CN114381476A - 一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法 - Google Patents

一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及苏氨酸发酵技术领域，且公开了一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法；本提苏氨酸发酵产率和转化率的方法包括以下步骤：S1、准备材料；S2、斜面培养；S3、种子培养；S4、发酵培养；S5、浓缩蒸发，本发明利用发酵偶联刮板浓缩蒸发技术，将苏氨酸发酵中后期含高浓度乙酸和铵根离子的发酵液在发酵罐正压和刮板蒸发器负压的双重作用下从发酵罐进入刮板蒸发器的料液进口，将乙酸和铵根离子通过蒸发作用进入冷凝器，浓缩后的发酵液通过浓缩液暂储罐进入发酵罐继续发酵，工艺操作简单，能耗少，可以连续进料，连续除乙酸和铵根离子等挥发性物质，连续排料，去除乙酸和铵根离子效率高，稳定性和自动化程度高。

Description

一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法
技术领域
本发明属于苏氨酸发酵技术领域，具体为一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法。
背景技术
苏氨酸(Threonine)化学名称为α-氨基-β-羟基丁酸,1935年由W.C.Rose在纤维蛋白水解物中分离和鉴定出来。在人体和动物所需的八种必需氨基酸中，苏氨酸是仅次于蛋氨酸、赖氨酸、苏氨酸的第四种氨基酸。苏氨酸在人的生长发育中发挥越来越重要的作用，被广泛应用于食品业、饲养业、以及医疗等方面。
目前，大肠杆菌直接发酵法是L-苏氨酸工业化生产的首选技术，在发酵过程中，代谢副产物乙酸和NH4+等过量累积会对菌体生长、菌体活力和产酸产生严重影响。L-苏氨酸的发酵高产的关键是控制乙酸的生成，到目前为止，还没有研究清楚乙酸对菌体确切的抑制机理，可能乙酸是阻遏DNA、RNA、蛋白质和脂质的合成，乙酸超过5g/L会降低菌体生长速率和转化率；因此，针对目前的状况，现需对其进行改进。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法，有效的解决了目前，大肠杆菌直接发酵法是L-苏氨酸工业化生产的首选技术，在发酵过程中，代谢副产物乙酸和NH4+等过量累积会对菌体生长、菌体活力和产酸产生严重影响。L-苏氨酸的发酵高产的关键是控制乙酸的生成，到目前为止，还没有研究清楚乙酸对菌体确切的抑制机理，可能乙酸是阻遏DNA、RNA、蛋白质和脂质的合成，乙酸超过5g/L会降低菌体生长速率和转化率的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法，包括以下步骤：
S1、准备材料：准备葡萄糖0.2％-5.0％，蛋白胨1.0％-1.5％，酵母粉0.5％-1.5％，牛肉膏1.0％-1.5％，NaCl0.5％-1.0％,琼脂1.8％-2.0％，KH2PO40.15％-0.55％，MgSO40.05％-0.25％，FeSO410mg/L-30mg/L，MnSO410mg/L-25mg/L，玉米浆2.0％-4.5％，VB12mg/L-4mg/L，氨基酸粉0.5％-1.1％，泡敌0.002％-0.005％，甜菜碱0.1％-0.2％，胆碱0.1％-0.2％；
S2、斜面培养：取用葡萄糖0.2％-0.5％，蛋白胨1.0％-1.5％，酵母粉0.5％-1.0％，牛肉膏1.0％-1.5％，NaCl0.5％-1.0％,琼脂1.8％-2.0％，将其放入斜面培养基中，调节PH值至7.0-7.2，将斜面培养基放入加热箱中，调节温度至32-36℃，培养时间为20-24h，检验合格后，放入冰箱保存备用；
