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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Cholesterin
ist für
eine Vielzahl zellulärer
Aktivitäten,
einschließlich
Membranbiogenese, Steroid- und Gallsäurebiosynthese, Caveolen-Bildung
und kovalente Proteinmodifikation unverzichtbar. Die weit verbreitete Verwendung
von Cholesterin bei verschiedenen Stoffwechselwegen bedeutet, dass
eine minimale Blutkonzentration aufrechterhalten werden muss. Auf
der anderen Seite ist ein Überschuss
zirkulierenden Cholesterins ein Hauptrisikofaktor bei der Entwicklung
der arteriosklerotischen Herzerkrankung, der hauptsächlichen
Todesursache in den USA mit nahezu 500.000 Todesfällen pro
Jahr.
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Die
Cholesterin-Spiegel im Kreislauf werden durch zelluläre Aufnahme,
Synthese und Abbau (Brown und Goldstein, Cell 89, 331–340, 1977)
reguliert. Entfernen eines Überschusses
an Cholesterin wird durch die Tatsache erschwert, dass es ein unlösliches
Lipid ist, von dem das meiste in Zellmembranen eingebettet ist. Der
hauptsächliche
Abbauweg für
Cholesterin ist die metabolische Umwandlung zu Gallsäuren, die
weniger hydrophob und daher leichter aus der Zelle zu entfernen
sind als Cholesterin. Die Umwandlung zu Gallsäuren erfolgt ausschließlich in
der Leber. Ein chemischer Stoffwechselweg bei dieser Umwandlung
wird durch das, das Ausmaß dieses
Stoffwechselweges begrenzende Enzym Cholesterin-7α-Hydroxylase
(Cyp7a) in Gang gesetzt. Beim Menschen wird Cholesterin sowohl über den
7α-Hydroxylase- als auch über den
Sterin-27-Hydroxylase-Stoffwechselweg zu Gallsäuren umgewandelt.
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In
vivo werden Gallsäuren
von Hepatocyten und intestinalen Mikroorganismen metabolisiert,
wobei eine große
Anzahl verschiedener Produkte entsteht. Die Existenz so vieler chemisch
verwandter Produkte und die komplexen biochemischen Stoffwechselwege
gestalten das Isolieren und das Untersuchen der Wirkungen einzelner
Komponenten schwierig. Siehe Elliott und Hyde, Am. J. Med. 51, 568–579, 1971).
Zum Beispiel sind Chenodesoxycholsäure (CDCA, 5β-Cholansäure-3α,7α- diol) und Cholsäure (CA,
5β-Cholansäure-3α,7α,12α-triol) zwei
der hauptsächlichen
Endprodukte der Gallsäurebiosynthese
(Chiang, Front. Biosci. 3, D176–193,
1998; Vlahcevic et al., Hepatology 13, 590–600, 1991). Beide werden ausschließlich in
der Leber hergestellt, wo sie durch Konjugation mit Taurin oder
Glycin weiter metabolisiert werden können. Diese Gallsäuren werden
in den Intestinalraum ausgeschüttet,
im Ileum reabsorbiert und über
den Pfortaderkreislauf in die Leber zurücktransportiert. Während ihres Übergangs
in den Intestinalraum unterlaufen die primären Gallsäuren wie CDCA und CA eine mikrobiell
vermittelte 7α-Dehydroxylierung
und werden dann zu Lithocholsäure (LCA,
5β-Cholansäure-3α-ol) bzw.
Desoxycholsäure
(DCA, 5β-Cholansäure-3α,12α-diol) umgewandelt
(Elliott und Hyde, Am. J. Med. 51, 568–579, 1971; Hylemon, „Metabolism
of Bile Acids in Intestinal Microflora" in Sterols and Bile Acids; H. Danielsson
und J. Sjovall, Hrsg. (New York, Elsevier), S. 331–344, 1985).
