T5H2及其应用，其中川桑色氨酸羟化酶T5H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，含有532个氨基酸，PI＝4.93，将川桑色氨酸羟化酶T5H2基因克隆后构建原核表达系统，表达后进行酶活测定，测得具有较高的色氨酸羟化酶活性，因此川桑色氨酸羟化酶T5H2可以作为工程菌的基因，表达的重组川桑色氨酸羟化酶T5H2也可以作为体外催化色胺转化为5‑色胺的催化剂，然后过不同的途径有效的合成相应产物，最后有效的合成褪黑素，具有很好的应用前景。

Description

川桑色氨酸羟化酶T5H2及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及川桑色氨酸羟化酶T5H2，还涉及川桑色氨酸羟化酶T5H2及其应用的应用。

背景技术

褪黑素，学名N-乙酰基-5-甲氧基-色胺，是一种吲哚胺，色氨酸的代谢产物。目前已知它广泛存在于人体、动物体及植物体内，生理作用非常广泛。由于其首先在人体的松果体内被发现，因此又被称为松果体素。随后的研究发现，其广泛存在于人体内的各个部位，含量极少，只有pg(1×10^-12g)/mL水平。目前已知的褪黑素的生理功能主要有调节生物体的昼夜节律，缓解睡眠障碍；抗氧化，褪黑素本身及其代谢产物不仅有强大的自由基清除能力，而且能够诱导生物体相关抗氧化酶活性增强，增强免疫作用，抗肿瘤，抗衰老，特别是对阿尔茨海默病有明显效果等优点。

长期以来褪黑素被认为是动物体内专有的，自从1995年在植物中检测到褪黑素之后，人们陆续在许多高等植物中也发现褪黑素存在。在动物中，褪黑素的生物合成途径已经非常清楚。在植物中褪黑素的合成途径包括3条：(1)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；色氨酸羟化酶将色胺转化为5-羟色胺；N-乙酰-5羟色胺转移酶将5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺；N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶或者咖啡酸氧甲基转移酶将N-乙酰-5羟色胺转化成褪黑素。(2)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；N-乙酰-5羟色胺转移酶将色胺转化为N-乙酰-5羟色胺；N-乙酰色胺氧甲基转移酶将N-乙酰-5羟色胺转化成褪黑素。(3)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；色氨酸羟化酶将色胺转化为5-羟色胺；N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶或者咖啡酸氧甲基转移酶将5-羟色胺转化成5-甲氧基-色胺；N-乙酰色胺转移酶将5-甲氧基-色胺转化成褪黑素。

色氨酸羟化酶基因(T5H2)是褪黑素合成过程中的第二个限速酶，该反应高度特异，是褪黑素合成中的重要酶促步骤。川桑中含有褪黑素，但是其含量极低，并不能大量提取获得。因此，研究褪黑素合成途径的色氨酸羟化酶基因及其基因，有利于体外合成途径的建立，为褪黑素规模化生产点奠定基础。

发明内容

有鉴于此，本发明通过分子生物学技术，克隆出褪黑素合成相关酶色氨酸羟化酶T5H2基因，分析该基因的核苷酸和翻译的氨基酸序列，采用大肠杆菌原核表达系统进行褪黑素合成相关酶色氨酸羟化酶T5H2的功能验证。用发酵的产物纯化、得到相关的色氨酸羟化酶蛋白直接体外依次合成褪黑素前体5-羟色胺。即本发明的目的之一在于提供一种川桑色氨酸羟化酶T5H2；本发明的目的之二在于提供一种川桑色氨酸羟化酶基因T5H2；本发明的目的之三在于提供所述川桑色氨酸羟化酶T5H2在制备色胺转化为5-羟色胺的催化剂中的应用；本发明的目的之四在于提供所述川桑色氨酸羟化酶基因T5H2在原核生物中重建褪黑素合成途径中的应用；本发明的目的之五在于提供一种制备重组川桑色氨酸羟化酶T5H2的方法；本发明的目的之六在于提供由权所述的方法制得的重组川桑色氨酸羟化酶T5H2；本发明的目的之七在于提供所述重组川桑氨酸羟化酶T5H2在制备色胺转化为5-羟色胺的催化剂中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种川桑色氨酸羟化酶T5H2，所述色氨酸羟化酶T5H2的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。

