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HINTERGRUND
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Cholesterin
ist für
eine Vielzahl zellulärer
Aktivitäten,
einschließlich
Membranbiogenese, Steroid- und Gallsäurebiosynthese, Caveola-Bildung
und kovalente Proteinmodifikation unverzichtbar. Die weit verbreitete Verwendung
von Cholesterin bei verschiedenen Stoffwechselwegen bedeutet, dass
eine minimale Blutkonzentration aufrechterhalten werden muss. Auf
der anderen Seite ist ein Überschuss
zirkulierenden Cholesterins ein Hauptrisikofaktor bei der Entwicklung
der arteriosklerotischen Herzerkrankung, der hauptsächlichen
Todesursache in den USA mit nahezu 500.000 Todesfällen pro
Jahr.
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Die
Cholesterin-Spiegel im Kreislauf werden durch zelluläre Aufnahme,
Synthese und Abbau (Brown und Goldstein, Cell 89, 331–340 (1977))
reguliert. Entfernen eines Überschusses
an Cholesterin wird durch die Tatsache erschwert, dass es ein unlösliches
Lipid ist, von dem das meiste in Zellmembranen eingebettet ist. Der
hauptsächliche
Abbauweg für
Cholesterin ist die metabolische Umwandlung zu Gallsäuren, die
weniger hydrophob und daher leichter aus der Zelle zu entfernen
sind als Cholesterin. Die Umwandlung von Gallsäuren geschieht ausschließlich in
der Leber. Ein chemischer Stoffwechselweg bei dieser Umwandlung
wird durch das, das Ausmaß dieses
Stoffwechselweges bestimmende Enzym Cholesterin-7α-Hydroxylase
(Cyp7a) in Gang gesetzt. Beim Menschen wird Cholesterin sowohl über den
7α-Hydroxylase- als
auch über
den Sterin-27-Hydroxylase-Stoffwechselweg zu Gallsäuren umgewandelt.
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In
vivo werden Gallsäuren
von Hepatocyten und intestinalen Mikroorganismen metabolisiert,
wobei eine große
Anzahl von verschiedenen Produkten entsteht. Die Existenz so vieler
chemisch verwandter Produkte und die komplexen biochemischen Stoffwechselwege
gestalten das Isolieren und das Untersuchen der Wirkungen einzelner
Komponenten schwierig (vgl. Elliott und Hyde, Am. J. Med. 51, 568–579 (1971)).
Zum Beispiel sind Chenodesoxycholsäure (CDCA, 5β-Cholansäure-3α, 7α- diol) und Cholsäure (CA,
5β-Cholansäure-3α, 7α, 12α-triol) zwei
der hauptsächlichen
Endprodukte der Gallsäurebiosynthese
(Chiang, Front. Biosci. 3, D176–193
(1998), Vlahcevic et al., Hepatology 13, 590–600 (1991)). Beide werden
ausschließlich
in der Leber hergestellt, wo sie durch Konjugation mit Taurin oder
Glycin weiter metabolisiert werden können. Diese Gallsäuren werden
in den Intestinalraum ausgeschüttet,
im Ileum reabsorbiert und über
den Pfortaderkreislauf in die Leber zurücktransportiert. Während ihres Übergangs
in den Intestinalraum unterlaufen die primären Gallsäuren wie CDCA und CA eine mikrobiell
vermittelte 7α-Dehydroxylierung
und werden dann zu Lithocholsäure (LCA,
5ß-Cholansäure-3α-ol) bzw.
Desoxycholsäure
(DCA, 5β-Cholansäure-3α, 12α-diol) umgewandelt
(Elliott und Hyde, Am. J. Med. 51, 568–579 (1971), Hylemon, „Metabolism
of Bile Acids in Intestinal Microflora" in „Sterol and Bile Acids, H.
Danielsson und J. Sjovall, Hrsg. (New York, Elsevier), S. 331 – 344 (1985)).
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Zusätzlich zu
ihren metabolischen Funktionen wirken Gallsäuren auch als Signalmoleküle, die
ihre eigene Biosynthese negativ regulieren. Insbesondere wirken
Gallsäurebestandteile
in einer negativen Rückkopplungsschleife,
die die Gallsäureproduktion
durch Hemmung der Expression des Cyp7a-Enzyms limitiert. Während es
bekannt ist, dass mehrere Gallsäurebestandteile
diese negative Rückkopplung
induzieren können,
sind die Beschaffenheit des Gallsäure-Sensors, der das Gallsäuresignal überträgt und der
Mechanismus, durch den es dies bewirkt, bisher unbekannt geblieben. Über die
Hemmung von Cyp7a ist jedoch bekannt, dass sie auf der Transkriptionsebene
auftritt, und Elemente einer negativen Gallsäure-Response-Elemente sind
im Cyp7a-Promotor gefunden worden. Für Gallsäuren wurde außerdem gezeigt,
dass sie die Sterin-27-hydroxylase herunterregeln, das Enzym, das
an der Umwandlung von Cholesterin zu Gallsäuren über verschiedene Stoffwechselwege
beteiligt ist (vgl. Twisk et al., Biochem. J. 305, 505–511, (1995)).
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Nukleare
Rezeptoren sind liganden-modulierte Transkriptionsfaktoren, die
die Transkriptionswirkungen von steroidalen, thyroidalen und retinoidalen
Hormonen vermitteln. Diese Rezeptoren haben konservierte DNA-Bindungsdomänen (DBD),
die spezifisch an die DNA der cis-wirksamen Elemente in den Promotoren
ihrer Zielgene und Ligandenbindungsdomänen (LBD) binden, was eine
spezifische Aktivierung der Rezeptoren durch ein bestimmtes Hormon
oder andere Faktoren ermöglicht.
Transkriptionelle Aktivierung des Zielgens eines nuklearen Rezeptors
tritt auf, wenn der zirkulierende Ligand an die LBD bindet und eine
Konformationsänderung
im Rezeptor bewirkt, die die Rekrutierung eines Co-Aktivators erleichtert.
Rekrutierung eines Co-Aktivators führt zur Bildung eines Rezeptorkomplexes,
der eine hohe Affinität
für eine
spezifische DNA-Region hat und der die Transkription eines spezifischen
Gens modulieren kann. Rekrutierung eines Co-Aktivators nach Bindung
eines Agonisten ermöglicht
dem Rezeptor die Aktivierung der Transkription. Bindung eines Rezeptor-Antagonisten induziert
einen anderen Konformationswechsel im Rezeptor, so dass die Co-Aktivator-Rekrutierung
zu einer unproduktiven Interaktion mit der basalen Transkriptionsmaschinerie
des Zielgens führt.
Wie für
den Fachmann offensichtlich, wird ein eine negative Transkriptionskontrolle über ein
bestimmtes Gen ausübender
Rezeptoragonist die Expression diese Gens in der Tat herabsetzen.
Umgekehrt wird ein Antagonist eines solchen Rezeptors die Genexpression
steigern.
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Mindestens
zwei Klassen nuklearer Co-Aktivatoren sind bestimmt worden. Die
erste Klasse beinhaltet die CBP- und SRC-1-verwandten Proteine,
die mittels ihrer Histonacetylaseaktivität die Chromatinstruktur modulieren.
Eine zweite Klasse beinhaltet PBD/DRIP 205/TRAP 220, das Teil eines
großen
transkriptionellen Komplexes ist, für den eine direkte Interaktion
mit der basalen Transkriptionsmaschinerie postuliert wird.
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Zusätzlich zu
den bekannten klassischen nuklearen, auf spezifische, identifizierte
Hormone reagierenden Hormonrezeptoren sind mehrere Rezeptoren ohne
bekannte Liganden, sogenannte Orphan-Rezeptoren, identifiziert worden.
Diese Orphan-Rezeptoren
beinhalten zum Beispiel FXR, CARβ,
PPARα, PPARδ, TR2-11, LXRα, GCNF, SF1,
RORα, Nurr1,
DAX und ERR2. Für
den Orphan-Rezeptor FXR (Farnesoid X-aktivierter Rezeptor) ist bekannt,
das er Cyp7a hemmt. Er bindet an sein Response-Element als Heterodimer
mit RXR (9-cis Retinsäure-Rezeptor),
das durch RXR-Liganden aktiviert werden kann.
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Es
wurde die Hypothese aufgestellt, dass Orphan-Rezeptoren als Sensoren
für einige
metabolische Signale, einschließlich
Fettsäuren,
Prostanoide und Metabolite von Farnesol und Cholesterin wirken.
Seit den Pioneer-Studien über
das lac-Operon ist es gut etablierter Wissensstand, dass bei Hefe
und Bakterien Intermediärmetabolite
als Signalmoleküle
dienen (Gancedo, Microbiol. Mo. Biol. Rev. 62, 334-361 (1998), Ullmann, Biochimie
67, 29–34
(1985)). Das Verständnis
der Metabolit-Kontrolle
bei Säugern
wurde durch die Notwendigkeit erschwert, Signalmetabolite und deren
verwandte Sensoren zu identifizieren.
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Frühere Studien über den
Gallsäure-Signalstoffwechselweg
in der Leber wurden unter Einsatz intakter Tiere oder von Hepatocyten
in Zellkultur durchgeführt.
Mit dieser Versuchsanordnung war man nicht in der Lage, zu entdecken
welche Verbindungen die letztendlichen Gallsäure-Signalmoleküle sind,
weil die Gallsäuren in
diesen Systemen durch intestinale Mikroorganismen und/oder leberspezifische
Enzyme einer metabolischen Umwandlung zu einer Anzahl verschiedener
Produkte unterzogen wurden. Der Rezeptor, der als Sensor für Cholesterin-
und Gallsäuresignale
fungiert, wurde daher nicht identifiziert.