S3、种子培养：取用葡萄糖3.0％-3.5％，KH2PO40.15％-0.20％，MgSO40.05％-0.10％，FeSO410mg/L-15mg/L，MnSO410mg/L-15mg/L，玉米浆2.5％-3.0％，酵母粉0.30％-0.35％，VB12mg/L-2.5mg/L，氨基酸粉0.5％-1％，泡敌0.002％-0.005％,将其放入种子培养基中，调节PH值至7.1-7.3，取步骤S1中的活化斜面，吸取10-20ml的无菌生理盐水置于活化斜面中，接着将活化斜面中的菌悬液接入种子培养基中，使用搅拌轴搅拌均匀，将种子培养基放入加热箱中，调节温度至36-38℃，接入溶氧控制仪，溶氧控制在20％-50％之间，培养时间为7-10h，至菌种OD600nm增加值大于20之后接种发酵；
S4、发酵培养：取用葡萄糖2.0％-5％(作为初糖使用)，KH2PO40.35％-0.55％，MgSO40.15％-0.25％，FeSO420mg/L-30mg/L，MnSO415mg/L-25mg/L，玉米浆2.0％-4.5％，酵母粉0.2％-0.5％，VB12mg/L-4mg/L，氨基酸粉0.6％-1.1％，甜菜碱0.1％-0.2％，胆碱0.1％-0.2％，泡敌0.002％-0.005％，将其放入发酵培养基中，调节PH值至7.0-7.1，将发酵培养基放入气浴恒温震荡器中，调节温度至36-38℃，接入溶氧控制仪和刮板浓缩蒸发系统，罐压控制在0.05-0.12MPa，通风比根据溶氧要求控制在0.3-0.8vvm，溶氧控制在20％-50％，初糖耗尽后，OD回升开始均匀加入葡萄糖糖液(葡萄糖糖液浓度为70％)，通过葡萄糖均匀添加速率维持溶氧DO在20％-50％，残糖浓度小于0.2％，使用气浴恒温震荡器摇瓶发酵，发酵时间为36-38h，其中，在发酵培养至16h时，乙酸开始迅速增长，铵根离子浓度增长至70mmol/L以上时，开启刮板浓缩蒸发系统；
S5、浓缩蒸发：将步骤S4中因刮板浓缩蒸发系统循环浓缩蒸发的浓缩液，使其进入发酵罐进行再次发酵，并向发酵罐中流加等量冷凝液体积的无菌水，以控制发酵体积平衡，使得菌体保持较高的活力和产酸速率。
优选的，所述步骤S2中，蛋白胨、牛肉膏和琼脂均需加热至80-90℃，使蛋白胨、牛肉膏和琼脂完全溶解，且在加热中挥发水分，需采用等量的无菌水补足。
优选的，所述步骤S2-S4中，调节PH值均采用10％HCl或10％NaOH进行调节至适合值。
优选的，所述步骤S3中，搅拌轴转速为300-700r/min，且搅拌轴使用前经高温灭菌消毒。
优选的，所述步骤S4中，气浴恒温震荡器型号为THZ-92A，气浴恒温震荡器振幅为8-10cm,震荡频率为80-90次/min。
优选的，所述步骤S2-S4中，操作步骤均在无菌操作室进行，且所述步骤S5中，刮板浓缩蒸发系统包括苏氨酸发酵罐、真空冷凝系统、冷凝液收集槽、刮板蒸发器和浓缩液暂储罐。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：该发明，利用发酵偶联刮板浓缩蒸发技术，将苏氨酸发酵中后期含高浓度乙酸和铵根离子的发酵液在发酵罐正压和刮板蒸发器负压的双重作用下从发酵罐进入刮板蒸发器的料液进口，发酵液进入刮板浓缩器，乙酸和铵根离子通过蒸发作用进入冷凝器，浓缩后的发酵液通过浓缩液暂储罐进入发酵罐继续发酵，完成一个蒸发过程，工艺操作简单，能耗少，而且可以连续进料，连续除乙酸和铵根离子等挥发性物质，连续排料，去除乙酸和铵根离子效率高，稳定性和自动化程度高；
该发明，在发酵16h开启蒸发系统，在发酵36h结束时，乙酸浓度由对照发酵的9.2g/L降至2.7g/L，铵根离子浓度由132.0mmol/L降至52.9mmol/L，产酸浓度由142g/L提高至187g/L，糖酸转化率由57.2％提高至62.7％，有效提高了L-苏氨酸的发酵产率和转化率。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1为本发明流程图；
图2为本发明刮板浓缩蒸发系统结构示意图；
图3为本发明实施例2数据图；
图4为本发明实施例2数据图；
图中：1、苏氨酸发酵罐；2、真空冷凝系统；3、冷凝液收集槽；4、刮板蒸发器；5、浓缩液暂储罐。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明提供一种方案：一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法，包括以下步骤：