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Zusätzlich zu
ihren metabolischen Funktionen wirken Gallsäuren auch als Signalmoleküle, die
ihre eigene Biosynthese negativ regulieren. Insbesondere wirken
Gallsäurebestandteile
in einer negativen Rückkopplungsschleife,
die die Gallsäureproduktion
durch Hemmung der Expression des Cyp7a-Enzyms limitiert. Während es
bekannt ist, dass mehrere Gallsäurebestandteile
diese negative Rückkopplung
induzieren können,
sind die Beschaffenheit des Gallsäure-Sensors, der das Gallsäuresignal überträgt und der
Mechanismus, durch den er dies bewirkt, bisher unbekannt geblieben. Über die
Hemmung von Cyp7a ist jedoch bekannt, dass sie auf der Transkriptionsebene
auftritt, und negative Gallsäure-Response-Elemente
sind im Cyp7a-Promotor gefunden
worden. Für
Gallsäuren
wurde außerdem
gezeigt, dass sie die Sterin-27-hydroxylase herunterregeln, das
Enzym, das an der Umwandlung von Cholesterin zu Gallsäuren über verschiedene
Stoffwechselwege beteiligt ist. Siehe Twisk et al., Biochem. J.
305, 505–511,
1995.
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Nukleare
Rezeptoren sind liganden-modulierte Transkriptionsfaktoren, die
die Transkriptionswirkungen von steroidalen, thyroidalen und retinoidalen
Hormonen vermitteln. Diese Rezeptoren haben konservierte DNA-Bindungsdomänen (DBD),
die spezifisch an die DNA der cis-wirksamen Elemente in den Promotoren
ihrer Zielgene und Ligandenbindungsdomänen (LBD) binden, was eine
spezifische Aktivierung der Rezeptoren durch ein bestimmtes Hormon
oder andere Faktoren ermöglicht.
Transkriptionelle Aktivierung des Zielgens eines nuklearen Rezeptors
tritt auf, wenn der zirkulierende Ligand an die LBD bindet und eine
Konformationsänderung
im Rezeptor bewirkt, die die Rekrutierung eines Coaktivators erleichtert.
Rekrutierung eines Coaktivators führt zur Bildung eines Rezeptorkomplexes,
der eine hohe Affinität
für eine
spezifische DNA-Region hat und der die Transkription eines spezifischen
Gens modulieren kann. Rekrutierung eines Coaktivators nach Bindung
eines Agonisten ermöglicht
dem Rezeptor die Aktivierung der Transkription. Bindung eines Rezeptor-Antagonisten induziert
einen anderen Konformationswechsel im Rezeptor, so dass die Coaktivatorrekrutierung zu
einer unproduktiven Interaktion mit der basalen Transkriptionsmaschinerie
des Zielgens führt.
Wie für
den Fachmann offensichtlich, wird ein eine negative Transkriptionskontrolle über ein
bestimmtes Gen ausübender Rezeptoragonist
die Expression dieses Gens in der Tat herabsetzen. Umgekehrt wird
ein Antagonist eines solchen Rezeptors die Genexpression steigern.
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Mindestens
zwei Klassen nuklearer Coaktivatoren sind identifiziert worden.
Die erste Klasse beinhaltet die CBP- und SRC-1-verwandten Proteine,
die mittels ihrer Histonacetylaseaktivität die Chromatinstruktur modulieren.
Eine zweite Klasse beinhaltet PBD/DRIP 205/TRAP 220, das Teil eines
großen
transkriptionellen Komplexes ist, für den eine direkte Interaktion
mit der basalen Transkriptionsmaschinerie postuliert wird.
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Zusätzlich zu
den bekannten klassischen nuklearen, auf spezifische, identifizierte
Hormone reagierenden Hormonrezeptoren sind mehrere Rezeptoren ohne
bekannte Liganden, sogenannte Orphanrezeptoren, identifiziert worden.
Diese Orphanrezeptoren beinhalten zum Beispiel FXR, CARβ, PPARα, PPARδ, TR2-11, LXRα, GCNF, SF1,
RORα, Nurr1,
DAX und ERR2. Für
den Orphanrezeptor FXR (Farnesoid X-aktivierter Rezeptor) ist bekannt,
das er Cyp7a hemmt. Er bindet an sein Response-Element als Heterodimer
mit RXR (9-cis Retinsäure-Rezeptor),
das durch RXR-Liganden aktiviert werden kann.
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Es
wurde die Hypothese aufgestellt, dass Orphanrezeptoren als Sensoren
für einige
metabolische Signale, einschließlich
Fettsäuren,
Prostanoide und Metabolite von Farnesol und Cholesterin wirken.