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Weil
die Hemmung des Cholesterinabbaus durch Gallsäuren die Menge an Cholesterin
limitiert, die in Form von Gallsäuren
ausgeschieden werden kann, wäre
die Identifizierung des den Gallsäure- und Chlolesterin-Metabolismus
regulierenden nuklearen Rezeptors ein bedeutender Fortschritt bei
der Entwicklung von Behandlungsmöglichkeiten
für Patienten
mit Hypercholesterinämie
und anderen Erkrankungen im Zusammenhang mit den Aktivierungspegeln
eines durch diesen Rezeptor regulierten Gens. Das derzeitige Unvermögen, die
Transkription oder Expression von durch Gallsäure regulierten Genen zu beeinflussen,
zum Beispiel die durch Gallsäuren
auf den Cholesterinabbau ausgeübte
negative Rückkopplung,
stellt einen schwerwiegenden Stolperstein bei der Behandlung von
Patienten mit dieses Gen betreffenden Erkrankungen, zum Beispiel
Hypercholesterinämie,
dar. Bei jeder Erkrankung, bei der ein Defekt in der Regulation
eines Gens unter der Kontrolle eines nuklearen Gallsäurerezeptors
involviert ist, würde
durch Modifikation der Rezeptoraktivität eine Verbesserung erzielt
werden. Für
den nuklearen Gallsäure- Sensor wurde gezeigt,
dass er auf Gallsäuren
entweder durch Stimulation oder Unterdrückung der Expression des Zielgens
reagiert. Diese Aktivitäten
werden durch positive FXR-Response-Elemente innerhalb dieser Gene
vermittelt. Zum Beispiel unterdrücken
Gallsäuren
in koordinierter Weise die Transkription von leber-, ileum- oder nieren-spezifischen
Gallsäure-Transportmolekülen (Torchia
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 225, 128–133 (1996)), Sterol-27-hydroxylase (Cyp27)
(Twisk et al., Biochem. J. 305, 505–511 (1995)) und Sterol-12α-hydroxylase
(Cyp12) (Einarsson et al., J. Lipid Res. 33, 1591–1595 (1992)).
Deshalb könnten
schädliche
metabolische Erkrankungen, die entweder durch Stimulation oder durch
Suppression eines Gallsäure-Rezeptor-Zielgens
verbessert werden könnten,
mit Gallsäure-Rezeptorliganden
behandelt werden.
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Folglich
besteht ein Bedarf an Verbindungen und Verfahren zur Modulation
der durch Gallsäuren
regulierten Genexpression. Ein weiterer Bedarf besteht an Verfahren
zum Screenen zur Identifizierung von Verbindungen, die eine pharmakologische
Intervention zur Modifikation der Transkriptionsregulation von durch Gallsäure regulierten
Genen bereitstellen. Solche Verbindungen und Verfahren wären für die Patienten
von Nutzen, die von einer Modifikation der durch Gallsäure regulierten
Gentranskription profitieren würden,
wie zum Beispiel solche Patienten, die an Hypercholesterinämie leiden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen von zur
Modulation FXR-vermittelter Gentranskription nützlicher Verbindungen bereit,
das das in Kontakt bringen einer Mischung von FXR und RXR mit einer
Verbindung und die Bestimmung umfasst, ob diese Verbindung die Bildung
eines FXR-RXR-Heterodimers fördert,
worin RXR eine RXR-Mutante (RXRm) ist, die eine funktionelle DNA-Bindungsdomäne umfasst und
die eine Mutation in der Ligandenbindungs-Domäne trägt und die eine wesentliche
Aktivierung durch RXR-Liganden verhindert, aber sonst keine wesentliche
Wirkung auf die Fähigkeit
des mutierten RXR-Rezeptors zur Bildung von Heterodimeren hat.
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Die
Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen
mit FXR-Antagonist-Aktivität
bereit, das das in Kontakt bringen einer Mischung von FXR, RXR und
einem bekannten FXR-Agonisten mit einer Verbindung und die Bestimmung
umfasst, ob diese Verbindung die Agonist-geförderte Bildung eines FXR-RXR-Heterodimers hemmt,
worin RXR eine RXR-Mutante (RXRm) ist, die eine funktionelle DNA-Bindungsdomäne enthält und die
eine wesentliche Aktivierung durch Liganden verhindert, die aber
ansonsten keine wesentliche Wirkung auf die Fähigkeit das mutierten RXR-Rezeptors
zur Bildung von Heterodimeren mit FXR hat.
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Eines
dieser Verfahren zum Screenen von Verbindungen auf Cholesterinabbau
modulierende Aktivität umfasst
(1) Bereitstellung einer ersten Mischung, die (i) einen FXR-Rezeptor,
(ii) einen RXR-Rezeptor und (iii) eine markierte DNA-Sonde enthält, die
ein Sequenz enthält,
an die die DNA-Bindungsdomäne
eines LigandFXR-RXR-Komplexes
spezifisch bindet, (2) Bereitstellung einer zweiten Mischung, die
(i) einen FXR-Rezeptor, (ii) einen mutierten RXR-Rezeptor („RXRm"), der eine funktionelle
DNA-Bindungsdomäne
enthält
und die eine Mutation in der Liganden-Bindungsdömane hat, die die Aktivierung
durch RXR-Liganden verhindert, aber ansonsten keine wesentliche
Auswirkung auf die Fähigkeit
des mutierten RXR-Rezeptors zur Bildung von Heterodimeren mit FXR
oder von Heteromeren zur Rekrutierung von Co-Aktivator hat, (iii) eine markierte
DNA-Sonde enthält,
die eine Sequenz enthält,
an die die DNA-Bindungsdomäne
eines Ligand-FXR-RXR-Komplexes spezifisch bindet, (3) in Kontakt
bringen dieser ersten und zweiten Mischungen mit der zu screenenden
Verbindung, (4) Bestimmung, ob die Verbindung die Bindung eines
FXR-RXR-Heterodimers
an die DNA-Sonde bewirkt und (5) Bestimmung, ob die zu screenende
Verbindung die Bindung eines FXR-RXRm-Heterodimers an die DNA-Sonde
bewirkt. In einer anderen Ausführungsform
des Screenens umfasst das Verfahren weiterhin das in Kontakt bringen
der ersten und zweiten Mischungen mit einem bekannten FXR-Liganden
und die Selektion (Auswahl) von Verbindungen, die die Fähigkeit
des bekannten FXR-Liganden hemmt, die Bindung des FXR-RXR-Heterodimers
an die DNA-Sonde zu bewirken. Die obigen Verfahren können zum
Screenen von Verbindungen mit FXR-Antagonist-Aktivitäten verwendet
werden, wobei in die erste und die zweite Mischung ein bekantner
FXR-Ligand eingeschlossen und in den Schritten (4) und (5) bestimmt
werden, ob die zu screenende Verbindung die Bindung des Heterodimers
an die DNA-Sonde hemmt. Zusätzlich
können
erfindungsgemäß Verfahren
verwendet werden, bei denen der Co-Aktivator ein Polypeptid oder
ein aktives Fragment davon ist, das ein mit dem FXR-RXR-Heterodimer
in ligand-abhängiger
Weise interagierendes Peptidmotiv enthält.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen nach zur Modulation FXR-vermittelter
Gentranstranskription nützlicher
Verbindungen bereit, das das in Kontakt bringen einer Mischung von
FXR, RXR und einem FXR-RXR-Co-Aktivator
mit einer Verbindung und die Bestimmung umfasst, ob diese Verbindung
die Co-Aktivator-Rekrutierung fördert,
worin RXR eine RXR-Mutante (RXRm) ist, die eine funktionelle DNA-Bindungsdomäne enthält und die
eine Mutation in der Ligandenbindungsdomäne trägt, die eine wesentliche Aktivierung
durch RXR-Liganden verhindert, die aber ansonsten keine wesentlichen
Auswirkungen auf die Fähigkeit
des mutierten RXR-Rezeptors zur Bildung von Heterodimeren mit FXR
oder zur Rekrutierung von Co-Aktivator durch solche Heterodimere
hat.
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Eine
weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
stellt ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen für FXR-Antagonisten-Aktivität bereit,
das das in Kontakt bringen einer Mischung von FXR, RXR, einem FXR-RXR-Co-Aktivator
und einem bekannten FXR-Agonisten mit einer Verbindung und die Bestimmung
umfasst, ob diese Verbindung die durch den Agonisten geförderte Rekrutierung
von Co-Aktivator durch ein FXR-RXR-Heterodimer hemmt, worin RXR
eine RXR-Mutante („RXRm") ist, die eine funktionelle
DNA-Bindungsdomäne
enthält
und die eine Mutation in der Ligandenbindungsdomäne trägt, die eine wesentliche Aktivierung
durch RXR-Liganden verhindert, aber ansonsten keine wesentliche
Auswirkung auf die Fähigkeit
des mutierten RXR-Rezeptors zur Bildung von Heterodimeren mit FXR
oder auf die Rekrutierung von Co-Aktivator durch solche Heterodimere
hat.
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Noch
ein weitere erfindungsgemäße Ausführungsform
des Screenens ist ein zelluläres
System, umfassend (a) die Transfektion von Säuger-Zellen mit einem für FXR kodierenden
Gens unter der Kontrolle eines operativen Promoters, (b) die Transfektion
der Zellen mit einem operativen Reporter-Gen unter Kontrolle eines mit
einer für
ein operatives Response-Element kodierenden DNA-Sequenz verbundenen
Promotors, an das ligandaktiviertes FXR oder ein FXR-Komplex zur
Interaktion der Transkription dieses Reporter-Gens bindet, (c) Kultivieren
dieser Zellen in Gegenwart einer zu screenenden Verbindung und (d) Überwachung
dieser Zellen auf Transkription oder Expression des Reporter-Gens
als Indikator (Hinweis) der FXR-Aktivierung, worin die Zellen mit
einem für
ein Gallsäuretransportermolekül kodierenden
Gen unter der Kontrolle eines operativen Promoters transfiziert
werden. Wenn es in Gegenwart eines bekannten FXR-Liganden durchgeführt wird,
ist dieses Verfahren nützlich
zur Identifizierung von FXR-Antagonisten. Expression des Transportermoleküls bewirkt
den Transport hydrophiler Moleküle
durch die Zellmembran, wodurch der Nachweis ihrer Fähigkeit
zur Modulation der FXR-Rezeptor-Aktivität ermöglicht wird.
