JPH06503642A - プロトオンコタンパク質ｃ−ＪＵＮとホルモン受容体との間の機能的拮抗作用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロトオンコタンパク質ｅ−ＪＵＮとホルモン受容体との間の機能的拮抗作用 本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈにより 認可された認証第ＧＭ２６４４４号の下で政府の援助により行われた。政府は本 発明に対して特定の権利を有する。

本発明はステロイドホルモン、ステロイドホルモン様化合物、ステロイドホルモ ン受容体、ステロイドホルモン様受容体、および関連する橿に関する。１つの特 別な面においては、本発明は、ステロイドおよび関連ホルモンが介在するプロセ スに関する。さらに別の面においては、本発明はプロトオンコ遺伝子タンパクＷ ？１合体ＡＰ−１が介在するプロセスに関する。

ｌ胛旦１五 ステロイドおよび関連ホルモンは発育、分化、およびホメｔスタンスの調節に重 要な役割を果たす。ホルモンは、遺伝子転写の直接のモノュレーターである、細 胞内受容体のスーパーファミリーに結合することにより調節効果をもたらす。

ホルモン受容体の突然変異を分析することにより、転写活性化、核の位置確認、 ＤＮＡ結合、およびホルモン結合に係わる機能ドメインが同定されている。

ホルモン受容体は種々の遺伝子転写の活性化および発現の抑制の両方に作用し得 る。このような抑制は、ホルモン受容体が、負のホルモン反応要素と呼ばれるＤ ＮＡ調節配列に結合し、これにより転写アクティベーターを置換することにより 生じると考えられている。

疾患の治療、副作用発生率の少ない治療薬の開発などの目的のために、ホルモン が直接または間接に特定の遺伝子のトランス活性化を活性化する程度、および／ またはホルモンが直接または間接に特定の遺伝子の発現を抑制する程度が制御可 能であれば望ましい。

ＡＰ−１タンパク質複合体は、細胞の成長、分化、および発育という多様な局面 に係わりのあるプロトオンコ遺伝子によりコードされる核タンパク質類の１員で ある。ＡＰ−１結合部位は、ｃ−Ｊｕｎホモダイマーおよびｃ−Ｊｕｎ／ｃ−Ｆ ｏｓヘテロダイマーにより認識される。ｃ−ＦｏｓのＡＰ−１部位への結合はｅ −Ｊｕｎを有するヘテロダイマーの形成に依存する。ホモダイマーおよびヘテロ ダイマーの形成は、ロイシンジノパー（ｚｉｐｐｅｒ）と呼ばれる構造により促 進される非共有結合相互作用に介在される。ＡＰ−１複合体は、いくつかの経路 に正の調節効果を付与することに加えて、いくつかの遺伝子に負の調節を行うこ とも示されている。

現在までのところ、特定のタンパク質の遺伝子調節におよぼす効果は、一般には 、調節される遺伝子のプロモーター領域内でのタンパク質と調節要素との間の相 互作用の結果であると考えられている。従って、１つより多い経路に効果をもた らす化合物は、１つより多い経路に共通する反応要素を認識すると考えられてい る。これに関しては、Ｄｉａｍｏｎｄら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９：　１２６６ −１２７２　（１９９０））が、インビトロにお（１てグルココルチコイド受容 体およびｃ−Ｊ　ｕｎまたはｃ−Ｆｏｓ　（ホルホールエステル活性化ＡＰ−１ 転写因子の構成分子）の両方に選択的に結合する「複合」グルフコルチコイド反 応要素（ＧＲＥ）を使用する研究について述べている。著者らは次に受容体（す なわちグルコフルチコイド受容体）および非受容体因子（すなわちｃ−Ｊｕｎま たはＣ−Ｆｏｓ）の間の相互作用にＤＮＡ結合を必要とする複合体ＧＲＥ作用の 一般的なモデルを提案している。

調節タンパク質が効果を奏するメカニズムを上述のように理解すれば、特定のタ ンパク質の１つの調節効果を変更せずにそのタンパク質の他の調節効果を変更す ることは可能で（よないだろう。従って、ホルモンまたはホルモンアナログの投 与によりもたらされるすべての有益な効果には、望ましくない副作用が起こる、 すなわち望ましくないプロセスの促進および／または所望のプロセスの阻害が起 こる可能性が強ｔＸ０従って、ごれまでは、当該技術分野において他の調節経路 （こ望ましくない影響を与えずに、既知の経路を妨害し得る化合物を探索する方 法には動機づけがなかった。

ｌ吸旦斐１ 本発明によれば、ホルモン受容体および転写因子ＡＰ−１ｆ；！相互に互いの転 写活性化活性を抑制し合うことが発見された。

同様に、ホルモン受容体および転写因子ＡＰ−１は相互に特定の遺伝子の発現を 阻害する互いの能力を脱抑制し得る。これは、ＤＮＡ結合とは独立した新しいメ カニズムにより起こると考えられる。

従って、本発明は、ホルモン反応性の遺伝子産物、および、／またはＡＰ−１反 応性の遺伝子産物の転写活性化を制御する手段を提供する。さらに、本発明は、 細胞の成長を阻害するが、該細胞の分化を促進しない化合物をふるい分ける手段 を提供する。

の　な目 図１は、転写因子ｃ−Ｊｕｎによる、グルココルチコイド受容在する転写誘導の 抑制を示す。

図２は、グルコフルチコイド受容体によるコラゲナーゼプロモーターの抑制を示 す。

図３は、グルココルチコイド受容てよる、ＡＰ−１で誘導されるコラゲナーゼプ ロモーターＣＡＴリポータ−の抑制を示す。

図４は、ＡＰ−１で誘導される発現を抑制しまたグルココルチコイドが介在する 転写を誘導する、グルココチコイド受容体のドメインを決定する遺伝子欠失研究 の結果を要約している。

図５は、ｅ−Ｊｕｎ遺伝子の欠失分析を、グルココルチコイドが介在する転写活 性化を抑制する、様々な欠失突然変異株の能力の表示と共に示す。

図６は、グルココルチコイド受容体のグルココルチコイド反応要素への結合を抑 制するｅ−Ｊ　ｕｎの能力を調べるために行われたゲルレターデーションアッセ イを示す。

図７は、コラゲナーゼプロモーター活性の、ＲＡＲが介在する抑制の抑制を示す 。

図８は、レチン酸受容体−アルファによるコラゲナーゼプロモーターの抑制を示 す。

図９は、コラゲナーゼプロモーターによる、ＡＰ−１で誘導される発現を抑制す るレチン酸受容体のドメインを決定する欠失研究結果を要約している。

図１０は、ｃ−Ｊ　ｕｎのＡＰ−１結合部位への結合を抑制するＲＡＲの能力を 決定するために行われるゲルレターデーションアッセイを示す。

図１１は、ＡＰ−１のＡＰ−１結合部位への結合を抑制するＲＡＲの能力を調べ るために行われるゲルレターデーションアッセイを示す。

日の！　な！Ｕ 本発明によれば、異常細胞の治療に有用な化合物を同定する方法が提供される。

この方法は以下の（ａ）　（ｂ）両方の性質を示す化合物を選択する工程を包含 する：（ａ）化合物が、 （ｉ＞ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体、 （ｉｉ）　Ａｐ−１、および （ｉｉｉ）ＡＰ−１反応性レポーター を発現し得る細胞系を有する第１のアッセイシステムで使用されるとき、ＡＰ− １の機能を妨害する能力を示し；および（ｂ）該化合物が、 （ｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体、および （ｉｔ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様反応性リポータ−５ を発現し得る細胞系を有する第２のアッセイシステムで使用されるとき、ステロ イドホルモン反応またはステロイドホルモン様反応遺伝子の転写活性を促進する 能力を実質的に示さない。

本発明の他の実施態様によれば、ＡＰ−１反応経路を妨害するがステロイドホル モンまたはステロイドホルモン様反応性経路には実質的に効果を及ぼさない化合 物を同定する方法であって、 （ａ＞該化合物のＡＰ−１反応性経路に及ぼす効果を測定する第１のアッセイ／ ステムにおいて該化合物を試験する工程であって、該第１のアッセイシステムは 、 （ｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体、 Ｈｉ）　ＡＰ−１、および （ｉｉｉ）ＡＰ−１反応性レポーター を発現し得る細胞系を有する、工程、および＜ｂ＞該化合物の、ステロイドホル モンまたはステロイドホルモン様反応性遺伝子の転写活性化に及ぼす効果を測定 する第２のアッセイ／ステムにおいて該化合物を試験する工程であって、該第２ のアッセイシステムは、 （ｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体、および （２）ステロイドホルモン反応性またはステロイドホルモン様反応性リポータ− １ を発現し得る細胞系を有する、工程、およびその後、（ａ＞の試験では阻害効果 を有し、また（ｂ）の試験で（よ実質的に効果を有しないこれらの化合物を選択 する工程を包含する方法が提供される。

本発明のさらに別の実施態様によれば、発現系；こお（１て、ステロイドホルモ ン反応性またはステロイドホルモン様反応性遺伝子の転写活性化をステロイドホ ルモンまた（まステロイドホルモン様化合物により抑制する方法であって、該ス テロイドホルモン反応性またはステロイドホルモン様反応性遺伝子の発現を抑制 するのに効果的なＡＰ−１発現を誘導する化合物および／または状態に、該系を 曝す工程を包含する方法が提供される。