Seit den Pioneer-Studien über
das lac-Operon ist es gut etablierter Wissensstand, dass bei Hefe
und Bakterien Intermediärmetaboliten
als Signalmoleküle
dienen (Gancedo, Microbiol. Mo. Biol. Rev. 62, 334–361, 1998),
Ullmann, Biochimie 67, 29–34,
1985). Das Verständnis
der Metabolit-Kontrolle bei Säugern
wurde durch die Notwendigkeit erschwert, metabolische Signale und
ihre verwandten Sensoren zu identifizieren.
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Frühere Studien über den
Gallsäure-Signalstoffwechselweg
in der Leber wurden unter Einsatz intakter Tiere oder von Hepatocyten
in Zellkultur durchgeführt.
Mit dieser Versuchsanordnung war man nicht in der Lage, zu entdecken
welche Verbindungen die letztendlichen Gallsäure-Signalmoleküle sind,
weil die Gallsäuren in
diesen Systemen durch intestinale Mikroorganismen und/oder leberspezifische
Enzyme einer metabolischen Umwandlung zu einer Anzahl verschiedener
Produkte unterzogen wurden. Der Rezeptor, der als Sensor für Cholesterin-
und Gallsäuresignale
fungiert, wurde daher nicht identifiziert.
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Da
die Hemmung des Cholesterinabbaus durch Gallsäuren die Menge an Cholesterin
limitiert, die in Form von Gallsäuren
ausgeschieden werden kann, wäre
die Identifizierung des den Gallsäure- und Cholesterin-Metabolismus
regulierenden nuklearen Rezeptors ein bedeutender Fortschritt bei
der Entwicklung von Behandlungsmodalitäten für Patienten mit Hypercholesterinämie oder
anderen Erkrankungen im Zusammenhang mit den Aktivierungspegeln
eines durch diesen Rezeptor regulierten Gens. Das derzeitige Unvermögen, die
Transkription oder Expression von durch Gallsäure regulierten Genen zu beeinflussen,
zum Beispiel die durch Gallsäuren
auf den Cholesterinabbau ausgeübte
negative Rückkopplung,
stellt einen schwerwiegenden Stolperstein bei der Behandlung von
Patienten mit dieses Gen betreffenden Erkrankungen, zum Beispiel
Hypercholesterinämie,
dar. Bei jeder Erkrankung, bei der ein Defekt in der Regulation
eines Gens unter der Kontrolle eines nuklearen Gallsäurerezeptors
involviert ist, würde
durch Modifikation der Rezeptoraktivität eine Verbesserung erzielt
werden. Für
den nuklearen Gallsäure- Sensor wurde gezeigt,
dass er auf Gallsäuren
entweder durch Stimulation oder Unterdrückung der Expression des Zielgens
reagiert. Diese Aktivitäten
werden durch positive FXR-Response-Elemente innerhalb dieser Gene
vermittelt. Zum Beispiel unterdrücken
Gallsäuren
in koordinierter Weise die Transkription von leber-, ileum- oder nieren-spezifischen
Gallsäure-Transportmolekülen (Torchia
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 225, 128–133, 1996), Sterin-27-hydroxylase (Cyp27);
(Twisk et al., Biochem. J. 305, 505–511, 1995) und Sterin-12α-hydroxylase
(Cyp12) (Einarsson et al., J. Lipid Res. 33, 1591–1595, 1992).
Deshalb könnten
schädliche
metabolische Erkrankungen, die entweder durch Stimulation oder durch
Suppression eines Gallsäurerezeptor-Zielgens
verbessert werden könnten,
mit Gallsäurerezeptorliganden
behandelt werden.
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Folglich
besteht ein Bedarf an Verbindungen und Verfahren zur Modulation
der durch Gallsäuren
regulierten Genexpression. Ein weiterer Bedarf besteht an Verfahren
zum Screenen zur Identifizierung von Verbindungen, die eine pharmakologische
Intervention zur Modifikation der Transkriptionsregulation von durch Gallsäure regulierten
Genen bereitstellen. Solche Verbindungen und Verfahren wären für die Patienten
von Nutzen, die von einer Modifikation der durch Gallsäure regulierten
Gentranskription profitieren würden,
wie zum Beispiel solche Patienten, die an Hypercholesterinämie leiden.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Screenen von den
Cholesterinabbau modifizierenden pharmakologisch wirksamen Verbindungen
bereit, das die Bestimmung umfasst, ob eine Verbindung die Aktivierung
des FXR-Rezeptors
inhibitiert, wodurch der Cholesterinabbau gesteigert wird.