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Der
Fachmann wird noch weitere erfindungsgemäße und in den Schutzumfang
der Ansprüche
fallende Ausführungsformen
erkennen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 stellt
Ergebnisse aus einem Aktivierungsassay von FXR-RXR-Heterodimeren
und einigen weiteren Orphan-Rezeptoren mit Gallsäureextrakt bereit. Die Rezeptoren,
von denen jeder dem Fachmann bekannt ist, und die weiterhin mit
ihrer Genbank-Zugangsnummer angegeben sind, sind: CARβ, PPARα, PPARδ, TR2-11.
LXRα, GCNF,
SF1, RORα,
Nurr1, DAX und ERR2.
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2 stellt
Ergebnisse bereit, die die Aktivierung durch einen synthetischen
spezifischen Liganden RXR-Liganden, LG268, chimäre Rezeptoren, die die GAL4-DNA
Bindungsdomäne
von Hefe fusioniert mit der Wildtyp RXR-Ligandenbindungsdomäne oder
einer mutierten RXR (RXRm) Ligandenbindungsdomäne enthalten, vergleichen.
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3 ist
ein Autoradiogramm, das die Ergebnisse eines elektrophoretischen
Mobilitätsversuchs
zeigt, durch den die Bildung von Rezeptor-Co-Aktivatorkomplexen
mit Wildtyp RXR (RXR-CoA) oder mutiertem RXR (RXRm-CoA) bei zunehmenden
Konzentrationen an RXR-Ligand LG268 nachgewiesen wird.
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4 stellt
quantitative Ergebnisse der in 3 gezeigten
Ergebnisse bereit.
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5 stellt
Ergebnisse bereit, die die Aktivierung von RXR- und FXR-Heterodimeren
durch den RXR-Liganden LG268 und einen Gallextrakt vergleichen.
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6 zeigt
FXR, RXR und RXRm-Aktivierungsergebnisse mit durch präparative
Dünnschichtchromatographie
von Gallextrakten erhaltenen Fraktionen.
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7 zeigt
den Umkehrphasen-HPLC-Absorbtionsnachweis von Fraktion B aus 6.
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8 stellt
Daten bereit, die zeigen, dass der HPLC-Peak Z aus 7 FXR-RXRm nachhaltig aktiviert,
aber keine Auswirkung auf RXR hat.
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9 zeigt
den Spiegel der FXR-Aktivierung durch mehrere verschiedene freie
Gallsäuren.
Juveniles Hormon III und der RXR-Ligand LG268 wurden als Kontrollen
einbezogen. UDCA zeigt Ursodesoxycholsäure (5-β-Cholansäure-3α, 7β-Diol).
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10 zeigt
zeigt den Spiegel der FXR-Aktivierung durch CA, CDCA, DCA und LCA,
unkonjugiert oder mit Glycin oder Taurin konjugiert, in Gegenwart
oder Abwesenheit eines Lebergallsäuretransporters.
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11 stellt
FXR-Aktivierungs-Dosisreaktionsdaten für CDCA, DCA und LCA bereit.
EC50 für
jede der Verbindungen war etwa 50 μM.
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12 fasst
die aus den in den vorigen Figuren angegebenen Daten abgeleiteten
Struktur-Aktivitäts-Infomationen
zusammen. ++ zeigt >200fache
Aktivierung und + zeigt 100-150fache Aktivierung von FXR-RXR-Heterodimeren
an.
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13 stellt
Ergebnisse bereit, die zeigen, dass sowohl CDCA und LCA die Transkription
in Zellen aktivieren, die das GAL-L-FXR-Chimär und RXR-LBD (L-RXR) co-exprimieren.
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14 zeigt
Ergebnisse, die die Aktivierung nach Rekrutierung von einem GAL-4
Co-Aktivator-Fusionsprotein (GAL-CoA) zeigen, das sowohl von der
Gegenwart von RXR- als auch von FXR-LBDs in einem Säuger-Assay
mit zwei Hybriden abhängig
ist.
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15 zeigt
Ergebnisse elektrophoretischer Beweglichkeit, die die Co-Aktivator-Rekrutierung durch verschiedene
Liganden in Gegenwart von FXR und RXR oder FXR und RXRm demonstrieren.
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16 zeigt
die Aktivierung eines LXR-Reporter-Gens durch LXR, RXR oder beide
in Gegenwart von FXR (linker Balken) und die Aktivierung von T3R
(Triiodthyronin-Rezeptor)
durch T3Rβ,
RXR oder beide in Gegenwart von FXR und zugegebenem Ligand (rechter
Balken) zeigen.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen
bereit, die FXR aktivieren oder inhibieren.
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Es
wurde gefunden, dass Gallextrakte spezifisch den FXR-Orphan-Rezeptor
aktivieren. Ein aktives endogenes Gallsäure-Signalmolekül, das diesen
Rezeptor aktiviert, wurde bis zur Homogenität gereinigt und als Chenodesoxycholsäure (CDCA)
identifiziert. Weitere Analyse und Struktur-Aktivitäts-Studien
ergaben, dass auch CA, DCA und LCA FXR aktivieren. Zusätzlich wurde
gezeigt, dass LCA die Co-Aktivator-Rekrutierung in vitro fördert.
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Um
zu verifizieren, dass eine Gallsäurekomponente
in der Lage ist, an den FXR-Orphan-Rezeptor
zu binden und diesen zu aktivieren, wurde ein Extrakt aus Schweinegalle
(Sigma) hergestellt und mit einer Anzahl nuklearer Orphan-Rezeptoren getestet.
Die zu untersuchenden Rezeptoren wurden in CV-1 Zellen exprimiert, die
von COS-Zellen stammten. Die Zellen wurden wie in Boyer et al. (Am.
J. Physiol. 266, G382-G387 (1994)) beschrieben exprimiert.
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Die
Verwendung eines heterologen Zellsystems als Standardmodell zur
Rekonstituierung der Gallsäurereaktionsfähigkeit
erlaubt die Überwachung
der Aktivität
in Abwesenheit metabolischer Ereignisse, die den zu untersuchenden
Ablauf verschleiern könnten.
Jedes geeignete heterologe Zellsystem kann zur Untersuchung der
Aktivierung potentieller oder bekannter nuklearer Gallsäure-Rezeptorliganden
verwendet werden, solange die Zellen zur transienten Transfektion
mit der passenden, die Rezeptoren, Reporter-Gene, Response-Elemente
oder dergleichen exprimierenden DNA geeignet sind. Zellen, die konstitutiv
ein oder mehrere der(s) erforderlichen Gens(e) exprimieren, können ebenfalls
verwendet werden. Zellsysteme, die zur transienten Expression von
Säugergenen
und zur Kultivierung in Zellkultur zugänglich sind, sind dem Fachmann bekannt.
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TABELLE
1 Reporter/Rezeptor-Paare
für den
Orphan-Rezeptor-Aktivierungsassay
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Zur
Untersuchung der Aktivierung verschiedener Orphan-Rezeptoren durch
Gallsäuren
wurden CV-1-Zellen transient mit in 1 angegebenen
Expressionsvektoren zusammen mit dem Fachmann bekannten passenden
Reporterkonstrukten transfiziert. Geeignete Reportergenkonstrukte
sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Biochemie und Molekularbiologie
gut bekannt. Die in dem in 1 berichteten
Assay verwendeten Reporter/Rezeptor-Paare sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Alle Transfektionsansätze
enthielten zusätzlich CMX-βgal als interne
Kontrolle. Zur Verwendung in diesen Untersuchungen geeignete Konstrukte
können
bequemerweise in pCMX kloniert werden. pCMX enthält den Cytomegalovirus-Promoter/Enhancer
gefolgt von einem Bakteriophagen T7- Promoter zur in vitro-Transkription.
Andere dem Fachmann bekannte Vektoren können bei den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden.
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Gene,
die für
die unlängst
beschriebenen Proteine in ganzer Länge kodieren und die zur Verwendung für die hier
beschriebenen Untersuchungen geeignet sind, wurden in pCMX kloniert:
Ratten-FXR (Zugangsnummer 018374), humanes RXRα (Zugangsnummer X52773), humanes
TRβ (Zugangsnummer
X04707, humanes LXRα (Zugangsnummer
022662), Mäuse-PPARa
(Zugangsnummer X57638), Mäuse-PPARδ (Zugangsnummer
010375), humanes TR2-11 (Zugangsnummer M29960), Mäuse-GCNF
(Zugangsnummer u14666), Mäuse-SF1
(Zugangsnummer S65878). Alle Zugangsnummern in dieser Anmeldung
beziehen sich auf GenBank-Zugangsnummern.
GAL4-Rezeptorfragmente enthaltende Fusionskonstrukte wurden durch
Fusion der folgenden Proteinsequenzen mit dem C-terminalen Ende
der GAL4 DANN-Bindungsdomäne
von Hefe (Aminosäuren
1-147) von pSG424 (Sadowski und Ptashne, Nucl. Acids Res., 17: 7539
(1989)): GAL-L-RXR (humanes RXRα Glu
203 – Thr
462), GAL-L-FXR (Ratten-FXR LBD Leu 181 – Gln 469), GAL-RORα (humanes
RORα1 Arg
140 – Gly
523, Zugangsnummer 004897), GAL-Nurr1 (Mäuse-Nurr1, Cys 318 – Phe 598,
Zugangsnummer S53744), GAL-DAX (humanes DAX-1, Zugangsnummer 031929),
GAL-ERR2 (humanes ERR2, Glu 171 – Val 433, Zugangsnummer X51417),
GAL-CoA (humanes SRC-1, Asp 617 – Asp 769, Zugangsnummer 059302)
konstruiert.
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Das
RXR LBD-Expressionskonstrukt L-RXR enthält das nukleare SV40 Tag-Lokalisierungssignal
(APKKKRKVG (SEQ ID Nr. 1)) stromaufwärts fusioniert mit dem humanen
RXRα LBD
(Glu 203 – Thr
462). VP-L-FXR enthält
Herpes-Virus VP16-Transaktivierungsdomäne von 78
Aminosäuren
verbunden mit dem Amino-terminalen Ende des Ratten-FXR LBD (Leu
181 – Gln
469). Das als Kontrollgen zum Vergleich mit der Aktivierung des
untersuchten Rezeptors oder der untersuchten Rezeptordomäne verwendete
CMX-βgal
enthält
die für
E. coli β-Galactosidase
kodierenden, aus pCH110 (Zugangsnummer 002445) stammenden Sequenzen.
