JP2002505111A - 改善したリンカーを有するポリジンクフィンガータンパク質 - Google Patents
改善したリンカーを有するポリジンクフィンガータンパク質Info
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Abstract
Description
明細書中においてその全体が参考として援用される)からの優先権を主張する。
よび国立癌研究所からの助成金PO1−CA42063、CDR−880301
4およびP30−CA14051によって援助された。米国政府は、本発明に特
定の権利を有する。本明細書中に記載される研究はまた、ハワードヒューズ医療
研究所により援助された。
れる最も一般的なDNA結合モチーフのうちの1つを構成し、そしてこれらのジ
ンクフィンガーは、新規な配列特異性を有するDNA結合タンパク質の設計およ
び選択について非常に魅力的な枠組みを提供した。多数の研究は、ジンクフィン
ガー−DNA相互作用の特異性を探索し、そして系統的に変更するためにファー
ジディスプレイ法または設計アイデアを使用した(Desjarlaisおよび
Berg、Proteins Struct.Funct.Genet.12:
101〜104(1992);DesjarlaisおよびBerg、Proc
.Natl.Acad.Sci.USA 90:2256〜2260(1993
);RebarおよびPabo、Science 263:671〜673(1
994);Jamiesonら、Biochemistry 33:5689〜
5695(1994);ChooおよびKlug、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 91:11163〜11167(1994);Wuら、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 92:344〜348(199
5);ならびにGreismanおよびPabo、Science 275:6
57〜661(1997))。
と他のDNA結合ドメイン(他のジンクフィンガータンパク質を含む)とを連結
し、伸長した部位を認識するハイブリッドタンパク質を生成した(Pomera
ntzら、Science 267:93〜96(1995);Kimら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3616〜3620(19
97))。例えば、ジンクフィンガータンパク質をGAL4二量体化ドメインに
連結し、新規なホモ二量体およびヘテロ二量体を開発しており(Pomeran
tzら、Biochemistry 4:965〜970(1997))、そし
てヌクレアーゼドメインに連結し、新規な制限酵素を生成している(Kimら、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156〜1160(
1996))。ジンクフィンガー/ホメオドメイン融合は、遺伝子治療における
潜在的な適用について試験されている(Riveraら、Nature Med
.2:1028〜1032(1996))。
ebar、(Ph.D.Thesis)、Selection Studies
of Zinc Finger−NA Recognition、Massa
chusetts Institute of Technology(199
7);Shi,Y.(Ph.D.Thesis)Molecular Mech
anisms of Zinc Finger Protein−Nuclei
c Acid Interactions、Johns Hopkins Un
iversity(1995))、または3つのフィンガーのタンパク質を2個
タンデムに連結することによって(Liuら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 94:5525〜5530(1997))、ジンクフィンガー
タンパク質のアフィニティーおよび特異性を増大させるいくつかの試みもまた存
在する。しかし、ポリフィンガータンパク質についてのこれらの以前の設計戦略
は全て、さらなるフィンガーを接続するための規範的な「TGEKP」リンカー
(アミノ酸配列トレオニン−グリシン−グルタミン酸−リジン−プロリンを有す
るリンカー)を使用し、アフィニティーにおいて比較的に適度な増大を生じた。
従って、キメラジンクフィンガータンパク質に対して増強したアフィニティーお
よび特異性を提供するリンカーを開発する必要性が存在する。
性の増強したキメラジンクフィンガータンパク質を作製するために、構造に基づ
く設計を使用する方法を提供する。本発明はまた、アフィニティーおよび特異性
の増強したキメラジンクフィンガータンパク質を作製するために、5個以上のア
ミノ酸長の可撓性リンカーを有するキメラジンクフィンガータンパク質を作製す
る方法を提供する。これらの方法を使用して作製されたジンクフィンガータンパ
ク質は、フェムトモル濃度の範囲の結合アフィニティーを有し、そして例えば、
単一の標的部位で高レベル(約70倍を超える)の転写抑制を提供する。このよ
うなジンクフィンガータンパク質は、遺伝子発現の調節(例えば、治療剤、診断
剤として)および研究での適用(例えば、機能性ゲノム学)のために使用され得
る。
ィンガータンパク質を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む:
(i)キメラジンクフィンガータンパク質の第1および第2のDNA結合ドメイ
ンのポリペプチドを選択する工程、ここでこれらのドメインの少なくとも一方が
ジンクフィンガーのポリペプチドを含み、そしてここで第1のドメインが第1の
標的部位に結合し、そして第2のドメインが第2の標的部位に結合し、ここで標
的部位が近接している、工程;(ii)第1および第2のドメインが第1の標的
部位および第2の標的部位に個々に結合される場合、第1のドメインと第2のド
メインとの間の物理的分離を決定するために、構造に基づく設計を使用する工程
;(iii)第1のドメインと第2のドメインとの間の物理的分離よりも少なく
とも1〜2Å長い可撓性リンカーを選択する工程;ならびに(iv)第1のドメ
インおよび第2のドメインと可撓性リンカーとを融合し、それによって近接した
標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する工程。
ンガータンパク質を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む:(
i)キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポリペプ
チドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチドを選択する工程であって、
ここでこれらのドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを
含み、ここで第1のドメインが第1の標的部位に結合し、そして第2のドメイン
が第2の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、工程;(ii)5
個以上のアミノ酸長である可撓性リンカーを選択する工程;ならびに(iv)第
1のドメインおよび第2のドメインと可撓性リンカーとを融合し、それによって
近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する工程
。
ンガータンパク質を提供し、このキメラジンクフィンガータンパク質は、以下を
含む:(i)キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインの
ポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチドであって、ここで
これらのドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、
そしてここで第1のドメインが第1の標的部位に結合し、そして第2のドメイン
が第2の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、キメラジンクフィ
ンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポリペプチドおよび第2のDN
A結合ドメインのポリペプチド;ならびに(ii)第1のドメインおよび第2の
ドメインが第1の標的部位および第2の標的部位に個々に結合される場合に、構
造に基づくモデリングにより決定されるように、第1のドメインと第2のドメイ
ンとの間の物理的分離よりも少なくとも1〜2Å長い可撓性リンカー;ここで第
1のドメインおよび第2のドメインは可撓性リンカーに融合される。
ンガータンパク質を提供し、ここでキメラジンクフィンガータンパク質は、以下
を含む:(i)キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメイン
のポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチドであって、これ
らのドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、そし
てここで第1のドメインが第1の標的部位に結合し、そして第2のドメインが第
2の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、キメラジンクフィンガ
ータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポリペプチドおよび第2のDNA結
合ドメインのポリペプチド;ならびに(ii)5個以上のアミノ酸長である可撓
性リンカー;ここで第1のドメインおよび第2のドメインは可撓性リンカーに融
合される。
ードする核酸を提供する。
ィンガーのポリペプチドである。別の実施態様において、このジンクフィンガー
のポリペプチドは、Zif268およびNREからなる群から選択される。別の
実施態様において、このジンクフィンガーのポリペプチドは、異種である。1つ
の実施態様において、第1のドメインは、ジンクフィンガーのポリペプチドであ
り、そして第2のドメインが異種DNA結合ドメインのポリペプチドを含む。別
の実施態様において、このキメラジンクフィンガータンパク質はさらに、調節ド
メインのポリペプチドを含む。
的部位に対してフェムトモル濃度のアフィニティーを有する。別の実施態様にお
いて、このキメラジンクフィンガータンパク質は、近接した標的部位に対して約
2〜4フェムトモル濃度のアフィニティーを有する。
ミノ酸長である。別の実施態様において、この可撓性リンカーは、配列RQKD
GERPまたはRQKDGGGSERPを有する。
分離される。
離され、そして可撓性リンカーは、5個または6個のアミノ酸長である。別の実
施態様において、近接した標的部位は、1個のヌクレオチドにより分離され、そ
して可撓性リンカーは、7個、8個、または9個のアミノ酸長である。別の実施
態様において、近接した標的部位は、2個のヌクレオチドにより分離され、そし
て可撓性リンカーは、10個、11個、または12個のアミノ酸長である。別の
実施態様において、近接した標的部位は、3個のヌクレオチドにより分離され、
そして可撓性リンカーは、12個以上のアミノ酸長である。
融合させるリンカーについての設計ストラテジーを提供する。これらのリンカー
は、可撓性であり、そして以前に使用された正統なリンカーより長く、いかなる
緊張も導入することなく、その標的部位へのキメラジンクフィンガータンパク質
の結合を可能にする。その標的部位は、代表的には、「複合性の」標的部位であ
り、0〜5以上のヌクレオチドによって隔てられる2つの近接した標的部位から
なる。各々の近接した標的部位は、キメラジンクフィンガータンパク質の1つの
DNA結合ドメインによって認識される。このリンカー設計ストラテジーは、2
つのDNA結合ドメインの間のリンカーについての最小の長さを決定するための
構造に基づく設計を包含し、次いで、リンカーに対する可撓性のさらなる少なく
とも約1〜2オングストロームを提供するために、リンカーにさらなるアミノ酸
を付加する。本発明は、従って、それらの標的部位についてフェムトモル濃度の
アフィニティーを有する、キメラジンクフィンガータンパク質を提供し、これは
、効率よく遺伝子発現を抑制する(例えば、単一の部位に標的化された場合、遺
伝子発現は約70分の1より低くなる)。
DNAがしばしばわずかにほどけていることを示す(Pavletichおよび
Pabo、Science 252:809−817(199l);Shiおよ
びBerg、Biochemistry 35:3845−3848(1996
);NekludovaおよびPabo、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 91:6948−6952(1994))。モデリング研究は、理
想的なB DNA上では正統なリンカーは、Zif268の好ましいドッキング
を可能にするにはやや短すぎること(Elrod−Ericksonら、Str
ucture 4:1171−1180(1996));DNAは、Zif26
8複合体中で見られる様式においてジンクフィンガーと相互作用するためにわず
かにほどけていなくてはならないことを示した。本質的には、ジンクフィンガー
のらせんの周期性は、B−DNAのらせんの周期性とは完全には一致しないよう
である。より多くフィンガーが存在する(ペプチドおよびDNAのらせんの周期
性が、段階的にさらに相からはずれ得る)場合、ほどけた緊張はより重要な問題
となり得るので、より長い、より可撓性のリンカーが、ポリフィンガータンパク
質の設計において試験された(KimおよびPabo、Proc.Nat’l
Acad.Sci.U.S.A.95:2812−2817(1998)を参照
のこと、これは、その全体が本明細書中で参考として援用される)。
キメラジンクフィンガータンパク質を作製するために使用され得ることを実証す
る。例えば、8アミノ酸のリンカーは、1つの塩基対によって隔てられている近
接した標的部位を認識するキメラジンクフィンガータンパク質のために使用され
た。11アミノ酸のリンカーは、2つの塩基対によって隔てられている近接した
標的部位を認識するキメラジンクフィンガータンパク質のために使用された。本
発明のリンカーはまた、構造に基づくモデリングを用いて設計され得る。構造に
基づくモデリングにおいては、各々のDNA結合ドメインポリペプチドの、その
DNA標的部位への結合を示すモデルが作製される。次いで、そのモデルは、ド
メインが近接した標的部位に結合する場合に、そのドメインの物理的分離を決定
するために使用される。ドメイン間の物理的分離は、リンカーまたはDNA結合
ドメインに対する立体障害なしで、第1のドメインのC−末端アミノ酸を第2の
ドメインのN−末端アミノ酸と接続するために使用されるリンカーの最小限の長
さを決定するために使用される。次いで、キメラジンクフィンガーに緊張を導入
することを避ける、わずかに長い可撓性リンカーを作製するために、この長さは
1〜2Å増加される。
されるが、このモデルはまた、物理的にも作製され得る。構造に基づくモデリン
グのために使用されるコンピュータープログラムの例は、Insight lI
(Biosym Technologies, SanDiego)およびQ
uanta 4.0 (Molecular Simulations(Bur