S1、准备材料：准备葡萄糖0.2％-5.0％，蛋白胨1.0％-1.5％，酵母粉0.5％-1.5％，牛肉膏1.0％-1.5％，NaCl0.5％-1.0％,琼脂1.8％-2.0％，KH2PO40.15％-0.55％，MgSO40.05％-0.25％，FeSO410mg/L-30mg/L，MnSO410mg/L-25mg/L，玉米浆2.0％-4.5％，VB12mg/L-4mg/L，氨基酸粉0.5％-1.1％，泡敌0.002％-0.005％，甜菜碱0.1％-0.2％，胆碱0.1％-0.2％；
S2、斜面培养：取用葡萄糖0.2％-0.5％，蛋白胨1.0％-1.5％，酵母粉0.5％-1.0％，牛肉膏1.0％-1.5％，NaCl0.5％-1.0％,琼脂1.8％-2.0％，将其放入斜面培养基中，调节PH值至7.0-7.2，将斜面培养基放入加热箱中，调节温度至32-36℃，培养时间为20-24h，检验合格后，放入冰箱保存备用；
S3、种子培养：取用葡萄糖3.0％-3.5％，KH2PO40.15％-0.20％，MgSO40.05％-0.10％，FeSO410mg/L-15mg/L，MnSO410mg/L-15mg/L，玉米浆2.5％-3.0％，酵母粉0.30％-0.35％，VB12mg/L-2.5mg/L，氨基酸粉0.5％-1％，泡敌0.002％-0.005％,将其放入种子培养基中，调节PH值至7.1-7.3，取步骤S1中的活化斜面，吸取10-20ml的无菌生理盐水置于活化斜面中，接着将活化斜面中的菌悬液接入种子培养基中，使用搅拌轴搅拌均匀，将种子培养基放入加热箱中，调节温度至36-38℃，接入溶氧控制仪，溶氧控制在20％-50％之间，培养时间为7-10h，至菌种OD600nm增加值大于20之后接种发酵；
S4、发酵培养：取用葡萄糖2.0％-5％(作为初糖使用)，KH2PO40.35％-0.55％，MgSO40.15％-0.25％，FeSO420mg/L-30mg/L，MnSO415mg/L-25mg/L，玉米浆2.0％-4.5％，酵母粉0.2％-0.5％，VB12mg/L-4mg/L，氨基酸粉0.6％-1.1％，甜菜碱0.1％-0.2％，胆碱0.1％-0.2％，泡敌0.002％-0.005％，将其放入发酵培养基中，调节PH值至7.0-7.1，将发酵培养基放入气浴恒温震荡器中，调节温度至36-38℃，接入溶氧控制仪和刮板浓缩蒸发系统，罐压控制在0.05-0.12MPa，通风比根据溶氧要求控制在0.3-0.8vvm，溶氧控制在20％-50％，初糖耗尽后，OD回升开始均匀加入葡萄糖糖液(葡萄糖糖液浓度为70％)，通过葡萄糖均匀添加速率维持溶氧DO在20％-50％，残糖浓度小于0.2％，使用气浴恒温震荡器摇瓶发酵，发酵时间为36-38h，其中，在发酵培养至16h时，乙酸开始迅速增长，铵根离子浓度增长至70mmol/L以上时，开启刮板浓缩蒸发系统；
S5、浓缩蒸发：将步骤S4中因刮板浓缩蒸发系统循环浓缩蒸发的浓缩液，使其进入发酵罐进行再次发酵，并向发酵罐中流加等量冷凝液体积的无菌水，以控制发酵体积平衡，使得菌体保持较高的活力和产酸速率。
其中，在步骤S2中，蛋白胨、牛肉膏和琼脂均需加热至80-90℃，使蛋白胨、牛肉膏和琼脂完全溶解，且在加热中挥发水分，需采用等量的无菌水补足，在步骤S2-S4中，调节PH值均采用10％HCl或10％NaOH进行调节至适合值，在步骤S3中，搅拌轴转速为300-700r/min，且搅拌轴使用前经高温灭菌消毒，在步骤S4中，气浴恒温震荡器型号为THZ-92A，气浴恒温震荡器振幅为8-10cm,震荡频率为80-90次/min，在步骤S2-S4中，操作步骤均在无菌操作室进行，且所述步骤S5中，刮板浓缩蒸发系统包括苏氨酸发酵罐、真空冷凝系统、冷凝液收集槽、刮板蒸发器和浓缩液暂储罐。
实施例一
一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法，包括以下步骤：
S1、准备材料：准备葡萄糖5.0％，蛋白胨1.5％，酵母粉1.5％，牛肉膏1.5％，NaCl1.0％,琼脂2.0％，KH2PO40.55％，MgSO40.25％，FeSO430mg/L，MnSO425mg/L，玉米浆4.5％，VB14mg/L，氨基酸粉1.1％，泡敌0.005％，甜菜碱0.2％，胆碱0.2％；