Dieses Gen wurde hier geeigneterweise verwendet, es kann jedoch
jedes nicht verwandte Gen als Kontrolle in den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden, das verfügbar
ist und für
das ein bequem durchzuführender
Assay zur Messung seiner Aktivierung existiert.
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RXRm
ist eine humane 9-cis-Retinsäure-Rezeptor-Ligand-Bindungsdomäne, die
eine einzige Punktmutation enthält
(Asp 322→Pro).
Diese mutierte Rezeptordomäne
be hält
die Fähigkeit
zur Bindung an DNA und zur Bildung von Heterodimeren mit FXR bei,
der jedoch die Fähigkeit
auf niedrige Ligandenkonzentrationen zu reagieren, wie es die Wildtyp-Rezeptordomäne tut,
fehlt. Diese defekte Ligandenbindungsdomäne gestattet das spezifische
Screenen im Aktivierungsassay nach Verbindungen, die an den nuklearen
Gallsäurerezeptor
(FXR) binden und diesen aktivieren und nicht nach Verbindungen,
die durch den RXR-Anteil des Heterodimers reagieren.
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Um
festzustellen, welche(r) Orphan-Rezeptor oder -Rezeptoren durch
Galle aktiviert werden und exogen zur Modifikation der Transkription
von auf Gallsäure
ansprechenden Genen manipuliert werden könnte(n), wurden die transfizierten
Zellen mit Schweinegallextrakt behandelt. Der Gallextrakt wurde
wie folgt hergestellt. Galle (Sigma, 1 g) wurde in Wasser gelöst und auf
pH 4,0 eingestellt. Das wasserunlösliche Material wurde weiter
mit Methanol extrahiert. Das methanollösliche Material wurde getrocknet
und in einer Konzentration von 100 μg/ml erneut gelöst.
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Die
CV-1 Zellen für
den Aktivierungsassay wurden in Dulbeccos modifiziertem, mit 10% über ein
Aktivkohlebett abgereichtem fötalem
Rinderserum, 50 U/ml Penicillin G und 50 μg/ml Streptomycinsulfat supplementiertem
Eagles-Medium (DMEM-FBS) bei 37°C
in 5% CO2 kultiviert. Einen Tag vor Transfektion
wurden die Zellen mit 50–80%
Konfluenz unter Verwendung von phenolrotfreiem DMEM-FBS ausplattiert.
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Die
Zellen wurden transient durch Lipofektion transfiziert. Reporterkonstrukte
(300 ng/105 Zellen) und Cytomegalovirus-getriebene
Expressionsvektoren (20–50
ng/105 Zellen) mit CMX-β-gal (500 ng/105 Zellen) wurden
als externe Kontrolle hinzugefügt.
Nach 2 h wurden die Liposomen entfernt und die Zellen für etwa 45 h
mit phenolrotfreiem, die Testgallsäure und andere Verbindungen
enthaltendem DMEM-FBS behandelt.
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Jede
Verbindung, die ein Kandidat für
die Aktivierung des nuklearen Gallsäurerezeptors ist, kann durch
dieses Verfahren getestet werden. Im Allgemeinen werden die Verbindungen
zur Optimierung der Chancen, dass die Aktivierung des Rezeptors,
falls sie auftritt nachzuweisen und zu erkennen sein wird, bei mehreren
verschie denen Konzentrationen getestet. Nach Ligandenexposition
wurden die Zellen geerntet und in einem Assay auf β-Galactosidaseaktivität (Kontrolle)
und Aktivität
des spezifischen Reporter-Gens untersucht. Alle hier offenbarten
Assays wurden dreifach durchgeführt
und variierten innerhalb des Experiments weniger als 15%. Jedes
Experiment wurde drei oder mehrmals mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
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Die
Aktivität
des Reporter-Gens kann geeigneterweise als Normalwert der internen
Kontrolle bestimmt und die Ergebnisse als (x)fache Aktivierung bezogen
auf unbehandelte Zellen aufgetragen werden. Vgl. in 1 die
Ergebnisse, die die Aktivierung eines Orphan-Rezeptors durch Gallextrakt
zeigen. Wie in dieser Figur gezeigt, war Gallsäure ein starker Aktivator von
FXR (56fach), hatte aber geringe oder keine Wirkung auf andere untersuchte
Orphan-Rezeptoren.
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Wie
oben diskutiert bindet FXR als Heterodimer mit RXR (9-cis Retinsäure-Rezeptor)
an sein Response-Element. Dieses Heterodimer kann durch Farnesoidliganden
oder durch RXR-bindende Liganden aktiviert werden (Forman et al.,
Cell:+- 803–812
(1995), Zavaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 94: 7909–7914 (1997)).
Da die Aktivierung der FXR-RXR-Heterodimere durch Gallextrakt die
Gegenwart von Liganden entweder für FXR oder RXR wiederspiegeln
könnte,
wurde ein FXR-RXR-Komplex
zum Screenen nach FXR-spezifischen Aktivatoren konzipiert, der bezüglich seiner
Reaktion auf RXR-Liganden defekt ist. Die Verfügbarkeit einer RXR-Ligandenbindungsdomäne gestattet
die Konzeption eines Assays zum Screenen, der die Aktivierung des
nuklearen Gallsäurerezeptors
in Abwesenheit von RXR-Wirkungen gestattet, wodurch sonst auftretende
falsch positive Ergebnisse vermieden werden.
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Damit
die RXR-Mutante in diesem Verfahren funktioniert, sollte der Rezeptor
durch RXR-Liganden minimal aktiviert und bei Exposition gegenüber RXR-Liganden
keinen Co-Aktivator binden können,
aber die Fähigkeit
zur Dimerisierung mit FXR und als Heterodimer mit FXR zur Bindung
von DNA beibehalten. Schließlich sollte
die Mutante nicht wesentlich mit der normalen Aktivität des nuklearen
Gallsäurerezeptors
interferieren. Um diese Eigenschaften sicherzustellen, wurden wie
unten beschrieben Tests über
die mutierte Ligandenbindungsdomäne
durchgeführt.
Andere Mutanten können
zur Untersuchung auf ihre Eignung zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren
auf dieselbe Weise getestet werden.
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Für eine,
eine einzige Punktmutation (Asp 322→Pro) in der Ligandenbindungsdomäne enthaltende RXR-Mutante
(RXRm) wurde gefunden, dass diese in diesen Analysen besonders gut
funktioniert. Chimäre, die
GAL4-DANN-Bindungsdomäne
von Hefe fusioniert mit entweder der Wildtyp- (GAL-L-RXR) oder der
mutierten RXR (GAL-L-RXRm)-Ligandenbindungsdomäne enthaltende Rezeptoren wurden
auf eine Reaktion auf einen synthetischen RXR-spezifischen Liganden
(LG268, 6-[1-(3,5,5,8,8-Pentamethyl-5,6,7,8-tetrahydronaphthalin-2-yl)cyclopropyl]nicotinsäure) in
derselben Weise wie bei den Ergebnissen in 1 für die Aktivierung
des Orphan-Rezeptors
durch Gallsäuren
beschrieben getestet. CV-1-Zellen wurden transient mit CMX-βgal, UASG × 4
und entweder GAL-L-RXR oder der GAL-L-RXRm-Ligandenbindungsdomäne(LBD)-Mutante
transfiziert. Nach Transfektion wurden die Zellen mit den in 2 angegebenen
Konzentrationen an LG268 behandelt. Dimere mit einer mutierten RXR-Ligandenbindungsdomäne zeigten
gegenüber
Dimeren mit der Wildtyp-RXR-Ligandenbindungsdomäne eine 10fache Abnahme ihrer
Aktivierungsstärke
(vgl. 2). Es wurden für RXR in voller Länge und
RXRm-Rezeptoren ähnliche
Ergebnisse beobachtet (Ergebnisse nicht gezeigt).
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Um
die Eignung dieser Mutante weiter zu bestätigen, wurde die Fähigkeit
von Wildtyp-RXR und RXRm zur Bindung von DNA und Rekrutierung von
Co-Aktivator als Reaktion auf Ligand verglichen. Experimente bezüglich der
elektrophoretischen Mobilitätsverschiebung
wurden im ersten Schritt durch Inkubation einer Mischung aus 1,2 μl in vitro
translatiertem RXR (3, oberes Bild) oder RXRm (3,
unteres Bild), 5 μg
gereinigtem, rekombinantem GST-GRIP1-Co-Aktivator (unten beschrieben)
und einer 32P-markierten DR1-Sonde (5'-AGCTACCAGGTCAAAGGTCACGTAGCT, SEQ ID
Nr. 2) mit steigenden Mengen an RXR-Ligand LG268 (0-1000 nM) durchgeführt. Die
DR1-Sonde SEQ ID Nr. 2 wurde für
alle hier offenbarten RXR-Homodimer-Tests verwendet. Jede im wesentlichen
zur Zielsequenz innerhalb der DNA-Bindungsdomäne homologe Nukleinsäuresonde kann
für diese
Assays verwendet werden, solange das mit Ligand besetzte Heterodimer mit
für das
verwendete Nachweisverfahren hinreichend hoher Affinität an die
Sonde bindet. Gleichermaßen kann
jeder zum Nachweis der Anwesenheit von Komplexen in der Mischung
ausreichend empfindliche, geeignete Marker zur Verwendung bei den
erfindungsgemäßen Verfahren
in Betracht gezogen werden.
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Während der
Inkubation bilden sich Komplexe, bei denen die Dimere Co-Aktivator
rekrutieren und an die markierte DNA-Sonde binden. Nach Inkubation
wurde die Mischung einer Elektrophorese unter nicht-denaturierenden
Bedingungen unterzogen. Für
diesen Assay wurden die Komplexe über ein 5%iges Polyacrylamidgel
in 45 mM Tris-Puffer, enthaltend 45 mM Borsäure und 1 mM EDTA, bei Raumtemperatur
aufgetrennt. Das Gel wurde zum Nachweis der markierten Komplexe
und anderer Komponenten einer Autoradiographie unterworfen.
