JP7456605B2 - Pcsk9の遺伝子編集 - Google Patents
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Description
本願は、2016年12月23日に出願された米国仮出願、U.S.S.N. 62/438,869に対する35 U.S.C.§119(e)下における優先権を主張し、当該仮出願は、本明細書において参考として援用される。
本発明は、国立衛生研究所(NIH)により付与された助成金番号GM065865下において政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
肝臓タンパク質であるプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)は、分泌型の球状の自己活性化型セリンプロテアーゼであって、LDL粒子のエンドサイトーシスの間にエンドソーム小胞内で低密度リポタンパク質受容体(LDL-R)とのpH依存的な相互作用を架橋するタンパク質結合アダプターとして作用し、LDL-Rの細胞表面へのリサイクルを防止し、LDL-コレステロールクリアランスの低下をもたらす。PCSK9がLDL-Rにより媒介されるLDLコレステロールのクリアランスをブーストする機能を遮断または阻害することは、製薬業界において多大な関心を得てきた。しかし、in vivoでPCSK9の保護的バリアントおよび機能喪失型変異体を作製する現在の方法は、コレステロールレベルを調節するように改変する必要がある細胞の数の多さに起因して、非効率的であった。他の懸念は、ゲノム編集により引き起こされ得るオフターゲット効果、ゲノムの不安定性、または発癌性の修飾に関するものである。
本明細書においておよび請求の範囲において用いられる場合、文脈が明らかに別を示さない限り、単数形「a」、「an」、および「the」は、単数および複数の参照を含む。したがって、例えば、「剤(an agent)」についての参照は、単一の剤および複数のかかる剤を含む。
Streptococcus pyogenes Cas9(野生型)ヌクレオチド配列
Streptococcus pyogenes Cas9(野生型)タンパク質配列
S. aureus Cas9野生型(配列番号6)
Streptococcus thermophilus野生型CRISPR3 Cas9(St3Cas9)
Streptococcus thermophilus CRISPR1 Cas9野生型(St1Cas9)
dCas9(D10AおよびH840A)
S. pyogenes Cas9ニッカーゼ(D10A)
S. aureus Cas9ニッカーゼ(D10A)
本明細書において開示されるのは、単独で、および循環のコレステロールおよびトリグリセリドレベルを相乗的に改善することができる他の保護的遺伝子バリアントと組み合わせて、LDL受容体により媒介されるLDLコレステロールのクリアランスをブーストするための、肝臓タンパク質プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)の、操作された、および天然に存在する保護的バリアントを作製するための、新規のゲノム/塩基編集の系、方法および組成物である。
野生型PCSK9遺伝子(>gi|299523249|ref|NM_174936.3| Homo sapiensプロタンパク質コンバターゼスブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)、転写物バリアント1、配列番号1990)
本開示のいくつかの側面は、PCSK9遺伝子中に変異を導入するためにPCSK9タンパク質をコードするポリヌクレオチドを編集する系、組成物および方法を提供する。本明細書において記載される遺伝子編集方法は、米国特許9,068,179、米国特許出願公開US20150166980、US20150166981、US20150166982、US20150166984、およびUS20150165054、ならびに米国仮出願62/245828、62/279346、62/311,763、62/322178、62/357352、62/370700、および62/398490において、ならびにKomor et al., Nature, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage, 533, 420-424(2016)において記載されるような核酸塩基エディターに依存し、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
表1.例示的な機能喪失型PCSK9変異
本明細書において記載される核酸塩基エディターを用いて、いくつかのアミノ酸コドンを、当該コドン中の標的塩基の脱アミノ化を介して、異なるコドンに変換することができる。例えば、いくつかの態様において、シトシン(C)塩基は、シトシンデアミナーゼドメイン(例えば、APOBEC1またはAID)を含む核酸塩基エディターによる脱アミノ化を介して、チミン(T)塩基に変換される。脱アミノ化(例えば、APOBEC1またはAIDなどのシトシンデアミナーゼによる)を介するCからTへの変更の間に、シトシンは、初めにウリジン(U)に変換され、G:Uミスマッチをもたらすことは、注目に値する。G:Uミスマッチは、次いで、DNA修復および複製経路によりT:A対に変換されて、それにより、元のシトシンの位置においてチミンを導入する。当業者が精通しているとおり、アミノ酸コドン中の塩基の変換は、当該コドンがコードするアミノ酸の変更をもたらし得る。シトシンデアミナーゼは、脱アミノ化を介して、シトシン(C)塩基をチミン(T)塩基に変換することができる。したがって、C塩基を含むアミノ酸コドンについて、C塩基を直接Tに変換することができることが想起される。例えば、ロイシンコドン(CTC)を、コード鎖上の第1のCの脱アミノ化を介して、TTC(フェニルアラニン)コドンに変換することができる。グアニン(G)塩基を含むアミノ酸コドンについて、C塩基が相補鎖上に存在する;そして、G塩基は、相補鎖上のCの脱アミノ化を介して、アデノシン(A)に変換することができる。例えば、
表2.PCSK9遺伝子における塩基編集を介する例示的なコドン変更
表3.コドン変更を介する例示的なPCSK9の機能喪失型変異
二重下線は、相補鎖上のCからTへの変更を示す。
ガイド配列(ガイドRNAの、核酸塩基エディターを標的配列にターゲティングする部分)が提供され、これは、完全なガイドRNA配列を作製するために、本明細書において提供される任意のtracrRNAフレームワーク配列と共に用いることができる。
a)BE型:SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI;VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI;EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI;VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI;SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI;KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI;St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI;St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
表4.タンパク質の折りたたみを不安定化するための例示的なPCSK9バリアント
a)BE型:SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI;VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI;EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI;VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI;SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI;KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI;St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI;St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
本開示のいくつかの側面は、PCSK9遺伝子を、生成されている全長の機能的PCSK9タンパク質の量を減少させるように編集する戦略を提供する。いくつかの態様において、PCSK9遺伝子のコード配列中に、正常な停止コドンの上流に、停止コドンを導入してもよい(「未成熟停止コドン」として言及される)。未成熟停止コドンは、未成熟な翻訳停止を引き起こし、その代わりに、短縮化された非機能的タンパク質をもたらし、ナンセンス変異依存mRNA分解経路を介してmRNAの迅速な分解を誘導する。例えば、Baker et al., Current Opinion in Cell Biology 16(3):293-299, 2004;Chang et al., Annual Review of Biochemistry 76:51-74, 2007;およびBehm-Ansmant et al., Genes & Development 20(4):391-398, 2006を参照;これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
表5.停止コドンへの変換
二重下線:相補鎖上の変更
表6.塩基編集を介するPCSK9遺伝子中への未成熟停止コドンの導入
ガイド配列(ガイドRNAの、核酸塩基エディターを標的配列にターゲティングする部分)が提供され、これは、完全なガイドRNA配列を作製するために、本明細書において提供される任意のtracrRNAフレームワーク配列と共に用いることができる。
a)BE型:SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI;VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI;EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI;VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI;SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI;KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI;St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI;St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
本開示のいくつかの側面は、PCSK9 mRNAの成熟および産生を防止することにより、細胞のPCSK9活性を低下させる戦略を提供する。いくつかの態様において、かかる戦略は、PCSK9遺伝子におけるスプライシング部位の変更を伴う。変更されたスプライシング部位は、変更されたスプライシングおよびPCSK9 mRNAの成熟化をもたらし得る。例えば、いくつかの態様において、変更されたスプライシング部位は、エクソンのスキッピングをもたらし、これは次いで、短縮化されたタンパク質生成物または変更されたリーディングフレームをもたらす。いくつかの態様において、変更されたスプライシング部位は、インフレームの停止コドンがイントロンにおいて翻訳中のリボソームと出会った場合に、イントロン配列の翻訳および未成熟な翻訳終了をもたらし得る。いくつかの態様において、開始コドンが編集され、タンパク質の翻訳が、次のATGコドンを開始させ、これは、正確なコードフレームでなくともよい。
表7.塩基編集を介する例示的なイントロン-エクソン接合部の変更
表8.塩基編集を介するPCSK9遺伝子におけるイントロン/エクソン接合部の変更
a)BE型:SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI;VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI;EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI;VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI;SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI;KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI;St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI;St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
本明細書において参考として援用されるKomor et al., Nature, 533, 420-424(2016)において記載されるように、塩基編集を用いて効率的かつ特異的なゲノム修飾を達成するためには、それに対して特定の相補的なガイドRNA配列を作製することができる標的C、および、必要な場合には、シチジンデアミナーゼ(例えば、Cas9、dCas9、Cas9n、Cpf1、NgAgoなど)に融合したDNA結合ドメインにマッチする近接するPAMを含むゲノム配列の賢明な選択を必要とする。ガイドRNA配列およびPAMの優先度は、プログラミング可能なDNA結合ドメイン(例えば、Cas9、dCas9、Cas9n、Cpf1、NgAgoなど)のゲノム標的配列を定義する。いくつかのゲノム配列の反復性の性質、ならびにゲノム全体にわたって短い配列が現れる確率論的な頻度に起因して、ゲノム中の全ての他の配列に対する1、2、3、4またはそれより多くのミスマッチを考慮して、最も低い数の潜在的なオフターゲット部位を有する塩基エディターをプログラミングするためのガイドRNAを同定することが必要であり、これは、Hsu et al(Nature biotechnology, 2013, 31(9):827-832)、Fusi et al(bioRxiv 021568;doi:http://dx.doi.org/10.1101/021568)、Chari et al(Nature Methods, 2015, 12(9):823-6)、Doench et al(Nature Biotechnology, 2014, 32(12):1262-7)、Wang et al(Science, 2014, 343(6166):80-4)、Moreno-Mateos et al(Nature Methods, 2015, 12(10):982-8)、Housden et al(Science Signaling, 2015, 8(393):rs9)、Haeussler et al,(Genome Biol. 2016;17:148)において記載されるとおりであり、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。ガイドRNAと標的DNAとの間のバルジの形成の可能性もまた考えられ得、これは、Bae et al(Bioinformatics, 2014, 30, 1473-5)において記載されるとおりであり、これは、本明細書において参考として援用される。表3~8から選択されるガイドRNAについての計算される特異性スコアの非限定的な例を、表9~13において示す。DNA結合ドメインのプログラミング効率に影響する他の計算されるパラメーターはが示され、これは、Housden et al(Science Signaling, 2015, 8(393):rs9)、Farboud et al(Genetics, 2015, 199(4):959-71)において記載されるとおりであり、これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
LDL-Rにより媒介されるコレステロールクリアランス経路は、複数のプレイヤーを含む。この経路に関与するタンパク質因子の非限定的な例として、アポリポタンパク質C3(APOC3)、LDL受容体(LDL-R)、および誘導性のLDL受容体分解剤タンパク質(IDOL)が挙げられる。これらのタンパク質因子およびそれらのそれぞれの機能は、当該分野において記載されている。さらに、これらの因子の機能喪失型バリアントは、同定されて特徴づけられており、心保護的機能を有することが決定されている。例えば、Jorgensen et al., N Engl J Med 2014;371:32-41July 3, 2014;Scholtz1 et al., Hum. Mol. Genet.(1999)8(11):2025-2030;De Castro-Oros et al., BMC Medical Genomics, 20147:17;およびGu et al., J Lipid Res. 2013, 54(12):3345-57を参照;これらの各々は、本明細書において参考として援用される。
表13.APOC3、LDL-R、およびIDOLの機能喪失型バリアント