lington,MA)を含む。これらのプログラムは、タンパク質についての
適切な座標を提供する、DNA結合タンパク質のX線結晶解析由来の情報をしば
しば使用する。この情報はまた、公的に利用可能なデータベース(例えば、Br
ookhaven Protein Data Bank)から得られ得る。こ
の情報はまた、その結晶構造が未知であるDNA結合タンパク質についての距離
および座標を外挿するために使用され得る。B DNAのモデルは、当該分野で
周知である。関係のある座標(例えば、距離およびサイズ)は、製造者の指示書
およびデフォルトのパラメーターを用いて、えり抜きのコンピューターモデリン
グプログラムとともに使用される。あるいは、カスタマイズされたパラメーター
が使用され得る。構造に基づくモデリングは、例えば、KimおよびPabo、
Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.95:2812−28
17(1998);PavletichおよびPabo、Science 25
2:809−817(1991);Rebar、博士論文(Massachus
etts Institute of Technology,Cambrid
ge MA)(1997);Liuら、Proc.Nat’I.Acad.Sc
i.U.S.A.94:5525−5530(1997);Pomerantz
ら、Science 267:93−96(1995);Pomerantzら
、Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.92:9752−9
756(1995);Liら、Nature Biotechnology 1
6:190−195(1998);Kimら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 94:3616−3620(1997);ならびにPomer
antzら、Biochemistry 4:965−970(1997)にお
いて記載されるように行われ得、これらは、本明細書中でそれらの全体が参考と
して援用される。2つの基本的な規準が、DNA結合ドメインのどのアラインメ
ントがDNAを結合するキメラタンパク質における組み合わせのために潜在能力
を有するかを示唆する:(1)ドメイン間の衝突の欠如、および(2)ドメイン
のカルボキシル末端領域およびアミノ末端領域の矛盾しない位置付け、すなわち
ドメインが方向付けられて、その結果1つのポリペプチドのカルボキシル末端領
域が次のポリペプチドのアミノ末端領域に結合され得る。
合ドメインのそれらの各々の標的部位との相互作用を実質的に妨害しない任意の
アミノ酸配列を含み得る。本発明のリンカーのための好ましいアミノ酸残基は、
グリシン、アラニン、ロイシン、セリン、バリン、およびスレオニンを含むがこ
れらに限定されない。一旦アミノ酸配列の長さが選択されたならば、リンカーの
配列は、例えば、ファージディスプレイライブラリー技術(例えば、米国特許第
5,260,203号を参照のこと)によって、または、スカフォールド(例え
ば、GTGQKPおよびGEKP、Liuら、Proc.Nat’l Acad
.Sci.U.S.A.94:5525−5530(1997)を参照のこと;
Whitlowら、Methods: A Companion to Met
hods in Enzymology 2:97−105(1991)もまた
参照のこと)のような天然に存在するかもしくは合成のリンカー配列を使用する
ことによって選択され得る。代表的には、本発明のリンカーは、リンカーアミノ
酸配列を介して融合された、リンカーおよびDNA結合ドメインをコードする組
換え核酸を作製することによって作製される。必要に応じて、リンカーはまた、
ペプチド合成を用いて作製され得、次いで、ポリペプチドDNA結合ドメインに
結合する。
ンからなり、ここで少なくとも1つのDNA結合ドメインが、ジンクフィンガー
ポリペプチドである。第2のDNA結合ドメインは、同一のドメインか、または
異種のドメインのいずれかであるジンクフィンガー結合ドメインであり得る。適
切なジンクフィンガータンパク質は、Cys2−His2ファミリー、例えば、S
P−1、SP−1C、ZIF268、NRE、Tramtrack、GLI、Y
Yl、またはTFIIIA由来の任意のタンパク質を含む(例えば、Jacob
s、EMBO.J.11:4507(1992);Desjarlaisおよび
Berg、PNAS 90:2256−2260(1993);Christy
ら、PNAS 85:7857−7861(l988);Greismanおよ
びPabo、Science 275:657−661(1997);Fair
allら、Nature 366:483(1993);Paveltichら
、Science 261:1701(1993)を参照のこと)。
;ホメオドメインタンパク質またはヘリックスターンヘリックスモチーフタンパ
ク質(例えば、MAT 1、 MAT 2、MAT a1、Antennape
dia、Ultrabithorax、Engrailed、Paired、F
ushi tarazu、HOX、Unc86、Oct1、Oct2、Pit、
λリプレッサー、およびtetリプレッサー);Gal 4;TATA結合タン
パク質;ヘリックスループヘリックスモチーフタンパク質(例えば、myc、m
yo D、Daughterless、Achaete−scute(T3)、
El2およびE47);ロイシンジッパー型タンパク質(例えば、GCN4、C
/EBP、c−Fos/c−JunおよびJunB);ならびにβシートモチー
フタンパク質(例えば、met、arc、およびmntリプレッサー)に由来す
る異種DNA結合ドメインであり得る。別の実施態様において、ジンクフィンガ
ータンパク質は、以下に記載のように、少なくとも1つ以上の調節ドメインに結
合される。好ましい調節ドメインは、転写因子リプレッサードメインまたは転写
因子アクチベータードメイン(例えば、KRABおよびVP16、コリプレッサ
ードメインおよびコアクチベータードメイン、DNAメチルトランスフェラーゼ
、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、およびFo
k1のようなエンドヌクレアーゼ)を含む。DNA結合ドメインのアミノ酸配列
は、天然に存在してもよく、または天然に存在しなくてもよい(または改変され
ていてもよい)。
486系によって代表される系によって制御され得る(例えば、Gossenお
よびBujard、PNAS 89:5547(1992);Oliginoら
、Gene Ther.5:49l−496(l998); Wangら、Ge
ne Ther.4:432−441(1997);Neeringら、Blo
od 88:1147−1155(1996);およびRendahlら、Na
t.Biotechnol.16:757−761(l998)を参照のこと)
。これらは、キメラジンクフィンガータンパク質の発現における低分子制御に影
響し、従って、目的の標的遺伝子における低分子制御に影響する。この利点とな
る特徴は、細胞培養モデルにおいて、遺伝子治療において、そしてトランスジェ
ニック動物および植物において使用され得る。
にする。なぜなら、これらのタンパク質は、公知のタンパク質の特性と異なった
DNA結合特性を有するからである。このキメラタンパク質は、近接した標的部
位を結合することを好み、従って、近接した標的部位を有する遺伝子の発現を調
節するために使用され得る。これらのキメラジンクフィンガータンパク質は、フ
ェムトモル濃度範囲、例えば、100フェムトモル、10フェムトモル以下で、
いくつかの場合には2〜4フェムトモルまで低く、およびいくつかの場合には1
フェムトモル濃度以下で、近接した標的部位に対してアフィニティーを有する。
診断的、ならびに細胞または動物モデル、および機能的遺伝学におけるような研
究的適用を含む、多数の適用を有する。例えば、ジンクフィンガータンパク質は
、遺伝子発現を調節するために使用され得、これは新規のヒトおよび哺乳動物の
治療的適用(例えば、遺伝疾患、癌、真菌感染、原生動物感染、細菌感染、およ
びウイルス感染、虚血、血管疾患、関節炎、免疫障害などの処置)を可能にし、
ならびに改変された表現型(疾患耐性、果実成熟、糖および脂質組成、収量、な
らびに色を含む)を有する植物を発生させる手段を提供する。さらに、本発明の
ジンクフィンガータンパク質は、診断アッセイのために、そして機能的遺伝学ア
ッセイのために使用され得る。
に記載される使用(例えば、真核細胞遺伝子および原核細胞遺伝子、細胞遺伝子
、ウイルス遺伝子、原生動物遺伝子、真菌遺伝子、ならびに細菌遺伝子)のいず
れかのために、任意の適切な標的部位を認識するように設計され得る。一般的に
、調節される適切な遺伝子は、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、分裂促
進因子、走化因子、癌活性化因子、レセプター、カリウムチャネル、Gタンパク
質、シグナル伝達分子、および他の疾患関連遺伝子を含む。
十分な近接さが、一般的に必要とされているすべてであるということである。プ
ロモーターに対する正確な位置付け、方向、および限度内での距離は、大した問
題ではない。この特徴は、ジンクフィンガータンパク質を構築するための部位の
選択における顕著な可撓性を可能にする。従って、ジンクフィンガータンパク質
によって認識される標的部位は、標的遺伝子中の任意の適切な部位であり得、こ
の標的遺伝子は、ジンクフィンガータンパク質(必要に応じて調節ドメインに連
結されている)による遺伝子発現の活性化または抑制を可能にする。
その上流にある領域を含む。さらに、標的部位は、エンハンサー領域、リプレッ
サー部位、RNAポリメラーゼ停止部位、および特異的調節部位(例えば、SP
−1部位、低酸素症応答エレメント、核レセプター認識エレメント、p53結合
部位)、cDNAコード領域中または発現配列タグ(EST)コード領域中の部
位に位置する。以下に記載されるように、代表的には、各々のフィンガーは2〜
4塩基対を認識し、2フィンガーのジンクフィンガータンパク質は4〜7塩基対
の標的部位に結合し、3フィンガーのジンクフィンガータンパク質は6〜10塩
基対部位に結合し、そして6フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、2つ
の近接した標的部位(各々の標的部位は6〜10塩基対を有する)に結合する。
ンビボで活性について試験し得る(Current Protocols in
Molecular Biology(Ausubelら、編、1994))
。インビボアッセイは、キメラジンクフィンガータンパク質をコードするプラス
ミドを使用し、これは、キメラジンクフィンガータンパク質の標的部位を有する
試験遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ(CAT)遺伝子、またはヒト成長ホルモン(hGH)遺伝子を
含むレポータープラスミドとともに同時発現される。これらの2つのプラスミド
が、宿主細胞に一緒に導入される。細胞の第2の群は、コントロール群として働
き、そして転写因子をコードするプラスミドおよび転写因子の結合部位を有さな
いレポーター遺伝子を含むプラスミドを受け取る。
れる;レポーター遺伝子からのmRNA合成、または関係するタンパク質の活性
の量がコントロール遺伝子のそれよりも大きかった場合、転写因子は転写の正の
レギュレーターである。レポーター遺伝子mRNA合成、または関係するタンパ
ク質の活性の量がコントロールのそれよりも小さかった場合、転写因子は転写の
負のレギュレーターである。
る。このプラスミドは、レポーター遺伝子と独立した遺伝子産物を発現し、そし
てこの遺伝子産物の量は、細胞が取り込んでいるプラスミドの数、および細胞に
導入されたDNAの効率を大ざっぱに示す。キメラジンクフィンガータンパク質
はまた、当業者に公知の方法を用いて、インビボで内在性の遺伝子の調節のため
に試験され得る。
、核ホルモン応答性エレメントを特異的に認識する(GreismanおよびP
abo、Science 275:657(1997))、設計された3フィン
ガーのペプチド(「NRE」と呼ばれる)に連結された融合物を提供する。ゲル
シフトアッセイは、この6フィンガーのペプチド268//NREが、フェムト
モル濃度範囲の解離定数で複合性の18塩基対DNA部位に結合することを示す
。この融合タンパク質において使用されるわずかに長いリンカーは、DNA結合
アフィニティーにおいて劇的な改善を提供し、以前の研究で使用されてきた正統
な「TGEKP」リンカーよりもずっと良好に働く。組織培養トランスフェクシ
ョン実験はまた、268//NREペプチドが、転写開始部位に密接する結合部
位に標的化される場合に、72倍の抑制をもたらす非常に効果的なリプレッサー
であることを示す。このストラテジーを使用することおよびファージディスプレ
イを介して選択されるペプチドを連結することは、生物学的適用および遺伝子治
療における使用のための、尋常でないアフィニティーおよび特異性を有する新規
なDNA結合タンパク質の設計を可能にする。
ため、または3フィンガータンパク質にさらなるフィンガーを添加するために、
従来の「TGEKP」リンカーを使用する、以前に報告されたポリフィンガータ
ンパク質よりもはるかにより強固に結合する。正統なリンカーを有するポリフィ
ンガータンパク質は、Rebar(Rebar(博士論文)、Selectio
n Studies of Zinc Finger−DNA Recogni
tion,Massachusetts Institute of Tech
nology(1997))、Shi(Shi(博士論文)、Molecula
r Mechanisms of Zinc Finger Protein−
Nucleic Acid Interactions,Johns Hopk
ins University(1995))、およびLiuら(Liuら、P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5525−5530 (
l997))によって試験された。各々の研究は、(適切な伸長部位における)
新しいポリフィンガータンパク質の結合を、もともとの3フィンガーペプチドの
結合と比較した。正統なリンカーを使用した場合、4フィンガーペプチドは、対
応する3フィンガーペプチドよりも6.3倍強固に結合し(Rebar(博士論
文)Selection Studies of Zinc Finger−D
NA Recognition, Massachusetts Instit
ute of Technology(1997))、5フィンガー構築物は、
もともとの3フィンガーペプチドを超えてKdの改善を示さず(Shi(博士論 文)、Molecular Mechanisms of Zinc Fing
er Protein−Nucleic Acid Interactions
,Johns Hopkins University(1995))、そして
6フィンガーペプチドは、対応する3フィンガーペプチドよりも58〜74倍強
固に結合した(Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9
4:5525−5530(l997))。
ともとの3フィンガーペプチドよりも6,000倍〜90,000倍強固に結合
する。268/NREおよび268//NRE構築物中で使用されるより長いリ
ンカーは、より大きなフィンガーのセットがすべて正統なリンカーを用いて連結