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In 3 zeigt
CoA eine die drei Rezeptorinteraktionsdomänen des Co-Aktivators GRIP1
enthaltende GST-Fusion. Die Ergebnisse bei der Verschiebung der
elektrophoretischen Mobilität
zeigen, dass RXRm im Vergleich zu Wildtyp-RXR-Co-Aktivator mit 100-fach
geringerer Stärke
rekrutiert. Obwohl sowohl die mutierten als auch die Wildtyp-Rezeptoren
DNA binden (3, Bahn 1), scheiterte RXRm
bei der Rekrutierung von Co-Aktivator bei zur maximalen Rekrutierung
durch den Wildtyp-Rezeptor in ausreichenden Konzentrationen (3,
vgl. oberes und unteres Bild, Bahnen 2–6).
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Die
in 3 gezeigte Quantifizierung der Menge an RXR-Co-Aktivator-Komplex
wurde durch Phosphorimager-Analyse des Autoradiogramms ermittelt
und als Funktion der LG268-Konzentration aufgetragen. Die Ergebnisse
zeigten, dass die Rekrutierung von Co-Aktivator durch RXRm etwa
100fach höhere
Ligandenkonzentrationen erforderte (4). Da die
RXR-Mutante die Fähigkeit
zur DNA-Bindung als Heterodimer mit FXR beibehielt (5 und
nicht gezeigte Ergebnisse), ihr aber die Fähigkeit fehlte, stark auf niedrige
Ligandenkonzentrationen zu reagieren, könnten FXR-RXRm-Heterodimere
zur Verifizierung der Aktivierung der FXR-Untereinheiten im Test
mit verschiedenen Liganden verwendet werden. Solche Heterodimere
könn ten deshalb
vorteilhafterweise in einem Verfahren zum Screenen nach den FXR-nuklearen Gallsäurerezeptor
aktivierenden Verbindungen und damit nach zur Modifikation der Transkription
von durch diesen Rezeptor regulierten Genen befähigten Verbindungen verwendet
werden.
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Die
Bestätigung
des analytischen Verfahrens wurde durch Untersuchung von FXR-RXR- und FXR-RXRm-Dimeren
bezüglich
der Aktivierung durch RXR- und FXR-Liganden erzielt. CV-1-Zellen wurden
mit den in 5 angegebenen, Rezeptordomänen tragenden
Plasmiden transfiziert und entweder mit 100 nM LG268 (linkes Bild)
oder einem Methanol-Extrakt aus Schweinegalle (200 μg/ml, rechtes
Bild) behandelt. Obwohl LG268 RXR (GAL-L-RXR)- und FXR-RXR-Heterodimere
akivierte, zeigte FXR-RXRm geringe oder keine Reaktion auf den RXR-spezifischen
Liganden LG268 (5, linkes Bild). Im Gegensatz
dazu behielt der Gallextrakt die Fähigkeit zur Aktivierung von
FXR-RXRm bei, hatte aber nur geringe Wirkung auf GAL-L-RXRm (5,
rechtes Bild). Ähnliche
Resultate wurde erhalten, wenn RXRm durch eine andere, die defekte AF2-Transaktivierungsdomäne enthaltende
RXR-Mutante (Phe 450→Ala,
Schulman et al., Mol. Cell. Biol., 16, 3807–3813 (1996)) (Ergebnisse nicht
gezeigt) ersetzt wurde. Dieser Assay-Typ kann daher spezifisch unterscheiden
zwischen der Aktivierung von RXR-Liganden und FXR-Liganden. Diese
speziellen Ergebnisse sind ein Indiz dafür, dass Gallextrakt einen FXR-spezifischen
Aktivator enthält.
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Weitere
Ergebnisse zeigten, dass die Aktivierung die AF2-Transaktivierungsdomäne von FXR
erfordert (Ergebnisse nicht gezeigt) Außerdem induzierten die Gallsäuren die
Aktivierung mit der erwarteten Kinetik (Aktivierung ist innerhalb
einer Stunde nach Zugabe des Liganden zu den Zellen zu beobachten:
Ergebnisse nicht gezeigt). Zusammengenommen demonstrieren die hier
vorgestellten Ergebnisse, dass FXR der endogene Gallsäure-Sensor
ist, der exogen mit geeigneten Liganden zur Modifizierung der Regulation
von, von der Aktivierung über
FXR abhängigen
Genen, wie zum Beispiel wichtigen, bei der Kontrolle des Cholesterinmetabolismus
beteiligten Genen, manipuliert werden kann.
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Ein
chemisches Fraktionierungsschema wurde zur Identifizierung und Reinigung
der biliären
Komponente im Gallextrakt, die an FXR bindet und FXR aktiviert,
erdacht. In einem ersten Schritt wurde der Methanol-Wasser-Gallextrakt über Kieselgelchromatographie
fraktioniert. Kurz beschrieben wurde der Extrakt auf eine Säule aufgetragen
und nacheinander mit Chloroform-Methanol im Verhältnis von 8:1 und 4:1, dann
mit 100% Methanol eluiert. 56 Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt
und auf ihre Fähigkeit
zur Aktivierung von FXR-RXRm getestet. Die aktive Fraktion wurde
weiter durch präparative
Dünnschichtchromatographie
(PTLC) gereinigt und in 5 Fraktionen (A-E) aufgetrennt.
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Um
die FXR-Aktivierung mit dem Material in diesen Fraktionen zu testen,
wurden CV-1-Zellen mit den, die in 6 angegebenen
Rezeptordomänen
tragenden Plasmiden transfiziert und mit 25 μg/ml jeder der 5 PTLC-Fraktionen
behandelt. Fraktion B (PTLC 0,35<Rf<0,52)
war die aktivste (30fach größere Aktivierung
von FXR-RXRm bezogen auf die Aktivierung von RXR) (vgl. 6).
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Das
aktive Material der PTLC-Fraktion B wurde weiter über Umkehrphasen-HPLC
auf einer C18-Säule gereinigt.
Die Absorption wurde bei 200 nm aufgezeichnet. Es waren drei Hauptpeaks
aufzulösen
(Peak X, Y und Z, 7). Die drei Peaks wurden jeweils
isoliert gesammelt. Die restlichen Fraktionen wurden vereinigt, um
eine vierte Fraktion zu bilden (W). Die vier Fraktionen wurden wie
oben bezüglich
Aktivierung von FXR-RXRm getestet. Kurz beschrieben wurden CV-1-Zellen
mit den, die in 8 angegebenen Rezeptordomänen tragenden
Plasmiden transfiziert und mit jeder der HPLC-Fraktionen bei Konzentrationen
von 25 μg/ml
behandelt. Fraktionen W, X und Y hatten geringe oder keine Aktivität (8).
Bemerkenswerterweise induzierte Peak Z eine dramatische 102fache
Aktivierung von FXR-RXRm, hatte aber keine Wirkung auf RXR. Diese
Ergebnisse zeigen, dass das Material in Peak Z nicht nur in potenter
Weise FXR aktivierte, sondern auch kein RXR aktivierendes Material
enthielt. Daher wurde das Material aus Peak Z zur Strukturanalyse
ausgewählt.
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Nach
Methylierung des Materials aus Peak Z wurde gleichzeitig Gaschromatographie-Massenspektrometrie
(GC-MS) durchgeführt.
Das Gaschromatogramm enthielt einen vorherrschenden Peak als Indiz
für eine
nahezu homogene Reinigung der aktiven Komponente. Die Verbindung
Z hatte eine Retentionszeit von 14,41 min in diesem Assay und war
von einem synthetischen Chenodesoxycholsäure-Standard (CDCA) nicht zu
unterscheiden. Um die Identität
dieses Materials weiter zu bestätigen,
wurden 13C-NMR, 1H-NMR,
DEPT-, DQFCOSY- und HMQC-Spektren (Ergebnisse nicht gezeigt) durchgeführt und
als identisch zum CDCA-Standard befunden. Die in diesem Assay den
nuklearen Gallsäure-Rezeptor
aktivierende Komponente im Extrakt aus Schweinegalle wurde damit
als CDCA identifiziert.
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Eine
Vielzahl handelsüblich
erhältlicher
Gallsäuren
(Sigma) wurde auf ihre Befähigung
zur Aktivierung von bekanntem FXR-RXR (9, linkes
Bild) und FXR-RXRm (9, rechtes Bild) getestet. Die
RXR-Liganden LG268 und Juvenilhormon III wurden auch zum Vergleich
als Testliganden einbezogen. Für
diese Assays wurden CV-1-Zellen mit CMX-βgal, EcRE × 6 und FXR + RXR (linkes Bild)
oder FXR + RXRm (rechtes Bild) transfiziert und mit den angegebenen
Gallsäuren
(100 μM),
Juvenilhormon III (JH III, 50 μM)
oder LG268 (100 μM)
behandelt. Die Gallsäuren
sind in der Figur wie folgt bezeichnet: CA = Cholsäure, CDCA
= Chenodesoxycholsäure,
DCA = Desoxycholsäure,
LCA = Lithocholsäure,
UDCA = Ursodesoxycholsäure.
Wie aus den Studien mit Gallsäureextrakt
zu erwarten, erwies sich synthetische CDCA als ein höchst wirksamer
Aktivator von FXR (346fache Aktivierung, 9, linkes
Bild). CDCA war nicht in der Lage andere Rezeptoren, einschließlich RXRα, PPARα, γ und δ, VDR, T3Rβ,
RAR, PXR, LXRα und
CARβ zu
aktivieren (Ergebnisse nicht gezeigt).
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Die
sekundären
Gallsäuren
CDA und LCA waren ebenfalls hochwirksam und induzierten eine 246fache
bzw. 106fache Aktivierung von FXR-RXR. Quantitativ ähnliche
Ergebnisse wurden mit FXR-RXRm (9, rechtes
Bild) erhalten, was ein Indiz dafür ist, dass all diese Gallsäuren über die
FXR-Untereinheit wirken. Ursodesoxycholsäure (UDCA, 5β-Cholansäure-3α, 7β-diol), das
7β-Epimer
von CDCA, war inaktiv, während
Substitution einer Hydroxylgruppe durch ein Keton in Position 7
eine Verbindung (7-Ketolithocholsäure, 5β-Cholansäure-3α-ol-7-on) mit einer intermediären Aktivität zwischen
CDCA und UDCA ergab (9, 15). Somit
war die Konfiguration um die Position 7 herum eine wesentliche Determinante
der FXR-Aktivität mit
7α-OH»7-keto»7β-OH. Ein
Vergleich von 7-Ketolithocholsäure
und 3,7-Diketocholansäure
(5β-Cholansäure-3,7-dion)
legt nahe, dass ein Keton in Position 3 gegenüber einer 3α-Hydroxylgruppe bevorzugt ist.