S2、斜面培养：取用葡萄糖0.2％，蛋白胨1.0％，酵母粉0.5％，牛肉膏1.0％，NaCl0.5％,琼脂1.8％，将其放入斜面培养基中，调节PH值至7.2，将斜面培养基放入加热箱中，调节温度至36℃，培养时间为20h，检验合格后，放入冰箱保存备用；
S3、种子培养：取用葡萄糖3.0％，KH2PO40.15％，MgSO40.05％，FeSO410mg/L，MnSO410mg/L，玉米浆2.5％，酵母粉0.30％，VB12mg/L，氨基酸粉0.5％，泡敌0.002％,将其放入种子培养基中，调节PH值至7.1，取步骤S1中的活化斜面，吸取20ml的无菌生理盐水置于活化斜面中，接着将活化斜面中的菌悬液接入种子培养基中，使用搅拌轴搅拌均匀，将种子培养基放入加热箱中，调节温度至36℃，接入溶氧控制仪，溶氧控制在20％-50％之间，培养时间为7h，至菌种OD600nm增加值大于20之后接种发酵；
S4、发酵培养：取用葡萄糖2.0％(作为初糖使用)，KH2PO40.35％，MgSO40.15％，FeSO420mg/L，MnSO415mg/L，玉米浆2.0％，酵母粉0.2％，VB12mg/L，氨基酸粉0.6％，甜菜碱0.1％，胆碱0.1％，泡敌0.003％，将其放入发酵培养基中，调节PH值至7.0-7.1，将发酵培养基放入气浴恒温震荡器中，调节温度至36℃，接入溶氧控制仪和刮板浓缩蒸发系统，罐压控制在0.05-0.12MPa，通风比根据溶氧要求控制在0.3-0.8vvm，溶氧控制在20％-50％，初糖耗尽后，OD回升开始均匀加入葡萄糖糖液(葡萄糖糖液浓度为70％)，通过葡萄糖均匀添加速率维持溶氧DO在20％-50％，残糖浓度小于0.2％，使用气浴恒温震荡器摇瓶发酵，发酵时间为36h，其中，在发酵培养至16h时，乙酸开始迅速增长，铵根离子浓度增长至70mmol/L以上时，开启刮板浓缩蒸发系统；
S5、浓缩蒸发：将步骤S4中因刮板浓缩蒸发系统循环浓缩蒸发的浓缩液，使其进入发酵罐进行再次发酵，并向发酵罐中流加等量冷凝液体积的无菌水，以控制发酵体积平衡，使得菌体保持较高的活力和产酸速率。
通过上述方法，利用发酵偶联刮板浓缩蒸发技术，将苏氨酸发酵中后期含高浓度乙酸和铵根离子的发酵液在发酵罐正压和刮板蒸发器负压的双重作用下从发酵罐进入刮板蒸发器的料液进口，发酵液进入刮板浓缩器，乙酸和铵根离子通过蒸发作用进入冷凝器，浓缩后的发酵液通过浓缩液暂储罐进入发酵罐继续发酵，完成一个蒸发过程，且工艺操作简单，能耗少，而且可以连续进料，连续除乙酸和铵根离子等挥发性物质，连续排料，去除乙酸和铵根离子效率高，稳定性和自动化程度高。
实施例二
L-苏氨酸发酵至16h时，利用刮板浓缩蒸发系统进行真空蒸发，去除发酵液中的乙酸和NH4+，浓缩后的发酵液利用隔膜泵压入发酵罐继续发酵，用无菌水补充蒸发掉的水分，维持原体积进行发酵，16h开始蒸发之后，偶联发酵的乙酸在发酵中后期一直维持较低的水平，发酵结束时为2.7g/L，而对照组发酵乙酸为9.2g/L，乙酸浓度下降了70.65％，铵根离子的浓度由对照发酵的132.0mmol/L降至偶联发酵的52.9mmol/L，降低了59.92％。偶联发酵的菌体量保持快速的增长态势，在发酵36h时，菌体浓度OD600nm由对照组发酵的46.9提高至59.2，对照组发酵在21h菌体浓度最大值为53.6，随后缓慢下降至46.9，偶联发酵菌体在发酵结束前，一直维持增长态势，在36h菌体量OD600nm达到59.2，提高了10.45％，可以看出，通过偶联发酵蒸发后，细胞的活力明显增强，36h时L-苏氨酸产量分别为142g/L和187g/L，提高了31.69％；通过偶联发酵，由于乙酸和NH4+浓度的大幅度下降，可以使得菌体保持较高的活力和产酸速率，平均糖酸转化率由对照发酵的57.2％提高至62.7％，提高了9.62％。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、准备材料：准备葡萄糖0.2％-5.0％，蛋白胨1.0％-1.5％，酵母粉0.5％-1.5％，牛肉膏1.0％-1.5％，NaCl0.5％-1.0％,琼脂1.8％-2.0％，KH2PO40.15％-0.55％，MgSO40.05％-0.25％，FeSO410mg/L-30mg/L，MnSO410mg/L-25mg/L，玉米浆2.0％-4.5％，VB12mg/L-4mg/L，氨基酸粉0.5％-1.1％，泡敌0.002％-0.005％，甜菜碱0.1％-0.2％，胆碱0.1％-0.2％；