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Ggf.
umfasst das Verfahren das in Kontakt bringen einer Mischung von
FXR und RXR mit einer Verbindung und die Bestimmung, ob die Verbindung
die Bildung von FXR-RXR-Heterodimeren fördert.
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Ggf.
umfasst das Verfahren das in Kontakt bringen einer Mischung von
FXR, RXR und einem bekannten FXR-Agonisten mit einer Verbindung
und die Bestimmung, ob die Verbindung die Bildung eines FXR-RXR-Heterodimers
fördert.
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Ggf.
umfasst das Verfahren das in Kontakt bringen einer Mischung von
FXR, RXR, einem FXR-RXR-Coaktivator und einem bekannten FXR-Agonisten
mit einer Verbindung und die Bestimmung, ob diese Verbindung die
Agonist-geförderte
Coaktivatorrekrutierung durch ein FXR-RXR-Heterodimer inhibiert.
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In
einer Ausführungsform
der Erfindung umfasst das Verfahren: (a) Transfizieren von Säugerzellen
mit einem für
FXR kodierenden Gen unter der Kontrolle eines operativen Promotors,
(b) Transfizieren der Zellen mit einem operativen Reportergen unter
Kontrolle eines Promotors, der mit einer für ein operatives Responseelement
kodierenden DNA-Sequenz verbunden ist, an die ligand-aktivierter
FXR- oder ligand-aktivierter FRX-Komplex
zur Transkriptionsinitiation des Reportergens bindet, (c) Kultivieren
der Zellen in Gegenwart einer Verbindung im Screeningverfahren und
(d) Überwachung
der Zellen hinsichtlich Transkription oder Expression des Reportergens
als Hinweis auf FXR-Aktivierung. Vorteilhafterweise können die
Zellen ebenfalls mit einem für
RXR oder RXRm kodierenden Gen transfiziert werden, wobei letzteres
ein Hilfsmittel bereitstellt, um Verbindungen, die FXR aktivieren
von denen zu unterscheiden, die RXR aktivieren. Wenn es in Gegenwart eines
bekannten FXR-Liganden
durchgeführt
wird, ist das Verfahren nützlich
zur Identifizierung von FXR-Antagonisten.
Eine weitere Modifikation dieses Verfahrens umfasst das Transfizieren
von Zellen mit einem, für
ein Gallsäuretransporter-Molekül kodierenden
Gen unter Kontrolle eines operativen Promotors. Die Expression eines
Transportmoleküls
bewirkt den Transport hydrophiler Moleküle über die Zellmembran und ermöglicht so den
Nachweis ihrer Fähigkeit
zur Modulation der Aktivierung des FXR-Rezeptors.
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Der
Fachmann wird noch weitere erfindungsgemäße und in den Schutzumfang
der Ansprüche
fallende Ausführungsformen
erkennen.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 stellt
Daten aus einem Aktivierungsassay von FXR-RXR-Heterodimeren und
mehreren weiteren Orphanrezeptoren mit Gallextrakt bereit. Die Rezeptoren,
von denen jeder dem Fachmann bekannt ist und die hierin ferner durch
ihre Genbank-Akzessionsnummer
identifiziert sind, sind CARβ,
PPARα, PPARδ, TR2-11, LXRα, GCNF, SF1,
RORα, Nurr1,
DAX und ERR2.
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2 stellt
Daten zum Vergleich der Aktivierung durch einen synthetischen spezifischen
RXR-Liganden, LG268, durch chimäre,
die Hefe-GAL4-DNA-Bindungsdomäne fusioniert
mit der Wildtyp-RXR-Ligandenbindungsdomäne oder durch eine mutierte
RXR (RXRm)-Ligandendomäne
bereit.