a)BE型:SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI;VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI;EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI;VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI;SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI;KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI;St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI;St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
APOC3アミノ酸配列(NC_000011.9 GRCh37.p5、配列番号1800)
MQPRVLLVVALLALLASARASEAEDASLLSFMQGYMKHATKTAKDALSSVQESQVAQQARGWVTDGFSSLKDYWSTVKDKFSEFWDLDPEVRPTSAVAA
対応するコドンに割り当てられたアミノ酸残基を示すAPOC3 cDNA配列。塩基編集の標的となる残基の例に、下線を付す(ヌクレオチド配列:配列番号1801、タンパク質配列:配列番号1802)。
表14.コドン変更および未成熟停止コドンを介する例示的なAPOC3の保護的な機能喪失型変異
a)BE型:SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI;VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI;EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI;VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI;SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI;KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI;St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI;St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
表15.APOC3遺伝子における塩基編集を介するイントロン/エクソン接合部の変更
a)BE型:SpBE3 = APOBEC1-SpCas9n-UGI;VQR-SpBE3 = APOBEC1-VQR-SpCas9n-UGI;EQR-SpBE3 = APOBEC1-EQR-SpCas9n-UGI;VRER-SpBE3 = APOBEC1-VRER-SpCas9n-UGI;SaBE3 = APOBEC1-SaCas9n-UGI;KKH-SaBE3 = APOBEC1-KKH-SaCas9n-UGI;St3BE3 = APOBEC1-St3Cas9n-UGI;St1BE3 = APOBEC1-St1Cas9n-UGI.
本明細書において記載される機能喪失型PCSK9バリアントを作製する方法は、核酸塩基エディターの使用により可能になる。本明細書において記載されるとおり、核酸塩基エディターは、(i)プログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン;および(ii)デアミナーゼドメインを含む融合タンパク質である。塩基エディターにおいて任意のプログラミング可能なDNA結合ドメインを用いることができることが理解されるべきである。
Cas9とDNA骨格との間の静電相互作用が減少しているCas9バリアント
高フィデリティー核酸塩基エディター(HF-BE3)
野生型Francisella novicida Cpf1(配列番号10)(D917、E1006、およびD1255に、太字および下線を付す)
野生型AsCpf1-残基R912を太い下線において示し、残基661~667を斜体および下線において示す。
AsCpf1(R912A)-残基A912を太い下線において示し、残基661~667を斜体および下線において示す。
野生型LbCpf1-残基R836およびR1138を、太い下線において示す。
LbCpf1(R836A)-残基A836を、太い下線において示す。
LbCpf1(R1138A)-残基A1138を、太い下線において示す。
AsCpf1(T663およびD665の欠失)
AsCpf1(K662、T663、D665およびQ666の欠失)
AsCpf1(K661、K662、T663、D665、Q666およびK667の欠失)
野生型Natronobacterium gregoryiアルゴノート(配列番号270)
C2c1(uniprot.org/uniprot/T0D7A2#)
sp|T0D7A2|C2C1_ALIAG CRISPR関連エンドヌクレアーゼC2c1 OS=Alicyclobacillus acidoterrestris(株ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B)GN=c2c1 PE=1 SV=1
C2c2(uniprot.org/uniprot/P0DOC6)
>sp|P0DOC6|C2C2_LEPSD CRISPR関連エンドリボヌクレアーゼC2c2 OS=Leptotrichia shahii(株DSM 19757 / CCUG 47503 / CIP 107916 / JCM 16776 / LB37)GN=c2c2 PE=1 SV=1
C2c3、翻訳元>CEPX01008730.1 マリンメタゲノムのゲノムアセンブリTARA_037_MES_0.1-0.22, contig TARA_037_MES_0.1-0.22_scaffold22115_1、全ゲノムショットガン配列
CasX(uniprot.org/uniprot/F0NN87;uniprot.org/uniprot/F0NH53)
>tr|F0NN87|F0NN87_SULIH CRISPR関連Casxタンパク質OS=Sulfolobus islandicus(株HVE10/4)GN=SiH_0402 PE=4 SV=1
>tr|F0NH53|F0NH53_SULIR CRISPR関連タンパク質、Casx OS=Sulfolobus islandicus(株REY15A)GN=SiRe_0771 PE=4 SV=1
CasY(ncbi.nlm.nih.gov/protein/APG80656.1)
>APG80656.1 CRISPR関連タンパク質CasY[未培養のParcubacteria群の細菌]
本開示のいくつかの側面は、異なるPAM特異性を有するCas9ドメインを提供する。典型的には、Cas9タンパク質、例えばS. pyogenesからのCas9(spCas9)は、具体的な核酸領域に結合するためには古典的NGG PAM配列を要求する。これは、ゲノム中の所望の塩基を編集する能力を限定し得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基編集融合タンパク質は、正確な場所に置かれることを必要とし得、例えば標的塩基は4塩基領域(例えば、「脱アミノ化ウインドウ」)内に置かれ、これがPAMのおよそ15塩基上流である。Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016)参照。その内容全体はここで参照によって組み込まれる。従って、いくつかの態様において、本明細書において提供される融合タンパク質のいずれかは、古典的(例えばNGG)PAM配列を含有しないヌクレオチド配列に結合することができるCas9ドメインを含有し得、緩やかなPAM要件を有する(PAMless Cas9)。PAMless Cas9は、配列番号1において提供されるようなStreptococcus pyogenes Cas9と比較して、その3’末端において古典的PAM(例えばNGG)を含まない標的配列に対して、増大した活性、例えば、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、少なくとも500倍、少なくとも1,000倍、少なくとも5,000倍、少なくとも10,000倍、少なくとも50,000倍、少なくとも100,000倍、少なくとも500,000倍、または少なくとも1,000,000倍、増大した活性を示す。非古典的PAM配列に結合するCas9ドメインは当分野において記載されており、当業者には明らかであろう。例えば、非古典的PAM配列に結合するCas9ドメインはKleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015);およびKleinstiver, B. P., et al., "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)に記載されており;それぞれの内容全体はここで参照によって組み込まれる。また、米国仮出願62/245828、62/279346、62/311763、62/322178、および62/357332を参照;これらの各々は、本明細書において参考として援用される。いくつかの態様において、本開示において有用なdCas9またはCas9ニッカーゼは、PAM用件を緩和する変異、例えば、配列番号1におけるA262T、K294R、S409I、E480K、E543D、M694IまたはE1219Vに対応する変異をさらに含んでもよい。
例示的なSaCas9配列
配列番号2021の残基N579に下線を付し太字とし、これは、変異して(例えばA579に)SaCas9ニッカーゼを生じてもよい。
例示的なSaCas9d配列
配列番号2022の残基A10は、配列番号E1のD10から変異してヌクレアーゼ不活性型SaCas9dを生じてもよく、これに下線を付し太字とする。
例示的なSaCas9n配列
配列番号2023の残基A579は、配列番号2021のN579から変異してSaCas9ニッカーゼを生じてもよく、これに下線を付し太字とする。
例示的なSaKKH Cas9
配列番号2024の残基A579は、配列番号2021のN579から変異してSaCas9ニッカーゼを生じてもよく、これに下線を付し太字とする。配列番号2024の残基K781、K967およびH1014は、配列番号2021のE781、N967およびR1014から変異してSaKKH Cas9を生じてもよく、これに下線を付し、斜体とする。
KKH-nCas9(D10A/E782K/N968K/R1015H)S. aureus Cas9ニッカーゼ
例示的なSpCas9
例示的なSpCas9n
VRER-Cas9(D1135V/G1218R/R1335E/T1337R)S. pyogenes Cas9
VRER-nCas9(D10A/D1135V/G1218R/R1335E/T1337R)S. pyogenes Cas9ニッカーゼ
VQR-Cas9(D1135V/R1335Q/T1337R)S. pyogenes Cas9
VQR-nCas9(D10A/D1135V/R1335Q/T1337R)S. pyogenes Cas9ニッカーゼ
EQR-Cas9(D1135E/R1335Q/T1337R)S. pyogenes Cas9
EQR-nCas9(D10A/D1135E/R1335Q/T1337R)S. pyogenes Cas9ニッカーゼ
Streptococcus thermophilus CRISPR1 Cas9(St1Cas9)ニッカーゼ(D9A)
Streptococcus thermophilus CRISPR3Cas9(St3Cas9)ニッカーゼ(D10A)
いくつかの態様において、本開示において有用な核酸塩基エディターは、(i)ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン;および(ii)デアミナーゼドメインを含む。いくつかの態様において、融合タンパク質のデアミナーゼドメインは、シトシンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC1デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ラットAPOBEC1である。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC1である。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC2デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Aデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Bデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Cデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Dデアミナーゼである。いくつかの態様においては、APOBEC3Fデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Gデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC3Hデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、APOBEC4デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、活性化誘導デアミナーゼ(AID)である。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ヤツメウナギCDA1(pmCDA1)である。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3Gまたはその機能的フラグメントである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、ヒトAPOBEC3GにおけるD316R/D317R変異に対応する変異を含む、APOBEC3Gバリアントである。例示的に、本開示の方法により用いることができる非限定的なシトシンデアミナーゼ配列を、以下の例1において提供する。
桿菌ファージPBS2(バクテリオファージPBS2)ウラシル-DNAグリコシラーゼ阻害剤
MTNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML(配列番号304)
Erwinia tasmaniensis SSB(熱安定性単鎖DNA結合タンパク質)
MASRGVNKVILVGNLGQDPEVRYMPNGGAVANITLATSESWRDKQTGETKEKTEWHRVVLFGKLAEVAGEYLRKGSQVYIEGALQTRKWTDQAGVEKYTTEVVVNVGGTMQMLGGRSQGGGASAGGQNGGSNNGWGQPQQPQGGNQFSGGAQQQARPQQQPQQNNAPANNEPPIDFDDDIP(配列番号305)
UdgX(DNA中でウラシルに結合するが、これを除去しない)
MAGAQDFVPHTADLAELAAAAGECRGCGLYRDATQAVFGAGGRSARIMMIGEQPGDKEDLAGLPFVGPAGRLLDRALEAADIDRDALYVTNAVKHFKFTRAAGGKRRIHKTPSRTEVVACRPWLIAEMTSVEPDVVVLLGATAAKALLGNDFRVTQHRGEVLHVDDVPGDPALVATVHPSSLLRGPKEERESAFAGLVDDLRVAADVRP(配列番号306)
UDG(触媒的に不活性なヒトUDG、DNA中でウラシルに結合するが、これを除去しない)
MIGQKTLYSFFSPSPARKRHAPSPEPAVQGTGVAGVPEESGDAAAIPAKKAPAGQEEPGTPPSSPLSAEQLDRIQRNKAAALLRLAARNVPVGFGESWKKHLSGEFGKPYFIKLMGFVAEERKHYTVYPPPHQVFTWTQMCDIKDVKVVILGQEPYHGPNQAHGLCFSVQRPVPPPPSLENIYKELSTDIEDFVHPGHGDLSGWAKQGVLLLNAVLTVRAHQANSHKERGWEQFTDAVVSWLNQNSNGLVFLLWGSYAQKKGSAIDRKRHHVLQTAHPSPLSVYRGFFGCRHFSKTNELLQKSGKKPIDWKEL(配列番号307)
[シトシンデアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質]-[任意のリンカー配列]-[UGI];
[シトシンデアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI]-[任意のリンカー配列]-[ ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質];
[UGI]-[任意のリンカー配列]-[シトシンデアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質];
[UGI]-[任意のリンカー配列]-[ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質]-[任意のリンカー配列]-[シトシンデアミナーゼ];
[ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質]-[任意のリンカー配列]-[シトシンデアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI];または
[ガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質]-[任意のリンカー配列]-[UGI]-[任意のリンカー配列]-[シトシンデアミナーゼ]。
[シトシンデアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[Cas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI];
[シトシンデアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI]-[任意のリンカー配列]-[Cas9ニッカーゼ];