本発明のこの実施態様において使用される発現系１ま、ステロイドホルモンまた はステロイドホルモン様イし合物（こ反応し、同時にｃ−Ｊｕｎ、　ｃ−Ｆｏｓ 、またはＡＰ−１の存在には実質的に反応しないことが望ましい。

本発明のさらに別の実施態様によれば、発現系において、ステロイドホルモン反 応性またはステロイドホルモン様反応性遺伝子の転写活性化をステロイドホルモ ンまたはステロイドホルモン様化合物、またはそれらのアナログにより抑制する 方法であって、 ｃ−Ｊ　ｕｎのロイシンジノパー領域またはその機能的アナログを含有するペプ チドを、該ステロイドホルモン反応性またはステロイドホルモン様反応性遺伝子 の発現を抑制するのに有効な量で該系に投与する工程を包含する方法が提供され る。

本発明のこの実施態様に関しては、本発明のこの実施態様で使用される発現系が 、ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様化合物に反応し、同時にｃ− Ｊｕｎ、　ｃ−Ｆｏｓ、またはＡＰ−１の存在には実質的に反応しないことが望 ましい。

本発明のさらに別の実施態様によれば、発現系において、ＡＰ−１反応性遺伝子 の転写活性化をＡＰ−１またはそのアナログにより抑制する方法であって、 （１）ステロイドホルモン受容体またはステロイドホルモン様受容体、またはそ のアナログの機能的なりガント結合ドメイン、および （ｉｉ）ステロイドまたはステロイド状受容体またはそれらのアナログの機能的 なりＮＡ結合ドメイン、を含有する組成物を、該ＡＰ−１反応性遺伝子の発現を 抑制するのに有効な量で該系に投与する工程を包含する方法が提供される。

本発明のこの実施態様で使用される発現系は、ｃ−Ｊｕｎ、　ｅ−ＦＯＳ、また はＡＰ−１には反応するが、ステロイドホルモン、またはステロイドホルモン様 化合物の存在には実質的に反応しないことが望ましい。

本発明のさらに別の実施態様によれば、ステロイドホルモン、またはステロイド ホルモン様化合物、またはそれらのアナログの存在下で、ステロイドホルモン受 容体、ステロイドホルモン様受容体、またはそれらのアナログによる負に調節さ れる遺伝子からの遺伝子産物の発現の抑制を克服する方法であって、 該遺伝子産物の発現の抑制を抑圧するのに有効な量で、ＡＰ＝１発現を誘導する 化合物および／または状態に該系を曝す工程を包含する方法が提供される。

本発明のさらに別の実施態様によれば、ステロイドホルモン受容体またはステロ イドホルモン様受容体、またはそれらのアナログの存在下で、ステロイドホルモ ン、ステロイドホルモン様化合物、またはそれらのアナログによるリン、ｆ球系 細胞の増殖および機能の阻害を克服する方法であって、該リンパ球系細胞の増殖 および機能の阻害を抑圧するのに有効な、ＡＰ−１発現を誘導する化合物および ／または状態に該系を曝す工程を包含する方法が提供される。

本発明のさらに別の実施態様によれば、ステロイドホルモンまたはステロイドホ ルモン様受容体と共に第１複合体を形成する化合物であって、該第１複合体は、 ＡＰ−１の存在下で、ＡＰ−１の機能を妨害し、また該第１？１合体は、ステロ イドホルモンまたはステロイドホルモン様反応性遺伝子の転写活性化を実質的に 促進し得ない、化合物が提供される。

ホルモンが介在する転写活性化が多くのホルモンで解明されている。そして、い くつかのホルモンで、この活性化のモードは多くの異なる。遺伝子に作用し得る 。この転写活性化を調節することが望ましい場合がある。本発明によれば、これ はＡＰ−１発現を誘導する化合物および／または状態に系を曝すことにより、ま たはホルモン反応性の遺伝子産物の発現を抑制する有効量で、ｃ−Ｊｕｎのロイ シンジノバー領域を有するペプチドまたはそのアナログをこの系に投与すること により、実現され得る。

ＡＰ−１の発現を誘導し得る化合物としては、腫瘍形成（例えば、ホルボールエ ステル）、成長因子（例えば、ＥＧＦ、　ＦＧＦ、　Ｃ５Ｆ）、サイトカイン（ 例えば、ＩＬ＝１、ＩＬ−２）、神経ペプチド（例えば、ソマトスタチン）、神 経伝達物質（例えば、アセチルコリン）、プロティンキナーゼＣ（および、プロ ティンキナーゼＣを誘導し得る化合物、例えば、ＥＧＦ、インシュリン、血小板 由来成長因子、アルファー１アンドロナージノク（ａｎｄｒｏｎｅｒｇｉｃ）剤 、ＩＬ−１、ＩＬ−２など）などを誘導する化合物を含む。

ＡＰ−１の発現を誘導し得る条件としては、系を紫外線照射、ガンマ線照射、ヒ ートショック、ストレスなどに曝すことが含まれる。

あるいは、本発明の方法は、内因性（または外因性’）　ＡＰ−１の発現を誘導 する代わりに、有効量のｃ−Ｊｕｎロインンジノパー領域を系に投与することに より実行され得る。この構成分子を含有するペプチドの投与は、例えば、所望の 構成分子を含有する精製または部分精製ペプチド組成物を直接導入、ロイノンジ ノバー領域をフードする遺伝子構築物の発現を誘導するなど多様な方法で実行さ れ得る。

ロイノンジソバ−６頁域はアルファへリノクスにそれ自身を据える少くとも２９ 個のアミノ酸のフラグメントである。ここでアミノ酸鎖の各７番目のアミノ酸が ロイノンであり、このため、１つのアルファへリソクスのロイシン残基は、第２ のアルファへリノクス、例えば別のｃ−Ｊｕｎ部分くこれによりホモダイマーを 産生ずる）、ｅ−Ｆｏｓ部分（これによりヘテロダイマーを産生ずる）などのロ イシン残基と嵌合し得る。

ｃ−Ｊ　ｕｎロイ／ンジ、バー領域を有するタンパク質の、発現系に存在するス テロイドホルモン受容体のモル量に対するモル比は大幅に変動し得る。一般的に 、約０５から１００：１の範囲の比率が有効である。好ましくは、ＡＰ−１構成 分子（またはその誘導体）のステロイドホルモン受容体に対する比率は約１から ２０．１の範囲であり、現時点で最も好適なモル比は約５から１５．１の範囲で ある。

本発明の本実施例で使用されるステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様 反応性遺伝子としては、グルココルチコイド反応性遺伝子、レチン酸反応性遺伝 子、ビタミンＤ３反応性遺伝子、甲状腺ホルモン反応性遺伝子、鉱質コルチコイ ド反応性遺伝子、エストロゲン反応性遺伝子、エストロゲン関連ホルモン反応性 遺伝子、アンドロゲン反応性遺伝子、黄体ホルモン反応性遺伝子、レチノイド（ ｒｅｔ　１ｎｏｉｄ）反応性遺伝子、アリール炭化水素反応性遺伝子などが含ま れる。

ホルモンで誘導される転写活性化を調節する本発明の方法は、疾患を示す患者を 治療するために使用され得る。このような治療を受け得る疾患としては、神経性 食欲不振、アルコール中毒症、重度の欝病、慢性ストレス症候群（これら疾患は グルココルチコイドが異常に高レベルであることにより免疫系が抑圧されること に関連する）などが含まれる。

ホルモンはまた、特定のプロセスに負の調節を行うことも知られている。この負 の調節を調節することが望まれることがある。本発明によれば、これは、系をＡ Ｐ−１発現を誘導する化合物および／または状態に曝すことにより、または遺伝 子産物の発現のホルモンで介在される抑制を抑圧するのに有効な量で、ｃ−Ｊｕ ｎのロイシンジノバー領域またはそのアナログを含有するペプチドをこの系に投 与することにより実行され得る。

ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様化合物により負の調節が行われ る遺伝子としては、プロオピオメラノコルチン遺伝子、プロラクチン遺伝子、プ ロリフニリン遺伝子、絨毛性ゴナドトロピンアルファサブユニ、ト遺伝子、ホス ホエノールピルビン酸カルボキシナーゼ遺伝子、および／またはフラーゲナーゼ 遺伝子が含まれる。

またＡＰ−１が介在する転写活性化が数多くの遺伝子産物に対して解明されてい る。この転写活性化を調節することが望まれることがある。本発明によれば、こ れは、（ｉ　）　Ｒ能的ステロイドホルモン受容体またはステロイドホルモン様 受容体リガンド結合ドメイン、またはそのアナログ、および （ｉｉ）遺伝子産物の発現を抑制するのに有効な量の、機能的なステロイドホル モン受容体またはステロイドホルモン様受容体ＤＮＡ結合ドメイン、またはその アナログを含有する組成物を、ＡＰ−１反応性の系に投与することにより実現さ れ得る。

本発明の本実施例で使用される組成物は、リガンド結合ドメインおよびＤＮＡ結 合ドメインの両方を含有する単一タンパク質として、または各々が所望の機能の １つを提供する２つの個別のタンパク質として投与され得る。現時点では、取扱 が容易なため、２つの所望の機能を単一のタンパク質の一部として提供すること が好適である。

本発明の本実施！ｌ！様で使用される組成物が１つのタンパク貫挿として投与さ れるかまたは２つのタンパク貫挿として投与されるかに関係なく、組成物は多様 な方法で調節される系に導入され得る。例えば、精製または部分精製タンパク質 を系に直接投与し得る。あるいは、所望のタンパク質をコードする発現ベクター をこのような産物を発現するために誘導し得る。