される場合に、蓄積する緊張をいくらか緩和しなければならないようである。お
そらくこれは、DNAのらせんの周期性、およびジンクフィンガーの好ましいら
せんの周期性におけるわずかなミスマッチを含み、特に4以上のフィンガーが正
統なリンカーを介して連結される場合に、それらがわずかに見当はずれになるこ
とを引き起こす。
に与えられた意味を有する。
ガーポリペプチド」は、亜鉛によって安定化されているDNA結合ドメインを有
するタンパク質をいう。個々のDNA結合ドメインは、代表的には、「フィンガ
ー」として呼ばれる。1つのジンクフィンガータンパク質は、少なくとも1フィ
ンガー、代表的には2フィンガー、3フィンガー、または6フィンガーを有する
。各々のフィンガーは、2〜4塩基対のDNA、代表的には3または4塩基対の
DNA(「部分配列」)を結合する。1つのジンクフィンガータンパク質は、標
的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各々のフィンガー
は、代表的には、約30アミノ酸の、亜鉛がキレートしたDNA結合サブドメイ
ンを含む。これらのタンパク質の1つのクラス(C2H2クラス)を特徴付ける例
示的なモチーフは、−Cys−(X)2-4−Cys−(X)12−His−(X)3 -5 −His(ここで、Xは任意のアミノ酸である)である。研究は、このクラス
の単一のジンクフィンガーが、単一のβターンの2つのシステイン残基とともに
、亜鉛が配位する2つの不変のヒスチジン残基を含むα−ヘリックスからなるこ
とを実証した(例えば、BergおよびShi、Science 27l:10
81−1085(1996)を参照のこと)。
メインを有し、そのうちの1つは、ジンクフィンガーポリペプチドであり、可撓
性リンカーを介して他のドメインと連結されているタンパク質をいう。これらの
2つのドメインは、同じかまたは異種であり得る。両方のドメインが、同じジン
クフィンガータンパク質であるか、または異種ジンクフィンガータンパク質であ
るかのいずれかであるジンクフィンガータンパク質であり得る。あるいは、1つ
のドメインが異種DNA結合タンパク質であり得る。
プチドによって認識される核酸配列である。ジンクフィンガータンパク質につい
ては、単一の標的部位は、代表的には約4〜約10塩基対を有する。代表的には
、2フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、4〜7塩基対の標的部位を認
識し、3フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、6〜10塩基対の標的部
位を認識し、そして6フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、2つの近接
した9〜10塩基対の標的部位を認識する。
て認識される標的部位の部分、例えば、2〜4塩基対の部分部位、代表的には3
塩基の部分部位に対応する。標的部位は、少なくとも2、代表的には3、4、5
、6、またはそれより多い部分部位(タンパク質の各フィンガーについて1つ)
を含む。
しない標的部位をいう。
れの対応する標的部位に結合する場合の、2つのドメイン間の距離をいう。この
距離は、リンカーの最小の長さを決定するために使用される。リンカーの最小の
長さとは、ドメインまたはリンカーに立体的な障害を提供することなしに、2つ
のドメインが連結されることを可能にする長さである(最小リンカー)。最小よ
りも長い長さを提供するリンカーは、「可撓性リンカー」である。
結合タンパク質の物理的モデルおよびコンピューターモデルを使用して、最小の
長さのリンカーおよび可撓性リンカーを決定する方法をいう。
の条件下で(すなわち、[標的]<<Kdの場合)、その標的に対する化合物( 例えば、ジンクフィンガータンパク質)の最大結合の半分を与える(すなわち、
化合物分子の半分が標的に結合する)化合物の濃度をいう。Kdを測定するため に使用されるアッセイ系を選択するべきであり、その結果、それはジンクフィン
ガータンパク質の実際のKdの最も正確な測定を与える。ジンクフィンガータン パク質の実際のKdの正確な測定を与える限り、任意のアッセイ系が使用され得 る。1つの実施態様において、本発明のジンクフィンガータンパク質についての
Kdは、本明細書中に記載されるように、電気泳動移動度シフトアッセイ(「E MSA」)を使用して測定される。ジンクフィンガータンパク質の純度または活
性について調整しない限りは、Kdの計算は、所定のジンクフィンガータンパク 質の真のKdの過小評価を生じ得る。
の約50塩基以内にある標的部位をいう。転写開始部位の「上流」とは、転写開
始部位の5’の約50塩基より多い標的部位をいう(すなわち、遺伝子の非転写
領域において)。
Biochem.66:117−172(1997)に記載される。
合、天然では互いに同じ類縁中に見出されない2つ以上の部分配列を含む核酸を
示す。例えば、組換え的に産生された核酸は代表的に、新たな機能的核酸を作製
するように、合成的に配置された関連のない遺伝子由来の2つ以上の配列を有す
る(例えば、1つの供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領
域)。従って、この2つの核酸は、この状況において互いに対して異種である。
細胞に対して添加される場合、この組換え核酸はまた、この細胞の内因性遺伝子
に対して異種である。従って、染色体において、異種核酸とは、染色体中に組み
込まれた非天然の(天然には存在しない)核酸、または非天然の(天然には存在
しない)染色体外の核酸を含む。対照的に、天然に転座した染色体の断片は、本
特許出願の文脈において異種と見なされない。なぜなら、この断片は、変異細胞
に対してネイティブである内因性の核酸配列を含むからである。
ンパク質)に連結される場合に、転写調節活性、DNA修飾活性、タンパク質修
飾活性などのような活性を有するタンパク質またはタンパク質ドメインをいう。
調節ドメインの例としては、タンパク質またはタンパク質のエフェクタードメイ
ン(例えば、転写因子および補因子(例えば、KRAB、MAD、ERD、SI
D、核因子κBサブユニットp65、初期増殖応答因子1、および核ホルモンレ
セプター、VP16、VP64)、エンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコ
ンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ
、ヒストンデアセムラーゼなど))が挙げられる。アクチベーターおよびリプレ
ッサーは、コアクチベーターおよびコリプレッサーを含む(例えば、Utley
ら、Nature 394:498−502(1998)を参照のこと)。
パク質(例えば、制限酵素、核ホルモンレセプター、ホメオドメインタンパク質
(例えば、エングレイルドまたはアンテナぺディア(antenopedia)
)、細菌性ヘリックスターンヘリックスモチーフタンパク質(例えば、λリプレ
ッサおよびtetリプレッサー)、Gal 4、TATA結合タンパク質、ヘリ
ックスループヘリックスモチーフタンパク質(例えば、mycおよびmyo D
)、ロイシンジッパー型タンパク質(例えば、fosおよびjun)、およびβ
シートモチーフタンパク質(例えば、metリプレッサ、arcリプレッサ、お
よびmntリプレッサ)由来のDNA結合ドメインをいう。
となく、既存のヒト配列を模擬するようにアミノ酸配列を改変することによって
、ヒトにおける免疫反応性を最小化するように改変された非ヒトポリペプチド配
列をいう(例えば、Jonesら、Nature 321:522−525(1
986)、および公開されたUK特許出願番号第8707252号を参照のこと
)。ジンクフィンガータンパク質についての骨格配列は、好ましくは既存のヒト
C2H2ジンクフィンガータンパク質(例えば、SP−1)から選択される。機能
的ドメインは、好ましくは既存のヒト遺伝子(例えば、NF−κBのp65サブ
ユニット由来の活性化ドメイン)から選択される。可能であれば、認識ヘリック
ス配列を、ヒトゲノムを配列決定することによって提供された数千の既存のジン
クフィンガータンパク質DNA認識ドメインから選択する。できる限り多く、ド
メインを、同じ既存のタンパク質由来のユニットとして結合する。これらの工程
の全ては、キメラジンクフィンガータンパク質中の新たな結合エピトープの導入
を最小化し、そして操作したジンクフィンガータンパク質をより低い免疫原性に
する。
ボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。この用
語は、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは連鎖を含
む核酸を包含する。これらの核酸は合成的であり、天然に存在し、および天然に
存在しない。これらの核酸は参照核酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌク
レオチドと類似の様式で代謝される。このようなアナログの例としては、ホスホ
ロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホス
ホネート、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)が挙げら
れ、この例は制限することを伴わない。他に示されない限り、特定の核酸配列は
また、保存的に改変されたそれらの改変体(例えば、縮重コドン置換)および相
補的配列、ならびに明示された配列を内在的に包含する。この用語、核酸は、遺
伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと交換
可能に使用される。ヌクレオチド配列は本明細書中において、慣習的な5’−3
’方向で示される。
おいて、アミノ酸残基のポリマーをいうために交換可能に使用される。この用語
は、1つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸のアナログま
たは擬態物であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマ
ーに対して適用される。ポリペプチドは、例えば、炭水化物残基の添加により改
変されて、糖タンパク質を形成し得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」お
よび「タンパク質」は、糖タンパク質ならびに非糖タンパク質を含む。ポリペプ
チド配列は、本明細書中において、慣習的なN末端からC末端への方向で示され
る。
に天然に存在するアミノ酸と類似の様式において機能するアミノ酸アナログおよ
びアミノ酸擬態物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコード
されるアミノ酸であり、ならびに後に改変されたそれらのアミノ酸(例えば、ヒ
ドロキシプロリン、カルボキシグルタミン酸、およびO−ホスホセリン)である
。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有す
る化合物(すなわち、水素に結合するα炭素、カルボキシル基に結合するα炭素
、アミノ基に結合するα炭素、およびR基に結合するα炭素(例えば、ホモセリ
ン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニン、およびメチルスルホ
ニウム))をいう。そのようなアナログは、改変されたR基(例えば、ノルロイ
シン)または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同
じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸擬態物とは、アミノ酸の一般的な化学構
造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式において機
能する化合物をいう。
する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一もしくは
本質的に同一のアミノ酸配列をコードする改変された核酸をいうか、または核酸
がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列をいう。特に、縮重
コドン置換は、1つ以上の選択された(または全ての)コドンの3番目の位置が
混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成すること
によって、達成され得る(Batzerら、Nucleic Acids Re
s.19:5081(1991);Ohtsukaら、J.Biol.Chem
.260:2605−2608(1985);Rossoliniら、Mol.
Cell.Probes 8:91−98(1994))。遺伝暗号の縮重が理
由で、多数の機能的に同一の核酸は、任意の所定のタンパク質をコードする。例
えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは全て、アミノ酸アラニン
をコードする。従って、本明細書中のアミノ酸において、コドンによってアラニ
ンが特定される全ての位置において、このコドンは、コードされるポリペプチド
を改変することなく、任意の対応する記載のコドンに改変され得る。そのような
核酸の改変は「サイレントな改変」であり、これは保存的に改変された改変の1
種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のどの核酸配列もまた、核酸の
全ての可能なサイレントな改変を記述する。当業者は、核酸中の各コドン(AU
G(これは通常、メチオニンついての唯一のコドンである)およびTGG(これ
は通常、トリプトファンについての唯一のコドンである)を除く)が、改変され
て機能的に同一の分子を産生し得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコ
ードする核酸の各サイレントな改変が、各記載の配列中に内在する。
レオチド、または低い割合のアミノ酸もしくはヌクレオチドを、改変、付加、ま
たは欠失する個々の置換、欠失、あるいは付加は、「保存的に改変された改変体
」を作製する。ここで、この改変は、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置
換を生じる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野に
おいて周知である。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型性の
改変体および対立遺伝子に加えられ、そしてそれらを除外しない。
eins(1984)を参照のこと)。
くとも第2のDNA結合ドメイン(これは、必要に応じて第2のジンクフィンガ
ーポリペプチドである)に連結した、少なくとも1つのジンクフィンガーポリペ
プチドを含む。キメラジンクフィンガータンパク質は、2つより多いDNA結合
ドメイン、ならびに1つ以上の調節ドメインを含み得る。本発明のジンクフィン
ガーポリペプチドは、選択した遺伝子中の選択された標的部位を認識するように
操作され得る。代表的には、任意の適切なC2H2ZEP(例えば、SP−1、S
P−1C、またはZIF268)由来の骨格を、操作したジンクフィンガーポリ
ペプチドのための足場として使用する(例えば、Jacobs、EMBO J.