[UGI]-[任意のリンカー配列]-[シトシンデアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[Cas9ニッカーゼ];
[UGI]-[任意のリンカー配列]-[Cas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[シトシンデアミナーゼ];
[Cas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[シトシンデアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI];または
[Cas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI]-[任意のリンカー配列]-[シトシンデアミナーゼ]。
表17.TracrRNAのオルトログおよび配列
本開示のいくつかの側面は、Gamタンパク質を含む融合タンパク質を提供する。本開示のいくつかの側面は、Gamタンパク質をさらに含む塩基エディターを提供する。塩基エディターは、当該分野において公知であり、例えば、2015年6月18日に公開された米国特許出願公開番号:US-2015-0166980;2015年6月18日に公開されたUS-2015-0166981;2015年6月18日に公開されたUS-2015-0166984;2015年6月18日に公開されたUS-2015-01669851;2016年10日20日に公開されたUS-2016-0304846;2017年5月4日に公開されたUS-2017-0121693-A1;および2015年6月18日に公開されたPCT出願公開番号:WO 2015/089406;および2017年4月27日に公開されたWO 2017/070632において、先に記載されている;これらの各々の全内容は、本明細書により参考として援用される。当業者は、本開示に基づいて、Gamタンパク質をさらに含む塩基エディターを作製する方法を理解するであろう。
バクテリオファージMuからのGam
AKPAKRIKSAAAAYVPQNRDAVITDIKRIGDLQREASRLETEMNDAIAEITEKFAARIAPIKTDIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRVRPPSVSIRGMDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2030)
>WP_001107930.1:多種の宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Enterobacteriaceae]
MAKPAKRIKSAAAAYVPQNRDAVITDIKRIGDLQREASRLETEMNDAIAEITEKFAARIAPIKTDIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRVRPPSVSIRGMDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2031)
>CAA27978.1:未命名のタンパク質生成物[Escherichia virus Mu]
MAKPAKRIKSAAAAYVPQNRDAVITDIKRIGDLQREASRLETEMNDAIAEITEKFAARIAPIKTDIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRVRPPSVSIRGMDAVMETLERLGLQRFVRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2058)
>WP_001107932.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]
MAKPAKRIKSAAAAYVPQNRDAVITDIKRIGDLQREASRLETEMNDAIAEITEKFAARIAPLKTDIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRVRPPSVSIRGMDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2032)
>WP_061335739.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]
MAKPAKRIKSAAAAYVPQNRDAVITDIKRIGDLQREASRLETEMNDAIAEITEKFAARIAPIKTDIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLITGDVSWRVRPPSVSIRGMDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2033)
>WP_001107937.1:多種の宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Enterobacteriaceae]>EJL11163.1:バクテリオファージMu Gam様ファミリータンパク質[Shigella sonnei str. Moseley]>CSO81529.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>OCE38605.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Shigella sonnei]>SJK50067.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJK19110.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SIY81859.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJJ34359.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJK07688.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJI95156.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SIY86865.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJJ67303.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJJ18596.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SIX52979.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJD05143.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJD37118.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJE51616.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]
MAKPAKRIRNAAAAYVPQSRDAVVCDIRRIGDLQREAARLETEMNDAIAEITEKYASQIAPLKTSIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRQRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2034)
>WP_001107930.1:多種の宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Enterobacteriaceae]
MAKPAKRIKSAAAAYVPQNRDAVITDIKRIGDLQREASRLETEMNDAIAEITEKFAARIAPIKTDIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRVRPPSVSIRGMDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2035)
>CAA27978.1 未命名のタンパク質生成物[EscherichiaウイルスMu]
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>WP_001107932.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]
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>WP_061335739.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]
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>WP_089552732.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]
MAKPAKRIKNAAAAYVPQSRDAVVCDIRRIGDLQREAARLETEMNDAIAEITEKYASQIAPLKTSIETISKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRQRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2039)
>WP_042856719.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]>CDL02915.1:推定宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Escherichia coli IS35]
MAKPAKRIKNAAAAYVPQSRDAVVCDIRRIGDLQREAARLETEMNDAIADITEKYASQIAPLKTSIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRQRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2040)
>WP_001129704.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]>EDU62392.1:バクテリオファージMu Gam様タンパク質[Escherichia coli 53638]
MAKSAKRIRNAAAAYVPQSRDAVVCDIRRIGNLQREAARLETEMNDAIAEITEKFAARIAPLKTDIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRQRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINREAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQDAGI(配列番号2041)
>WP_001107936.1:多種の宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Enterobacteriaceae]>EGI94970.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質gam[Shigella boydii 5216-82]>CSR34065.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>CSQ65903.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>CSQ94361.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJK23465.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJB59111.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJI55768.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJI56601.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJJ20109.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJJ54643.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJI29650.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SIZ53226.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJA65714.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJJ21793.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJD61405.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJJ14326.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SIZ57861.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJD58744.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJD84738.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJJ51125.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJD01353.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJE63176.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]
MAKPAKRIRNAAAAYVPQSRDAVVCDIRRIGDLQREAARLETEMNDAIAEITEKYASQIAPLKTSIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRQRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQDAGI(配列番号2042)
>WP_050939550.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]>KNF77791.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]
MAKPAKRIKNAAAAYVPQSRDAVVCDIRRIGDLQREAARLETEMNDAIAEITEKYASQIAPLKTSIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRLRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFICTKQEINKEAILLEPKVVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2043)
>WP_085334715.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]>OSC16757.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]
MAKPVKRIRNAAAAYVPQSRDAVVCDIRRIGDLQREAARLETEMNDAIAEITEKYASQIAPLKTSIETLSKGIQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRQRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2044)
>WP_065226797.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]>ANO88858.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]>ANO89006.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]
MAKPAKRIRNAAAAYVPQSRDAVVCDIRWIGDLQREAVRLETEMNDAIAEITEKYASRIAPLKTRIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRQRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2045)
>WP_032239699.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Escherichia coli]>KDU26235.1:バクテリオファージMu Gam様ファミリータンパク質[Escherichia coli 3-373-03_S4_C2]>KDU49057.1:バクテリオファージMu Gam様ファミリータンパク質[Escherichia coli 3-373-03_S4_C1]>KEL21581.1:バクテリオファージMu Gam様ファミリータンパク質[Escherichia coli 3-373-03_S4_C3]