リガンド結合ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを含有する組成物の、発現系に 存在するＡＰ−１に対するモル比は大幅に変動し得る。一般的に、約０．５から １００：１の範囲の比率が有効である。好ましくは、組成物のＡＰ−１に対する 比率は約１から２ｏ：１の範囲であり、現時点で最も好適なモル比は約５から１ ５：１の範囲である。

本発明の方法は、例えば、ＡＰ−１により刺激される疾患を治療するために、多 様な方法で使用され得る。このような疾患としては腫瘍形成（例えば、リンパ腫 ）、関節炎、喘息、アレルギー、発疹などが含まれる。

本発明の実施において使用が予想されるホルモン受容体には、例えば、グルココ ルチコイド受容体、レチン酸受容体、ビタミンＤ３受容体、甲状腺受容体、鉱質 コルチコイド受容体、エストロゲン受容体、エストロゲン関連受容体、レチノイ ド受容体、アンドロゲン受容体、黄体ホルモン受容体、アリール炭化水素受容体 などのような細胞内ステロイド受容体が含まれる。現時点で好適な受容体として は、グルココルチコイド受容体、甲状腺受容体、鉱質コルチコイド受容体、エス トロゲン受容体、エストロゲン関連受容体、レチノイド受容体、アンドロゲン受 容体、および黄体ホルモン受容体がある。本発明の実施において使用される現時 点で最も好適な受容体はグルココルチコイド受容体である。これは、この受容体 が特に十分に特徴づけされているためである。

本発明の１つの実施管機によれば、異常細胞を治療するのに有用な化合物は、Ａ Ｐ−１の機能を妨害するがステロイドホルモン反応性遺伝子の転写活性化は促進 しないという２つの基準を満たす化合物をめてスクリーニングすることにより同 定され得る。

ＡＰ−１の機能を妨害する試験化合物の能力を評価する便利な手段は、ステロイ ドホルモン受容体、ＡＰ−１、およびＡＰ−１反応性リポータ−を発現し得る細 胞系を有するアッセイシステムでこの試験化合物を使用することである。内因性 受容体、ＡＰ−１、およびＡＰ−１反応性リポータ−を発現する細胞、または上 記の１つ以上の外因性の供給源を有する細胞を使用し得る。

この目的のために使用する好適な細胞は、ＡＰ−１反応性リポータ−と結合する ［ホルモン反応性要素」を有しない細胞である。

化合物がＡＰ−１経路の機能を妨害するのに有効である場合は、ＡＰ−１反応性 リポータ−（従来の方法により容易に測定し得る遺伝子産物）は発現しない。反 対に、化合物がＡＰ−１反応性経路を妨害しない場合は、ＡＰ−１反応性リポー タ−が発現し、容易に測定し得る。

ステロイドホルモン反応性遺伝子の転写活性化を促進する（または促進しない） 試験化合物の能力を評価する都合のよい手段は、ホルモン受容体およびホルモン 反応性リポータ−を発現し得る細胞系を有するアッセイシステムにおいてその試 験化合物を使用することである。内因性ステロイドホルモン受容体および／また はステロイドホルモン反応性リポータ−を発現する細胞が使用され得る。あるい は、ステロイドホルモン受容体および／またはステロイドホルモン反応性受容体 を持つトランスフェクトされた細胞が使用され得る。試験化合物が転写活性化を 促進する場合は、ステロイドホルモン反応性リポータ−は発現し、また容易に測 定し得る。反対に、試験化合物が転写活性化を促進しない場合は、ステロイドホ ルモン反応性リポータ−は発現しない。

次に本発明を以下の制限されない実施例によりさらに詳しく説明する。

支患廻 本明細書に記載される実施例で使用される実験の手順を以下に示す。

９　えプラスミド コラ−ゲナーゼ−ＣＡＴ構築物およびプラスミド（ＡＰ−１）Ｓ−ＴＫＣＡＴに ついてはＡｎｇｅｌらにより述べられている（Ｍｏ、Ｃ、Ｂ’。

１、、１：２２５６−２２６６　（１９Ｂ？＞参照）。

組換えＧＲ突然変異株についてはＨｏ　ｌ　ｆｅｎ　ｂｅｒ　ｇらにより述べら れている（Ｃｅｌｌ、　４９：３９−４６　（１９８７）およびＣｅ１ｌ　５５ ：　８９９−９０６（１９８８）、ＧｉｇｕｅｒｅらＮａｔｕｒｅ　３３０：６ ２４−６２９　（１９８７）、ならびにＬｌｍｏｓｏｎｏおよびＥｖａｎｓ、　 Ｃｅ１ｌ　Ｓ７：１１３９−１１４６　（１９８９）参照）。

ＲＡＲ突然変異株ＲＡＲａΔ１−８０は、ＧＲ１３のＮｏｔ　Ｉ−’ｌａｗ旧断 片をＲＡＲＮｘの断片に置換することにより生成した（　Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ およびＥｖａｎｓ、　Ｃｅ１ｌ　８６：８９９−９０６　（１９８ｇ）参照）。

突然変異株ＲＡＲａΔＮ×は、ＲＡＲＩＺＮＸのＮｏｔｌ−Ｘｈｏｌ断片をＮｏ ｔｌ−Ｘｈｏｌ制限酵素部位を含有する合成オリゴヌクレオチドに置換す名こと により生成した。

組換えマウスｃ−Ｊｕｎ構築物はＬａｍｐｈらのＮａｔｕｒｅ　３３４：　６２ ９−６３１　（１９８８）およびＲａｎ５ｏｎｅらにより述べられている（Ｇｅ ｎｅｓ　ａｎｄＤｅｖｅｌ、３ニア７０−７８１　（１９８９）およびＰｒｏｃ 、　Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ−Ａ、　８７：　３８０６−３ ８１０　（１９９０）参照）。マウスｃ−Ｊｕｎ　（Ｌａｍｐｈら、上述）のア ミノ酸２８２から３３４をコードするＤＮＡ配列をポリメラーゼ鎖反応で増幅し 、ひき続＜　ｐＲＳ発現ベクター（Ｇｉｇｕｅｒｅら、Ｃｅ１ｌ　４６：６４５ −６５２　（１９８６＞）にある、ＳＶ４０核転座信号（ＫａｌｄｅｒＯｎら、 廁且３９：　４９９−５０９　（１９８４））の下流との結合により、構築物５ ＶＴＬＺＪｕｎを形成した。配列はＴａｂｏｅおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：４７ ６７−４７７１　（１９８７）により確認した。

トランスフェクションおよびリポータ−のアッセイプラスミドＤＮＡのＨｅＬａ 、　Ｎ！）１３Ｔ３、またはＣＶ−１細胞へのトランスフェクションは、Ｇｏｒ ｍａｎら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｊｏｌ、　２：１０４４−１０５１　（１ ９８２）に記載された襟章リン酸カルシウム共沈法を用い、これにＳｃｈ；ｌｅ Ｉ：）、　Ｎａｔｕｒｅ　３３２：８７−９０　（１９８８＞に記載された僅か な改変を加えて行った。細胞は１０％のウシ血清（ＢＣＳ）を添加したＤＭＥＭ 培地で維持した。トランスフェクションの２４時間前に、１００ｍｍ皿当り７に １０５個の細胞を、１０％の活性炭処理したウシ血清（ＢＣＳ）を添加しフェノ ールレッドを含まないＤＭＥＭにて平板培養した。典型的には、２μｇのリポー タ−プラスミドおよび２μｇのＲＡＳ−β−ガラクト／ダーゼ（効率的なトラン スフェクン目ンのための内部対照）発現ベクター（ＵｍｅｓｏｎｏおよびＥｖａ ｎｓ、上述）を使用した。別の発現構築物の同時トランスフェクションは各実施 例で示す。トランスフェクトされたＤＮＡの全量はｐ［１ｃ１１１で常に２０Ｐ ｇに調整した。細胞を沈澱物に１６−２０時間曝した。特に指示のない限り、細 胞は、１０％の活性炭処理したＢＣＳおよび１０−７Ｍ　ＤＥＸ　（または１０ −６Ｍ　ＲＡ）を添加したフェノールレッドを含まないＤＭＥＭで扱われた。Ｃ ｏ１−ＣＡＴリポータ−構築物のＴＰＡ誘導に対しては、ＨｅＬａ細胞は、０． ５％の活性炭処理したＢＣＳを添加したフェノールレッドを含まないＤＭＥＭで 扱い、同時に１１００ｎ／＋＊ｌのＴＰＡおよび１０−７Ｍ　ＤＥＸでインキュ ベートした。

タンパク　−ＤｆｌＡＡアッセイ 新しくインビトロ翻訳されたタンパク質３μｌを結合緩衝液［１０＋ａＭ　ＨＥ ＰＥＳ、ｐＨ７，８／　４　ａ＋Ｍ　ＭｇＣｌ２／　ｏ、　ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ ／　４　ｍＭススペルミジン２ｍＭジチオスレイトール、１００μｇ／＋＊ｌの ウシ血ｌ青アルブミン、’ｔμｇ／ｍｌのポリ（ｄ　１−ｄＣ）／１５％（ｖｏ ｌ／ｖｏｌ）グリセロール］にて水上で１０分間、予めインキュベートした。続 いて、２μｇの３２Ｐ−ラベルされたオリゴヌクレオチドプローブ（４ｘｌＯ’ ｄｐｍ）を反応混合物に添加した。競合アッセイとして、様々な量のバクテリア により発現したＧＲ，ＲＡＲα、または形質転換されていないバクテリアＢＬ− ２１溶解物をＪｕｎタンパク質と同時に添加した。Ｊｕｎタンパク質はインビト ロにおいて翻訳するか、またはＨｅＬａ細胞抽出物から得た。氷上でさらに１５ 分間インキュベートした後、タンパク質−ＤＮＡｆｆ１合体を４５ｍＭトリス／ ３２．３ｍＭホウ酸／　１．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，３にて４％のＰＡＧ Ｅにより分析した。