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3 ist
ein Autoradiogramm, das die Ergebnisse von elektrophoretischen Mobilitätsexperimenten zeigt,
wobei die Bildung von Rezeptor-Coaktivator-Komplexen mit Wildtyp-RXR (RXR-CoA)
oder mutiertem RXR (RXRm-CoA) bei steigenden Konzentrationen von
RXR-Ligand LG268 gezeigt wird.
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4 stellt
quantitative Daten für
die in 3 gezeigten Ergebnisse bereit.
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5 stellt
die Aktivierung von RXR- und FXR-Heterodimeren durch den RXR-Liganden LG268 und einen
Gallsäureextrakt
vergleichende Daten bereit.
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6 zeigt
FXR-, RXR- und RXRm-Aktivierungsdaten von aus präparativer Dünnschichtchromatographie von
Gallextrakt erhaltenen Fraktionen.
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7 zeigt
das schrittweise Verfolgen der Absorption von Fraktion B aus 6 bei
Umkehrphasen-HPLC.
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8 stellt
Daten bereit, die zeigen, dass der HPLC-Peak Z aus 7 FXR-RXRm stark aktiviert, aber
keine Wirkung auf RXR hat.
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9 zeigt
den Pegel der FXR-Aktivierung durch mehrere verschiedene freie Gallsäuren. Das
Juvenilhormon III und der RXR-Ligand LG268 wurden als Kontrollen
eingeschlossen. UDCA zeigt Ursodesoxycholsäure (5β-Cholansäure-3α,7β-diol).
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10 zeigt
den Pegel der FXR-Aktivierung durch unkonjugierte und entweder mit
Glycin oder Taurin konjugierte CA, CDCA, DCA und LCA in Gegenwart
oder Abwesenheit des Lebergallsäure-Transporters.
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11 stellt
dosisabhängige
FXR-Aktivierungs-Responsedaten für
CDCA, DCA und LCA bereit. Der EC50-Wert
für jede
der Verbindungen war etwa 50 μM.
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12 fasst
die in den vorigen Figuren angegebenen, aus der Struktur-Aktivitätsinformation
erhaltenen Daten zusammen. ++ zeigt > 200-fache und + 100–150fache Aktivierung der FXR-RXR-Heterodimere
an.
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13 stellt
Daten bereit, die zeigen, dass sowohl CDCA als auch LCA die Transkription
in Zellen aktivieren, die eine GAL-L-FXR-Chimäre und RXR-LBD (L-RXR) coexprimieren.
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14 zeigt
Daten, die die sowohl von der Anwesenheit der RXR- als auch der
RXR-Ligandenbindungsdomänen
abhängige
Aktivierung nach Rekrutierung eines GaL-4-Coaktivator-Fusionsproteins (GAL-CoA)
in einem Säuger-Two-Hybrid-Assay
nachweist.
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15 zeigt
Daten der elektrophoretischen Mobilität, die die Coaktivatorrekrutierung
durch unterschiedliche Liganden in Gegenwart von FXR und RXR oder
FXR und RXRm nachweist.
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16 zeigt
die Aktivierung eines LXR-Reportergens durch LXR, RXR oder beide
in Gegenwart von FXR (linkes Feld) und die Aktivierung des T3R (Triiodthyronin-Rezeptor) durch T3Rβ, RXR oder
beide in Gegenwart von FXR und zugegebenem Ligand (rechtes Feld).
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen
bereit, die FXR hemmen und die nützlich
in einem Verfahren zur Modulierung der Transkription der durch den
als FXR-Rezeptor identifizierten, nuklearen Gallsäurerezeptor
(BAR) regulierten Gene sind.
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Es
ist gefunden worden, dass Gallextrakte spezifisch den Orphanrezeptor
FXR aktivieren. Ein aktives endogenes, diesen Rezeptor aktivierendes
Gallsäuresignalmolekül wurde
bis zur Homogenität
gereinigt und als Chenodesoxycholsäure identifiziert (CDCA). Weitere
Analysen und Struktur-Aktiviätsstudien
machten deutlich, dass CA, DCA und LCA ebenfalls FXR aktivieren.
Zusätzlich
wurde für
LCA gefunden, dass es in vitro die Coaktivatorrekrutierung fördert.