S2、斜面培养：取用葡萄糖0.2％-0.5％，蛋白胨1.0％-1.5％，酵母粉0.5％-1.0％，牛肉膏1.0％-1.5％，NaCl0.5％-1.0％,琼脂1.8％-2.0％，将其放入斜面培养基中，调节PH值至7.0-7.2，将斜面培养基放入加热箱中，调节温度至32-36℃，培养时间为20-24h，检验合格后，放入冰箱保存备用；
S3、种子培养：取用葡萄糖3.0％-3.5％，KH2PO40.15％-0.20％，MgSO40.05％-0.10％，FeSO410mg/L-15mg/L，MnSO410mg/L-15mg/L，玉米浆2.5％-3.0％，酵母粉0.30％-0.35％，VB12mg/L-2.5mg/L，氨基酸粉0.5％-1％，泡敌0.002％-0.005％,将其放入种子培养基中，调节PH值至7.1-7.3，取步骤S1中的活化斜面，吸取10-20ml的无菌生理盐水置于活化斜面中，接着将活化斜面中的菌悬液接入种子培养基中，使用搅拌轴搅拌均匀，将种子培养基放入加热箱中，调节温度至36-38℃，接入溶氧控制仪，溶氧控制在20％-50％之间，培养时间为7-10h，至菌种OD600nm增加值大于20之后接种发酵；
S4、发酵培养：取用葡萄糖2.0％-5％(作为初糖使用)，KH2PO40.35％-0.55％，MgSO40.15％-0.25％，FeSO420mg/L-30mg/L，MnSO415mg/L-25mg/L，玉米浆2.0％-4.5％，酵母粉0.2％-0.5％，VB12mg/L-4mg/L，氨基酸粉0.6％-1.1％，甜菜碱0.1％-0.2％，胆碱0.1％-0.2％，泡敌0.002％-0.005％，将其放入发酵培养基中，调节PH值至7.0-7.1，将发酵培养基放入气浴恒温震荡器中，调节温度至36-38℃，接入溶氧控制仪和刮板浓缩蒸发系统，罐压控制在0.05-0.12MPa，通风比根据溶氧要求控制在0.3-0.8vvm，溶氧控制在20％-50％，初糖耗尽后，OD回升开始均匀加入葡萄糖糖液(葡萄糖糖液浓度为70％)，通过葡萄糖均匀添加速率维持溶氧DO在20％-50％，残糖浓度小于0.2％，使用气浴恒温震荡器摇瓶发酵，发酵时间为36-38h，其中，在发酵培养至16h时，乙酸开始迅速增长，铵根离子浓度增长至70mmol/L以上时，开启刮板浓缩蒸发系统；
S5、浓缩蒸发：将步骤S4中因刮板浓缩蒸发系统循环浓缩蒸发的浓缩液，使其进入发酵罐进行再次发酵，并向发酵罐中流加等量冷凝液体积的无菌水，以控制发酵体积平衡，使得菌体保持较高的活力和产酸速率。
2.根据权利要求1所述的一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法，其特征在于：所述步骤S2中，蛋白胨、牛肉膏和琼脂均需加热至80-90℃，使蛋白胨、牛肉膏和琼脂完全溶解，且在加热中挥发水分，需采用等量的无菌水补足。
3.根据权利要求1所述的一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法，其特征在于：所述步骤S2-S4中，调节PH值均采用10％HCl或10％NaOH进行调节至适合值。
4.根据权利要求1所述的一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法，其特征在于：所述步骤S3中，搅拌轴转速为300-700r/min，且搅拌轴使用前经高温灭菌消毒。
5.根据权利要求1所述的一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法，其特征在于：所述步骤S4中，气浴恒温震荡器型号为THZ-92A，气浴恒温震荡器振幅为8-10cm,震荡频率为80-90次/min。
6.根据权利要求1所述的一种提苏氨酸发酵产率和转化率的方法，其特征在于：所述步骤S2-S4中，操作步骤均在无菌操作室进行，且所述步骤S5中，刮板浓缩蒸发系统包括苏氨酸发酵罐、真空冷凝系统、冷凝液收集槽、刮板蒸发器和浓缩液暂储罐。
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