次に乾燥ゲルをＫｏｄａｋ　ＸＡＲフィルムを使用して一７０°Ｃで増強スクリ ーンに曝した。

１　：　ＪｕｎはＧＲが　る　を　」 ｃ−ＪｕｎおよびＧＲ発現プラスミドをＮＩＨ３Ｔ３細胞に同時トランスフェク トして、アッセイによりｃ−ＪｕｎがＧＲＥ２−ＴＫＣＡＴリポータ−プラスミ ドＪＳｃｈｉｉｌｅら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２：１４１８−１４２０　（１９ ８８）］のＧＲが介在する活性化を阻害し得るかどうかをアッセイした。

この実験ではＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した。これは、これらが内因性ＧＲを含有 し、飢餓によりＡＰ−１μ合体の残量のみを発現するためである。図１に示すよ うに、合成グルココルチコイドデキサメタシンの添加により、ＧＲはリポータ− 活性を強力に誘導した。

一定量のＧＲプラスミド発現および変動量のｃ−Ｊ　ｕｎ発現プラスミド、ΔＪ ｕｎ、　ｃ−Ｊｕｎをコードする配列を欠く構築物およびΔＲＫＪｕｎ、　ｃ− Ｊｕｎ　ＤＮＡ結合ドメインを欠く構築物により同時トランスフェクションを実 行し、そして実験に含まれた。図１では、細胞はＤＥＸにより未処理のもの（黒 棒）または処理されたもの（斜線捧）として示される。図に示した数字は同時ト ランスフェクトされたプラスミドＤＮＡのｇ数を示す。図ＩＡに示すように、合 成グルココルチコイドデキサメタシン（ＤＥＸ）の添加によりＧＲはリポータ− 活性を強力に誘導したく図ＩＡ。

レーン１）。ｃ−Ｊ　ｕｎ発現プラスミドの量を増加する同時トランスフェクシ ョンは、濃度に依存してホルモンで誘導されるリポータ−活性を阻害した（図Ｉ Ａ、レーン１を２−５と比較）。これに対して、ｃ−Ｊ　ｕｎをコードする配列 を欠く親プラスミドΔＪｕｎのトランスフェクションはＧＲＥ２−ＴＫＣＡＴの 活性を変えなかった（図ＩＡ、レーン７）。ＧＲＥ２−ＴＫＣＡＴリポータ−は 内因性ＡＰ−１部位を欠いているため、阻害はｃ−Ｊｕｎ（７）ＤＮＡへの結合 を必要とするようにはみえない。これは、機能的ＤＮＡ結合ドメインを欠く突然 変異体ΔＲＫＪｕｎにより確証されたく図ＩＡ、レーン６）。この突然変異体は 、野生型ｃ−Ｊｕｎタンパク質の抑制に類似したレベルの抑制を示した（図ＩＡ 、レーン５と６を比較）。ＧＲＥを欠く対照プラスミドＴＫＣＡＴの発現はホル モン処理またはｃ−Ｊ　ｕｎの過剰発現のいずれにも影響を受けなかった。ｃ− Ｊｕｎはまた、Ｎ１）１３Ｔ３細胞中に存在する内因性ＧＲによりＧＲＥ２−Ｔ ＫＣＡＴのホルモン依存性活性化を抑制した（図ＩＢ、レーン１と２とを比較） 。

ｃ−Ｊｕｎが介在する発現が特定のＧＲＥまたはプロモーター配列に特異的では ないことをさらに示すために、マウス哺乳類腫瘍ウィルスプロモーター中にパリ ンドロームＧＲＥを含有するΔ！ＩＩＧＲＥ、−ＣＡＴリポータ−プラスミド（ Ｔｈｏ＋ｎｐｓｏｎおよびＦ、ＶａｎＳｓ　Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８６：３４９４−３４９８　（１９８９）） をＮ１＋１３７３細胞にトランスフェクトした。ＤＥＸのな％ｚ　（黒棒）まｔ こ（ま存在下（斜線棒）でのＮＩＨ３Ｔ３細胞中のＧＲＥ２−ＴＫＣＡＴ、ΔＭ ＧＲＥ、−ＣＡＴ、および対照プラスミドΔＭ−ＣＡＴの転写活性化を図ＩＢｉ こ示す。転写活性化はＮＩＨ３Ｔ３細胞（レーン１−２）また（±０．５μｇの ＯＲ発現プラスミド（レーン３−６）によりトランスフェクトされた細胞中に存 在する内因性受容体活性で分析した。ここでは（＋）５μｇの（−Ｊｕｎ発現プ ラスミドｈ９同時トランスフェクトされた。Ｎ１）１３Ｔ３細胞を低血清（０５ ％）１こて培養した。コノ構築物の活性はホルモンの存在下でＧＲζこより効率 的（こ誘導され（図ＩＢ、レーン３）、またｃ−Ｊｕｎの過剰発現ζこより抑制 １されり（図ＩＢ、レーン４）。十ルモン処理およびｃ−Ｊｕｎの過ｆ！ＩＩ発 現のいずれも対照プラスミドΔＭ−ＣＡＴの活性を著しく変えることはなかった （図１Ｂ、レーン５および６）。

（以下余白） ｍ　コラゲナーゼＡＰ−１゜　はＤＥＸ　にパ・　で　る本実施例では、ＯＲが ＡＰ−１反応性プロモーターの誘導を阻害する能力を試験した。ＡＰ−１誘導可 能リポータ−構築物（ＡＰ−１）ｓ−ＴＫＣＡＴを、低濃度（０，５％）の血清 中で培養したＧＲ陰性ＣＶ−１細胞にトランスフェクトされた（図２Ａ）。図２ Ａは、ＯＲ発現プラスミドまたはＧＲコード配列が欠失している親ベクターへＧ Ｈのいずれかと、Ｊｕｎ／Ｆｏｓ発現プラスミドとで同時トランスフェクトした 無処理（黒塗り棒）またはＤＥＸ処理した（斜線棒）、ＣＶ−１細胞中テノリポ ーター構築物（ＡＰ−１）ｓ−ＴＫＣＡＴ、　および対照プラスミドＴＫＣＡＴ の活性を要約したものである。ＣＶ−を細胞を既製１ｉ（０，５％）の血清中で 培養した。このプロモーターは高い基礎活性を有しているが、Ｊｕｎ／Ｆｏｓ発 現ベクターの同時トランスフェクシジンによりさらに刺激される（図２Ａ、レー ン２）。ＤＥＸおよびＧＲの存在により、この誘導は強力に阻害されるが（レー ン２）、一方ＧＲコード配列が欠失した対照プラスミド△ＧＲはＤＥＸの存在中 でのＪｕｎ／Ｆｏｓ誘導に効果がない（レーン３）。ＴＫＣＡＴ対照（レーン４ および５）で示したように、誘導はＡＰ−１部位の存在に依存し、これらの部位 が存在しなければ、グルココルチコイドのみでは効果がない。

コラゲナーゼプロモーターは、ＧＲによる細胞遺伝子の潜在的な調節を試験する 機会を提供した。この遺伝子を選択した理由は、グルココルチコイドがその発現 を負に調節することが示されたからである（　Ｂｒ１ｎｃｋｅｒｈｏｆｆら、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　２５：６３７ｇ−６３８４（１９８ｇ）参照）。Ｊｕｎ ／ＡＰ−１およびＪｕｎ／ＡＰ−１経路を刺激する因子がその活性を正に誘導す ることが公知である一方、種々のコラゲナーゼプロモーター−ＣＡＴリポータ− プラスミドが）ｌｅＬａまたはＣ’／−１細胞にそれぞれにトランスフェクトさ れた。

Ｈｅ　Ｌ　ａおよびＣＶ−１細胞を用いた理由は、コラゲナーゼが両方の細胞系 中に発現するからである（Ａｎｇｅｌら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　 ７：２２５６−２２６６　（１９８７））。さらに、ＨｅＬａ細胞は内因性のＧ Ｒ活性を発現する。図２Ｂは、ＤＥＸが存在していない（黒塗り棒）または存在 している（斜線棒）状態で１０％血清中で培養したＨ　ｅ　Ｌ　ａ細胞中の種々 のフラゲナーゼプロモーターーＣＡＴ欠失突然変異体および異種のリポータ−の 転写活性を示している。図中、”ＴＫ”はチミジンキナーゼ−ＣＡＴ構築物を示 し；　−（ＡＰ−１）５ＴＫ−はＴＫ−ＣＡＴの前にあるコラゲナーゼＡＰ−１ 部位の５つの複写を包含する構築物を示し；また△ＭＧＲＥｐ−はＤＭＣＡＴに クローンされたコンセンサスＧｌ？Ｅを包含する構築物を示す。図２Ｂ（レーン １−３）に示すように、ＤＥＸを１ｌｅＬａ細胞に添加すると、１２００Ｃｏｌ −ＣＡＴおよび７３　Ｃｏ１−ＣＡＴリポータ−活性がそれぞれ４−５倍に抑制 されたが、リポータ−プラスミド６３　Ｃｏ１−ＣＡＴの活性は変化しなかった 。これらの結果は、抑制がコラゲナーゼプロモーター中の一７３位および一６３ 位の間に位置するＤＮＡ配列に介在されていることを示している。この領域はＡ Ｐ−１？１合体によって認識されるＴＰＡ−誘導可能なエノハンサーを含有して いることが示された。ＤＥＸ反応性リポータ−△ＭＧＲＥ、−ＣＡＴはホルモン に依ａして活性化されたが、このことはコラゲナーゼプロモーターまたは異種リ ポータ−の抑制がＡＰ−１部位の存在に依存していることを示している（図２Ｂ 、レーン６）。