Mehre Di- und Trihydroxygallsäuren
mit einer Hydroxylgruppe in Position 6 waren inaktiv (Murocholsäure/Hyochol- und α-Muricholsäure) ebenso
Dehydrocholsäure
(5β-Cholansäure-3,7,12-trion).
Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass 3,7- und 3,12-substituierte
Gallsäuren
hochwirksame Aktivatoren von FXR sind. 12 ist
ein zusammenfassender Vergleich von chemischer Struktur von Schlüsselgallsäuren und
ihrer Wirksamkeit als FXR-Aktivatoren.
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Da
für Farnesoid-Metaboliten
bereits gezeigt wurde, dass sie FXR aktivieren (Forman et al., Cell,
81: 687–693
(1995)), wurde die Aktivität
eines der aktivsten Farnesoid-Aktivatoren, das Juvenilhormon III
(JH III, 50 μM),
getestet. Diese Verbindung war aktiv, hatte aber eine schwächere Aktivität bezogen
auf die wirksamsten Gallsäuren
(9).
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CDCA
und CA sind beide auf dem klassischen Stoffwechselweg hergestellte
Hauptgallsäuren,
jedoch war CA unwirksam, obwohl CDCA ein extrem wirksamer Aktivator
von FXR war. Sowohl CA als auch konjugierte Gallsäuren sind
relativ hydrophile Verbindungen, die nicht bereitwillig Zellmembranen
passieren. Es wäre
möglich,
dass in diesem Assay keine Aktivierung des nuklearen Gallsäurerezeptors
festgestellt wurde, nicht weil die Verbindungen selbst nicht aktiv
sind, sondern einfach deshalb, weil sie nicht in ausreichend hohen
Konzentrationen in die Zellen gelangen. Ein zweiter Assay für die Aktivierung
des nuklearen Gallsäurerezeptors
wurde erdacht, der solche Verbindungen wirksam auf ihre Aktivierung
testet, die nicht ohne Hilfe die Zellmembran durchqueren können.
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Leber
und Ileum exprimieren gewebespezifische Gallsäuretransportproteine zur effizienten
Aufnahme dieser Verbindungen (Craddock et al., Am. J. Physiol. 274, G157-169
(1998)). Keines dieser Transportproteine wurde in den hier verwendeten
CV-1/COS-Zellen exprimiert. Deshalb wurden CV-1-Zellen mit einem
Humanlebergallsäure-Transportprotein
transfiziert (Zugangsnummer L21893). Die Verwendung dieses Transporters gestattet
es, Gallsäuren
oder von Gallsäure
abgeleitete Verbindungen oder Verbindungen, die auf Grund ihrer strukturellen Ähnlichkeit
mit Gallsäure
durch den Transporter transportiert werden, die auf Grund ihrer
hydrophilen Eigenschaften nicht leicht in die Zelle gelangen, auszuwählen und
bezüglich
ihrer Aktivierung des nuklearen Gallsäure-Rezeptors zu testen. Gallsäuretransporter
aus Nieren- und Darmgewebe können
ebenfalls wirksam verwendet werden. Jeder geeignete unspezifische
Transporter kann ebenfalls verwendet werden.
-
Für den Assay
zur nuklearen Gallsäurerezeptor-Aktivierung
durch hydrophile Gallsäuren
wurden CV-1-Zellen mit CMX-βgal,
EcRE × 6
und FXR + RXR allein (10, linkes Bild) und zusätzlich mit
einem Lebergallsäuretransporter
(10, rechtes Bild) transfiziert. Nach Transfektion
wurden die Zellen mit Konzentrationen von 100 μM der angegebenen Gallsäuren behandelt.
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Obwohl
CA in Abwesenheit des Gallsäuretransporters
(10, linkes Bild) inaktiv war, ermöglichte
die Co-Expression des Lebergallsäuretransporters
CA eine dramatische, 170fache Aktivierung von FXR (10, rechtes
Bild). In ähnlicher
Weise waren die im ersten Assay schwachen oder inaktiven Glycin-
und Taurin-Konjugate von CA, CDCA, DCA and LC als stärker hydrophile
Gallsäuren
in Lebergallsäuretransporter
exprimierenden Zellen hoch wirksam (10, vgl.
rechtes und linkes Bild). Ähnliche
Ergebnisse wurden mit dem darmspezifischen Gallsäuretransporter gefunden (Ergebnisse
nicht gezeigt). Somit war dieser Assay in der Lage zu zeigen, dass
intrazelluläre
CA ein wirksamer FXR-Aktivator ist wie auch die Glycin- und Taurin-Konjugate
der aktiven freien Gallsäuren.
Der Assay kann sowohl zum Test von durch den Gallsäuretransporter
transportierten Verbindungen als auch von nicht durch diesen transportierten
Verbindungen verwendet werden. Die Ergebnisse zeigen auch, dass
FXR und die Gallsäuretransporter
eine gemeinsame, überlappende
Spezifität
haben.
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Zusätzlich zu
den Strukturaktivitätsstudien
wurden Dosis-Response-Analysen für
einige nukleare Gallsäurerezeptorliganden
durchgeführt.
Für diese
in 11 gezeigten Analysen wurden CV-1-Zellen wie oben
mit einem Lebergallsäuretransporter
transfiziert und mit den angegebenen verschiedenen Konzentrationen
für jede
Gallsäure
behandelt. CDCA, DCA und LCA zeigten jeweils eine EC50 von
etwa 50 μM.
Das Struktur-Aktivitäts-Verhältnis (9, 10 und 12)
und das Dosis-Response-Profil
(11) der Gallsäure
für FXR sind ähnlich zu
den für
endogene Gallsäuresensoren
berichteten (Chiang, Front. Biosci., 3, D176-193 (1998), Kanda et
al., Biochem. J. 330, 261–265
(1998), Twisk et al., Biochem. J. 305, 505–511, Zhang et al., J. Biol. Chem.
273, 2424–2428
(1998)). Dies bestätigt
das in diesen Studien verwendete Modell, indem gezeigt wird, dass
die durch diesen Assay ermittelten Ergebnisse gut mit den in vivo-Ergebnissen
korrelieren.
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Außerdem sind
die EC50-Werte der Gallsäure für den nuklearen Gallsäurerezeptor
und die physiologische Konzentration der Gallsäuren eng korreliert. Zum Beispiel
treten die transkriptionellen Auswirkungen von CDCA und DCA bei
Konzentrationen von etwa 50–250 μM auf (Kanda
et al., Biochem. J. 330, 261–265
(1998), Twisk et al., Biochem. J. 305, 505–511 (1995), Zhang et al.,
J. Biol. Chem. 273, 2424–2428
(1998)). Diese Konzentration liegt sehr nahe an der hier für den nuklearen
Gallsäurerezeptor
entdeckten EC50 (50 μM) und stimmt überein mit
der endogenen Konzentration für
diese Komponenten in der Galle (CDCA: 10–150 μM, DCA 5 μM) (Matoba et al., J. Lipid
Res. 27, 1154–1162
(1986)) und in der Intestinalflüssigkeit
(CDCA: 50 μM,
DCA: 320 μM,
LCA: 120 μM)
(McJunkin et al., Gastroenterol. 80, 1454–1464 (1981)). Die EC50 für
den nuklearen Gallsäurerezeptor
stimmt ebenfalls mit der Michaelis-Konstante (KM)
von 3–100 μM für Leber-
und Ileumgallsäuretransportproteine überein (Boyer
et al., Am. J. Physiol. 266, G382-G387 (1994), Wong et al., J. Biol.
Chem. 269, 1340–1347
(1994)). Tatsächlich
reagieren die nuklearen Gallsäurerezeptoren
bei den durch die Gallsäuretransporter
festgestellten intrazellulären
Konzentrationen wirksam auf Gallsäure (vgl. 10,
rechtes Bild).
-
Wie
oben diskutiert enthalten die klassischen nuklearen Rezeptoren modulierende
Ligandenbindungsdomänen,
die heterologen DNA-Bindungsdomänen
Ansprechbar keit auf Liganden verleihen. Um zu untersuchen, ob nukleare
Gallsäurerezeptoren
ebenfalls eine Interaktion mit einem heterodimeren Partner zur Bindung
eines endogenen Liganden mit hoher Affinität benötigen, wurde die Befähigung von
CDCA und LCA zur Aktivierung des Rezeptors in GAL-L-RXR, GAL-L-FXR
oder GAL-L-FXR plus L-RXR co-exprimierenden Zellen getestet. Erwartungsgemäß aktivierten
CDCA und LCA die GAL-L-RXR-Chimäre
nicht (vgl. 13). Jedoch ergab die Co-Expression von GAL-L-FXR
zusammen mit RXR-Ligandenbindungsdomäne (L-RXR) einen Komplex, der
sowohl auf CDCA als auch auf LCA ansprach (13). Nur
eine Ligandenbindungsdomäne
exprimierende Zellen (entweder RXR oder FXR) wurden von keiner der
Gallsäuren
aktiviert. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass das Ansprechen auf
Gallsäure
nicht nur durch FXR-LBD vermittelt wird, was eine intakte FXR AF2-Transaktivierungsdomäne erfordert,
sondern dass die Aktivierung des Rezeptors eine Verbindung mit seinem
Dimerisationspartner erfordert. Zusätzlich zeigten Zeitverlaufsexperimente,
dass LCA und CDCA FXR mit der für
nukleare Rezeptorliganden erwarteten Kinetik aktivieren, d. h. die
Aktivierung wurde innerhalb 1 h nach Zugabe zu den Zellen beobachtet
(Ergebnisse nicht gezeigt).