MAKSAKRIRNAAATYVPQSRDAVVCDIRRIGDLQREAARLETEMNDAIAEITEKYASQIAPLKTSIETLSKGIQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRQRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2046)
>WP_080172138.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Salmonella enterica]
MAKSAKRIKSAAATYVPQSRDAVVCDIRRIGDLQREAARLETEMNDAIAEITEKYASQIAPLKTSIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKSANLVTGDVQWRQRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2047)
>WP_077134654.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Shigella sonnei]>SIZ51898.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]>SJK07212.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質[Shigella sonnei]
MAKSAKRIRNAAAAYVPQSRDAVVCDIRRIGNLQREAARLETEMNDAIAEITEKYASQIAPLKTSIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRQRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQDAGI(配列番号2048)
>WP_000261565.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Shigella flexneri]>EGK20651.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質gam[Shigella flexneri K-272]>EGK34753.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質gam[Shigella flexneri K-227]
MVVSAIASTPHDAVVCDIRRIGDLQREAARLETEMNDAIAEITEKDASQIAPLKTSIETLSKGVQGWCEANRDELTNGGKVKTANLVTGDVSWRQRPPSVSIRGVDAVMETLERLGLQRFIRTKQEINKEAILLEPKAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQEAGI(配列番号2049)
>ASG63807.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Kluyvera georgiana]
MVSKPKRIKAAAANYVSQSRDAVITDIRKIGDLQREATRLESAMNDEIAVITEKYAGLIKPLKADVEMLSKGVQGWCEANRDDLTSNGKVKTANLVTGDIQWRIRPPSVSVRGPDAVMETLTRLGLSRFIRTKQEINKEAILNEPLAVAGVAGITVKSGIEDFSIIPFEQTADI(配列番号2050)
>WP_078000363.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Edwardsiella tarda]
MASKPKRIKSAAANYVSQSRDAVIIDIRKIGDLQREATRLESAMNDEIAVITEKYAGLIKPLKADVEMLSKGVQGWCEANRDELTCNGKVKTANLVTGDIQWRIRPPSVSVRGPDSVMETLLRLGLSRFIRTKQEINKEAILNEPLAVAGVAGITVKTGVEDFSIIPFEQTADI(配列番号2051)
>WP_047389411.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Citrobacter freundii]>KGY86764.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Citrobacter freundii]>OIZ37450.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Citrobacter freundii]
MVSKPKRIKAAAANYVSQSKEAVIADIRKIGDLQREATRLESAMNDEIAVITEKYAGLIKPLKTDVEILSKGVQGWCEANRDELTSNGKVKTANLVTGDIQWRIRPPSVAVRGPDAVMETLLRLGLSRFIRTKQEINKEAILNEPLAVAGVAGITVKSGVEDFSIIPFEQTADI(配列番号2052)
>WP_058215121.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Salmonella enterica]>KSU39322.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Salmonella enterica subsp. enterica]>OHJ24376.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Salmonella enterica]>ASG15950.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Salmonella enterica subsp. enterica serovar Macclesfield str. S-1643]
MASKPKRIKAAAALYVSQSREDVVRDIRMIGDFQREIVRLETEMNDQIAAVTLKYADKIKPLQEQLKTLSEGVQNWCEANRSDLTNGGKVKTANLVTGDVQWRVRPPSVTVRGVDSVMETLRRLGLSRFIRIKEEINKEAILNEPGAVAGVAGITVKSGVEDFSIIPFEQSATN(配列番号2053)
>WP_016533308.1:ファージ:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Pasteurella multocida]>EPE65165.1:ファージ:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Pasteurella multocida P1933]>ESQ71800.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Pasteurella multocida subsp. multocida P1062]>ODS44103.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Pasteurella multocida]>OPC87246.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Pasteurella multocida subsp. multocida]>OPC98402.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Pasteurella multocida subsp. multocida]
MAKKATRIKTTAQVYVPQSREDVASDIKTIGDLNREITRLETEMNDKIAEITESYKGQFSPIQERIKNLSTGVQFWAEANRDQITNGGKTKTANLITGEVSWRVRNPSVKITGVDSVLQNLKIHGLTKFIRVKEEINKEAILNEKHEVAGIAGIKVVSGVEDFVITPFEQEI(配列番号2054)
>WP_005577487.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Aggregatibacter actinomycetemcomitans]>EHK90561.1:ファージ:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Aggregatibacter actinomycetemcomitans RhAA1]>KNE77613.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Aggregatibacter actinomycetemcomitans RhAA1]
MAKSATRVKATAQIYVPQTREDAAGDIKTIGDLNREVARLEAEMNDKIAAITEDYKDKFAPLQERIKTLSNGVQYWSEANRDQITNGGKTKTANLVTGEVSWRVRNPSVKVTGVDSVLQNLRIHGLERFIRTKEEINKEAILNEKSAVAGIAGIKVITGVEDFVITPFEQEAA(配列番号2055)
>WP_090412521.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Nitrosomonas halophila]>SDX89267.1:Mu様プロファージ:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Nitrosomonas halophila]
MARNAARLKTKSIAYVPQSRDDAAADIRKIGDLQRQLTRTSTEMNDAIAAITQNFQPRMDAIKEQINLLQAGVQGYCEAHRHALTDNGRVKTANLITGEVQWRQRPPSVSIRGQQVVLETLRRLGLERFIRTKEEVNKEAILNEPDEVRGVAGLNVITGVEDFVITPFEQEQP(配列番号2056)
>WP_077926574.1:宿主-ヌクレアーゼ阻害剤タンパク質Gam[Wohlfahrtiimonas幼虫]
MAKKRIKAAATVYVPQSKEEVQNDIREIGDISRKNERLETEMNDRIAEITNEYAPKFEVNKVRLELLTKGVQSWCEANRDDLTNSGKVKSANLVTGKVEWRQRPPSISVKGMDAVIEWLQDSKYQRFLRTKVEVNKEAMLNEPEDAKTIPGITIKSGIEDFAITPFEQEAGV(配列番号2057)
本開示の側面は、PCSK9をコードするポリヌクレオチドを編集するために用いることができる組成物に関する。いくつかの態様において、編集は、in vitroで行われる。いくつかの態様において、編集は、培養細胞において行われる。いくつかの態様において、編集は、in vivoで行われる。いくつかの態様において、編集は、哺乳動物において行われる。いくつかの態様において、哺乳動物は、ヒトである。いくつかの態様において、哺乳動物は、げっ歯類であってもよい。いくつかの態様において、編集は、ex vivoで行われる。
本明細書において記載される組成物は、それを必要とする対象に、治療有効量において、高い循環コレステロールレベルに関連する状態を処置するために、投与してもよい。本明細書において記載される組成物および方法を用いて処置することができる、高い循環コレステロールレベルに関連する状態
として、限定することなく、以下が挙げられる:高コレステロール血症、上昇した総コレステロールレベル、上昇した低密度リポタンパク質(LDL)レベル、上昇したLDL-コレステロールレベル、低下した高密度リポタンパク質レベル、脂肪肝、冠動脈心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、2型糖尿病、高い血圧上昇、アテローム動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、およびこれらの組み合わせ。組成物およびキットは、対象において循環コレステロールレベルを低下させることにおいて有効であり、それにより状態を処置する。
本開示の他の側面は、例えばin vitroでの編集のための、核酸塩基エディターの産生および/または単離のための、宿主細胞および生物を提供する。宿主細胞は、一般に、核酸塩基エディターおよび本明細書において記載される翻訳系の構成成分を発現するように操作される。いくつかの態様において、宿主細胞は、核酸塩基エディターおよび翻訳系の構成成分をコードするベクターを含み(例えば、形質転換されているか、形質導入されているか、または遺伝子導入され)、これは、例えばクローニングベクターまたは発現ベクターであってよい。ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、ネイキッドのポリヌクレオチド、または抱合型ポリヌクレオチドの形態であってよい。ベクターは、細胞および/または微生物中に、標準的な方法により導入され、これは、エレクトロポレーション、ウイルスベクターによる感染、小さいビーズまたは粒子の中または表面上のいずれかに核酸を有する小粒子による高速弾道学的浸透(high velocity ballistic penetration)(Klein et al., Nature 327, 70-73(1987))を含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、原核細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、真核細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、細菌細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、培養細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、組織または生物の中にある。
本明細書において記載される発明がより完全に理解され得るために、以下の例を記載する。本願において記載される合成例は、本明細書において提供される化合物および方法を説明するために提供され、決してそれらの範囲を限定する者として解釈されるべきではない。
好適なガイドヌクレオチド配列によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインの非限定的な例が提供される。本開示は、Cas9バリアント、例えば1つ以上の生物からのCas9タンパク質を提供し、これは1つ以上の変異を含み得る(例えば、dCas9またはCas9ニッカーゼを創るため)。いくつかの態様において、下でアステリスク(asterek)によって同定されているCas9タンパク質のアミノ酸残基の1つ以上は、変異させられ得る。いくつかの態様において、配列番号1によって提供されるアミノ酸配列のD10および/またはH840残基、または配列番号11~260によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、変異している。いくつかの態様において、配列番号1によって提供されるアミノ酸配列のD10残基、または配列番号11~260によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、D以外のいずれかのアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号1によって提供されるアミノ酸配列のD10残基、または配列番号11~260によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Aに変異している。いくつかの態様において、配列番号1によって提供されるアミノ酸配列のH840残基、または配列番号11~260によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する残基は、Hである。いくつかの態様において、配列番号1によって提供されるアミノ酸配列のH840残基、または配列番号11~260によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、H以外のいずれかのアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号1によって提供されるアミノ酸配列のH840残基、または配列番号11~260によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Aに変異している。いくつかの態様において、配列番号1によって提供されるアミノ酸配列のD10残基、または配列番号11~260によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する残基は、Dである。
WP_010922251.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号11
WP_039695303.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus gallolyticus]配列番号12
WP_045635197.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus mitis]配列番号13
5AXW_A:Cas9、A鎖、結晶構造[Staphylococcus Aureus]配列番号14
WP_009880683.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号15