优选的，编码川桑色氨酸羟化酶T5H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2、一种川桑色氨酸羟化酶基因T5H2，所述川桑色氨酸羟化酶基因T5H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3、所述川桑色氨酸羟化酶T5H2在作为色胺转化为5-羟色胺的催化剂中的应用。色氨酸羟化酶T5H2可以在体外完成催化反应，也可以在宿主体内进行催化反应，宿主可以为真核生物，也可以为原核生物。

4、所述川桑色氨酸羟化酶基因T5H2在宿主细胞中重建褪黑素合成途径中的应用，其特征在于：所述T5H2为催化色胺转化为5-羟色胺的关键酶基因。

5、一种制备重组川桑色氨酸羟化酶T5H2的方法，所述将如SEQ ID NO.3所示的川桑色氨酸羟化酶基因T5H2连入Pcold-tf质粒KpnⅠ和ECORI酶切位点，获得重组表达载体Pcold-tf-T5H2，再将获得的重组表达载体转化表达菌株B21(DE3)，在28℃、IPTG终浓度为1mM条件下诱导表达，提取，纯化，获得重组川桑色氨酸羟化酶T5H2。

优选的，所述提取的方法是收集菌体，在功率为200W条件下超声破碎，超声总时间15min，每超声1s，暂停3s；然后在4℃、15000g条件下离心20min，收集上清。

优选的，所述纯化是使用镍柱纯化，用含咪唑浓度为100mM的洗脱液进行洗脱。

6、由所述的方法制得的重组川桑氨酸羟化酶T5H2；其该重组酶的酶促反应最适底物浓度1.0μm，最适温度为28℃，最适pH为碱性(pH＝8.8)，最适反应时间为10分钟。

7、所述重组川桑氨酸羟化酶T5H2在作为色胺转化为5-羟色胺的催化剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了川桑氨酸羟化酶T5H2及其基因，将川桑氨酸羟化酶T5H2进行原核表达和酶活性的测定，测得其具有较高的色氨酸羟化酶的活性，其DNA碱基序列和氨基酸序列均与已报道的色氨酸羟化酶基因序列有差异。因此，我们认为这是新的色氨酸羟化酶基因，其原核表达的酶活性高，作为工程菌的目的基因表达重组酶，重组酶作为催化剂合成褪黑色素前体物质，最后经不同的途径合成褪黑素，作为抗肿瘤，抗衰老，特别是对阿尔茨海默病候选药物，具有很好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为扩增色氨酸羟化酶基因T5H2电泳图。

图2为Pcold-tf-MnT5H2诱导上清经镍柱纯化后咪唑洗脱SDS-PAGE电泳图(1：蛋白质Marker；2：Pcold-tf空载(+IPTG)；3：重组子(-IPTG)；4：重组子(+IPTG)；5：上清经最适浓度咪唑浓度洗脱液)。

图3为底物色胺在色氨酸羟化酶的催化下生成物经UPLC-MS/MS鉴定的质谱图(A:5-羟色胺标品B:生成物(底物在T5H2酶催化下生成物))。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明中商业5-羟色胺(Sigma，市售价1096元/1096)检验色氨酸羟化酶基因所表达的酶活性。

实施例1、色氨酸羟化酶基因T5H2克隆

首先根据Morus.T5H2datebase上已报道的Morus.T5H2色氨酸羟化酶基因(Morus018957)设计扩增T5H2的引物，具体如下：

T5H2上游引物为：5'-ggggtaccatggctctccttcagtggtt-3'(SEQ ID NO.1)；

T5H2下游引物为：5'-cggaattctt atggaaagcgtggcttgg-3'(SEQ ID NO.2)。

以川桑的cDNA为模版，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行PCR扩增，扩增获得T5H2基因全长，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。回收扩增产物，然后与pMD19-T载体连接，连接产物转化E.coli.Trans1-T1感受态细胞，获得的阳性克隆送往华大基因公司测序。获得T5H2基因全长序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