-
Zur
Bewertung der Befähigung
von CDCA und LCA Co-Aktivator-Rekrutierung zu induzieren, wurden CV-1-Zellen
mit CMX-βgal,
UASG × 4
und GAL-CoA (ein GAL4-Fusionskonstrukt
mit 3 Rezeptorinteraktionsdomänen
des Co-Aktivators SRC-1) transfiziert. Wo in 14 angegeben,
wurden die Zellen auch mit Konstrukten co-transfiziert, die die Ligandenbindungsdomäne von RXR
(L-RXR) und/oder die VP16-Transaktivierungsdomäne fusioniert
mit der Ligandenbindungsdomäne
von FXR (VP-L-FXR)
enthielten. Nach Transfektion wurden die Zellen mit 100 μM CDCA oder
LCA behandelt. Weder CDCA noch LCA waren in der Lage, eine funktionelle
Interaktion zwischen einem GAL4-Co-Aktivatorfusionsprotein (GAL-CoA)
und einer Chimäre
enthaltend die VP16-Transaktivierungsdomäne fusioniert mit FXR-LBD (VP-L-FXR)
zu bewirken. Jedoch induzierten die Gallsäuren in Gegenwart von RXR-LBD
einen 4- bis 7fachen
Anstieg der Aktivität
(14).
-
Co-Aktivator-Rekrutierungs-Assays
sind als zuverlässiges
Verfahren zur Identifizierung und zur Bestimmung der Aktivität bei Orphan-Rezeptorliganden
eingeführt worden
(Blumberg et al., Genes Dev. 12, 1269–1277 (1998), Forman et al.,
Nature 395, 612–615
(1998), Kliewer et al., Cell 92, 73–82 (1998), Krey et al., Mol.
Endocrinol. 11, 779–791
(1997)). Erfindungsgemäß wurde
ein Doppelhybrid-in vitro-Co-Aktivatorrekrutierungs-Assay
für Säuger entwickelt,
um zu untersuchen, ob mutmaßliche
Liganden eine funktionelle Verbindung von FXR und einem Co-Aktivator
als Test für
die Befähigung
eines Liganden, die durch nukleare Gallsäurerezeptoren regulierte Gentranskription
zu modifizieren, bewirken können.
-
In
vitro-Co-Aktivatorrekrutierungs-Assays wurden durch Zugabe des Liganden
zu einer Mischung der folgenden Komponenten durchgeführt: nuklearer
Gallsäurerezeptor,
9-cis Retinsäure-Rezeptor,
ein Co-Aktivator, markiertes nukleares Gallsäurerezeptor-Response-Element
(Sonde). Eine die Rezeptorinteraktionsdomänen des Co-Aktivators GRIP1
enthaltende Polyaminosäure
kann als Co-Aktivator verwendet werden. Jeder funktionelle Co-Aktivator
oder Co-Aktivator-Komplex kann zur Verwendung in diesem Assay in
Betracht gezogen werden. GRIP1 wurde in Bakterien exprimiert und
für diese
Assays gereinigt. Das die drei Rezeptorinteraktionsdomänen der
Mäuse-GRIP1
enthaltende GST-GRIP1-Konstrukt (Arg 625-Lys 765, Zugangsnummer 039060)
fusioniert mit Gluthathion-S-Transferase wurde für die Expression des GRIP1-Co-Aktivators
hergestellt. Weitere geeignete Co-Aktivatoren z.B. PBD/DRIP 205/TRAP
220 sind dem Fachmann bekannt und können für die hier offenbarten erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden. Ein zur Verwendung in diesem Assay geeignetes
Response-Element kann jede im wesentlichen zur DNA-Zielsequenz des
nuklearen Gallsäurerezeptors
homologe Nukleinsäuresonde
sein.
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Jedes
mit dem Assay-System kompatible Assay-System kann verwendet werden.
Im wesentlichen zur DNA-Bindungsregion homologe Oligonukleotidsequenzen,
an die der nukleare Rezeptor bindet, kommen für die erfindungsgemäßen Verfahren
in Betracht. Im wesentlichen homologe Sequenzen (Sonden) sind Sequenzen,
die unter den Assaybedingungen an den ligandaktivierten Rezeptor
binden. Response-Elemente
können durch
dem Fachmann bekannte Verfahren zur Erhöhung oder Ver minderung der
Bindung des Response-Elements an den nuklearen Rezeptor modifiziert
werden.
-
Die
folgenden Response-Elemente wurden in den hier beispielhaft ausgeführten Assays
verwendet: hsp27 EcRE × 6
(Yao et al., Nature 366, 476–479
(1993)), UASG × 4, PPRE × 3 (Forman et al., Cell 81,
687–693 (1995)), βRE2 × 3 (Forman
et al., Nature 115, 612–615
(1998)), LXRE × 3
(Willy et al., Genes Dev. 9, 1033–1045 (1995)), T3RE
(MLV) × 3
(Perlmann et al., Genes Dev. 7, 1411–1422 (1993)), SF1 × 4 (5'-AGCTTAGCCAAGGTCAGAGAAGCTT,
SEQ ID Nr. 3) und DRO × 2
(5'-AAGCTTCAGGTCAAGGTCAGAGAGCTT, SEQ
ID Nr. 4).
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Nach
Zugabe eines mutmaßlichen
Liganden zu der oben beschriebenen Mischung von Komponenten und
Durchmischen wurde die Mischung unter definierten Bedingungen inkubiert.
Die Bildung von Komplexen in der Mischung wurde wie in 15 gezeigt
durch die Verschiebung der elektrophoretischen Beweglichkeit analysiert,
es kann jedoch jedes Verfahren zur Trennung der in der Mischung
gebildeten Komplexe von den Einzelbestandteilen verwendet werden,
solange es zur Abtrennung der markierten Komplexe von den anderen Bestandteilen
der Mischung ausreicht. Techniken wie zum Beispiel Dünnschichtchromatographie,
HPLC, Größenausschlusschromatographie,
Sedimentation, Immunseparationstechniken oder weitere dem Fachmann bekannte
geeignete Verfahren können
verwendet werden.
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Erwartungsgemäß versagten
die FXR-RXR-Heterodimere bei der Rekrutierung des Co-Aktivators
in Abwesenheit von Ligand (15, Bahn
1). Bei den in 15 dargestellten Ergebnissen
war wichtig, dass die Zugabe von LCA den Hauptanteil der Heterodimere
in einen Komplex mit dem Co-Aktivator GRIP1 verschob (Bahn 2). Ähnliche
Resultate wurden mit Glyco-LCA (Bahn 3) und mit LG268 (Bahn 4) erhalten.
Zur Unterscheidung zwischen der Bindung durch die FXR- und RXR-Untereinheiten
wurden die Co-Aktivatorrekrutierungs-Assays unter Ersetzen von RXR
durch RXRm wiederholt (vgl. 15, Bahnen
5–8).
Bezeichnenderweise rekrutierten sowohl LCA- (Bahn 6) als auch Glyco-LCA-
(Bahn 7) Co-Aktivator, wohin gegen LG268 inaktiv war (Bahn 8). Diese
in vitro-Ergebnisse zeigen, dass Lithocholsäure (LCA) und deren Glycin-Konjugat FXR-spezifische
Liganden sind.
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Während LCA
und Glyco-LCA im in vitro-Co-Aktivatorrekrutierungs-Assay, einem
Standardverfahren zur Bestimmung der Ligandenaktivität, aktiv
waren, waren andere aktive Gallsäuren
einschließlich
CA, CDCA und DCA weniger wirksam bei der GRIP1-Rekrutierung oder
den verwandten Co-Aktivatoren SRC-1 und ACTR (Ergebnisse nicht gezeigt).
Auf der Grundlage ihrer gemeinsamen Strukturen, Aktivitäten und
Aktivierungskinetiken sind CA, CDCA und DCA alle FXR-Liganden, obwohl
sie auch einen der vielen anderen, unlängst beschrieben nuklearen
Rezeptor-Co-Aktivatoren
benutzen können
(vgl. zum Beispiel Blanco et al., Genes Dev. 12, 1638-1651 (1998), Fondell
et al., PNAS USA 96, 1959–1964
(1999)).
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Der
Co-Aktivatorrekrutierungs-Assay wies effizient Verbindungen nach,
die zur Bildung einer funktionellen Bindungsbeziehung mit dem Response-Element
der DNA in der Lage waren, die ein nukleares Gallsäure-Rezeptor-Zielgen
reguliert. Gallsäuren
können
die Transkription mehrerer Gene einschließlich Cyp7a und Sterin-27-hydroxylase hemmen
(Chiang, Front. Biosci. 3, D176-193 (1998)). Zusätzlich zur Hemmung durch seine
Gallsäure-Endprodukte
wird die Cyp7a-Transkription durch die Akkumulation des Substrats
Cholesterin stimuliert. Die Reaktion auf Cholesterin wird durch
den Oxysterin-Rezeptor LXRα vermittelt
(Peet et al., Cell 93, 693–704
(1998)). Somit ist die Kontrolle des Cholesterinabbaus zu Gallsäuren durch
den Cyp7a-Stoffwechselweg Gegenstand einer positiven Rückkopplung
durch Cholesterin und einer negativen Rückkopplung durch Gallsäuren wie
im folgenden Diagramm gezeigt.
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Wie
auch im Fall des nuklearen Gallsäurerezeptors
benutzt LXRα RXR
als obligatorischen Dimerisationspartner. LXRα-RXR-Heterodimere sind konstitutiv
aktiv, wahrscheinlich aufgrund des Vorliegens endogener LXR-Liganden
(Apfel et al., Mol. Cell. Biol. 14, 7025–7035 (1994), Forman et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94,10588-10593 (1997), Willy et al., Genes Dev.
9, 1033–1045
(1995)), sind jedoch allein inaktiv.
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FXR
und LXRα werden
in mehreren Geweben co-exprimiert (Leber, Darm und Niere). Deshalb
wurde eine Serie von Assays zur Untersuchung durchgeführt, ob
Gallsäuren
eine Auswirkung auf die Tanskriptionskontrolle durch LXRα haben. Ähnliche
Experimente wurden mit dem Schildrüsenhormon-Rezeptor (T3R) durchgeführt, der ebenfalls durch Cyp7a-Transkription
in der Leber hochreguliert wird (vgl. Crestani et al., Biochem.