WP_010922251.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号16
WP_011054416.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号17
WP_011284745.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号18
WP_011285506.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号19
WP_011527619.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号20
WP_012560673.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号21
WP_014407541.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号22
WP_020905136.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号23
WP_023080005.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号24
WP_023610282.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号25
WP_030125963.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号26
WP_030126706.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号27
WP_031488318.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号28
WP_032460140.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号29
WP_032461047.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号30
WP_032462016.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号31
WP_032462936.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号32
WP_032464890.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号33
WP_033888930.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号34
WP_038431314.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号35
WP_038432938.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号36
WP_038434062.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pyogenes]配列番号37
BAQ51233.1:CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー[Streptococcus pyogenes]配列番号38
KGE60162.1:仮説上のタンパク質MGAS2111_0903[Streptococcus pyogenes MGAS2111]配列番号39
KGE60856.1:CRISPR関連エンドヌクレアーゼタンパク質[Streptococcus pyogenes SS1447]配列番号40
WP_002989955.1:多種:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus]配列番号41
WP_003030002.1:多種:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus]配列番号42
WP_003065552.1:多種:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus]配列番号43
WP_001040076.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号44
WP_001040078.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号45
WP_001040080.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号46
WP_001040081.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号47
WP_001040083.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号48
WP_001040085.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号49
WP_001040087.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号50
WP_001040088.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号51
WP_001040089.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号52
WP_001040090.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号53
WP_001040091.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号54
WP_001040092.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号55
WP_001040094.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号56
WP_001040095.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号57
WP_001040096.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号58
WP_001040097.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号59
WP_001040098.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号60
WP_001040099.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号61
WP_001040100.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号62
WP_001040104.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号63
WP_001040105.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号64
WP_001040106.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号65
WP_001040107.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号66
WP_001040108.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号67
WP_001040109.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号68
WP_001040110.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号69
WP_015058523.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号70
WP_017643650.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号71
WP_017647151.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号72
WP_017648376.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号73
WP_017649527.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号74
WP_017771611.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号75
WP_017771984.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号76
CFQ25032.1:CRISPR関連タンパク質[Streptococcus agalactiae]配列番号77
CFV16040.1:CRISPR関連タンパク質[Streptococcus agalactiae]配列番号78
KLJ37842.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus agalactiae]配列番号79
KLJ72361.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus agalactiae]配列番号80
KLL20707.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus agalactiae]配列番号81
KLL42645.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus agalactiae]配列番号82
WP_047207273.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号83
WP_047209694.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号84
WP_050198062.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号85
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WP_050204027.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号87
WP_050881965.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号88
WP_050886065.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus agalactiae]配列番号89
AHN30376.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus agalactiae 138P]配列番号90
EAO78426.1:網状赤血球結合タンパク質[Streptococcus agalactiae H36B]配列番号91
CCW42055.1:CRISPR関連タンパク質、SAG0894ファミリー[Streptococcus agalactiae ILRI112]配列番号92
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WP_037593752.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus anginosus]配列番号94
WP_049516684.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus anginosus]配列番号95
GAD46167.1:仮説上のタンパク質ANG6_0662[Streptococcus anginosus T5]配列番号96
WP_018363470.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus caballi]配列番号97
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WP_021320964.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus equi]配列番号108
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AHY15608.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus iniae]配列番号116
AHY17476.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus iniae]配列番号117
ESR09100.1:仮説上のタンパク質IUSA1_08595[Streptococcus iniae IUSA1]配列番号118
AGM98575.1:CRISPR関連タンパク質Cas9/Csn1、サブタイプII/NMEMI[Streptococcus iniae SF1]配列番号119
ALF27331.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus intermedius]配列番号120
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WP_049473442.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus mutans]配列番号167
WP_049474547.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus mutans]配列番号168
EMC03581.1:仮説上のタンパク質SMU69_09359[Streptococcus mutans NLML4]配列番号169
WP_000428612.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus oralis]配列番号170
WP_000428613.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus oralis]配列番号171
WP_049523028.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus parasanguinis]配列番号172
WP_003107102.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus parauberis]配列番号173
WP_054279288.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus phocae]配列番号174
WP_049531101.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus pseudopneumoniae]配列番号175
WP_049538452.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus pseudopneumoniae]配列番号176
WP_049549711.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus pseudopneumoniae]配列番号177
WP_007896501.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus pseudoporcinus]配列番号178
EFR44625.1:CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー[Streptococcus pseudoporcinus SPIN 20026]配列番号179
WP_002897477.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus sanguinis]配列番号180
WP_002906454.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus sanguinis]配列番号181
WP_009729476.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus sp. F0441]配列番号182
CQR24647.1:CRISPR関連タンパク質[Streptococcus sp. FF10]配列番号183
WP_000066813.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus sp. M334]配列番号184