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Um
zu verifizieren, dass eine Gallsäure-Komponente
in der Lage war, an den FXR-Orphanrezeptor
zu binden und diesen zu aktivieren, wurde ein Extrakt aus Schweinegalle
(Sigma) hergestellt und an einer Anzahl nuklearer Orphanrezeptoren
getestet. Die zu testenden Rezeptoren wurden in von COS-Zellen abstammenden
CV-1-Zellen exprimiert. Die Zellen sind in Boyer et al., Am. J.
Physiol. 266, G382–G387,
1994, beschrieben.
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Die
Verwendung eines Standardmodels für heterologe Zellsysteme zur
Rekonstitution der Gallsäurereaktivität erlaubt
es, die Aktivität
in Abwesenheit des metabolischen Ereignisses zu überwachen, das den zu testenden
Prozess verschleiern könnte.
Jedes geeignete heterologe Zellsystem kann zum Testen der Aktivierung
potentieller oder bekannter nuklearer Gallsäurerezeptorliganden verwendet
werden, solange die Zellen transient, mit der entsprechenden, die
Rezeptoren, Reportergene, Responseelemente und dergleichen exprimierenden
DNA transfiziert sein können.
Zellen, die konstitutiv ein oder mehrere der erforderlichen Gene
exprimieren, können
ebenfalls verwendet werden. Dem Fachmann sind für die transiente Expression
von Säugergenen
geeignete und der Aufrechterhaltung in Zellkultur zugängliche
Zellsysteme gut bekannt.
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Tabelle
1. Reporter/Rezeptor-Paare für
den Orphanrezeptor-Aktivierungsassay
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Um
die Aktivierung von verschiedenen Orphanrezeptoren durch Gallsäure zu testen,
wurden CV-1 Zellen transient mit Expressionsvektoren für die in 1 angegebenen
Rezeptoren zusammen mit geeigneten Reporterkonstrukten gemäß dem Fachmann
bekannten Methoden transfiziert. Geeignete Reportergenkonstrukte
sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Biochemie und Molekularbiologie
gut bekannt. Die in dem in 1 dargestellten
Assay verwendeten Reporter/Rezeptor-Paare sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Alle Transfektionen enthielten zusätzlich CMX-βgal
als interne Kontrolle. Passende Konstrukte zur Verwendung in diesen Studien
können
in geeigneter Weise in pCMX kloniert werden. pCMX enthält den Cytomegalovirus-Promotor/Enhancer
gefolgt von einem Promotor des Bakteriophagen T7 zur Transkription
in vitro. Weitere dem Fachmann bekannte Vektoren können bei
den erfindungsgemäßen Verfahren
benutzt werden.
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Für die folgenden,
zuvor beschriebenen, zur Verwendung in dieser Studie geeigneten
Proteine in ihrer vollständigen
Länge kodierende
Gene wurden in pCMX kloniert: FXR von der Ratte (Akzessionsnummer U18374),
RXRα vom
Menschen (Akzessionsnummer X52773), TRβ vom Menschen (Akzessionsnummer X04707),
LXRα vom
Menschen (Akzessionsnummer U22662), PPARα von der Maus (Akzessionsnummer X57638),
PPARδ von
der Maus (Akzessionsnummer U10375), TR2-11 vom Menschen (Akzessionsnummer M29960),
GCNF von der Maus (Akzessionsnummer U14666), SF1 von der Maus (Akzessionsnummer S65878).
Alle Akzessionsnummern in dieser Anmeldung beziehen sich auf GenBank-Akzessionsnummern. GAL4-Fusionsprodukte
enthaltende Rezeptorfragmente wurden durch Fusion der folgenden
Proteinsequenzen mit dem C-terminalen Ende der Hefe-GAL4-DNA-Bindungsdomäne (Aminosäuren 1–147) von
pSG424 (Sadowski und Ptashne, Nucl. Acids Res., 17, 7539, 1989)
konstruiert: GAL-L-RXR (RXRα vom
Menschen, Glu 203 – Thr
462), GAL-L-FXR (FXR-LBD von der Ratte, Leu 181 – Gln 469), GAL-RORα (RORα1 vom Menschen,
Arg 140 – Gly
523, Akzessionsnummer U04897), GAL-Nurr1 (Nurr1 von der Maus, Cys
318 – Phe
598, Akzessionsnummer: S53744), GAL-DAX (DAX-1 vom Menschen, Akzessionsnummer:
U31929), GAL-ERR2 (ERR2
vom Menschen, Glu 171 – Val
433, Akzessionsnummer X51417), GAL-CoA (SRC-1 vom Menschen, Asp 617 – Asp 769,
Akzessionsnummer U59302).