11:4507(1992);DesjarlaisおよびBerg、PNAS
90:2256−2260(1993)を参照のこと)。次いで、多くの方法
を使用して、その標的に対して高アフィニティーを有するジンクフィンガーポリ
ペプチドを設計および選択し得る。ジンクフィンガーポリペプチドを、標的遺伝
子中の任意の適切な標的部位に対して、高アフィニティーで結合するように設計
または選択し得る。同時係属中の特許出願USSN 、(1999年1月1
2日出願)(TTC代理人整理番号第019496−001800、本明細書中
で参考として援用される)は、選択された標的部位に対するジンクフィンガーポ
リペプチドの設計、構築、および発現のための方法を、包括的に記載する。
ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピューター/合理設計
、アフィニティー選択、PCR、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリ
ーからのクローニング、合成的構築など)を使用して、ジンクフィンガーポリペ
プチドをコードする核酸を設計および構築し得る(例えば、米国特許第5,78
6,538号;Wuら、PNAS 92:344−348(1995);Jam
iesonら、Biochemistry 33:5689−5695(199
4);RebarおよびPabo、Science 263:671−673(
1994);ChooおよびKlug、PNAS 91:11163−1116
7(1994);ChooおよびKlug、PNAS 91:11168−11
172(1994);DesjarlaisおよびBerg、PNAS 90:
2256−2260(1993);DesjarlaisおよびBerg、PN
AS 89:7345−7349(1992);Pomerantzら、Sci
ence 267:93−96(1995);Pomerantzら、PNAS
92:9752−9756(1995);およびLiuら、PNAS 94:
5525−5530(1997);GriesmanおよびPabo、Scie
nce 275:657−661(1997);DesjarlaisおよびB
erg、PNAS 91:11−99−11103(1994)を参照のこと)
。
月12日出願)(TTC代理人整理番号第019496−001800)は、標
的遺伝子を選択し、そして1〜6(またはそれ以上)のD型可能部位(下記の定
義を参照のこと)を含有する遺伝子内に標的部位を同定する方法を提供する。次
いで、これらの方法を使用して、予め選択された部位に結合するジンクフィンガ
ーポリペプチドを合成し得る。標的部位の選択のこれらの方法は、標的セグメン
トにおける1つ以上のD型可能部位の存在が、D型可能部位を欠失する標的セグ
メントに結合するジンクフィンガーポリペプチドと相対的に、その部位に結合す
るように選択または設計されたジンクフィンガーポリペプチドにおいて、より高
い結合アフィニティーについての潜在能力を付与するという認識を、一部前提条
件とする。
、3つの標的部位によりもむしろ4つの塩基に結合することを可能にする標的部
位の領域である。そのようなジンクフィンガーは、二本鎖標的セグメントの内の
一本の鎖(標的鎖)上の塩基のトリプレットおよび他方の鎖上の第4の塩基に結
合する(同時係属中の出願USSN (1999年1月12日出願)(TT
C代理人整理番号第019496−001800の図2を参照のこと)。4塩基
の標的セグメントへの単一のジンクフィンガーの結合は、標的鎖の配列上および
ジンクフィンガーのアミノ酸配列上の両方への束縛を課す。標的鎖内の標的部位
は、「D型可能」部位モチーフ5’NNGK3’(ここで、NおよびKは、慣習
的なIUPAC−IUBあいまいコードである)を含むべきである。そのような
部位への結合のためにジンクフィンガーは、−1位にアルギニン残基および+2
位でアスパラギン酸(または低い程度で好ましくは、グルタミン酸)を含むべき
である。−1位のアルギニン残基は、D型可能部位中のG残基と相互作用する。
ジンクフィンガーの+2位でのアスパラギン酸(またはグルタミン酸)残基は、
D型可能部位中のK塩基に相補的な反対の鎖の塩基と相互作用する。D型可能部
位の名前を付与するのは、アスパラギン酸(記号D)と反対の鎖の塩基(第4の
塩基)との間の相互作用である。D型可能部位の式から明らかなように、D型可
能部位の2つのサブタイプが存在する:すなわち、5’NNGG3’および5’
NNGT3’である。前者の部位について、ジンクフィンガーの+2位のアスパ
ラギン酸またはグルタミン酸は、D型可能部位に対して反対の鎖中のCと相互作
用する。後者の部位において、ジンクフィンガーの+2位のアスパラギン酸また
はグルタミン酸は、D型可能部位に対して反対の鎖中のAと相互作用する。一般
的に、NNGGは、NNGTより好ましい。
的部位は、そのタンパク質のうちの少なくとも1つのフィンガー、および必要に
応じて2つかまたは3つ全てのフィンガーが、D型可能部位を結合する潜在能力
を有するように選択されるべきである。このような選択は、式5’−NNx a
Ny bNzc−3’を有する、より大きな標的遺伝子内から標的部位を選択す
ることによって達成され得る。ここで、 各々のセット(x、a)、(y、b)および(z、c)は、(N、N)または(
G、K)のいずれかであり; (x、a)、(y、b)および(z、c)のうちの少なくとも1つは(G、K)
であり、そして NおよびKは、IUPAC−IUBあいまいコードである。
少なくとも1つはセット(G、K)であり、このことはこのセットの第1の位置
がGであり、そして第2の位置がGまたはTであることを意味する。(G、K)
ではない3つのセット(もしあれば)のセットは(N、N)であり、これはこの
セットの第1の位置が任意のヌクレオチドによって占められ得、そしてこのセッ
トの第2の位置が任意のヌクレオチドで占められ得ることを意味する。例として
、セット(x、a)は(G、K)であり得、そしてセット(y、b)および(z
、c)は両方とも(N、N)であり得る。
Nzcのトリプレットは、ジンクフィンガーポリペプチドの3つのフィンガーに
よって結合される標的鎖上に塩基のトリプレットを示す。x、yおよびzのうち
の1つのみがGであり、このGがKに続く場合、標的部位は単一のD型可能部分
部位を含む。例えば、xのみがGであり、そしてaがKである場合、この部位は
、強調されたD型可能部分部位を有する以下、
である場合、この標的部位は、2つの重複するD型可能部分部位を以下のように
有する:
方を有する。x、yおよびzの3つ全てがGであり、そしてa、b、およびcが
Kである場合、この標的セグメントは、3つのD型可能部分部位を以下のように
含み、
。
能な部分配列内で、上記の式5’−NNx aNy bNzc−3’と合致する
標的部位について体系的に検索することによって進む。いくつかのこのような方
法において、潜在的な標的遺伝子のいずれかの鎖上の10連続している塩基のあ
らゆる可能な部分配列を評価して、それが上記の式に合致するか否かを決定し、
そして合致する場合には、いくつのD型可能部位が存在するかを決定する。代表
的には、そのような比較はコンピューターによって実施され、そしてこの式に合
致する標的部位のリストが出力される。必要に応じて、そのような標的部位は、
いくつのD型可能部位が存在するかに従って、種々のサブセットに出力され得る
。
第2の標的セグメントを同定する。そのような方法における2つの標的セグメン
トは、その標的遺伝子において互いの近接または隣接(すなわち、約0〜5塩基
内)であることが強制される。隣接の標的セグメントの選択に基づくこのストラ
テジーは、それぞれ第1および第2の標的セグメントについて特異的である2つ
の成分のジンクフィンガーポリペプチドの連結によって形成されるジンクフィン
ガーポリペプチドの設計を可能にすることである。これらの原則は、拡大されて
、任意の数の成分フィンガーを有するジンクフィンガーポリペプチドによって結
合されるべき標的部位を選択し得る。例えば、9つのフィンガータンパク質につ
いての適切な標的部位は、3つの成分セグメント(各々は上記の式と合致する)
を有する。
に供され得るか、またはそのような部位について特異的なジンクフィンガーポリ
ペプチドの設計または選択(もし必要であれば)および産生のために直接的に使
用され得る。潜在的な標的部位を評価するためのさらなる判断基準は、遺伝子内
での特定の領域に対するそれらの隣接度である。ジンクフィンガーポリペプチド
をそれ自体で細胞性遺伝子を抑制するように使用する場合(すなわち、抑制部分
へジンクフィンガーポリペプチドを連結することを伴わない)、最適な位置は、
転写開始の部位、またはその上流50bp内もしくは下流50bp内であるよう
に思われ、転写複合体の形成を阻害する(KimおよびPabo、J.Biol
.Chem.272:29795−296800(1997))か、あるいは必
須のエンハンサー結合タンパク質と競合するように思われる。しかし、ジンクフ
ィンガーポリペプチドが機能的ドメイン(例えば、KRABリプレッサードメイ
ン、またはVP16アクチベータードメインに融合される場合、結合部位の位置
はかなりより柔軟であり、そして既知の調節領域の外側であり得る。例えば、K
RABドメインは、KRABが結合する位置から少なくとも3kbpまでのプロ
モーターで転写を抑制し得る(Margolinら、PNAS 91:4509
−4513(1994))。従って、標的遺伝子と共に明白に生物学的に重要な
セグメント(例えば、調節配列)を必ずしも含むかまたは重複する必要のない標
的部位が選択され得る。標的セグメントをさらに評価するための他の判断基準と
しては、そのようなセグメントまたは関連のセグメントに結合するジンクフィン
ガーポリペプチドの事前の有効性、および/または所定の標的セグメントを結合
するように新たなジンクフィンガーポリペプチドを設計することの容易さが挙げ
られる。
リペプチドは、種々のアプローチによって提供され得る。最も単純なアプローチ
は、その標的部位に結合することが既に公知である既存のコレクションから、予
め特徴付けられたジンクフィンガーポリペプチドを提供することである。しかし
、多くの例において、そのようなジンクフィンガーポリペプチドは存在しない。
新たなジンクフィンガーポリペプチドを設計する代替のアプローチもまた使用さ
れ得る。この代替のアプローチは、既存のジンクフィンガーポリペプチドのデー
タベース中の情報およびそれらの個々の結合アフィニティーを使用する。さらな
るアプローチは、上記に議論した置換の法則に基づいてジンクフィンガーポリペ
プチドを設計することである。なおさらなる代替手段は、ファージディスプレイ
のような経験的プロセスによって所定の標的に対して特異性を有するジンクフィ
ンガーポリペプチドを選択することである。いくつかのそのような方法において
、ジンクフィンガーポリペプチドの各成分フィンガーは、他の成分フィンガーと
は独立に設計または選択される。例えば、各フィンガーを異なる先に存在してい
たジンクフィンガーポリペプチドから獲得し得るか、または各フィンガーを別々
の無作為化および選択に供し得る。
れ、設計され、またはさもなければ提供されると、そのジンクフィンガーポリペ
プチドまたはそれをコードするDNAが合成される。ジンクフィンガータンパク
質をコードするDNAを合成および発現するための例示的な方法を、以下に記載
する。次いで、ジンクフィンガーポリペプチドまたはそれをコードするポリヌク
レオチドを、そのジンクフィンガーポリペプチドが結合する標的部位を含む標的
遺伝子の発現を調節するため、またはその標的遺伝子の分析のために使用し得る
。
現および精製) 可撓性リンカーを含むキメラジンクフィンガータンパク質およびこのようなキ
メラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸は、組換え遺伝学の分野で慣
用的な技術を使用して作製され得る。本発明における使用の一般的な方法を開示
する基本的なテキストとしては、Sambrookら、Molecular C
loning,A Laboratory Manual(第2版、1989)
;Kriegler,Gene Transfer and Expressi
on,A Laboratory Manual(1990);およびCurr
ent Protocols in Molecular Biology(A
usubelら編、1994)が挙げられる。さらに、本質的には、任意の核酸
は、任意の種々の商業的供給源から注文される注文品であり得る。同様に、ペプ
チドおよび抗体は、任意の種々の商業的供給源から注文される注文品であり得る
。
ドおよび可撓性リンカーを発現するのに必要なコード配列が作製される。1つの
プロトコルは、PCRに基づくアセンブリ手順であり、これは、(3フィンガー
のジンクフィンガーポリペプチドを1つ作成するために)6つの重複オリゴヌク
レオチドを利用する。3つのオリゴヌクレオチドは、認識ヘリックスの間のDN
A結合ドメインの部分をコードする「普遍」配列に対応する。これらのオリゴヌ
クレオチドは、全てのジンクフィンガー構築物について一定のままである。他の
3つの「特異的な」オリゴヌクレオチドは、認識ヘリックスをコードするように
設計される。これらのオリゴヌクレオチドは、認識ヘリックスの主に1、2、3
および6位で置換を含み、このことは、これらのオリゴヌクレオチドを、異なる
ジンクフィンガーの各々に対して特異的にする。
が2つの工程で行われる。最初に、二本鎖DNAテンプレートが、低温度のアニ
ーリング工程を用いる4つのサイクルのPCR反応において、6つのオリゴヌク
レオチド(3つの普遍オリゴヌクレオチド、3つの特異的なオリゴヌクレオチド
)を組み合わせることによって作製され、それにより、オリゴヌクレオチドがア
ニーリングされ、DNA「足場」が形成される。この足場におけるギャップは、
高忠実度の熱安定性ポリメラーゼ(TaqポリメラーゼおよびPfuポリメラー
ゼの組み合わせもまた十分である)によって充填される。構築の第2期において
、ジンクフィンガーテンプレートは、設計された外部プライマーによって増幅さ
れて、クローニングのためのいずれかの末端で制限部位をシャトルベクターに取
り込むか、または発現ベクターに直接取り込む。
キメラジンクフィンガータンパク質の特定の領域をコードする相補オリゴヌクレ
オチドをアニールすることに基づく。この特定のアプリケーションは、このオリ
ゴヌクレオチドが、最終連結工程の前にリン酸化されることを必要とする。この
ことは、通常、アニーリング反応を設定する前に行われるが、リン酸化(kin
asing)はまた、アニーリング後にも生じ得る。簡潔には、このタンパク質
の定常領域をコードする「普遍」オリゴヌクレオチド(上記のオリゴ1、2およ
び3)は、相補オリゴヌクレオチドとアニールされる。さらに、フィンガー認識
ヘリックスをコードする「特異的」オリゴヌクレオチドは、それらのそれぞれの
相補オリゴヌクレオチドとアニールされる。これらの相補オリゴは、上記のプロ
トコルで以前にポリメラーゼによって充填されている領域を充填するように設計
される。共通のオリゴ1およびフィンガー3に対する相補オリゴは、選択される
ベクターへのクローニングに使用される制限部位に特異的な突出する配列(ov
erhanging sequence)を残すように操作される。第2のアセ
ンブリプロトコルは、以下の局面において開始プロトコルとは異なる:新たに設
計されたZFPをコードする「足場」は、全体的に合成DNAから構成され、そ
れによりポリメラーゼ充填工程を排除し、さらにベクターにクローニングされる
フラグメントは、増幅を必要としない。最後に、残った配列特異的突出(ove
rhang)の設計は、挿入フラグメントの制限酵素消化の必要性を排除する。
グメントは、発現ベクターに連結される。可撓性リンカーおよび第2のDNA結
合ドメイン(必要ならば、ジンクフィンガーポリペプチド)をコードする配列も
またベクターに連結されて、キメラジンクフィンガータンパク質が作製される。
代表的には、この可撓性リンカーは、2つのDNA結合ドメインの間の発現ベク
ターに連結されるオリゴヌクレオチドによってコードされる。第2のDNA結合
ドメインは、上記のように作製され得るか、または当該分野で周知の方法(例え
ば、PCRなど)を使用して、別の供給源からクローニングされ得るか、もしく
は別の供給源から得られ得る。通常利用される発現ベクターとしては、改変され
たpMAL−c2細菌発現ベクター(New England BioLabs
,「NEB」)または真核生物発現ベクターであるpcDNA(Promega
)が挙げられるがこれらに限定されない。
は、(例えば、Kdの決定のために)原核生物または真核生物細胞への形質転換 についての中間ベクターに、複製および/または発現のためにクローニングされ
る。中間ベクターは、代表的には、ジンクフィンガータンパク質またはタンパク
質産物をコードする核酸の保存または操作のための、原核生物ベクター(例えば 、プラスミド)、またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。ジンク
フィンガータンパク質をコードする核酸はまた、代表的には、植物細胞、動物細
胞(好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞)、真菌細胞、細菌細胞、また
は原生動物細胞への投与のための発現ベクターにクローニングされる。
ンガータンパク質は、代表的には、転写を指向するためのプロモーターを含む発
現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌プロモーターおよび真核生物
プロモーターは当該分野で周知であり、そして例えば、Sambrookら、M
olecular Cloning,A Laboratory Manual
(第2版、1989);Kriegler,Gene Transfer an
d Expression:A Laboratory Manual(199
0);およびCurrent Protocols in Molecular
Biology(Ausubelら編、1994)に記載される。ジンクフィ
ンガータンパク質を発現するための細菌発現系は、例えば、E.coli、Ba
cillus sp.、およびSalmonellaにおいて利用可能である(
Palvaら、Gene 22:229−235(1983))。このような発
現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞の
ための真核生物発現系は当該分野で周知であり、そしてまた、市販されている。
ロモーターは、特定のアプリケーションに依存する。例えば、強力な構成プロモ
ーターは、代表的には、ジンクフィンガータンパク質の発現および精製のために
使用される。対照的に、ジンクフィンガータンパク質が、遺伝子調節のためにイ
ンビボで投与される場合、構成プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれか
が使用され、これは、ジンクフィンガータンパク質の特定の使用に依存する。プ
ロモーターはまた、代表的には、トランス活性化に応答するエレメント(例えば 、低酸素応答エレメント、Gal4応答エレメント、lacリプレッサー応答エ
レメント)および低分子制御系(例えば、tet調節系およびRU−486系)
を含み得る(例えば、Gossen&Bujard,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.89:5547(1992);Oliginoら、
Gene Ther.5:491−496(1998);Wangら、Gene
Ther.4:432−441(1997);Neeringら、Blood
88:1147−1155(1996);およびRendahlら、Nat.