WP_009754323.1 II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus sp. taxon 056]配列番号185
WP_044674937.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus suis]配列番号186
WP_044676715.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus suis]配列番号187
WP_044680361.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus suis]配列番号188
WP_044681799.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Streptococcus suis]配列番号189
WP_049533112.1:CRISPR関連タンパク質Csn1[Streptococcus suis]配列番号190
WP_029090905.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Brochothrix thermosphacta]配列番号191
WP_006506696.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Catenibacterium mitsuokai]配列番号192
AIT42264.1:Cas9hc:NLS:HA[クローニングベクターpYB196]配列番号193
WP_034440723.1:II型CRISPRエンドヌクレアーゼCas9[Clostridiales bacterium S5-A11]配列番号194
AKQ21048.1:Cas9[CRISPR媒介型遺伝子ターゲティングベクターp(bhsp68-Cas9)]配列番号195
WP_004636532.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Dolosigranulum pigrum]配列番号196
WP_002364836.1:多種:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus]配列番号197
WP_016631044.1:多種:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus]配列番号198
EMS75795.1:仮説上のタンパク質H318_06676[Enterococcus durans IPLA 655]配列番号199
WP_002373311.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecalis]配列番号200
WP_002378009.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecalis]配列番号201
WP_002407324.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecalis]配列番号202
WP_002413717.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecalis]配列番号203
WP_010775580.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecalis]配列番号204
WP_010818269.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecalis]配列番号205
WP_010824395.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecalis]配列番号206
WP_016622645.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecalis]配列番号207
WP_033624816.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecalis]配列番号208
WP_033625576.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecalis]配列番号209
WP_033789179.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecalis]配列番号210
WP_002310644.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecium]配列番号211
WP_002312694.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecium]配列番号212
WP_002314015.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecium]配列番号213
WP_002320716.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecium]配列番号214
WP_002330729.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecium]配列番号215
WP_002335161.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecium]配列番号216
WP_002345439.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecium]配列番号217
WP_034867970.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecium]配列番号218
WP_047937432.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus faecium]配列番号219
WP_010720994.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus hirae]配列番号220
WP_010737004.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus hirae]配列番号221
WP_034700478.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus hirae]配列番号222
WP_007209003.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus italicus]配列番号223
WP_023519017.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus mundtii]配列番号224
WP_010770040.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus phoeniculicola]配列番号225
WP_048604708.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus sp. AM1]配列番号226
WP_010750235.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Enterococcus villorum]配列番号227
AII16583.1:Cas9エンドヌクレアーゼ[発現ベクターpCas9]配列番号228
WP_029073316.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Kandleria vitulina]配列番号229
WP_031589969.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Kandleria vitulina]配列番号230
KDA45870.1:CRISPR関連タンパク質Cas9/Csn1、サブタイプII/NMEMI[Lactobacillus animalis]配列番号231
WP_039099354.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Lactobacillus curvatus]配列番号232
AKP02966.1:仮説上のタンパク質ABB45_04605[Lactobacillus farciminis]配列番号233
WP_010991369.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria innocua]配列番号234
WP_033838504.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria innocua]配列番号235
EHN60060.1:CRISPR関連タンパク質、Csn1ファミリー[Listeria innocua ATCC 33091]配列番号236
EFR89594.1:crispr関連タンパク質, Csn1ファミリー[Listeria innocua FSL S4-378]配列番号237
WP_038409211.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria ivanovii]配列番号238
EFR95520.1:crispr関連タンパク質Csn1[Listeria ivanovii FSL F6-596]配列番号239
WP_003723650.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria monocytogenes]配列番号240
WP_003727705.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria monocytogenes]配列番号241
WP_003730785.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria monocytogenes]配列番号242
WP_003733029.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria monocytogenes]配列番号243
WP_003739838.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria monocytogenes]配列番号244
WP_014601172.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria monocytogenes]配列番号245
WP_023548323.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria monocytogenes]配列番号246
WP_031665337.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria monocytogenes]配列番号247
WP_031669209.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria monocytogenes]配列番号248
WP_033920898.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria monocytogenes]配列番号249
AKI42028.1:CRISPR関連タンパク質[Listeria monocytogenes]配列番号250
AKI50529.1:CRISPR関連タンパク質[Listeria monocytogenes]配列番号251
EFR83390.1:crispr関連タンパク質Csn1[Listeria monocytogenes FSL F2-208]配列番号252
WP_046323366.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Listeria seeligeri]配列番号253
AKE81011.1:Cas9[植物多重ゲノム編集ベクターpYLCRISPR/Cas9Pubi-H]配列番号254
CUO82355.1:細菌において保存されているまだ特徴づけられていないタンパク質[Roseburia hominis]配列番号255
WP_033162887.1:II型CRISPR RNAガイド型エンドヌクレアーゼCas9[Sharpea azabuensis]配列番号256
AGZ01981.1:Cas9エンドヌクレアーゼ[合成コンストラクト]配列番号257
AKA60242.1:ヌクレアーゼ欠損Cas9[合成コンストラクト]配列番号258
AKS40380.1:Cas9[合成プラスミドpFC330]配列番号259
4UN5_B:Cas9、B鎖、結晶構造、配列番号260
ヒトAID
マウスAID
イヌAID
ウシAID
マウスAPOBEC-3
ラットAPOBEC-3
アカゲザルAPOBEC-3G
チンパンジーAPOBEC-3G
ミドリザルAPOBEC-3G
ヒトAPOBEC-3G
ヒトAPOBEC-3F
ヒトAPOBEC-3B
ヒトAPOBEC-3C:
ヒトAPOBEC-3A:
ヒトAPOBEC-3H:
ヒトAPOBEC-3D
ヒトAPOBEC-1
Mouse APOBEC-1
Rat APOBEC-1
ヤツメウナギCDA1(pmCDA1)
ヒトAPOBEC3G D316R_D317R
ヒトAPOBEC3G 鎖A
ヒトAPOBEC3G 鎖A D120R_D121R
Escherichia coli発現のためのHis6-rAPOBEC1-XTEN-dCas9(配列番号293)
循環中のコレステロールの約70%は、低密度リポタンパク質(LDL)中で輸送され、これは、肝臓においてLDL受容体(LDL-R)媒介型エンドサイトーシスにより排出され、これに加えて内在性コレステロール生合成経路の下方制御がもたらされる。PCSK9は、分泌型の球状のセリンプロテアーゼであって、そのN末端プロドメインをタンパク質分解性自己プロセッシングして、その触媒部位を永久に遮断する強力な内在性阻害剤とすることができる(図1A~1C)。PCSK9の機能を遮断するために用いられる医薬剤のリストは、表12において見出すことができる。成熟PCSK9は、分泌経路を通して排出され、クラスリン被覆小胞においてタンパク質結合アダプターとして作用して、LDL粒子のエンドサイトーシスの間にLDL受容体とのpH依存性相互作用を架橋し、これが、LDL受容体の細胞表面へのリサイクルを防止する(図2)1。PCSK9のノックアウトマウスモデルは、著しく低い循環コレステロールレベルを示し2、これは、細胞表面上のLDLRの提示の増強および肝細胞によるLDL粒子の取り込みの増加に起因する。ヒトゲノム全体に関連する研究は、高コレステロール血症患者において有害なPCSK9の機能獲得型バリアント3、ならびに、低コレステロール血症の個体において有益な機能喪失型および不安定なPCKS9バリアントを同定した(図1A~1C、表1)3b、c、4。既知のヒトPCSK9バリアントのリストは、表18において見出すことができる。
in vivoでの組織中への遺伝子/タンパク質送達の不完全な浸透に起因して、PCSK9遺伝子のコピーのうちの相当な画分は、未修飾/野生型であり続ける15。したがって、パラクリン機構において改変されていない細胞から効率的に発現され、自己活性化され、細胞外輸送されてクラスリン被覆ピットに会合するPCSK9の機能喪失型バリアントは、ゲノム/塩基編集治療剤のために優先されるべきである。
表18.LOVDデータベースからの既知のヒトPCSK9のバリアントのリスト
赤色:ガイドRNAによりプログラムされたゲノム/塩基編集反応を用いてマッチした/模倣された修飾
1. (a) Fisher, T. S.; Lo Surdo, P.; Pandit, S.; Mattu, M.; Santoro, J. C.; Wisniewski, D.; Cummings, R. T.; Calzetta, A.; Cubbon, R. M.; Fischer, P. A.; Tarachandani, A.; De Francesco, R.; Wright, S. D.; Sparrow, C. P.; Carfi, A.; Sitlani, A., Effects of pH and low density lipoprotein (LDL) on PCSK9-dependent LDL receptor regulation. The Journal of biological chemistry 2007, 282 (28), 20502-12; (b) Cunningham, D.; Danley, D. E.; Geoghegan, K. F.; Griffor, M. C.; Hawkins, J. L.; Subashi, T. A.; Varghese, A. H.; Ammirati, M. J.; Culp, J. S.; Hoth, L. R.; Mansour, M. N.; McGrath, K. M.; Seddon, A. P.; Shenolikar, S.; Stutzman-Engwall, K. J.; Warren, L. C.; Xia, D.; Qiu, X., Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature structural & molecular biology 2007, 14 (5), 413-9.