抑制は細胞型特異的でないことを示すために、ＧＲ発現ベクターをＣｏｔ−ＣＡ Ｔリポータ−プラスミドと共にＧＲ−陰性Ｃ’／−１細胞に同時トランスフェク トした。図２Ｃは、ＯＲ発現プラスミドまたは対照プラスミド（△ＧＲ）のいず れかと同時トランスフェクトしたコラゲナーゼプロモーター欠失突然変異体およ び△ＭＧＲＥ、−ＣＡＴのＣＶ−１細胞中での転写活性を示す。細胞はＤＥＸが 存在していない（黒塗り棒）または存在している（斜線棒）状態で、１０％血清 中で培養した。図２Ｃのレーン１は、ＧＲに対するコード配列が欠失している親 プラスミドとトランスフェクトしたＣｖ−１細胞へＤＥＸを添加してもＣｏ１− ＣＡＴ活性は変わらなかったことを示している。対照的に、受容体の存在中では 、１２０１）　Ｃｏ１−ＣＡＴおよび７３　Ｃｏｔ−Ｃａｔはホルモンに依存し て強力に抑制されたが（図２０、レーン２−３）、Ｉｉ３　Ｃａ１−ＣＡＴは活 性されたＧＲの影響を僅かに受けたに過ぎなかった（図２Ｃ、レーン４）。

ＧＲおよびＪｕｎ／ＡＰ−１の間の相互作用をさらに調べるために、Ｃａ１−Ｃ ＡＴリポータ−活性を、ＴＰＡで処理するか、あるいはＪｕｎおよびＦｏｓタン パク質を過剰発現させることにより増強させた。

コラゲナーゼ−ＣＡＴ欠失突然変異体の発現を、未処理ＨｅＬａ細胞中でＴＰＡ 、　ＤＥＸのいずれか、またはその両方を組み合わせたものを用いてインキュベ ートして測定した。コラゲナーゼ−ＣＡＴ欠失突然変異体の転写活性を、ＯＲ発 現プラスミド、ＧＲコード配列が欠失している親ベクター△ＧＲ，またはＪ　ｕ ｎ／Ｆｏｓ発現ブラスミドのいずれかと同時トランスフェクトしたＣＶ−１細胞 を、処理していない（黒塗り棒）またはＤＥＸ処理して（斜線棒）、測定した。

ＨｅＬａおよびＣＶ−を細胞の両方を低濃度（０，５％）の血清中で培養した。

図３Ａに示すように、低濃度（０，５％）の血清中で培養したＨｅＬａ細胞にＴ ＰＡを添加すると、１２００　Ｃｏ１−ＣＡＴ活性は大幅に上昇した（レーン１ および３を比較）。この誘導はＤＥＸ添加による内因性ＧＲ受容体で刺激するこ とによりかなり減少したく図３Ａ、レーン４）。６３　Ｃａ１−ＣＡＴの発現は いずれの処理によっても僅かに影響を受けたに過ぎなかった（図３Ａ、し７５　 ８　）　ｏ　１２００　Ｃｏ１−ＣＡＴの発現は、Ｊｕｎ／Ｆｏｓ発現プラスミ ドを、低濃度（０，５％）の血清中で培養したＣＶ−１細胞に同時トランスフェ クトすることにより高められ得る（図３８゜レーン２）。これらの誘導レベルは ＤＥＸ活性化ＧＲによって効果的に抑制されたく図３Ｂ、レーン１および２を比 較）。ＧＲコード配列が欠失している親プラスミド△ＧＲを用いると、抑制は見 られなかった（図３８．　レーン３）。ホルモン処理、およびＪｕｎ／Ｆｏｓの 過剰発現のいずれも対照プラスミド６３　Ｃｏ１−ＣＡＴの活性を有意に変えな かった（図３Ｂ、レーン４および５）。

図２および３に示すデータはコラゲナーゼプロモーター、およびＴＫリポータ− の活性化および抑制の両方が、ＡＰ−１部位の転写活性の存在に依存することを 示している。ＡＰ−１部位はコラゲナーゼ遺伝子プロモーターの主要なエンノ・ ンサーであり、（ＡＰ−１）５−ＴＫＣＡＴの唯一のエンハンサ−である。従っ て、グルココルチコイドはＡＰ−１反応性遺伝子の一般的調節剤とじて機能し得 る。

ｍ　ＧＲＤＮＡ　ΔドメインはＪｕｎＡＰ−１゛　のに八　で　るが　でない 上記実験はＪｕｎ／ＡＰ−１活性がホルモンに依存してＧＲによって効果的に抑 制され得ることを示している。抑制に関与する受容体の領域を明確にするため、 ＣＶ−１細胞での同時トランスフェクションして、いくつかのＧＲ突然変異体の 、１２００　Ｃｏ１−ＣＡＴリポータ−活性を抑制する能力を分析した。図４に 、予めＧＲ突然変異体を転写活性、核局在性、ＤＮＡ結合、およびリガンド結合 で特徴付けたＧＲ突然変異体を、１２００　Ｃｏ１−ＣＡＴリポータ−活性の抑 制、またはＭＴＶ−ＣＡＴリポータ−の活性化能力についてアッセイした。野生 型受容体は２つの活性ドメイン（γｌおよびγ２）、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮ Ａ）、およびリガンド結合ドメイン（リガンド）からなる。図４で、突然変異体 を記載した上の目盛りはアミノ酸位置数を示すものである。欠失したアミノ酸は 左側に示す。いくつかの突然変異体では、ＧＲＤＮＡ結合ドメインはＧＡＬ４　 （ＧｇａｌＧ）、ＴＩ？　（ＧＴＧ）、またはＲＡＲ（ＧＲＧ）のＤＮＡ結合ド メインに置き換えられている。組換え突然変異体ＲＧＲはＧＲＤＮＡ結合ドメイ ンと、ＲＡＲアミノ末端およびカルずキ／末端から構成される。突然変異体ＧＴ Ｇ　３Ａは、ＧＲＤＮＡ結合ドメインのＰ−ボックス中に３つの点突然変異（Ｅ Ｇ−Ｇ）を含有する。野生型ＧＲを用いて得た１２００　Ｃｏ１−ＣＡＴリポー タ−活性の抑制を１００％に設定した。全ての突然変異体はウェスタンプロット 分析でアッセイしたように同量で細胞中に発現した。１３−１７行に示すハイブ リッド受容体はホルモンに依存して同種の反応要素を活性化する。はとんどのア ミン末端欠失突然変異体はグルココルチコイドが介在する抑制が減少した（図４ 、レーンｌをレーン２−５と比較）。興味深いことに、転写活性化ドメインにお ける、短いγ１と呼ばれる欠失を持つ、突然変異体へ２４０−２９０　（レーン ３）は、野生型ＧＲよりも良好にリポータ−活性を抑制した。カルボキン末端が 欠けた突然変異体５５０°および５１５゛は共に、ホルモンに依存しない抑制活 性が大幅に減少した（レーン６および８）。これらのデータは、リガンド結合ド メイン、および、より少ない程度ではあるが、アミノ末端がリプレッサー活性に 寄与することを示している。

全てのＤＮＡ結合ドメインの欠失は、抑制の完全な損失をきたしたくレーン１０ 、突然変異体△４２ｇ−４９０）。さらなる分析は、ＧＲの第１亜鉛フインガー （レーン１１、突然変異体△４２０−４５１）または第２亜鉛フインガー（レー ン１２、突然変異体へ４５０−４８７）のいずれかの欠失は完全に抑制を解除し たことを明らかにした。この領域のみを発現する突然変異体（レーン７、突然変 異体△９−３８５１５５０’、およびレーン９、突然変異体へ９−３８５１５１ ５”）もまた非活性であるので、ＤＮＡ結合ドメインは抑制に必要であるが、充 分ではない。ＧＲＤＮＡ結合ドメインを酵母転写因子ＧＡＬ４のそれと置換する と、ホルモンに依存してＧＡＬ４反応性プロモーターを活性化し得るが、抑制出 来ない突然変異体（レーン１３、突然変異体Ｇｇａ　ＩＧ）となる。ＧＲはコラ ゲナーゼＡｐ−を部位に結合しないため、ＧＲＤＮＡ結合ドメインの重要性は予 期されない（図６に示すように）。