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Das
RXR-LBD-Expressionskonstrukt L-RXR enthält das SV40 TAg nukleare Lokalisationssignal
(APKKKRKVG (SEQ ID Nr. 1)) fusioniert stromaufwärts der menschlichen RXRα-LBD (Glu
203 – Thr
462). VP-L-FXR enthält
die 78 Aminosäuren
der VP16-Transaktivierungs-Domäne
des Herpesvirus verbunden mit dem Amino-terminalen Ende der IXR-LBD
von der Ratte (Leu 181 – Gln
469). CMX-βgal, verwendet
als Kontrollgen zum Vergleich mit der Aktivierung des zu testenden
Rezeptors oder der zu testenden Rezeptordomäne, enthält die aus pCH110 (Akzessionsnummer
U02445) stammenden, für
die β-Galactosidase
von E. coli kodierenden Sequenzen. Hier wurde dieses Gen in geeigneter
Weise verwendet, es kann jedoch jedes nicht verwandte, verfügbare Gen,
für das
ein geeigneter Assay existiert, als Kontrolle mit den erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden.
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RXRm
ist eine Bindungsdomäne
für den
menschlichen 9-cis-Retinonsäure-Rezeptor,
der eine einzige Punktmutation enthält (Asp322→Pro). Diese mutierte Rezeptor-Domäne behält die Fähigkeit
zur DNA-Bindung und zur Bildung heterodimerer Komplexe mit FXR bei,
es fehlt ihr jedoch die Fähigkeit,
auf geringe Konzentrationen an Ligand zu reagieren, wie dies die
Wildtyp-Rezeptordomäne
vermag. Diese defekte LBD ermöglichte
einen Aktivierungsassay zum spezifischen Screenen nach Verbindungen,
die an den nuklearen Gallsäurerezeptor
(FXR) binden und diesen aktivieren und nicht nach Verbindungen,
die über
den RXR-Anteil des Heterodimers wirken.
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Um
zu bestimmen, welcher Orphanrezeptor oder welche -rezeptoren durch
Galle aktiviert wurde(n) und exogen zur Modifizierung der Transkription
der auf Gallsäure
reagierenden Gene manipuliert werden könnten, wurden die transfizierten
Zellen mit Schweinegallextrakt behandelt. Der Gallextrakt wurde
wie folgt hergestellt. Galle (Sigma, 1 g) wurde in Wasser gelöst und auf
pH 4,0 eingestellt. Das wasserlösliche
Material wurde weiter mit Methanol extrahiert. Das Methanol-lösliches
Material wurde getrocknet und erneut mit 100 μg/ml gelöst.
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CV-1-Zellen
für die
Aktivierungsassays wurden in mit 10% über ein Aktivkohlebett gereinigtem
fötalem Kälberserumalbumin,
50 U/ml Penicillin G und 50 μg/ml
Streptomycinsulfat (DMEM-FBS) supplementiertem Dulbeccos modifiziertem
Eagles-Medium bei
37°C in
5% CO2 angezogen. An Tag 1 vor der Transfektion
wurden die Zellen mit 50 bis 80% Konfluenz unter Verwendung von
phenolrotfreiem DMEM-FBS ausplattiert.
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Die
Zellen wurden durch Lipofektion transient transfiziert. Reporterkonstrukte
(300 ng/105 Zellen) und vom Cytomegalovirus
angetriebene Expressionsvektoren (20–50 ng/105 Zellen)
wurden mit CMX-β-gal
(500 ng/105 Zellen) als interner Kontrolle
zugegeben. Nach 2 Stunden wurden die Liposomen entfernt und die
Zellen während
etwa 45 h mit die Testgallsäure
und weitere Verbindungen enthaltendem, phenolrotfreiem DMEM-FBS
behandelt.
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Jede
Verbindung, die ein Kandidat für
die Aktivierung des nuklearen Gallsäurerezeptor ist, kann mit diesem
Verfahren getestet werden. Generell werden die Verbindungen zur
Optimierung der Chancen die Aktivierung des Rezeptors, falls vorhanden,
nachzuweisen und zu erkennen, in mehreren Konzentrationen getestet.