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3. (a) Abifadel, M.; Varret, M.; Rabes, J. P.; Allard, D.; Ouguerram, K.; Devillers, M.; Cruaud, C.; Benjannet, S.; Wickham, L.; Erlich, D.; Derre, A.; Villeger, L.; Farnier, M.; Beucler, I.; Bruckert, E.; Chambaz, J.; Chanu, B.; Lecerf, J. M.; Luc, G.; Moulin, P.; Weissenbach, J.; Prat, A.; Krempf, M.; Junien, C.; Seidah, N. G.; Boileau, C., Mutations in PCSK9 cause autosomal dominant hypercholesterolemia. Nature genetics 2003, 34 (2), 154-6; (b) Costet, P.; Krempf, M.; Cariou, B., PCSK9 and LDL cholesterol: unravelling the target to design the bullet. Trends in biochemical sciences 2008, 33 (9), 426-34; (c) Cohen, J. C.; Boerwinkle, E.; Mosley, T. H., Jr.; Hobbs, H. H., Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. The New England journal of medicine 2006, 354 (12), 1264- 72.
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20. Dewpura, T.; Raymond, A.; Hamelin, J.; Seidah, N. G.; Mbikay, M.; Chretien, M.; Mayne, J., PCSK9 is phosphorylated by a Golgi casein kinase-like kinase ex vivo and circulates as a phosphoprotein in humans. The FEBS journal 2008, 275 (13), 3480-93.
請求項において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、そうでないと示されていない限り、または文脈から明らかでない限り、1以上を意味し得る。グループの1以上のメンバーの間の「or」を含む請求項または説明は、そうでないと示されていない限り、または文脈から明らかでない限り、1またはすべてのグループメンバーが所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連がある場合に満足すると考えられる。発明は、そのグループの正確に1のメンバーが所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連がある態様を含む。発明は、1より多く、またはすべてのグループメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連する態様も含む。
Claims (42)
- (i) (a)ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン、および(b)シトシンデアミナーゼドメインを含む、融合タンパク質;ならびに
(ii) プロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン(C)塩基に(i)の融合タンパク質をターゲティングするガイド核酸
を含む組成物であって、
ここで、前記組成物が、in vitroまたはex vivoでの核酸編集における使用のためのものであり、
ここで、核酸編集は、PCSK9タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、PCSK9をコードするポリヌクレオチドにおけるシトシン(C)からチミン(T)への変更をもたらす、融合タンパク質による標的C塩基の脱アミノ化をもたらすために好適な条件下で該融合タンパク質およびガイド核酸と接触させることを含み;ならびに
ここで、CからTへの変更は、PCSK9タンパク質において、W10X、W11X、Q31X、W77X、Q90X、Q99X、Q101X、Q152X、W156X、Q172X、Q190X、Q219X、Q256X、Q275X、Q278X、Q302X、Q342X、Q344X、Q382X、Q387X、Q413X、W428X、Q433X、W453X、Q454X、W461X、Q503X、Q531X、Q554X、Q555X、W566X、R582X、Q584X、Q587X、Q619X、Q621X、W630X、Q686XおよびQ689Xからなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらし、ここで、Xは停止コドンである、前記組成物。 - ガイド核酸が、配列番号938~1123のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- (i) (a)ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン、および(b)シトシンデアミナーゼドメインを含む、融合タンパク質;ならびに
(ii) アポリポタンパク質C3(APOC3)タンパク質をコードするポリヌクレオチド中の標的シトシン(C)塩基に(i)の融合タンパク質をターゲティングするガイド核酸
を含む組成物であって、
ここで、前記組成物は、in vitroまたはex vivoでの核酸編集における使用のためのものであり、
ここで、核酸編集は、APOC3をコードするポリヌクレオチドを、APOC3をコードするポリヌクレオチドにおけるシトシン(C)からチミン(T)への変更をもたらす、融合タンパク質による標的C塩基の脱アミノ化をもたらすために好適な条件下で該融合タンパク質およびガイド核酸と接触させることを含み;ならびに
ここで、CからTへの変更は、APOC3タンパク質において、Q2X、R19X、Q33X、Q51X、Q54X、Q57X、Q58X、W62X、W74X、およびW85Xからなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらし、ここで、Xは停止コドンである、前記組成物。 - ガイド核酸が、配列番号1810~1848のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項3に記載の組成物。
- ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質が、ニッカーゼであり;任意に、ニッカーゼが、Cas9ニッカーゼであり;さらに任意に、Cas9ニッカーゼが、配列番号1におけるD10A変異またはH840A変異に対応する変異を含み;さらに任意に、Cas9ニッカーゼが、配列番号1におけるD10A変異に対応する変異を含む、請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。
- ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1ドメイン、無能化Cpf1ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノートドメイン、およびそのバリアントからなる群より選択され;任意に、ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cas9(dCas9)ドメインであり;さらに任意に、dCas9ドメインのアミノ酸配列が、配列番号1におけるD10AおよびH840Aに対応する変異を含む、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。
- (i) ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Cpf1(dCpf1)ドメインまたは無能化Cpf1ドメインを含み;任意に、dCpf1ドメインまたは無能化Cpf1ドメインが、AcidaminococcusまたはLachnospiraceaeの種からのものであり;あるいは、
(ii) ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型アルゴノート(dAgo)ドメインを含み;任意に、dAgoドメインが、Natronobacterium gregoryi(dNgAgo)からのものである、請求項1~4または6のいずれか一項に記載の組成物。 - シトシンデアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質B-mRNA編集複合体(APOBEC)ファミリーデアミナーゼを含み;任意に、シトシンデアミナーゼが、APOBEC1、APOBEC2、APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3C、APOBEC3D、APOBEC3F、APOBEC3G、APOBEC3H、およびAPOBEC4からなる群より選択され;または、シトシンデアミナーゼが、活性化誘導デアミナーゼ(AID)、またはpmCDA1を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。
- シトシンデアミナーゼドメインが、配列番号271~292および303のうちのいずれかのアミノ酸配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含み;任意に、シトシンデアミナーゼドメインが、配列番号271~292および303のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の組成物。
- 融合タンパク質が、Gamタンパク質をさらに含み;任意に、Gamタンパク質が、配列番号2030~2058のうちのいずれか1つのアミノ酸配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含み;さらに任意に、Gamタンパク質が、配列番号2030~2058のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項1~9のいずれか一項に記載の組成物。
- 融合タンパク質が、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)ドメインをさらに含み;任意に、UGIドメインが、配列番号304のアミノ酸配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含み;さらに任意に、UGIドメインが、配列番号304のアミノ酸配列を含む、請求項1~10のいずれか一項に記載の組成物。
- シトシンデアミナーゼドメインが、ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのN末端に融合している、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物。
- UGIドメインが、ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのC末端に融合している、請求項11に記載の組成物。
- シトシンデアミナーゼ、ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン、およびUGIドメインが、それぞれ、任意のリンカーを介して共に融合しており;任意に、融合タンパク質が、構造:NH2-[シトシンデアミナーゼドメイン]-[任意のリンカー配列]-[ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン]-[任意のリンカー配列]-[UGIドメイン]-COOHを含む、請求項11~13のいずれか一項に記載の組成物。
- リンカーが、(GGGS)n(配列番号1998)、(GGGGS)n(配列番号308)、(G)n、(EAAAK)n(配列番号309)、(GGS)n、SGSETPGTSESATPES(配列番号310)、または(XP)nモチーフ、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせを含み、ここでnは、独立して1~30の整数であり、ここでXは、任意のアミノ酸であり;任意に、リンカーが、アミノ酸配列SGSETPGTSESATPES(配列番号310)を含み;任意に、リンカーが(GGS)nであり、ここでnは、1、3、または7である、請求項14に記載の組成物。
- 融合タンパク質が、配列番号10または293~302のうちのいずれか1つのアミノ酸配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含み;任意に、融合タンパク質が、配列番号10または293~302のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の組成物。
- PCSK9コード配列中の停止コドンが、短縮化されたかまたは非機能的なPCSK9タンパク質をもたらし;
任意に、停止コドンが、TAG(Amber)、TGA(Opal)、またはTAA(Ochre)である;
さらに任意に:
(i) 停止コドンが、コード鎖上のCの脱アミノ化を介するCAGからTAGへの変更から生じる;
(ii) 停止コドンが、コード鎖上のCの脱アミノ化を介するCGAからTGAへの変更から生じる;
(iii)停止コドンが、コード鎖上のCの脱アミノ化を介するCAAからTAAへの変更から生じる;
(iv) 停止コドンが、相補鎖上のCの脱アミノ化を介するTGGからTAGへの変更から生じる;
(v) 停止コドンが、相補鎖上のCの脱アミノ化を介するTGGからTGAへの変更から生じる;または