Biotechnol.16:757−761(1998)を参照のこと)。
現カセットを含み、これは、宿主細胞(真核生物または原核生物のいずれか)に
おける核酸の発現に必要な全てのさらなるエレメントを含む。従って、代表的な
発現カセットは、例えば、ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸配列、
および例えば、転写物の効果的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部
位、または翻訳終結に必要なシグナルに作動可能に連結されたプロモーターを含
む。このカセットのさらなるエレメントとしては、例えば、エンハンサー、およ
び異種のスプライスされたイントロンシグナル(heterologous s
pliced intronic signal)が挙げられ得る。
ィンガータンパク質の意図された使用(例えば植物、動物、細菌、真菌、原生動
物などにおける発現)に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては
、pBR322に基づくプラスミドの、pSKF、pET23D、および市販の
融合発現系(例えば、GSTおよびLacZ)ようなプラスミドが挙げられる。 好ましい融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質「MBP」である。この
ような融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質の精製のために使用され
る。エピトープタグもまた、発現をモニタリングするため、ならびに細胞および
細胞成分局在化をモニタリングするために、組換えタンパク質に付加されて、単
離の簡便な方法を提供する(例えば、c−mycまたはFLAG)。
核生物発現ベクター(例えば、SV40ベクター、乳頭腫ウイルスベクターおよ びエプスタインバーウイルスに由来するベクター)において使用される。他の例
示的な真核生物ベクターとしては、pMSG,pAV009/A+、pMTO1
0/A+、pMAMneo−5、バキュロウイルスpDSVE、および以下のプ
ロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げ
られる:SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネ
インプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプ
ロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現につ
いての効果を示した他のプロモーター。
ーカー(例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラ
ーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ)を有する。高収率の発現系もまた、適
切である(例えば、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイル
スプロモーターの指示下で配列をコードするジンクフィンガータンパク質ととも
に、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターを使用する)。
て機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗
生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするプラスミ
ドの非必須領域における唯一の制限部位を含む。
細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞を産生し、次いでこれを、標準的な技術を
使用して精製する(例えば、Colleyら、J.Biol.Chem.264
:17619−17622(1989);Guide to Protein
Purification, Methods in Enzymology,
第182巻(Deutscherら、1990)を参照のこと)。真核生物およ
び原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って行われる(例えば、Mor
rison,J.Bact.132:349−351(1977);Clark
−Curtiss&Curtiss,Methods in Enzymolo
gy 101:347−362(Wuら編、1983)を参照のこと)。
され得る。これらの手順としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポ
リブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイク
ロインジェクション、裸のDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター(エ
ピソーム性および統合性の両方)、ならびにクローニングされたゲノムDNA、
cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の
周知の方法のいずれかの使用が挙げられる(例えば、Sambrookら、前出
、を参照のこと)。使用される特定の遺伝子操作手順は、少なくとも1つの遺伝
子を、選択されるタンパク質を発現し得る宿主細胞に首尾良く導入し得ることが
必要であるのみである。
フィンガータンパク質を精製するために使用され得る(Ausubel、前出、
Sambrook、前出、を参照のこと)。さらに、任意の適切な宿主(例えば
、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞など)が使用され得る。
質に融合したジンクフィンガータンパク質(MBP−ジンクフィンガータンパク
質)の発現は、アミロースカラム(NEB)による簡単な精製を可能にする。高
発現レベルのキメラジンクフィンガータンパク質は、IPTGでの誘導によって
得られ得る。なぜなら、pMal−c2発現プラスミドにおけるMBP−ジンク
フィンガータンパク質融合は、IPTG誘導性tacプロモーター(NEB)の
制御下にあるからである。MBP−ジンクフィンガータンパク質融合プラスミド
を含む細菌は、10μM ZnCl2、0.02%グルコースおよび50μg/ mlアンピシリンを含む2×YT培地に播種され、そして37℃にて振盪される
。中期対数増殖期で、IPTGを0.3mMまで添加して、そしてこの培養物を
振盪させる。3時間後、この細菌を遠心分離によって採取し、超音波処理によっ
て破壊し、次いで不溶性物質を遠心分離によって除去する。MBP−ジンクフィ
ンガータンパク質を、アミロース結合樹脂上に捕捉し、20mM Tris−H
Cl(pH7.5)、200mM NaCl、5mM DTTおよび50μM
ZnCl2を含む緩衝液で十分に洗浄し、次いで本質的に同じ緩衝液中でマルト ースを用いて抽出する(精製は、NEBからの標準的なプロトコルに基づく)。
精製したタンパク質を定量し、そして生化学分析のために保存する。
度シフトアッセイ(「EMSA」)によって特徴付けられる(Buratows
ki&Chodosh、Current Protocols in Mole
cular Biology、12.2.1−12.2.7頁(Ausubel
編、1996))。
要に応じて、遺伝子発現の調節のための調節ドメインと結合され得る。このキメ
ラジンクフィンガータンパク質は、1つ以上の調節ドメインと、あるいは2つ以
上の調節ドメインと共有結合され得るかまたは非共有結合され得、この2つ以上
のドメインは、同じドメインの2つのコピーであるか、または2つの異なるドメ
インである。この調節ドメインは、例えば、融合タンパク質の一部としてアミノ
酸リンカーを介して、キメラジンクフィンガータンパク質に共有結合的に連結さ
れ得る。このジンクフィンガータンパク質はまた、非共有二量体化ドメイン(例 えば、ロイシンジッパー、STATタンパク質N末端ドメイン、またはFK50
6結合タンパク質)を介して調節ドメインと結合され得る(例えば、O’She
a,Science 254:539(1991)、Barahmand−Po
urら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.211:1
21−128(1996);Klemmら、Annu.Rev.Immunol
.16:569−592(1998);Klemmら、Annu.Rev.Im
munol.16:569−592(1998);Hoら、Nature 38
2:822−826(1996);およびPomeranzら、Biochem
.37:965(1998)を参照のこと)。この調節ドメインは、任意の適切
な位置でキメラジンクフィンガータンパク質と結合され得、この位置としては、
このキメラジンクフィンガータンパク質のC末端またはN末端が上げられる。
加のための通常の調節ドメインとしては、例えば、以下が挙げられる:転写因子
由来の異種DNA結合ドメイン;転写因子(アクチベーター、リプレッサー、コ
アクチベーター、コリプレッサー)、サイレンサー、核ホルモンレセプター、癌
遺伝子転写因子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、
rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバーなど)由来のエフ
ェクタードメイン;およびクロマチン関連タンパク質およびその変更因子(例え ば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ)。
本の転写に関与するものを含む。このようなポリペプチドとしては、転写因子、
そのエフェクタードメイン、コアクチベーター、サイレンサー、核ホルモンレセ
プターが挙げられる(例えば、転写に関与するタンパク質および核酸エレメント
の概説については、Goodrichら、Cell 84:825−30(19
96)を参照のこと;一般的な転写因子は、Barnes&Adcock,Cl
in.Exp.Allergy 25、補遺 2:46−9(1995)および
Roeder,Methods Enzymol.273:165−71(19
96)に概説される)。転写因子専用のデータベースもまた公知である(例えば
、Science 269:630(1995)を参照のこと)。核ホルモンレ
セプター転写因子は、例えば、Rosenら、J.Med.Chem.38:4
855−74(1995)に記載される。転写因子のC/EBPファミリーは、
Wedelら、Immunobiology 193:171−85(1995
)に概説される。核ホルモンレセプターによって転写調節を媒介するコアクチベ
ーターおよびコリプレッサーは、例えば、Meier,Eur.J.Endoc
rinol.134(2):158−9(1996);Kaiserら、Tre
nds Biochem.Sci.21:342−5(1996);およびUt
leyら、Nature 394:498−502(1998)に概説される。
GATA転写因子(これは、造血の調節に関与する)は、例えば、Simon,
Nat.Genet.11:9−11(1995);Weissら、Exp.H
ematol.23:99−107に記載される。TATAボックス結合タンパ
ク質(TBP)およびその関連するTAFポリペプチド(これは、TAF30、
TAF55、TAF80、TAF110、TAF150、およびTAF250を
含む)は、Goodrich&Tjian,Curr.Opin.Cell B
iol.6:403−9(1994)およびHurley,Curr.Opin
.Struct.Biol.6:69−75(1996)に記載される。転写因
子のSTATファミリーは、例えば、Barahmand−Pourら、Cur
r.Top.Microbiol.Immunol.211:121−8(19
96)に概説される。疾患に関与する転写因子は、Asoら、J.Clin.I
nvest.97:1561−9(1996)に概説される。
インは、転写リプレッサーとして使用される(Thiesenら、New Bi
ologist 2:363−374(1990);Margolinら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:4509−4513(
1994);Pengueら、Nucl.Acids Res.22:2908
−2914(1994);Witzgallら、Proc.Natl.Acad
.Sci.U.S.A.91:4514−4518(1994))。別の実施態
様において、KAP−1(KRABコリプレッサー)は、KRABとともに使用
される(Friedmanら、Genes Dev.10:2067−2078
(1996))。あるいは、KAP−1は、ジンクフィンガータンパク質ともに
単独で使用され得る。転写リプレッサーとして作用する他の好ましい転写因子お
よび転写因子ドメインとしては以下が挙げられる:MAD(例えば、Somme
rら、J.Biol.Chem.273:6632−6642(1998);G
uptaら、Oncogene 16:1149−1159(1998);Qu
evaら、Oncogene 16:967−977(1998);Larss
onら、Oncogene 15:737−748(1997);Lahert
yら、Cell 89:349−356(1997);およびCultraro
ら、Mol Cell.Biol.17:2353−2359(19977)を
参照のこと);FKHR(横紋筋肉腫遺伝子におけるフォークヘッド(fork
head);Ginsbergら、Cancer Res.15:3542−3
546(1998);Epsteinら、Mol.Cell.Biol.18:
4118−4130(1998));EGR−1(初期増殖応答遺伝子産物1;
Yanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:829
8−8303(1998);およびLiuら、Cancer Gene The
r.5:3−28(1998);ets2リプレッサー因子リプレッサードメイ
ン(ERD;Sgourasら、EMBO J.14:4781−4793(1
9095));およびMAD smSIN3相互作用ドメイン(SID;Aye
rら、Mol.Cell.Biol.16:5772−5781(1996))
。
ーターとして使用される(例えば、Hagmannら、J.Virol.71:
5952−5962(1997)を参照のこと)。活性化ドメインを補充し得る
他の好ましい転写因子としては、以下が挙げられる:VP64活性化ドメイン(
Seipelら、EMBO J.11:4961−4968(1996));核
ホルモンレセプター(例えば、Torchiaら、Curr.Opin.Cel
l.Biol.10:373−383(1998);核因子κBのp65サブユ
ニット(Bitko&Barik,J.Virol.72:5610−5618
(1998)およびDoyle&Hunt,Neuroreport 8:29
37−2942(1997));およびEGR−1(初期増殖応答遺伝子産物1
;Yanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:82
98−8303(1998);およびLiuら、Cancer Gene Th
er.5:3−28(1998))。
するほかのタンパク質はまた、キメラジンクフィンガータンパク質のための調節
ドメインとして有用である。このような変更因子は、しばしば、例えばホルモン
によって媒介される転写のスイッチのオンまたはオフに関与する。転写調節に関
与するキナーゼは、Davis,Mol.Reprod.Dev.42:459
−67(1995)、Jacksonら、Adv.Second Messen
ger Phosphoprotein Res.28:279−86(199
3)、およびBoulikas,Crit.Rev.Eukaryot.Gen