ＤＮＡ結合が、ＧＲが介在する抑制に必要でｆｌｙｓとするさらなる証拠を提供 するため（Ｄｉａｍｏｎｄら、前出、により観察された相互反応を生じせしめる ためにＤＮＡ結合が必要とされることとは対照的１す、変化した標的遺伝子特異 性を有する突然変異受容体を、それが抑制能力を損失したかを確かめるために試 験した。ＤＮＡ結合ドメインのＰ−ボックス中の点突然変異を介して生じた、こ のＧＲ突然変異体は、ＧＲＥの代わりにＴＲＥまたはＥＲＥを認識する。この突 然変異体はなお、はんの僅かに減少した有効性てらって抑制し得る（図４、レー ン１４）。同様の実験で、ＧＲＤＮＡ結合ドメインがＲＡＲまたはＴＲのいずれ かのものと交換された突然変異体（突然変異体ＧＲＧおよびＧＴＧ）は、１２０ ０　Ｃｏ１−ＣＡＴ発現を抑制し得た（図４Ａ、レーン１５および１６）。最終 的に、ＧＲアミン末端およびカルボキン末端がＲＡＲのそれと交換された突然変 異体（ＲＧＲ）もまた効果的に抑制した（レーン１７）。

これらの結果を合わせると、ＧＲＤＮＡ結合ドメインおよび無傷のフィンガー構 造が、有効な抑制に必要であることが示されている。しかし、い（っかのステロ イドホルモン受容体のＤＮＡ結合ドメインをＧＲのそれと置換しても抑制活性は 破壊されなかったため、ＤＮＡ結合ドメインの標的遺伝子特異性は重要でないよ うだ。加えて、ＲＡＲアミノ末端およびカルボキン末端、並びにＧＲＤＮＡ結合 ドメインからなる突然変異受容体はなお、抑制活性を維持していた。

！　ｃ−Ｊｕｎロインンジノパーは ＯＲ゛　の　に５′１　で　る ｃ−Ｊｕｎタンパク質のどの領域が、ＧＲが介在する活性化の抑制に反応性であ るかを確かめるために、一連の変異ｃ−Ｊｕｎタンパク質を低濃度（０，５％） の血清中で培養したＮ１）１３Ｔ３細胞中で、ＧＲＨ２−ＴＫＣＡＴ活性を抑制 する能力に関して試験した。ＧＲＨ２−ＴＫＣＡＴまたはＴＫＣＡＴリポータ− 構築物を、記載の変異体の１つを５ａ　ｇ有するかまたは有さない０．５ａｇの ＯＲ発現プラスミドで旧Ｈ３丁３細胞に同時トランスフェクトした。細胞を低濃 度（０，５％）の血清中で培養した。

図５は、倍数誘導としてリポータ−活性を示す。ｃ−Ｊｕｎタンパク質はアミン 末端（Ｎ）１２）、ＤＮＡ結合領域（ＢＲ）、ロイシンジッパ−（ＬＺ）、およ びカルボキシ末端（Ｃ）からなるものと記載する。記載した突然変異体の上の数 は、対応する領域の開始または末端のアミノ酸の位置を示す。突然変異体５ＶＴ ＬＺＪｕｎはロイシンジノパーの前でクローン化されたＳＶ４０核転座信号を含 有する。ｃ−Ｊｕｎ突然変異体はほぼ同量発現した。ｃ−ＪｕｎＤＮＡ結合ドメ イン（図５、レーン３）または完全なアミン末端（図５、レーン５）のいずれの 欠失も、ＧＲＨ２−ＴＫＣＡＴリポータ−活性を抑制するｃ−Ｊｕｎタンパク質 の能力を変えなかった。

しかし、ロイシンジノパーの欠失によりタンパク質の抑制能力がなくなった（図 ５、レーン４）。

ＧＲ−介在活性を抑制するｃ−Ｊｕｎロイシンジノパーの能力をさらに調べるた めに、ロイシンジノパーと２３個のカルボ十／末端アミノ酸を、ＳＶ４０核局在 化信号に融合した変異体を構築した。図５、レーン６に示すように、この変異体 は野生型ｃ−Ｊ　ｕｎと同様のレベルでリポータ−活性を抑制した。対照プラス ミドＴＫＣＡＴの活性はホルモン処理またはｃ−Ｊ　ｕｎの過剰発現のいずれに よっても変わらなかったく図５、レーン７および８）。

図４および５に示す結果は、ｃ−Ｊｕｎが効果的にＧＲ−介在活性化を抑制し得 ること、およびロイシンジノパーを含有するＣ−Ｊｕｎのカルボキン末端領域が この効果を与えるに充分であることを示している。

支立月１工　ＡＰ−１はＧＲ−ＧＲＥＡ　り　を　るｃ−Ｊ　ｕｎおよびＯＲ間 の物理的相互作用の可能性を試験するために、ゲルレターデーションアッセイを 行った。これらのアノセイハ、パリンドロームＧＲＥを含有する３２ｐ−標識さ れたオリゴヌクレオチド；およびＧＲ（図６Ａ、レーン１．３、および４）また はベーターガラクトシターゼ（図６Ａ、レーン２）のいずれかを発現する構築物 でトランスフェクトされたｃｏｓ細胞から調製した抽出物を用いて行った。ＧＲ Ｉ４　（図６Ａ、レーン３）またはコラゲナーゼＡＰ−１結合部位（図６Ａ、レ ーン４）を含有する標識されていないオリゴヌクレオチドの５０倍過剰量を用い て、競合反応を行った。

ＧＲ（ＣＯＳ細胞中での過剰発現により得た）は、パリンドロームＧＲＥを含有 するオリゴヌクレオチドと、特異的に遅延された複合体を形成した（図６Ａ、レ ーン１）。ＧＲ−ＧＩ？ＩＪＩ合体は、標識されていないＧＲＨの５０倍過剰量 により効果的に競合される一方（レーン３）、コラゲナーゼプロモーター中にあ ルＡＰ−１部位を含有するオリゴヌクレオチドの５０倍過剰量との競合では影響 を受けなかった（レーン４）。この結果はＧＲがコラゲナーゼＡＰ−１結合部位 に結合しないことを示している。

’７”　ルＬ／　９−７’−７ヨンアノセイをパリンドロームＧＲＥ（図６１３ 、レーン１−８）またはＮＦ−１％合部位（図６Ｂ、レーン９−１２）を含有す る”ｐ−［識されたオリゴヌクレオチド；およびＧＲを発現するＣｏｓ細胞から 調製した抽出物を用いて行った。

精製した、細菌で発現したｃ−Ｊｕｎ　（図６Ｂ、レーン１−４、および９−１ ２）が存在しない中（図６Ｂ、レーンｌ、５、および９）、６３ｎｇ　（ＣＩＩ Ｕ６Ｂ、レーン２．６、および１０）、１３０ｎｇ　（図６Ｂ、レーン３．７、 および１１）、または２５０ｎｇ　（図６Ｂ。

レーン４．８、および１２）存在する中、またはＢ　Ｌ　２１細菌溶解物（疑似 物Ｍｏｃｋ＞　存在下（レーン５−８）で反応を行った。

精製した、細菌で発現したｃ−Ｊｕｎの量を増やして添加すると、形１戊される ＧＲ−ＧＲＥ複合体の量が大幅に減少した（図６Ｂ、レーン２−４）。対照的に 、疑似形質転換した細菌の溶解物を１ｔ７Ｊ［］してもＧＲ−ＧＲＥ？’！合体 形成に影響を及ぼさながった（図６１３、レーン５−８）。

ＧＲ−ＧＲＥ柑互作用におけるｃ−Ｊｕｎの効果の特異性を示すために、ケルレ ターデー／ｇノアノセイをｃｏｓ細胞抽出物（ＧＲを含有）およびＮＦ−１％合 部位を含有するオリゴヌクレオチドを用いて行った。ｃ−Ｊｕｎの贋を増やして 添加してもＮＦ−１％合活性に影響を及ぼさなかった（図６Ｂ、レーン９−１２ ）。

これらのインビトロでのデータをインビボでの結果とさらに相関させるために、 ΔＮＪｕｎと称されるｃ−Ｊｕｎ　トランケーション突然変異体（図５、レーン ５参照）をＧＲ−ＧＲＥ相互作用を遅延する能力に関してアッセイした。アミノ 酸１−２４９が欠失した、ΔＮＪｕｎは、ｃ−Ｊｕｎタンパク質のロイシンジノ パーおよび基本ドメインを保持していた。インビボでの結果と一致して、トラン ケーション突然変異体はＧＲ−ＧＲＥ複合体の形成を破壊し得たく図６Ｃ；ゲル 妨害ア、セイをパリンドロームＧＲＥを含有する３２ｐ−標識されたオリゴヌク レオチド、およびＧＲを発現するＣＯ３細胞からＲ製した抽出物を用いて行った ）。精製した、細菌で発現したΔＮＪｕｎ　（レーン１−４）が存在しない中（ レーンｌおよび５）、または２００ｎｇ　（レ−７２および６）、４００ｎｇ　 （レーン３および７）、または８０Ｄｎｇ　（レーン４および８）存在する中、 またはＢＬ２１細菌溶解物（疑似物；レーン５−８）で反応を行った。