(vi) 停止コドンが、コード鎖上のCの脱アミノ化および相補鎖上のCの脱アミノ化を介する、CGGからTGAへ、またはCGAからTAAへの変更から生じる、
請求項1に記載の組成物。 - 1つ以上のタンデムな停止コドンが導入され;
任意に、変異が、W10X-W11X、Q99X-Q101X、Q342X-Q344X、およびQ554X-Q555Xからなる群より選択され、ここでXは、停止コドンである、請求項1および5~17のいずれか一項に記載の組成物。 - 停止コドンが、構造不安定化変異の後に導入され;
任意に、構造不安定化変異が、P530S/L、P581S/L、およびP618S/Lからなる群より選択される、請求項1および5~18のいずれか一項に記載の組成物。 - 停止コドンが、Q531X、R582X、およびQ619Xからなる群より選択され;
および、構造不安定化変異を導入するために用いられるガイド核酸が、配列番号579~937のうちのいずれか1つの配列を含む、請求項19に記載の組成物。 - (a)PAM配列が、変更されているCの3'に位置するか;または
(b)PAM配列が、変更されているCの5'に位置する;
任意に、PAM配列が、NGG、NGAN、NGNG、NGAG、NGCG、NNGRRT、NGGNG、NGRRN、NNNRRT、NNNGATT、NNAGAA、およびNAAACからなる群より選択され、ここで、Yはピリミジンであり、Rはプリンであり、およびNは任意の核酸塩基である、請求項1~20のいずれか一項に記載の組成物。 - PAM配列が、NNT、NNNT、およびYNTからなる群より選択され、ここで、Yはピリミジンであり、およびNは任意の核酸塩基であり;
および/または、標的C塩基の3'に位置するPAM配列は存在せず;
および/または、標的C塩基の5'に位置するPAM配列は存在せず;
および/または、標的C塩基の3'または5'に位置するPAM配列は存在しない、請求項21に記載の組成物。 - 少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個の変異が、PCSK9をコードするポリヌクレオチド中に導入される、請求項1および5~22のいずれか一項に記載の組成物。
- ガイド核酸が、RNA(gRNA)である、請求項1~23のいずれか一項に記載の組成物。
- ガイド核酸が、ssDNA(gDNA)を含む、請求項1~23のいずれか一項に記載の組成物。
- 核酸編集が、培養細胞中で行われる、請求項1~25のいずれか一項に記載の組成物。
- 以下:
(i) (a)ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン;および(b)シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質;ならびに
(ii) (i)の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイド核酸
を含む、組成物であって;
ここで、(ii)のガイド核酸は、(i)の融合タンパク質をターゲティングすることでポリヌクレオチド中にシトシン(C)からチミン(T)への変更を導入し、およびここで、CからTへの変更は、PCSK9タンパク質において、W10X、W11X、Q31X、W77X、Q90X、Q99X、Q101X、Q152X、W156X、Q172X、Q190X、Q219X、Q256X、Q275X、Q278X、Q302X、Q342X、Q344X、Q382X、Q387X、Q413X、W428X、Q433X、W453X、Q454X、W461X、Q503X、Q531X、Q554X、Q555X、W566X、R582X、Q584X、Q587X、Q619X、Q621X、W630X、Q686XおよびQ689Xからなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらし、ここで、Xは停止コドンである、前記組成物。 - 以下:
(i) (a)ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン;および(b)シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質;
(ii) (i)の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイド核酸;ならびに
(iii)(i)の融合タンパク質を、アポリポタンパク質C3(APOC3)タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイド核酸
を含む、組成物であって;
ここで、(ii)のガイド核酸は、(i)の融合タンパク質をターゲティングすることで、PCSK9をコードするポリヌクレオチド中にシトシン(C)からチミン(T)への変更を導入し、およびここで、CからTへの変更は、PCSK9タンパク質において、W10X、W11X、Q31X、W77X、Q90X、Q99X、Q101X、Q152X、W156X、Q172X、Q190X、Q219X、Q256X、Q275X、Q278X、Q302X、Q342X、Q344X、Q382X、Q387X、Q413X、W428X、Q433X、W453X、Q454X、W461X、Q503X、Q531X、Q554X、Q555X、W566X、R582X、Q584X、Q587X、Q619X、Q621X、W630X、Q686XおよびQ689Xからなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらし、ここで、Xは停止コドンである、前記組成物。 - 以下:
(i) (a)ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン;および(b)シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質;
(ii) (i)の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイド核酸;
(iii)(i)の融合タンパク質を、アポリポタンパク質C3(APOC3)タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイド核酸;ならびに
(iv) (i)の融合タンパク質を、低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイド核酸
を含む、組成物であって;
ここで、(ii)のガイド核酸は、(i)の融合タンパク質をターゲティングすることで、PCSK9をコードするポリヌクレオチド中にシトシン(C)からチミン(T)への変更を導入し、およびここで、CからTへの変更は、PCSK9タンパク質において、W10X、W11X、Q31X、W77X、Q90X、Q99X、Q101X、Q152X、W156X、Q172X、Q190X、Q219X、Q256X、Q275X、Q278X、Q302X、Q342X、Q344X、Q382X、Q387X、Q413X、W428X、Q433X、W453X、Q454X、W461X、Q503X、Q531X、Q554X、Q555X、W566X、R582X、Q584X、Q587X、Q619X、Q621X、W630X、Q686XおよびQ689Xからなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらし、ここで、Xは停止コドンである、前記組成物。 - 以下:
(i) (a)ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン;および(b)シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質;
(ii) (i)の融合タンパク質をプロタンパク質転換酵素サブチリシン/ケキシン9型(PCSK9)タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイド核酸;
(iii)(i)の融合タンパク質を、アポリポタンパク質C3(APOC3)タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイド核酸;
(iv) (i)の融合タンパク質を、低密度リポタンパク質受容体タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイド核酸;ならびに
(v) (i)の融合タンパク質をLDL受容体タンパク質の誘導性分解剤をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイド核酸
を含む、組成物であって;
ここで、(ii)のガイド核酸は、(i)の融合タンパク質をターゲティングすることで、PCSK9をコードするポリヌクレオチド中にシトシン(C)からチミン(T)への変更を導入し、およびここで、CからTへの変更は、PCSK9タンパク質において、W10X、W11X、Q31X、W77X、Q90X、Q99X、Q101X、Q152X、W156X、Q172X、Q190X、Q219X、Q256X、Q275X、Q278X、Q302X、Q342X、Q344X、Q382X、Q387X、Q413X、W428X、Q433X、W453X、Q454X、W461X、Q503X、Q531X、Q554X、Q555X、W566X、R582X、Q584X、Q587X、Q619X、Q621X、W630X、Q686XおよびQ689Xからなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらし、ここで、Xは停止コドンである、前記組成物。 - 以下:
(i) (a)ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン;および(b)シトシンデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質;ならびに
(ii) (i)の融合タンパク質を、アポリポタンパク質C3(APOC3)タンパク質をコードするポリヌクレオチドにターゲティングするガイド核酸
を含む、組成物であって;
ここで、(ii)のガイド核酸は、(i)の融合タンパク質をターゲティングすることで、ポリヌクレオチド中にシトシン(C)からチミン(T)への変更を導入し、およびここで、CからTへの変更は、APOC3タンパク質において、Q2X、R19X、Q33X、Q51X、Q54X、Q57X、Q58X、W62X、W74X、およびW85Xからなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらし、ここで、Xは停止コドンである、前記組成物。 - (v)のガイド核酸が、配列番号1788~1791のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項30に記載の組成物。
- (iv)のガイド核酸が、配列番号1792~1799のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項29、30および32のいずれか一項に記載の組成物。
- (iii)のガイド核酸が、配列番号1806~1906のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項28~30、32および33のいずれか一項に記載の組成物。
- (ii)のガイド核酸が、配列番号938~1123のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項27~30および32~34のいずれか一項に記載の組成物。
- (ii)のガイド核酸が、配列番号1810~1848のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項31に記載の組成物。
- 請求項27~36のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸および請求項27~36のいずれか一項に記載のガイド核酸を含み;任意に、薬学的に受入可能なキャリアをさらに含む、組成物。
- LDL受容体により媒介されるLDLコレステロールのクリアランスをブーストする用途のための;または、対象における循環コレステロールレベルを低下させる用途のための、請求項27~37のいずれか一項に記載の組成物。
- 状態を処置する用途のための、請求項27~38のいずれか一項に記載の組成物であって、任意に、状態が、高コレステロール血症、上昇した総コレステロールレベル、上昇した低密度リポタンパク質(LDL)レベル、上昇したLDL-コレステロールレベル、低下した高密度リポタンパク質レベル、脂肪肝、冠動脈心疾患、虚血、脳卒中、末梢血管疾患、血栓症、2型糖尿病、高い血圧上昇、アテローム動脈硬化症、肥満、アルツハイマー病、神経変性、またはこれらの組み合わせである、前記組成物。
- (i)の融合タンパク質が、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)ドメインをさらに含み;任意に、UGIドメインが、配列番号304のアミノ酸配列に対して、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、または少なくとも99.5%同一であるアミノ酸配列を含み;任意に、UGIドメインが、配列番号304のアミノ酸配列を含む、請求項27~39のいずれか一項に記載の組成物。
- シトシンデアミナーゼドメインが、ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのN末端に融合しており;任意に、UGIドメインが、ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメインのC末端に融合している、請求項40に記載の組成物。
- シトシンデアミナーゼ、ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン、およびUGIドメインが、それぞれ、任意のリンカーを介して共に融合しており;任意に、融合タンパク質が、構造NH2-[シトシンデアミナーゼドメイン]-[リンカー配列]-[ガイド核酸によりプログラミング可能なDNA結合タンパク質ドメイン]-[リンカー配列]-[UGIドメイン]-COOHを含む、請求項40または41に記載の組成物。
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