实施例2、色氨酸羟化酶基因T5H2重组载体构建及原核表达

将实施例1的扩增产物用KpnⅠ和ECORI进行双酶切，同时用KpnⅠ和ECORI进行双酶切酶切Pcold-tf质粒，分别回收T5H2基因片段和Pcold-tf质粒骨架，用T₄DNA连接酶连接获得重组质粒Pcold-tf-T5H2，然后将重组质粒Pcold-tf-T5H2转化，大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，经鉴定正确的Pcold-tf-T5H2送往华大基因公司测序，测序结果与第一次测序得到的序列一致从而获得了正确的序列。

提取Pcold-tf-T5H2质粒，将其转入表达菌株B21(DE3)，在1.5ml的离心管加入450μl含有Amp抗性的LB培养基，按照1：100扩大培养到试管中，28℃，220rpm摇床培养至OD₆₀₀＝0.6，取1ml菌液保存了作为诱导前阳性对照，加入IPTG进行诱导，IPTG中浓度为1mM，28℃下诱导8h，诱导后各取1ml菌液保存作为诱导后总蛋白，剩余菌液4℃，5000rpm离心10min收菌，弃上清，菌体用PBS洗两次；超声破碎，超声功率为200W，超声1s，暂停3s，超声总时间15min；4℃，15000×g，20min，取上清于新的离心管中。将之前保存的诱导前和诱导后的菌液10000rpm离心1min沉淀用PBS重悬，加入适量5×Loading buffer。取破碎离心后的上清加入适量5×Loading buffer。将加入的样品沸水浴，之后12000rpm离心2min，吸取上清进行检测目的蛋白的表达情况；

将含Pcold-tf-T5H2质粒的菌株诱导8小时的上清进镍柱纯化，分别用含咪唑浓度为：100mM，200mM，250mM，300mM的洗脱液进行洗脱，SDS-PAGE检测其咪唑洗脱浓度，结果如图2所示。结果显示，100mM的咪唑可以将大量的目的蛋白洗脱下来。

实施例3、重组色氨酸羟化酶T5H2浓度及活性检测

取Pcold-tf-T5H2菌株诱导8小时的上清经镍柱纯化，后采用UPLC测定酶促反应的产物的物质量来表示酶活力，酶的活力单位定义为每分钟生成1nmol的物质的量为一个比活力即1U诱导诱导菌液摇了8小时之后，5ml上清经纯化后，用10ml咪唑浓度为100mM洗脱，液洗脱后，洗脱液里面所含的色氨酸羟化酶的浓度为0.074mg/ml。

以浓度为1.0μM的色胺为底物，在温度为28℃、pH为8.8的条件下，加入的酶活力17.785U的色氨酸羟化酶，反应10min，然后用UPLC-MS/MS鉴定，结果如图3所示。结果显示，催化生成的5-羟色胺总量为355.69nmol(6290ug)(图2)。

上述结果表明本发明通过原核表达的重组色氨酸羟化酶T5H2具有较高的色氨酸脱羧酶的活性，可以用于在原核构建褪黑素代谢途径的目的基因，也可将获得的重组色氨酸羟化酶T5H2用于体外合成褪黑素前体物质5-羟色胺，再在其他酶作用下继续合成褪黑素。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 川桑色氨酸羟化酶T5H2及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggtaccat ggctctcctt cagtggtt 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggaattctt atggaaagcg tggcttgg 28

<210> 3

<211> 1530

<212> DNA

<213> 川桑(Morus alba)