e Expr.5:1−77(1995)に概説され、一方、ホスファターゼは
、例えば、Schonthal&Semin,Cancer Biol.6:2
39−48(1995)に概説される。核チロシンキナーゼは、Wang,Tr
ends Biochem.Sci.19:373−6(1994)に記載され
る。
n、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mo
sファミリーメンバー)の遺伝子産物およびそれらの関連因子および変更因子か
ら入手され得る。癌遺伝子は、例えば、Cooper,Oncogenes,第
2版、The Jones and Bartlett Series in
Biology,Boston,MA,Jones and Bartlett
Publishers,1995に記載される。ets転写因子は、Wasl
ylkら、Eur.J.Biochem.211:7−18(1993)および
Crepieuxら、Crit.Rev.Oncog.5:615−38(19
94)に概説される。mys癌遺伝子は、例えば、Ryanら、Biochem
.J.314:713−21(1996)に概説される。junおよびfos転
写因子は、例えば、The Fos and Jun Families of
Transcription Factors,Angel&Herrlic
h編(1994)に記載される。max癌遺伝子は、Hurlinら、Cold
Spring Harb.Symp.Quant.Biol.59:109−
16.に概説される。myb遺伝子ファミリーは、Kanei−Ishiiら、
Curr.Top.Microbiol.Immunol.211:89−98
(1996)に概説される。mosファミリーは、Yewら、Curr.Opi
n.Genet.Dev.3:19−25(1993)に概説される。
ベーターとして使用される(例えば、Jin&Scotto,Mol.Cell
.Biol.18:4377−4384(1998);Wolffe,Scie
nce 272:371−372(1996);Tauntonら、Scien
ce 272:408−411(1996);およびHassigら、Proc
.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:3519−3524(19
98)を参照のこと)。別の実施態様において、ヒストンデアセチラーゼは、転
写リプレッサーとして使用される(例えば、Jin&Scotto,Mol.C
ell.Biol.18:4377−4384(1998);Synticha
ki&Thireos,J.Biol.Chem.273:24414−244
19(1998);Sakaguchiら、Gene Dev.12:2831
−2841(1998);およびMartinezら、J.Biol.Chem
.273:23781−23785(1998)を参照のこと)。
製、発現のモニタリング、または細胞および細胞成分の局在化のモニタリングの
容易さのために、マルトース結合タンパク質(「MBP」)、グルタチオンSト
ランスフェラーゼ(GST)、ヘキサヒスチジン、c−myc、およびFLAG
エピトープのような融合タンパク質として発現される。
特許出願が詳細かつ個々に参照として援用することを示すように、本明細書中で
参考として援用する。
か詳細に記載してきたが、特定の変更および改変が添付の特許請求の範囲の精神
または範囲から逸脱せずになされ得ることは、本発明の教示に照らして、当業者
に容易に明らかである。
、本質的に類似の結果を得るように変更または改変し得る種々の重要ではないパ
ラメーターを容易に認識する。
ィンガー発現プラスミドを、Zif268ペプチドおよび/またはNREペプチ
ドの所望のフィンガーをコードするDNAセグメントのPCR増幅により構築し
た。これらのDNAセグメントを、以下のオリゴヌクレオチド二重鎖を、pcD
NA3(Invitrogen)のHindIII部位およびXbaI部位にサ
ブクローニングすることにより構築されたpCSのHindIII部位およびB
amHI部位に挿入した:
aines,Protein Sci.2:348〜356(1993);Ki
mおよびRaines,i.219:165〜166(1995))およびSV
40ラージT抗原からの核局在化シグナル(Kalderonら,Cell 3
9:499〜509(1984))の両方を有するジンクフィンガーペプチドを
作製するために設計した。レポータープラスミドを、QuikChangeTM
キット(Stratagene)を用いて部位指向性変異誘発により構築した。
変異誘発のためのテンプレートプラスミド(pGL3−TATA/Inr)の構
築は、以前に記載されている(KimおよびPabo,J.Biol.Chem
.272:29795〜29800(1997))。全ての構築物のDNA配列
を、ジデオキシ配列決定により確認した。
EのペプチドをコードするDNAセグメントを、PCRにより増幅し、そしてp
GEX−6P−3(Pharmacia)にサブクローニングした。このジンク
フィンガータンパク質を、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融
合物としてE.coli中に発現し、そして製造業者のプロトコールに従ってア
フィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。これらの構築物は、Sペプ
チドタグもSV40核局在化シグナルも有さなかった。GSTを、引き続き、P
reScissionTMプロテアーゼ(Pharmacia)での消化により
除去した。タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを用いるSDSポ
リアクリルアミドゲル電気泳動を用いることにより評価した(Pomerant
zら,Science 267:93〜96(1995))。活性なジンクフィ
ンガータンパク質の濃度を、記載のように(RebarおよびPabo,Sci
ence 263:671〜673(1994))本質的に決定した。これらの
2つの方法は、匹敵する結果を与え、これはタンパク質のほとんど全てが活性で
あったことを示した。
bis−TrisプロパンpH7.0、100mMのNaCl、5mMのMgC
l2、20mMのZnSO4、10%のグリセロール、0.1%のNonidet
P40、5mMのDTT、および0.10mg/mLのウシ血清アルブミンの
溶液中に適切なジンクフィンガーペプチドおよび結合部位を含んだ。全ての結合
実験を、室温で実施した。結合部位のDNA配列は以下である:
において用いられる標識DNAを、クレノウ伸長またはキナーゼ反応により調製
した。
希釈を、1時間、室温で標識化プローブDNA(0.4〜1.4pM)とインキ
ュベートした。次いで、この反応混合物をゲル電気泳動に供した。放射活性シグ
ナルをphosphorimager分析により定量した;明確な解離定数を、
記載された(RebarおよびPabo,Science 263:671〜6
73(1994))ように決定した。
定した。on−rate定数を決定する場合、結合反応を開始するために、標識
したプローブDNA(最終濃度、約0.4pM)を室温でジンクフィンガーペプ
チド(最終濃度、5〜10pM)に添加し、そしてアリコートを種種の時点(0
〜20分)でゲル電気泳動により分析した。時間tでの結合した割合をゲルのp
hosphorimager分析により決定した。次いでこのデータを以下の式
に適合した(KaleidaGraphTMプログラム(Synergy Sof
tware): F=Ffinal[1−exp(−kobs×t)] ここで、Fは、時間tでの結合した割合であり、Ffinalは、反応終了時点に結 合した、計算した割合であり;そしてkobsは、速度定数である(Hoopes ら、J.Biol.Chem.267:11539〜11547(1992))
。on−rate定数を以下の式から計算した: kon=(Ffinal×kobs)/[P] ここで、[P]は、ジンクフィンガータンパク質の濃度である。off−rat
e定数を、記載されたように本質的に決定した(Kimら、Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 94:3616〜3620(1997))。タン
パク質(最終濃度、100pM)を標識化プローブDNAと1時間プレインキュ
ベートし、次いで、大過剰の非標識化プローブDNA(最終濃度、20nM)を
添加した。アリコートを種々の時点で取り出し、そしてゲル電気泳動により分析
した。標識部位の割合を、1時間のプレインキュベーション期間の終わりに見出
された割合に対して正規化した。正規化された、結合した割合の自然対数を時間
に対してプロットし、そしてoff−rateを傾きから決定した。速いon−
rateおよびoff−rate測定のための全てのデータポイントを電気泳動
の所用時間について補正した。
々の量(0、0.05、0.5、5、および50nM)の非放射性の競合DNA
と1時間インキュベートし、次いで標識したN/Z部位(6〜8pM)を添加し
た。サンプルを2、24、48、96、190および600時間後にゲル電気泳
動により分析した。速度比(Kdc/Kd)を以下の式から算出した: kdc/Kd={[C]/[P]t}×(Fo×F)/(Fo−F)(1−F) ここで、kdcは、競合DNAへの結合に関する解離定数であり;Kdは、インタ クトなキメラ部位に対する結合に関する解離定数であり;[C]は、競合DNA
の濃度であり;[P]tは、タンパク質の総濃度であり;F0は、競合DNAの非
存在下にいて、結合された割合であり、そしてFは、競合DNAの存在下で結合
された割合である。この式は、遊離のタンパク質の濃度がDNAに結合するタン
パク質の濃度より有意に小さいと仮定する。この基準は、N/Z部位での268
//NREペプチドのKdが3.8fMであり、そして5pMの融合ペプチドが
これらの競合実験に用いられるので、容易に満たされるはずである。
プチド(200pM)、標識化N/Z部位およびわずかな過剰モルの非標識N/
Z部位を含んだ。種々の量のサケ精子DNAを添加し、そしてサンプルをインキ
ュベーション2、24および48時間後、ゲル電気泳動により分析した。速度比
を算出する場合、サケ精子DNAのそれぞれの塩基が可能性のある(非特定の)
結合部位の開始を示すと仮定した。
epekら、Genes Dev.10:2079〜2088(1996))よ
うにグリセリンショックを用いるリン酸カルシウム沈降によりトランスフェクシ
ョンした。トランスフェクション実験は、代表的に細胞を単層培養(6ウェルプ
レート)で、10〜30%コンフルエンシーで用い、そして以下のプラスミドを
添加した:0.2mgの発現が空のプラスミド(pCS)またはジンクフィンガ
ーペプチドをコードする発現プラスミド;0.2mgのレポータープラスミド;
1mgの活性化因子プラスミド(GAL4−VP16);0.1mgのβ−ガラ
クトシダーゼ発現プラスミド(pCMVb;Clontech);および2.5
mgのキャリアプラスミド(pUC19)。トランスフェクトされた細胞におけ
るルシフェラーゼ活性およびβガラクトシダーゼ活性を記載された(Kimら,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3616〜3620(
1997);KimおよびPabo,J.Biol.Chem.272:297
95〜29800(1997))ように測定した。293細胞において発現され
た全てのジンクフィンガーペプチドを、S.TagTMRapid Assayキ
ット(Novagen)(KimおよびRaines,Protein Sci
.2:348〜356(1993);KimおよびRaines,Anal.B
iochem.219:165〜166(1995))を用いることにより定量
した。
導入を回避するため接合部位でより長い(正準でない)リンカーを用いる、2つ
の3フィンガーペプチドの結合を含む。フィンガー間の妨害または衝突のいずれ
の危険性をさらに減じるため、このリンカーを設計し、そのためそれらは、個々
の9bpの結合部位間に挿入された1または2のさらなる塩基対を有する複合性
の結合部位と適合し得た。本明細書において報告した研究は、核のホルモン応答
エレメントの部分(5’−AAG GGT TCA−3’;配列番号9)(Gr
eismanおよびPabo,Science 275:657〜661(19
97))に対して強固にそして特異的に結合する、3フィンガーZif268ペ
プチド(これは、5’−GCG TGG GCG−3’部位;配列番号8を認識
する)および3フィンガー「NRE」ペプチド(ファージディスプレイを介して
以前に選択されたZif268改変体)を用いた。中心に1つのさらなる塩基対
を有する複合性の標的部位は、配列5’−AAG GGT TCA G GCG
TGG GCG−3’(配列番号10)を有し、そしてN/Z部位と呼ばれる
(Nは、NREペプチドについての結合部位を意味し、そしてZは、Zif26
8についての結合部位を意味する)。中心にさらなる2つの塩基対を有する部位
は、配列5’−AAG GGT TCA GT GCG TGG GCG−3’
(配列番号11)を有し、そしてN//Z部位と呼ばれる。
ichおよびPabo,Science 252:809〜817(1991)
;Elrod−Ericksonら,Structure 4:1171〜11
80(1996)は、それぞれの結合部位を認識し得るポリフィンガータンパク
質を作製するための適切な長さのリンカーを決定するために用いられた(図1お
よび2を参照のこと)。N/Z部位で、最初のペプチドのαらせん末端のLeu
と次のペプチドの最初のβシートのTyr残基との間に8残基を有することが十
分な可撓性を可能にするようであった。正準な「TGEKP」リンカーは、この
領域に4残基(すなわち、Gly−Glu−Lys−Pro)を有する。N/Z
部位では、LeuとTyrとの間に11残基を用いることが合理的であるようで
あった(図1A)。それぞれのリンカー(図1A)は、3フィンガーZif26
8ペプチドのN末端およびC末端に天然に隣接する配列を含んだ。さらなる可撓
性を可能にするため、グリシンを、より短いリンカー(正準リンカーよりなお4
残基長い)に含め、そしてGly−Gly−Gly−Ser配列を、より長いリ
ンカー(正準リンカーより7残基長い)に含めた。結合部位の表記法に類似する
表記法を用いて、より短いリンカーを有する融合タンパク質を、268/NRE
と表示し、そしてより長いリンカーを有する融合タンパク質を268//NRE
と表記する。
トをアッセイする。Zif268、NREおよび268//NREジンクフィン
ガーペプチドを発現し、そしてE.coliから精製し、そしていくつかのセッ
トのゲルシフト実験に用いた。実験の予備的なセットを、簡便に設計し、2つの
3フィンガータンパク質が隣接9bp部位で結合し得るか否かを決定した(未結
合のペプチドの結合における任意の妨害は、複合性の部位についてポリフィンガ
ータンパク質のアフィニティーを減じ得る)。最初の実験は、直接並列されるN
RE結合部位およびZif268結合部位を有するDNAフラグメント(NZ部
位と呼ばれる)を用いた(5’−AAG GGT TCA GCG TGG G
CG−3’;配列番号12)。種々の量のNREペプチドをZif268の存在
下または非存在下で標識化NE部位とインキュベートした(図3)。3フィンガ
ーNREペプチドは、実際に、遊離の部位に対してよりも、事前結合したZif
268を有するVZ部位に対してわずかにより強固に結合する。NREペプチド
の明確な解離定数(Kd)は、それが単独で結合する場合180pMであるが、
Zif268が隣接部位に事前結合する場合、60pMである。同様の結果がN
/Z部位で得られた。これらの実験は、隣接部位で結合したペプチド間に衝突が
存在しないことを証明し、そしてある程度、穏やかな協同性の効果があり得さえ
することを示唆する。ポリフィンガータンパク質のアフィニティーにおける以前
の制限(Rebar(博士号論文),Selection Studies o