）ＪＬｆ＠ｌＬ＝　コラゲナーゼプロモーターノＲＡＲが　る 細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子（１ ２０ＱＣｏｌ−ＣＡＴ）に融合されたコラゲナーゼプロモーターの１，２−キロ ベース部分を含有するリポータ−プラスミドを、ＲＡＲα、ＲＡＲβ、およびＲ ＡＲγ（図７、棒２−４）をコードする０１μｇの発現プラスミドと共に、Ｈｅ Ｌａ細胞に同時トランスフェクトした。そして１０％血清中で培養し、リポータ −遺伝子がレチン酸（ＲＡ）の影響を受けるかをアッセイした。ＨｅＬａ細胞は 、内因性ＲＡＲを含有し、コラゲナーゼ遺伝子おヨヒＪｕｎタンパク質を発現す るため、この実験に用いた。図７に示すように、内因性ＲＡＲは約５０％のＲＡ を添加することにより、１２００Ｃｏｌ−ＣＡＴ活性を抑制したく図７、棒ｌ） 。ＲＡＲａ、ＲＡＲβ、またはＲＡＲγ発現プラスミドのいずれか１つの同時ト ランスフェクションによって、さらに、１２００Ｃｏｌ−ＣＡＴリポータ−活性 を、非ＲＡ処理対照の約１５％にまで阻害したく図７、棒２−４）。

対照的に、対照プラスミドβＲＥ−ＴＫＣＡＴ　（公知のＲＡ−反応要素、βＲ ＡＲＥを含有［５ｕｃｏｖらの、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ Ａ　８７：５３９２−５３９６　（＋９９０）］）は、ＲＡによって誘導された 。このことは、ＲＡ−介在抑制がコラゲナーゼプロモーターに特異的であること を示している（図７、棒５）。

尖−施渭ユユ　コラゲナー（プロモーターのＡｐ−１０は■二を在□抑」■≦ビ 要コニ−１ 玉実施例では、ＲＡによる抑制に介在するコラゲナーゼプロモーター（すなわち ＡＰ−１反応性プロモーター）のＤＮＡ配列を試験した。従って、挿々のフラゲ ナーセーＣＡＴリポータープラスミドをＲＡＲα発現ベクターと共に、ＲＡが存 在しない（図８、黒塗り捧）または存在する（図８、斜線棒）状態で、１０％の 血清中で培養したＨｅＬａ細胞に同時トランスフェクトした。

図８（捧１−３）は、ＲＡのＨｅＬａ細胞への添加により、１２００Ｃａｌ−Ｃ ＡＴおよび７３Ｃｏｌ−ＣＡＴリポータ−活性の両方が約６倍抑制されたが、リ ポータ−プラスミド６３Ｃｏｌ−ＣＡＴの活性は変化しなかったことを示してい る。

これらの結果は抑制が、コラゲナーゼプロモーター中の一７３位および一６３位 の間に位置するＤＮＡ配列に介在されることを示している。従って、ＧＲに類似 したＲＡＲは、ＡＰ−１反応性プロモーターの誘導を阻害し得る。

さらに、ＡＰ−１反応性プロモーターの誘導を阻害するＲＡＲの能力を試験する ために、ＡＰ−１誘導し得るリポータ−構築物（ＡＰ−１）ｓ−ＴＫＣＡＴをＨ ｅＬａ細胞にトランスフェクトした。このプロモーターの高い基礎活性もまたＲ ＡおよびＲＡＲａ（図８、棒４）の存在中で抑制されたが、対照ＴＫプロモータ ーの発現はＲＡの影響を受けない（図８、棒５）。予想通り、ＲＡ−反応性リポ ータ−βＲＥ−ＴＫＣＡＴは、ホルモンに依存性の様式で活性化された（図８、 棒６）。

図８に示すデータから、ＲＡによるコラゲナーゼプロモーターまたは異種リポー タ−の抑制はＡＰ−１部位の存在に依存することが示される。

足車■に　ＲＡＲＤＮＡ４：Ａドメインおよびｌに　と１屋且ＪｕｎＡＰ−１の 　にパ・　で　るが　でない上述の試験はＪｕｎ／ＡＰ−１活性はホルモンに依 存性の様式で効果的にＲＡＲａによって抑制され得ることを示している。抑制に 関与する受容体の領域を明確にするために、いくつかのＲＡＲ突然変異体を、Ｃ Ｖ−＋細胞における同時トランスフェクションの研究で、（ＡＰ−１）Ｓ−ＴＫ ＣＡＴ　’）ポーター活性を抑制する能力に関して分析した。図９中、各受容体 の上の目盛りはアミノ酸数を示している。野生型ＲＡＲαはＮ末端（アミノ酸１ −８０）、ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸８ｌ−１５３）　、およびリガンド結 合ドメイン（アミノ酸＋５４−４６２）からなる。欠失したアミノ酸を左側に示 す。Ｏ１μｇのＲＡＲα発現プラスミドと同時トランスフェクトすることにより 得られた１２００ｃａｌ−ＣＡＴリポータ−活性のＲＡ依存抑制を１００％に設 定した。

ＲＡＲの全てのＮ末端の欠失によっては、ＣＡＴ活性を抑制する受容体の能力を 損なわなかった（図９、棒１を棒２と比較）。

しかし、ＤＮＡ結合ドメインの欠失は、抑制の完全損失をきたした（図９、棒３ ）。

さらなる分析により、ＲＡＲａ　ＤＮＡ結合ドメインをＧＲ（ＲＧＲ）のそれと 交換した変異体は、なお充分に抑制し得ることが明らかにされたく図９、捧４） 。これらの結果はステロイド受容体ＤＮＡ結合ドメインが有効な抑制に必要であ ることを示している。しかし、ＤＮＡ結合ドメインの標的遺伝子特異性は比較的 重要でない。

さらなる分析により、両方のＣ末端先端切断型変異体４０３°および２０３°は 完全に抑制能力を失ったことが明らかにされたく図９、棒５および６〉。受容体 リガンド結合ドメインの重要性を示す別の方法として、ＲＡＲのＣ末端をオンコ ジーンｖ−ｅｒｂＡのそれと交換した。得られた変異体ＲＲｅｒｂＡもまた抑制 しなかった（図９、棒７）。

見立■１±　ＲＡＲはＡＰ−ＩＡ゛　を　げるＲＡＲおよびＡＰ−１の間の潜在 的物理的相互反応を試験するために、ゲルレターデーションアッセイを行った。

細菌で発現させたＲＡＲａは、コラゲナーゼＡＰ−１部位を含有する３２ｐ標識 されたオリゴヌクレオチドを有する遅延された複合体を形成し得なかったく図１ ０、レーン２）。このことは、ＲＡＲが、この配列に直接結合することにより、 コラゲナーゼ発現を阻害しないことを示している。対照的に、インビトロで転写 されたｃ−Ｊｕｎは特異的に遅延された複合体を形成した（図１０、レーン３） 。

細菌で発現させたＲＡＲａの量を増やして添加すると投与量に依存する形で形成 される複合体の量が大幅に減少する（図１０゜レーン４−７）。一方、疑似形質 転換したＢＬ２１細菌性溶解物はｃ−Ｊ　ｕｎのＤＮＡへの結合に影響を及ぼさ なかった（図１０、レーン８−１１）。

細菌で発現させたＲＡＲａはまた、ＨｅＬａ細胞抽出物をＡＰ−１供給源として 用いた時、ＡＰ−Ｉ　ＤＮＡ結合を阻害した（図１１、レーンｌを２−４と比較 ）。疑似形質転換したＢＬ２１細菌の溶解物の添加は複合体形成に影響を及ぼさ なかった（図１１、レーン５−８）。対照として、ゲルレターデーションアッセ イを）ＨｅＬａ細胞抽出物中に存在するＮＦ−１活性およびＮＦ−１結合部位を 含有するオリゴヌクレオチドを用いて行った。細菌で発現させたＲＡＲａの量を 増やして添加しても、ＮＦ−１結合活性に影響を及ぼさなかった。このことはＲ ＡＲαのＡＰ−Ｉ　ＤＮＡ結合に対する阻害効果の特異性を示している。

本発明を特に、好適な実施態様を用いて詳細に説明したが、その改変および修飾 もまた本発明の意図および範囲内で行われ得ると理解される。

似４　１Ｙり％ φ１１・　まｖ０％ ＦＩＧ、　２Ｃ Ｖ−１ ΔＧＲ十　−−−− ＦＩＧ、　６Ｂ １２３４５６７８９１ＯＬｌ１２ ＦＩＧ、　６Ｃ ＦＩＧ、　７ 動斗　土■○％ ＦＩＧ、　１０ ＋　２　３　４　５　６　７　８　９　ｔｏ　ＩＩＦｔＧ、１ｔ 、　、、Ｎ、　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０６８４８