<400> 3

atggctctcc ttcagtggtt aaacgaaccg tctttgctct tctttgccac agttttcctt 60

gtaatttttc tcaacttcat cttcagaaat aacccaattg ttagaaacag aagaagagca 120

ttgaatctcc caccaagccc tccaaaactt cccatcattg gaaaccttca ccagcttgga 180

aacaaccctc acgtctctct ccaaaaattg gcacaaaaat atggtccaat tatttactta 240

caacttggtc aagtcccaac tgtgatagtt tcatcagcta gagtagccaa agaagcattg 300

aaaacccatg atctggcctt gtcaagccgt ccgcaaatct tctcagccaa acatcttttc 360

tacaactgca ctgacattgt tttctcccca tatggagctt attggaggta cattaggaag 420

atatgcatac ttgagctgtt tagtgccaaa agggttcaat cttttggctt cattcgagaa 480

gaggaagttg ctcatctggt gcgtcgggtt tcggagtctt atcccggcac aaccaatcta 540

agcaagatgc ttgggttgta tgccaatgat gttctttgca gggtggcttt cggaagggat 600

ttctcaggag gtggagacta tgataagcag ggattccaaa agatgcttga agagtatcaa 660

gagttgctag gagggctcag tgttggagat ttctttcctt ccatggagtt tgtgcacgct 720

ttgacgggaa ccaaatcgag acttgtcgcc acgtttcatc gttttgatca acttttcgat 780

cagattgtgg ctgaacatgc cgatcctgat agaaaaaatg ttgagcacaa ggaccttgtt 840

gatgtcttgc ttgatattca gaagaatgag tctggggaca ttactctcac catggacaat 900

gtcaaggcta tcatattgga catgtttgct gcagggaccg atacaacatt catagtcctt 960

gattggggaa tgacagagct cattttgaac cctaaagttt tggaaaaagc acaagctgaa 1020

gttagaagtg ttatgggaga gagaaaagtt gttttagaga gtgatctgcc tcaactcgac 1080

tacatgaaag cagtcatcaa agagaccttc agattgcatc ctcctgctcc agttctagtc 1140

cctagagaat caatggaaca tgttactacg gatggatacg atattccagc gaagacgaga 1200

atctttgtca atgcctgggc aattgggaga gacccggaaa gttgggaaga tccagaagca 1260

ttcaaaccag aaagatttat gggtagtagt attgatttca agggacagga ttttgagctc 1320

ataccatttg gagctggtag aagaatctgc cctgccatga catttggaac ggcgagtgtt 1380

gagcttgctt tagctcagct tctccatagc ttcgattggg agcttcctcc tggagttgcg 1440

gctaaagatt tggacatgac tgaagttttt ggcatcacaa tgcacaggaa agccagttta 1500

atagtcctcg ccaagccacg ctttccataa 1530

<210> 4

<211> 509

<212> PRT

<213> 川桑(Morus alba)

<400> 4

Met Ala Leu Leu Gln Trp Leu Asn Glu Pro Ser Leu Leu Phe Phe Ala

1 5 10 15

Thr Val Phe Leu Val Ile Phe Leu Asn Phe Ile Phe Arg Asn Asn Pro

20 25 30

Ile Val Arg Asn Arg Arg Arg Ala Leu Asn Leu Pro Pro Ser Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Pro Ile Ile Gly Asn Leu His Gln Leu Gly Asn Asn Pro His

50 55 60

Val Ser Leu Gln Lys Leu Ala Gln Lys Tyr Gly Pro Ile Ile Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Leu Gly Gln Val Pro Thr Val Ile Val Ser Ser Ala Arg Val Ala