Bioghys. Res. Commun. 198, 546–553
(1994)). In Rezeptoraktivierungs-Assays unter Verwendung von LXRE
X3-TK-Luc zeigten LXRα und
RXR allein geringe Aktivität,
aktivierten aber bei gemeinsamer Expression konstitutiv den LXR-Reporter (Ergebnisse
nicht gezeigt). Co-Expression von RXR hatte nur eine leichte Auswirkung
auf die T3-Ansprechbarkeit, was anzeigt, dass anders als bei LXRα und FXR
endogene Spiegel von RXR zum Aufrechterhalten der T3R-Funktion
ausreichend sind.
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Um
zu bestimmen, ob der mit Ligand besetzte Gallsäure-Rezeptor LXRα hemmt, wurden
CV-1-Zellen mit CMX-βgal,
LXRE × 3
und den die in 16, linkes Bild angegebenen
Rezeptoren enthaltenden Expressionsvektoren transfiziert. Die Assays
wurden in Gegenwart oder Abwesenheit eines FXR-Expressionsvektors durchgeführt. Die
Zellen wurden entweder mit Konzentrationen von 0 μM oder 10,0 μM CA oder
CDCA behandelt. „(x)fach-Suppression" in der Figur stellt
die Hemmung der konstitutiven Aktivität von LXR durch diese nuklearen
Gallsäurerezeptor-Liganden
dar. Das rechte Bild von 16 zeigt
wie oben transfizierte Zellen, wobei LXRE × 3 durch T3R
ersetzt wurde. Bei diesen Assays wurden die Zellen mit 100 nM T3 behandelt, entweder allein oder in Gegenwart
von 100 μM
LCA oder CDCA. „(x)fach-Suppression" im rechten Bild
stellt die Hemmung der durch T3 stimulierten
Aktivität
dar.
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In
Abwesenheit des nuklearen Gallsäurerezeptors
hatten Gallsäuren
wenig Auswirkung auf die LXRα-Aktivität. Jedoch
verursachten sie in dessen Gegenwart eine dramatische 4-8fache Unterdrückung der
LXRα-Aktivität (vgl. 16).
Diese Hemmung wurde durch Zugabe von LXR-Liganden herabgesetzt (Ergebnisse nicht
gezeigt). Gallsäure-abhängige Suppression
hatte keine Auswirkung auf T3-Ansprechbarkeit
und war LXRα-spezifisch.
Somit besitzen LXRα und
FXR gegenteilige metabolische Funktionen, wobei FXR als Gallsäuresensor
wirkt, der LXRα als
Reaktion auf physiologisch relevante Gallsäuren hemmt. Da LXRα ein positiver Regulator
der Cyp7a-Transkription ist, stellt dieses molekulare Verbindungsglied
zwischen LXRα- und FXR-Signalen
einen Mechanismus zur negativen Regulierung LXRα-abhängiger Gene durch Gallsäure dar.
Die hier beschriebenen Assays sind somit nützlich zur Selektion von Verbindungen,
die auch die Transkription dieser Gene modifizieren können.
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen mutmaßlicher
FXR-Liganden bereit, die als Agonisten oder Antagonisten des FXR-Rezeptors
wirken können
und die deshalb therapeutisch oder prophylaktisch bei der Kontrolle
des Cholesterin-Stoffwechsels
verwendet werden können.
Die oben beschriebenen und nachfolgend beispielhaft dargestellten
Assays stellen Verfahren zur Selektion von Verbindungen bereit,
die die Transkription von durch den Gallsäure-Rezeptor regulierten Genen
modulieren. Die Erfindung ist weiterhin in den folgenden Beispielen
beschrieben und veranschaulicht, die nicht einschränkend gemeint
sind.
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Transienter
Transfektions-Assay für
FXR-Aktivität
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CV-1-Zellen
wurden in Dulbeccos modifiziertem, mit 10% über ein Aktivkohlebett abgereichertem,
fötalem
Rinderserum, 50 U/ml Penicillin G und 50 μg/ml Streptomycinsulfat supplementierten
Eagles-Medium (DMEM-FBS) bei 37°C
in 5% CO2 kultiviert. Einen Tag vor Transfektion
wurden die Zellen mit 50–80%
Konfluenz unter Verwendung von phenolrotfreiem DMEM-FBS ausplattiert.
Die Zellen wurden transient durch Lipofektion transfiziert (Forman
et al., Cell 81, 687–693
(1995)). Den Herpesvirus-Thymidinkinase-Promotor (–105/+51)
verbunden mit dem Ecdyson-Response-Element
(EcRE × 6)
enthaltende Luciferase-Reporterkonstrukte (300 ng/105 Zellen)
und Cytomegalovirus getriebene Expressionsvektoren (20–50 ng/105 Zellen) wurden zusammen mit CMX-ßgal als
interne Kontrolle zugegeben. Säuger-Expressionsvektoren
wurden von dem Plasmid pCMX abgeleitet, das den Cytomegalovirus-Promotor/Enhancer
gefolgt von einem Promotor des Bakteriophagen T7 zur in vitro-Transkription
enthält.
Es wurden zwei Assays parallel durchgeführt, einer unter Verwendung
von mit CMX-βgal,
EcRE × 6,
FXR und RXR enthaltenden Expressionsvektoren transfizierten Zellen und
einer unter Verwendung von mit CMX-ßgal,
EcRE × 6,
FXR und RXRm enthaltenden Expressionsvektoren transfizierten Zellen.
Nach Inkubation mit Liposomen während
2 h wurden die Liposomen entfernt und die Zellen für etwa 45
h mit phenolrotfreiem, 100 μM
CDCA enthaltendem DMEM-FBS behandelt. Nach Liganden-Exposition wurden
die Zellen geerntet und gemäß bekannten
Verfahren auf Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivität getestet.
Alle Messpunkte wurden dreifach bestimmt und variierten um weniger
als 15%. Jedes Experiment wurde drei oder mehrmals mit ähnlichen
Ergebnissen wiederholt.
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Beispiel 2: Transienter,
für hydrophile
Verbindungen geeigneter Transfektions-Assay für FXR-Aktivität
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Es
wurde ein Assay wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass
die Zellen auch mit einem pcDNA-Expressions-Vektor für den humanen
Lebergallsäuretransporter
co-transfiziert wurden.
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Beispiel 3: Assay zum
Screenen von Verbindungen, die die Transkription des nuklearen Gallsäurerezeptor-Zielgens
modulieren
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CV-1-Zellen
wurden in Dulbeccos modifiziertem, mit 10% über ein Aktivkohlebett abgereichertem,
fötalen
Rinderserum, 50 U/ml Penicillin G und 50 μg/ml Streptomycinsulfat supplementierten
Eagles-Medium (DMEM-FBS) bei 37°C
in 5% CO2 kultiviert. Einen Tag vor Transfektion
wurden die Zellen mit 50–80%
Konfluenz unter Verwendung von phenolrotfreiem DMEM-FBS ausplattiert.
Die Zellen wurden durch Lipofektion unter Verwendung von N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-ammoniummethylsulfat
gemäß den Vorschriften
des Herstellers (Boehringer Mannheim) transfiziert.
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Die
CV-1-Zellen wurden mit unter Verwendung von CMX-ßgal, die Ligandenbindungsdomäne von RXR
(L-RXR) und die Ligandenbindungsdomäne von FXR (L-FXR) enthaltenden
Konstrukten und eines den Herpesvirus-Thymidinkinase-Promotor (–105/+51)
verbunden mit einer angegebenen Anzahl von Kopien des Response-Elements
Hsp27 EcRE × 6
enthaltenden Luciferase-Reporterkonstruktes transfiziert. Ein Parallelassay
wurde durchgeführt,
bei dem die Ligandenbindungsdomäne
von RXR (Zugangsnummer X52773) durch die Ligandenbindungsdomäne RXRm
ersetzt wird. Nach Transfektion wurden die Zellen mit variierenden
Konzentrationen der als Gallsäurerezeptor-Agonisten
oder Antagonisten in Frage kommenden Verbindungen während etwa
45 h in phenolrotfreiem DMEM-FBS behandelt. Nach Exposition gegenüber diesen
Verbindungen wurden die Zellen geerntet und auf Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivität getestet.
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Beispiel 4: Assay zum
Screenen von Verbindungen, die die Transkription des nuklearen Gallsäurerezeptor-Zielgens
modulieren
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Ein
Assay zum Screenen von Verbindungen wird gemäß Beispiel 3 durchgeführt, mit
der Ausnahme, dass die Zellen außerdem mit einem pcDNA-Expressions-Vektor
für den
humanen Lebergallsäuretransporfer co-transfiziert
werden.
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Beispiel 5 Assay zum Screenen
von Verbindungen, die die Transkription des nuklearen Gallsäurerezeptor-Zielgens
modulieren
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Ein
Assay zum Screenen wird gemäß Beispiel
3 durchgeführt,
mit der Ausnahme, dass der Parallelassay unter Verwendung des das
RXRm enthaltende Expressionskonstrukt ausgelassen wird.
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Beispiel 6: Co-Aktivatorrekrutierungs-Assay
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GST-GRIP1
wurde in E. coli exprimiert und über
Glutathion-Sepharose-Säulen
gereinigt. In vitro translatiertes FXR + RXR (15,
rechtes Bild) und GST-GRIP1 (5 μg)
wurden während
30 min bei Raumtemperatur mit 100 000 cpm einer Klenowmarkierten
hsp27 EcRE-Sonde (5'-AGCTCGATGGACAAGTGCATTGAACCCTTGAAGCTT,
SEQ ID Nr. 5) in 10 mM Tris pH 8, 50 mM KCl, 6% Glycerin, 0,05%
NP-40, 1 mM DTT, 12,5 ng/μl
Poly dl·dC
und dem auf Co-Aktivatorrekrutierung zu testendem Liganden inkubiert.
Die Komplexe wurden über
ein 5%iges Polyacrylgel in 0,5 × TBE
(45 mM Tris, 45 mM Borsäure,
1 mM EDTA) bei Raumtemperatur einer Elektrophorese unterworfen.
Die elektrophoretische Beweglichkeit zeigte die Rekrutierung von Co-Aktivator
an.