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．異常細胞の治療に有用な化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の （ａ）（ｂ）両方の性質を示す化合物を選択する工程を包含する： （ａ）該化合物が： （ｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体、 （ｉｉ）ＡＰ−１、および （ｉｉｉ）ＡＰ−１反応性レポーター を発現し得る細胞系を有する第１のアッセイシステムで使用されるとき、ＡＰ− １の機能を妨害する能力を示し；および（ｂ）該化合物が： （ｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体、および （ｉｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様反応性リポーター、 を発現し得る細胞系を有する第２のアッセイシステムで使用されるとき、ステロ イドホルモンまたはステロイドホルモン様反応性遺伝子の転写活性化を促進する 能力を実質的に示さない。
2. ２．前記化合物が、ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体と第 １の複合体を形成し得；該第１の複合体が、ＡＰ−１の存在下で、ＡＰ−１の機 能を阻害し得；また該第１の複合体がステロイドホルモンまたはステロイドホル モン様反応性遺伝子の転写活性化を実質的に促進し得ない、請求項１に記載の方 法。
3. ３．前記受容体がグルココルチコイド受容体、レチン酸受容体、ビタミンＤ３受 容体、甲状腺受容体、鉱質コルチコイド受容体、エストロゲン受容体、エストロ ゲン関連受容体、レチノイド受容体、アンドロゲン受容体、または黄体ホルモン 受容体から選択される、請求項１に記載の方法。
4. ４．ＡＰ−１反応性経路を妨害するがステロイドホルモンまたはステロイドホル モン様反応性経路には実質的に効果を及ぼさない化合物を同定する方法であって ：（ａ）該化合物のＡＰ−１反応性経路に及ぼす効果を測定する第１のアッセイ システムにおいて該化合物を試験する工程であって；該第１のアッセイシステム は： （ｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体、 （ｉｉ）ＡＰ−１、および （ｉｉｉ）ＡＰ−１反応性レポーター を発現し得る細胞系を有する、工程：および（ｂ）該化合物の、ステロイドホル モンまたはステロイドホルモン様反応性遺伝子の転写活性化に及ぼす効果を決定 する第２のアッセイシステムにおいて該化合物を試験する工程であって；該第２ のアッセイシステムは： （ｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体、および （ｉｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様反応性リポーター、 を発現し得る細胞系を有する、工程；およびその後、（ａ）の試験では阻害効果 を有し、また（ｂ）の試験では実質的に効果を有しないこれらの化合物を選択す る工程を包含する方法。
5. ５．前記受容体が、グルココルチコイド受容体、レチン酸受容体、ビタミンＤ３ 受容体、甲状腺受容体、鉱質コルチコイド受容体、エストロゲン受容体、エスト ロゲン関連受容体、レチノイド受容体、アンドロゲン受容体、または黄体ホルモ ン受容体から選択される、請求項４に記載の方法。
6. ６．発現系において、ステロイドホルモン反応性またはステロイドホルモン様反 応性遺伝子の転写活性化を、ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様化 合物により抑制する方法であって： 該ステロイドホルモン反応性またはステロイドホルモン様反応性遺伝子の発現を 抑制するのに効果的な、ＡＰ−１発現を誘導する化合物および／または状態に、 該系を曝す工程を包含する方法。
7. ７．前記ステロイドホルモン反応性またはステロイドホルモン様反応性遺伝子が 、グルココルチコイド反応性、レチン酸反応性、ビタミンＤ３反応性、甲状腺ホ ルモン反応性、鉱質コルチコイド反応性、エストロゲン反応性、エストロゲン関 連ホルモン反応性、アンドロゲン反応性、黄体ホルモン反応性、またはレチノイ ド反応性である、請求項６に記載の方法。
8. ８．前記ステロイドホルモン反応性またはステロイドホルモン様反応性遺伝子が 、グルココルチコイド反応性、甲状腺ホルモン反応性、鉱質コルチコイド反応性 、エストロゲン反応性、エストロゲン関連ホルモン反応性、アンドロゲン反応性 、黄体ホルモン反応性、またはレチノイド反応性である、請求項６に記載の方法
9. ９．ＡＰ−１の発現を誘導する前記化合物および／または状態が、腫瘍形成、成 長因子、サイトカイン、神経ペプチド、神経伝達物質、プロテインキナーゼｃ、 またはプロテインキナーゼｃを誘導し得る化合物を誘導する化合物；または紫外 線照射、ガンマ線照射、ストレス、またはヒートショックの状態から選択される 、請求項６に記載の方法。
10. １０．ステロイドホルモン反応性またはステロイドホルモン様化合物反応性遺伝 子の過剰発現を含む疾患状態を示す患者を治療する方法であって、請求項６に記 載の方法に従って、該患者を治療する工程を包含する方法。
11. １１．発現系において、ステロイドホルモン反応性またはステロイドホルモン様 反応性遺伝子の転写活性化を、ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様 化合物またはそれらのアナログにより抑制する方法であって：ｃ−Ｊｕｎのロイ シンジッパー領域またはその機能的なアナログを含有するペプチドを、該ステロ イドホルモン反応性またはステロイドホルモン様反応性遺伝子の発現を抑制する のに有効な量で該系に投与する工程を包含する方法。
12. １２．ｃ−Ｊｕｎのロイシンジッパー領域の、ステロイドホルモン受容体または ステロイドホルモン様受容体、またはそれらのアナログに対するモル比が約０． ５から１００：１の範囲である、請求項１１に記載の方法。
13. １３．発現系において、ＡＰ−１反応性遺伝子の転写活性化を，ＡＰ−１または そのアナログにより抑制する方法であって：（ｉ）ステロイドホルモンまたはス テロイドホルモン様受容体、またはそれらのアナログの機能的なリガンド結合ド メイン、および （ｉｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体、またはそれら のアナログの機能的なＤＮＡ結合ドメイン、を該ＡＰ−１反応性遺伝子の発現を 抑制するのに有効な量で含有する組成物を、該系に投与する工程を包含する方法 。
14. １４．前記ＡＰ−１反応性遺伝子が、コラーゲナーゼ遺伝子、ｃ−Ｊｕｎ遺伝子 、ｃ−Ｆｏｓ遺伝子、免疫反応性遺伝子（例えば、Ｔ細胞受容体遺伝子、ＩＬ− １遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、およびＩＬ−２受容体遺伝子、またはレチン酸受容 体−アルファ遺伝子から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. １５．前記組成物が： （ｉ）ステロイドホルモン受容体またはステロイドホルモン様受容体、またはそ れらのアナログの機能的なリガンド結合ドメイン、および （ｉｉ）ステロイドホルモン受容体またはステロイドホルモン様受容体、または それらのアナログの機能的なＤＮＡ結合ドメイン、 を含有し、グルココルチコイド受容体、レチン酸受容体、ビタミンＤ３受容体、 甲状腺受容体、鉱質コルチコイド受容体、エストロゲン受容体、エストロゲン関 連受容体、レチノイド受容体、アンドロゲン受容体、または黄体ホルモン受容体 から選択される、請求項１３に記載の方法。
16. １６．前記組成物が： （ｉ）ステロイドホルモン受容体またはステロイドホルモン様受容体、またはそ れらのアナログの機能的なリガンド結合ドメイン、および （ｉｉ）ステロイドホルモン受容体またはステロイドホルモン様受容体、または それらのアナログの機能的なＤＮＡ結合ドメイン、 を含有し、グルココルチコイド受容体、甲状腺受容体、鉱質コルチコイド受容体 、エストロゲン受容体、エストロゲン関連受容体、レチノイド受容体、アンドロ ゲン受容体、または黄体ホルモン受容体から選択される、請求項１３に記載の方 法。
17. １７．前記組成物のＡＰ−１に対するモル比が約０．５から１００：１の範囲で ある、請求項１３に記載の方法。
18. １８．疾患を有する患者を治療する方法であって、該疾患状態はＡＰ−１により 刺激され、請求項１３に記載の方法により該患者を治療する工程を包含する方法 。
19. １９．ステロイドホルモン、またはステロイドホルモン様化合物、またはそれら のアナログの存在下で、ステロイドホルモン受容体、ステロイドホルモン様受容 体、またはそれらのアナログにより負の調節を受ける遺伝子からの遺伝子産物の 発現の抑制を克服する方法であって：該遺伝子産物の発現の抑制を抑圧するのに 有効な、ＡＰ−１発現を誘導する化合物および／または状態に該系を曝す工程を 包含する方法。
20. ２０．ステロイドホルモン、ステロイドホルモン様化合物、またはそれらのアナ ログの存在下で負の調節を受ける前記遺伝子が、プロオピオメラノコルチン遺伝 子、プロラクチン遺伝子、プロリフェリン遺伝子、絨毛性ゴナドトロピンアルフ ァサブユニット遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシナーゼ遺伝子、ま たはコラーゲナーゼ遺伝子から選択される、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．ステロイドホルモン受容体またはステロイドホルモン様受容体、またはそ れらのアナログの存在下で、ステロイドホルモン、ステロイドホルモン様化合物 、またはそれらのアナログによるリンパ球系細胞の増殖および機能の阻害を克服 する方法であって、 該リンパ球系細胞の増殖の阻害を抑圧するのに有効な、ＡＰ−１発現を誘導する 化合物および／または状態に該系を曝す工程を包含する方法。
22. ２２．ステロイドホルモン受容体またはステロイドホルモン様受容体と第１複合 体を形成する化合物であって、該第１複合体は、ＡＰ−１の存在下でＡＰ−１の 機能を妨害し、また該第１複合体は、ステロイドホルモン反応性またはステロイ ドホルモン様反応性遺伝子の転写活性化を実質的に促進し得ない、化合物。
23. ２３．異常細胞の治療に有用な化合物を選択する方法であって： （ｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体、 （１ｉ）ＡＰ−１、および （ｉｉｉ）ＡＰ−１反応性レポーター を発現し得る細胞系を有するアッセイシステムで使用されるとき、ＡＰ−１の機 能を妨害する化合物を選択する工程を包含する、方法。
24. ２４．異常細胞の治療に有用な化合物を選択する方法であって、ＡＰ−１の機能 を妨害するが： （ｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様受容体、および （ｉｉ）ステロイドホルモンまたはステロイドホルモン様反応性リポーター、 を発現し得る細胞系を有するアッセイシステムで使用されるとき、ステロイドホ ルモン反応性またはステロイドホルモン様反応性遺伝子の転写活性化に実質的に 作用をもたない化合物を選択する工程を包含する、方法。