85 90 95

Lys Glu Ala Leu Lys Thr His Asp Leu Ala Leu Ser Ser Arg Pro Gln

100 105 110

Ile Phe Ser Ala Lys His Leu Phe Tyr Asn Cys Thr Asp Ile Val Phe

115 120 125

Ser Pro Tyr Gly Ala Tyr Trp Arg Tyr Ile Arg Lys Ile Cys Ile Leu

130 135 140

Glu Leu Phe Ser Ala Lys Arg Val Gln Ser Phe Gly Phe Ile Arg Glu

145 150 155 160

Glu Glu Val Ala His Leu Val Arg Arg Val Ser Glu Ser Tyr Pro Gly

165 170 175

Thr Thr Asn Leu Ser Lys Met Leu Gly Leu Tyr Ala Asn Asp Val Leu

180 185 190

Cys Arg Val Ala Phe Gly Arg Asp Phe Ser Gly Gly Gly Asp Tyr Asp

195 200 205

Lys Gln Gly Phe Gln Lys Met Leu Glu Glu Tyr Gln Glu Leu Leu Gly

210 215 220

Gly Leu Ser Val Gly Asp Phe Phe Pro Ser Met Glu Phe Val His Ala

225 230 235 240

Leu Thr Gly Thr Lys Ser Arg Leu Val Ala Thr Phe His Arg Phe Asp

245 250 255

Gln Leu Phe Asp Gln Ile Val Ala Glu His Ala Asp Pro Asp Arg Lys

260 265 270

Asn Val Glu His Lys Asp Leu Val Asp Val Leu Leu Asp Ile Gln Lys

275 280 285

Asn Glu Ser Gly Asp Ile Thr Leu Thr Met Asp Asn Val Lys Ala Ile

290 295 300

Ile Leu Asp Met Phe Ala Ala Gly Thr Asp Thr Thr Phe Ile Val Leu

305 310 315 320

Asp Trp Gly Met Thr Glu Leu Ile Leu Asn Pro Lys Val Leu Glu Lys

325 330 335

Ala Gln Ala Glu Val Arg Ser Val Met Gly Glu Arg Lys Val Val Leu

340 345 350

Glu Ser Asp Leu Pro Gln Leu Asp Tyr Met Lys Ala Val Ile Lys Glu

355 360 365

Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Ala Pro Val Leu Val Pro Arg Glu Ser

370 375 380

Met Glu His Val Thr Thr Asp Gly Tyr Asp Ile Pro Ala Lys Thr Arg

385 390 395 400

Ile Phe Val Asn Ala Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Glu Ser Trp Glu

405 410 415

Asp Pro Glu Ala Phe Lys Pro Glu Arg Phe Met Gly Ser Ser Ile Asp

420 425 430

Phe Lys Gly Gln Asp Phe Glu Leu Ile Pro Phe Gly Ala Gly Arg Arg

435 440 445

Ile Cys Pro Ala Met Thr Phe Gly Thr Ala Ser Val Glu Leu Ala Leu

450 455 460

Ala Gln Leu Leu His Ser Phe Asp Trp Glu Leu Pro Pro Gly Val Ala

465 470 475 480

Ala Lys Asp Leu Asp Met Thr Glu Val Phe Gly Ile Thr Met His Arg

485 490 495

Lys Ala Ser Leu Ile Val Leu Ala Lys Pro Arg Phe Pro

500 505

Claims

1.一种川桑色氨酸羟化酶T5H2，其特征在于：所述色氨酸羟化酶T5H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述川桑色氨酸羟化酶T5H2，其特征在于：编码川桑色氨酸羟化酶T5H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种川桑色氨酸羟化酶基因T5H2，其特征在于：所述川桑色氨酸羟化酶基因T5H2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1所述川桑色氨酸羟化酶T5H2在作为色胺转化为5-羟色胺的催化剂中的应用。

5.权利要求3所述川桑色氨酸羟化酶基因T5H2在宿主细胞中重建褪黑素合成途径中的应用，其特征在于：所述T5H2为催化色胺转化为5-羟色胺的关键酶基因。

6.一种制备重组川桑色氨酸羟化酶T5H2的方法，其特征在于：所述将如SEQ ID NO.3所示的川桑色氨酸羟化酶基因T5H2连入Pcold-tf质粒KpnⅠ和ECORI酶切位点，获得重组表达载体Pcold-tf-T5H2，再将获得的重组表达载体转化表达菌株B21(DE3)，在28℃、IPTG终浓度为1mM条件下诱导表达，提取，纯化，获得重组川桑色氨酸羟化酶T5H2。

7.根据权利要求6所述制备重组氨酸羟化酶T5H2的方法，其特征在于：所述提取的方法是收集菌体，在功率为200W条件下超声破碎，超声总时间15min，每超声1s，暂停3s；然后在4℃、15000g条件下离心20min，收集上清。

8.根据权利要求6所述制备重组川桑氨酸羟化酶T5H2的方法，其特征在于：所述纯化是使用镍柱纯化，用含咪唑浓度为100mM的洗脱液进行洗脱。

9.由权利要求6～8任一项所述的方法制得的重组川桑氨酸羟化酶T5H2。

10.权利要求9所述重组川桑氨酸羟化酶T5H2在作为色胺转化为5-羟色胺的催化剂中的应用。