f Zinc Finger−DNA Recognition,Massac
husetts Institute of Technology(1997
);Shi,(博士号論文)、Molecular Mechanisms o
f Zinc Finger Protein−Nucleic Acid I
nteractions,Johns Hopkins University
(1995);Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9
4:5525〜5530(1997))は、リンカー設計の問題に起因するよう
である。
定は、268//NREペプチドが個々の9bp部位についてよりも複合性部位
について有意により高いアフィニティーを有することを示す(表1)。この融合
タンパク質は、その結合部位についてNREペプチド(180pM)およびZi
f268ペプチド(14pM)のKdSと類似のKdSを有する単離された9bp
部位と結合する。対照的に、268//NRE融合タンパク質は、複合性部位に
非常に強固に結合するので、解離定数が小さ過ぎ、タンパク質滴定によって容易
に決定できない。少なくとも0.4pMの標識化プローブDNAがこれらのゲル
シフト実験において必要であり、これは<1pMのKd値を正確に測定すること
を困難にした。これらの技術が困難と仮定して、268//NREペプチドの結
合についてon−rateおよびoff−rateを測定すること、および平衡
結合定数(表1)を推定するためにこれらのrateを用いることを決定した。
3フィンガーペプチドを用いる並行する研究は、有用なコントロールを与えた。
268//NRE、NREおよびZif268のペプチドについてのon−ra
teは、速く、そして拡散制御限界(108〜109M−1s−1)に近かった
(von HippelおよびBerg,I.264:675〜678(198
9))。このoff−rateは、大きな差異を示した:3フィンガーペプチド
は、<39秒の半減期を有し、一方、268//NREペプチドは、NZ部位で
370次間の半減期を有する。コントロール研究は、268//NREペプチド
が単一の9bp部位を有する、より不安定な複合体を形成することを示す(従っ
て、N部位で、半減期=150秒)。NREフィンガーおよびZif268フィ
ンガーの両方は、NZ部位で268//NREペプチドで観察される異常に安定
な複合体を形成するように、そのそれぞれ9bpの部分部位に結合するに違いな
い。
を用いることにおける確実性を示した。計算は、268//NREペプチドがN
z部位で2.1×10-15M(2.1fM)、N/Z部位で3.7fM、そしてN
//Z部位で3.0fMのKdを有する複合性の結合部位に対するフェムトモル 濃度のアフィニティーを有することを示す(これらの3つのKdsの一貫性はまた
心強い、なぜなら、より長い可撓性のリンカーがこれらの任意の間隔と容易に適
合させるはずであると予期されるからである)。このデータは、新しいリンカー
設計がかなり有効であることを示す:268//NRE融合ペプチドは、個々の
9bpの部位に対してよりも複合性部位に対してはるかに強固に(5,000〜
95,000倍)結合し、そして本来の3フィンガーペプチドのいずれよりもは
るかに強固に(6,000〜90,000倍)結合する。
よび特異性をさらに研究するために用いた(図4A)。直接、9bpのN部位お
よびZ部位が融合ペプチドに対する結合について複合性N/Z部位とどの程度十
分に競合し得るかを実験の1セットで試験した。これらの実験では、種々の量の
非放射活性のN部位またはZ部位を、268//NREペプチドの限界量と混合
した。インキュベーションの1時間後、わずかに過剰モル(融合タンパク質の総
量に比べて)の標識したN/Z部位を添加した。これらの条件下で、約70%の
標識化DNAが、競合DNAの非存在下でシフトされる。種々の時間点で採取し
たサンプルをゲル電気泳動により分析した。この実験における268//NRE
ペプチドの濃度(5pM)は、N/Z部位についてのペプチドの解離定数より数
オーダーの規模で高いので、ほとんどすべてのペプチドは、競合DNAが添加さ
れない場合、N/Z部位に結合する。競合DNAの存在下でのシフトしたN/Z
部位の量の低下は、競合する部位に対する268//NREペプチドの結合を反
映する。
ク質の安定性は、実際、重大な懸念となる(複合性部位は、最後に添加され、そ
して平衡には、長時間かかる。なぜなら、融合タンパク質は、それが最初に標識
したN/Z部位に衝突する前に、数百回または数千回、非放射活性のZ部位に衝
突し得るからである)。高濃度の非放射活性のN部位またはZ部位での事前平衡
の後、シフトしたN/Z標識の画分が約600時間までインキュベーション時間
を徐々に増加させるにつれて、安定性を増加することが決定された。600時間
のインキュベーション後、標識化N/Z部位の有意な画分が、非放射活性のN部
位またはZ部位の10,000倍モル過剰の存在下でさえシフトされる。特異性
比(上記のように算出した)は、268//NREペプチドが少なくとも3,8
00+1,600の率でN部位より複合性部位を優先し、そして融合ペプチドが
少なくとも320+44の率でZ部位よりも複合性部位を優先することを示す。
これらの実験は、6フィンガーペプチドの顕著な特異性を直接確認するが、これ
らの値は、特異性比にごく低くしか拘束されない。このタンパク質サンプルは、
これらの実験に必要とされる長いインキュベーション時間の間に、ある程度の活
性を失う(遊離のタンパク質の活性は、これらの条件下で約2日の半減期を有す
る)、そして変性したタンパク質は、標識したN/Z部位をシフトする機会を決
して有さない。
的/非特異的結合定数の比を推測するために用いた(図4B)。これらの実験は
、268/NREペプチドが非特異的なDNAに対して非常に効率的に識別し、
そして8.8+1.5×106の特異性比(kdns/kd)を示すことを示した。 3フィンガーZif268ペプチドを用いる並行する実験は、1.2+0.1×
105の特異性比を示す。競合物としてウシ胸腺DNA、およびわずかに異なる 条件を用いる以前の研究は、Zif268ペプチドについて0.31×105の 特異性比を示した(GreismanおよびPabo,Science 275
:657〜661(1997))。同時に得た、6フィンガー268//NRE
融合ペプチドのアフィニティーおよび特異性についてのデータは、それが非常に
有効なリプレッサーとして働き得ることを示唆し、そして、それがインビボにお
けるさらなる分析のための優れた候補物であることを確かに示した。
リフィンガーペプチドがレポーター遺伝子からの転写を効果的に抑制し得るか否
かを理解するために用いた。以前の研究では、Zif268ペプチドが、Zif
268ペプチドがTATAボックスまたは開始エレメント近接部位に結合する場
合、基礎の転写およびVP−16活性化転写の両方を効果的に抑制し得ることが
示されている(KimおよびPabo,J.Biol.Chem.272:29
795〜29800(1997))。本試験では、適切な結合部位(Z、N、N
/ZおよびN//Z)が開始エレメント近接の匹敵する位置に組み込まれたルシ
フェラーゼレポーターおよび類似のプロモーター構築物が用いられた(図1B)
。
化転写の72倍の抑制を、およびN//Z部位を含むプロモーターで47倍の抑
制を示すことが決定された(図5A〜5D)。268/NREペプチドは、N/
Z部位で68倍の抑制を示す。明らかに、これらの融合ペプチドは、適切な間隔
を有する部位で非常に有効なリプレッサーである。3フィンガーペプチドを用い
る並行実験は、抑制を示すが、それらが融合ペプチドよりもかなり有効性が低い
ことを示す。従って、NREペプチドは、以下を示す:プロモーター内のN部位
で1.9倍抑制;N/Z部位で1.8倍抑制;N//Z部位で2.7倍抑制;そ
して単離されたZ部位では抑制なし。Zif268ペプチドは、以下を示す:Z
プロモーターから13倍抑制;N/Zプロモーターから8.9倍抑制;N//Z
プロモーターから15倍抑制;そして単離されたN部位では抑制なし。さらなる
実験は、N/Z部位で融合タンパク質で得られたかなり高い抑制レベルを達成す
るために共有結合が必要であることを証明する。
チドを(同時トランスフェクションアッセイにおいて両方の発現プラスミドを含
むことにより)同時発現することは、N/Z部位で単離されたZif268ペプ
チドを有する場合に得られた8.9倍抑制に匹敵する(実験誤差内)レベルであ
る、N/Z部位でのわずか8.5倍の抑制を示す。これは、268/NRE融合
タンパク質および268//NRE融合タンパク質がN/Z部位で示す68倍お
よび72倍の抑制よりかなり低く、そしてこれらの「相乗的な」効果は共有結合
を必要とすることが明白である。
に結合し得る場合でさえ、ある程度の穏やかな抑制的効果を有し得ることは注目
される。従って、6フィンガーペプチド(268/NREおよび268//NR
E)は、Zプロモーターから21〜23倍の抑制を示す。同様の(22倍)抑制
レベルがN//Z部位で268/NREペプチドで得られる。モデリングは、リ
ンカーがこの部位ですべての6フィンガーの特異的結合を可能にするには短すぎ
ることを示唆する。これらの抑制レベルは、Z部位で単離されたZif268ペ
プチドで観察されるレベルより、一貫して、いくらか高い(13倍抑制)。(2
68//NREペプチドがZ部位に結合する場合)、以下の可能性がある:1)
NREフィンガーが自由であり、そしてさらに転写複合体のアセンブリを立体的
に妨害しないか、または2)NREフィンガーがDNAと弱い非特異的な接触を
形成し、これにより複合体の安定性をわずかに増強する。さらなる研究は、すべ
てのペプチドが匹敵するレベルで発現されることを示す。
グを有し、そしてペプチドの量は、S−タンパク質での活性化後、リボヌクレア
ーゼアッセイを用いることにより定量された(KimおよびRaines,Pr
otein Sci.2:348〜356(1993);KimおよびRain
es,Anal.Biochem.219:165〜166(1995))。控
えめな推測で、細胞におけるペプチドの発現レベルは、3フィンガーペプチドの
解離定数より有意に高い(少なくとも100倍)ことを示す。268/NREお
よび268//NREペプチドの4フィンガー改変体および5フィンガー改変体
をコードするプラスミドもまた構築した。これらを組織培養トランスフェクショ
ン研究において試験し、そしてそれらは、代表的に、3フィンガーペプチドで観
察されたレベルと6フィンガーペプチドで観察されたレベルとの中間の抑制レベ
ルを示した(図5A〜5D)。
設計を示す。Zif268−DNA複合体およびテンプレートB−DNA(連結
で使用)の共結晶構造を、ホスフェートを重ね合わせることによって整列した(
PavletichおよびPabo、Science 252:809〜817
(1991);Elrod−Ericksonら、Structure 4:1
171〜1180(1996))。このモデルにおいて、2個の3フィンガーペ
プチドは、2bpのギャップ(灰色で示される塩基)により分離された対応する
9bp部位(白で示される塩基)に結合する。この下巻き(underwoun
d)DNAの1つのヘリックスターンが11bpを含むので、一方の3フィンガ
ーペプチドの配向は、他方の3フィンガーペプチドの配向にほとんど正確に適合
することに留意すること。
ェクション研究において使用されるレポーター構築物の模式的な描写である。図
2Aは、ジンクフィンガーのペプチドを示す。各フィンガーを丸で表す。Zif
268ペプチド中のリンカーのアミノ酸配列(これは、規範的な「TGEKP」
リンカーを有する)を示し、そして3フィンガーペプチドを接続するために使用
されるより長いリンカーを以下に示す。各々の場合において、左のボックスは、
ヘリックス領域を示し、そしてフィンガーの第2の保存されたHis残基を含む
:ジグザグ線は、次のフィンガーの第1のβシートを示し、これは、第1の保存
されたCys残基を含む。図2Bは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のプロモ
ーターを例示する。TATAボックス、開始コドン、およびジンクフィンガー結
合部位のヌクレオチド位置を、転写開始部位(+1)について番号付けする。
1nM、および1nM)のNREペプチドを、遊離結合部位(レーン1〜4)で
、または0.5時間0.1nMのZif268ペプチドと予めインキュベートし
た結合部位(レーン5〜8)とともに1時間インキュベートした。遊離DNAお
よびタンパク質−DNA複合体の位置を示す。
5pM)を、種々の量(0.05nM、0.5nM、5nMおよび50nM)の
コールド競合物DNA(レーン3〜14)と1時間予めインキュベートし、次い
で、わずかにモル過剰(ペプチド濃度を超える)の標識したN/Z部位(608
pM)を、反応混合物に添加した。アリコートを、種々の時点でゲル電気泳動に
より分析した。そしてこのゲルは、室温で600時間のインキュベーション時間
後に結果を示す。図4Bにおいて、268//NRE(レーン2〜6)またはZ
if268ペプチド(レーン7〜11)を、標識したN/Z部位と混合し、わず
かにモル過剰(ペプチド濃度を超える)の標識していないN/Z部位を添加し(
その結果、70%の標識した部位が、サケ精子DNAの非存在下で移動される)
、そして種々の量のサケ精子DNA(0μg/ml、0.1μg/ml、1μg
/ml、10μg/ml、および100μg/ml)を含んだ。インキュベーシ
ョンの24時間後、ゲル電気泳動によってサンプルを分析した。
グラフ(図5A、図5B、図5C、および図5D)を示す。リン酸カルシウム沈
澱法を使用して、記載(Cepekら、Genes Dev.10:2079〜
2088(1996))されるようにヒト293細胞をトランスフェクトした。
ルシフェラーゼ活性およびβガラクトシダーゼ活性を、48時間後に測定した。
ルシフェラーゼ活性を対応するβガラクトシダーゼで除算し、相対的なルシフェ
ラーゼ活性を得た。抑制レベル(倍数の抑制)を、1)空の発現プラスミドを用
いてトランスフェクトした細胞からの相対的なルシフェラーゼ活性を、2)ジン
クフィンガー発現プラスミドを用いてトランスフェクトした細胞からの相対的な
ルシフェラーゼ活性により除算することによって得た。異なるレポーターに対す
るグラフにおいて、異なる目盛りを使用する。68/NR、68/NRE、およ
び68//NR、および68//NREペプチドは、1個または2個の末端フィ
ンガーを欠く、6つのフィンガーを有する融合タンパク質の改変体である。従っ
て、68/NRペプチドは、NREペプチドのフィンガー1およびフィンガー2
に融合した(2つのリンカーの短い方を介して)Zif268ペプチドのフィン
ガー2およびフィンガー3を含む。このデータは、3つの独立した実験の平均を
表し、そして平均の標準誤差を示す。
Claims (58)
- 【請求項1】 近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパ
ク質を作製する方法であって、以下: (i)該キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインポリ
ペプチドおよび第2のDNA結合ドメインポリペプチドを選択する工程であって
、ここで該ドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み
、そして該第1のドメインが第1の標的部位に結合し、そして該第2のドメイン
が第2の標的部位に結合し、ここで標的部位が隣接している、工程; (ii)該第1のドメインおよび該第2のドメインが、該第1の標的部位およ
び該第2の標的部位に個々に結合される場合、該第1のドメインと該第2のドメ
インとの間の物理的分離を決定するために、構造に基づく設計を使用する工程; (iii)該第1のドメインと該第2のドメインとの間の物理的分離よりも少
なくとも1〜2Å長い可撓性リンカーを選択する工程;および (iv)該可撓性リンカーと該第1のドメインおよび該第2のドメインとを融
合する工程であって、それによって近接した標的部位に結合するキメラジンクフ
ィンガータンパク質を作製する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項2】 前記可撓性リンカーが少なくとも5個のアミノ酸長である、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記可撓性リンカーが少なくとも8個のアミノ酸長である、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 前記可撓性リンカーがアミノ酸配列RQKDGERPを有す
る、請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 前記可撓性リンカーが少なくとも11個のアミノ酸長である
、請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 前記可撓性リンカーがアミノ酸配列RQKDGGGSERP
を有する、請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 前記近接した標的部位が少なくとも1個のヌクレオチドによ
り分離される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 前記近接した標的部位が少なくとも2個のヌクレオチドによ
り分離される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 前記第1のドメインおよび前記第2のドメインがジンクフィ
ンガーのポリペプチドである、請求項1に記載の方法。 - 【請求項10】 前記ジンクフィンガーのポリペプチドが、Zif268お
よびNREからなる群から選択される、請求項9に記載の方法。 - 【請求項11】 前記ジンクフィンガーのポリペプチドが異種である、請求
項9に記載の方法。 - 【請求項12】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標
的部位に対してフェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項9に記載の
方法。 - 【請求項13】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標
的部位に対して約2〜4フェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項1
2に記載の方法。 - 【請求項14】 前記第1のドメインがジンクフィンガーポリペプチドであ
り、そして前記第2のドメインが異種DNA結合ドメインのポリペプチドを含む
、請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が調節ドメインの
ポリペプチドをさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項16】 近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータン
パク質を作製する方法であって、以下: (i)該キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインポリ
ペプチドおよび第2のDNA結合ドメインポリペプチドを選択する工程であって
、ここで該ドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み
、ここで該第1のドメインが第1の標的部位に結合し、そして該第2のドメイン
が第2の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、工程; (ii)5個以上のアミノ酸長である可撓性リンカーを選択する工程;ならび
に (iv)該可撓性リンカーと該第1のドメインおよび該第2のドメインとを融
合する工程であって、それによって近接した標的部位に結合するキメラジンクフ
ィンガータンパク質を作製する工程、 を含む、方法。 - 【請求項17】 前記近接した標的部位が、0個のヌクレオチドにより分離
され、そして前記可撓性リンカーが5個または6個のアミノ酸長である、請求項
16に記載の方法。 - 【請求項18】 前記近接した標的部位が1個のヌクレオチドにより分離さ
れ、そして前記可撓性リンカーが7個、8個、または9個のアミノ酸長である、
請求項16に記載の方法。 - 【請求項19】 前記可撓性リンカーがアミノ酸配列RQKDGERPを有
する、請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 前記近接した標的部位が2個のヌクレオチドにより分離さ
れ、そして前記可撓性リンカーが10個、11個、または12個のアミノ酸長で
ある、請求項16に記載の方法。 - 【請求項21】 前記可撓性リンカーがアミノ酸配列RQKDGGGSER
Pを有する、請求項20に記載の方法。 - 【請求項22】 前記近接した標的部位が3個のヌクレオチドにより分離さ
れ、そして前記可撓性リンカーが12個以上のアミノ酸長である、請求項16に
記載の方法。 - 【請求項23】 前記第1のドメインおよび前記第2のドメインがジンクフ
ィンガーのポリペプチドである、請求項16に記載の方法。 - 【請求項24】 前記ジンクフィンガーのポリペプチドがZif268およ
びNREからなる群から選択される、請求項23に記載の方法。 - 【請求項25】 前記ジンクフィンガーのポリペプチドが異種である、請求
項23に記載の方法。 - 【請求項26】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標
的部位に対してフェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項23に記載
の方法。 - 【請求項27】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標
的部位に対して約2〜4フェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項2
5に記載の方法。 - 【請求項28】 前記第1のドメインがジンクフィンガーのポリペプチドで
あり、そして前記第2のドメインが異種DNA結合ドメインポリペプチドを含む
、請求項16に記載の方法。 - 【請求項29】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が調節ドメインの
ポリペプチドをさらに含む、請求項16に記載の方法。 - 【請求項30】 近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータン
パク質であって、該キメラジンクフィンガータンパク質が、以下: (i)該キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポ
リペプチドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチドであって、ここで該
ドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、ここで該
第1のドメインが第1の標的部位に結合し、該第2のドメインが第2の標的部位
に結合し、ここで標的部位が近接している、キメラジンクフィンガータンパク質
の第1のDNA結合ドメインのポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメインの
ポリペプチド;ならびに (ii)該第1のドメインと該第2のドメインが該第1の標的部位および該第
2の標的部位に個々に結合される場合に、構造に基づくモデリングにより決定さ
れるように、該第1のドメインと該第2のドメインとの間の物理的分離よりも少
なくとも1〜2Å長い可撓性リンカー; を含み、 ここで該第1のドメインおよび該第2のドメインが該可撓性リンカーと融合さ
れる、タンパク質。 - 【請求項31】 前記可撓性リンカーが少なくとも5個のアミノ酸長である
、請求項30に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項32】 前記可撓性リンカーが少なくとも8個のアミノ酸長である
、請求項30に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項33】 前記リンカーがアミノ酸配列RQKDGERPを有する、
請求項32に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項34】 前記可撓性リンカーが少なくとも11個のアミノ酸長であ
る、請求項30に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項35】 前記リンカーがアミノ酸配列RQKDGGGSERPを有
する、請求項34に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項36】 前記第1のドメインおよび前記第2のドメインがジンクフ
ィンガーのポリペプチドである、請求項30に記載のキメラジンクフィンガータ
ンパク質。 - 【請求項37】 前記ジンクフィンガーのポリペプチドがZif268およ
びNREからなる群から選択される、請求項36に記載のキメラジンクフィンガ
ータンパク質。 - 【請求項38】 前記ジンクフィンガーのポリペプチドが異種である、請求
項36に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項39】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標
的部位に対してフェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項36に記載
のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項40】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標
的部位に対して約2〜4フェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項3
9に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項41】 前記第1のドメインがジンクフィンガーのポリペプチドで
あり、そして前記第2のドメインが異種DNA結合ドメインのポリペプチドを含
む、請求項30に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項42】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が調節ドメインの
ポリペプチドをさらに含む、請求項30に記載のキメラジンクフィンガータンパ
ク質。 - 【請求項43】 請求項30に記載のキメラジンクフィンガータンパク質を
コードする単離された核酸。 - 【請求項44】 近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータン
パク質であって、ここで該キメラジンクフィンガータンパク質が、以下: (i)該キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポ
リペプチドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチドであって、ここで該
ドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、ここで該
第1のドメインが第1の標的部位に結合し、そして該第2のドメインが第2の標
的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、キメラジンクフィンガータン
パク質の第1のDNA結合ドメインのポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメ
インのポリペプチド;ならびに (ii)5個または6個のアミノ酸長である可撓性リンカー; を含み、 ここで該第1のドメインおよび該第2のドメインが可撓性リンカーに融合され
る、タンパク質。 - 【請求項45】 前記近接した標的部位が0個のヌクレオチドにより分離さ
れ、そして前記可撓性部位が5個または6個のアミノ酸長である、請求項44に
記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項46】 前記近接した部位が1個のヌクレオチドにより分離され、
そして前記可撓性リンカーが7個、8個、または9個のアミノ酸長である、請求
項44に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項47】 前記可撓性リンカーがアミノ酸配列RQKDGERPを有
する、請求項46に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項48】 前記近接した標的部位が2個のヌクレオチドにより分離さ
れ、そして前記可撓性リンカーが10個、11個、または12個のアミノ酸長で
ある、請求項44に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項49】 前記可撓性リンカーがアミノ酸配列RQKDGGGSER
Pを有する、請求項48に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項50】 前記近接した標的部位が3個のヌクレオチドにより分離さ
れ、そして前記可撓性リンカーが12個以上のアミノ酸長である、請求項44に
記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項51】 前記第1のドメインおよび前記第2のドメインがジンクフ
ィンガーのポリペプチドである、請求項44に記載のキメラジンクフィンガータ
ンパク質。 - 【請求項52】 前記ジンクフィンガーのポリペプチドがZif268およ
びNREからなる群から選択される、請求項51に記載のキメラジンクフィンガ
ータンパク質。 - 【請求項53】 前記ジンクフィンガーのポリペプチドが異種である、請求
項51に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項54】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標
的部位に対してフェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項51に記載
のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項55】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標
的部位に対して約2〜4フェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項5
4に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項56】 前記第1のドメインがジンクフィンガーのポリペプチドで
あり、そして前記第2のドメインが異種DNA結合ドメインのポリペプチドを含
む、請求項44に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。 - 【請求項57】 前記キメラジンクフィンガータンパク質が調節ドメインの
ポリペプチドをさらに含む、請求項44に記載のキメラジンクフィンガータンパ
ク質。 - 【請求項58】 請求項44に記載のキメラジンクフィンガータンパク質を
コードする単離された核酸。
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