Nach Exponieren gegenüber
dem Liganden wurden die Zellen geerntet und in einem Assay auf β-Galactosidase-Aktivität (Kontrolle)
und Aktivität
des spezifischen Reportergens getestet. Alle hier offenbarten Assays
wurden dreifach durchgeführt
und variierten innerhalb eines Experiments um weniger als 15%. Jedes
Experiment wurde drei- oder mehrmals mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
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Die
Aktivität
des Reportergens kann in geeigneter Weise als interne Kontrolle
abgeglichen und die Ergebnisse können
als Vielfaches der Aktivierung bezogen auf unbehandelte Zellen in
einem Plot aufgetragen werden. Siehe 1 bezüglich der
die Aktivierung des Orphanrezeptors durch Gallextrakt. Wie in der
Figur gezeigt, war der Gallextrakt ein starker Aktivator (56fach)
von FXR, hat aber wenig bis keine Wirkung auf die weiteren getesteten
Orphanrezeptoren.
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Wie
oben besprochen, bindet FXR als Heterodimer mit RXR (9-cis-Retinolsäure-Rezeptor) an sein
Responseelement. Dieses Heterodimer kann durch Farnesoid-Liganden oder durch
an RXR bindende Liganden aktiviert werden (Forman et al., Cell 803–812, 1995;
Zavaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 7909–7914, 1997).
Da die Aktivierung der FXR-RXR-Heterodimere durch Gallextrakt das
Vorhandensein von Liganden entweder für FXR oder für RXR widerspiegeln
könnte,
wurde zum Screenen nach FXR-spezifischen Liganden ein in seiner
Reaktion auf RXR-Liganden defekter FXR-RXR-Komplex hergestellt.
Die Verfügbarkeit
einer RXR-Ligandenbindungsdomäne
gestattet die Schaffung eines Screeningassays, bei dem die Aktivierung
des nuklearen Gallsäurerezeptors
in Abwesenheit von RXR-Effekten nachgewiesen wird, was falsch positive
Ergebnisse verhindert, die ansonsten auftreten könnten.
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Damit
die RXR-Mutante in diesem Verfahren funktioniert, sollte der Rezeptor
durch RXR-Liganden minimal aktiviert werden und beim Exponieren
gegenüber
RXR-Liganden keinen
Coaktivator rekrutieren können, aber
die Fähigkeit
zur Dimer-Bildung
mit FXR und zur Bindung von DNA als Heterodimer mit FXR beibehalten. Letztendlich
sollte die Mutante mit der normalen Aktivität des nuklearen Gallsäurerezeptors
nicht wesentlich interferieren. Um diese Eigenschaften sicherzustellen,
wurden wie unten beschrieben Tests an der mutierten Ligandenbindungsdomäne durchgeführt. Weitere
Mutanten können
zur Bestimmung ihrer Eignung zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Verfahren
ebenfalls in der gleichen Weise getestet werden.
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Eine
eine einzige Punktmutation (Asp 322→Pro) in der LBD enthaltende
RXR-Mutante (RXRm)
wurde als in diesen Analysen besonders gut funktionierend befunden.
Chimäre,
die Hefe-GAL4-DNA-Bindungsdomäne,
fusioniert entweder mit der Ligandenbindungsdomäne vom Wildtyp RXR (GAL-L-RXR)
oder mit der von RXRm (GAL-L-RXRm) enthaltende Rezeptoren wurden
auf die gleiche, wie in 1 zur Aktivierung der Orphanrezeptoren
durch Gallsäure
beschriebenen Weise auf eine Reaktion auf einen synthetischen RXR-spezifischen
Liganden (LG268, 6-[1-(3,5,5,8,8-Pentamethyl-5,6,7,8-tetrahydronaphthalin-2-yl)cyciopropyl]nicotinsäure) getestet.
CV-1-Zellen wurden transient mit CMX-βgal, UASG × 4 und
entweder mit GAL-L-RXR oder mit der GAL-L-RXRm-LBD-Mutante transfiziert.
Nach der Transfektion wurden die Zellen mit den in 2 angegebenen
Konzentrationen von LG268 behandelt. Dimere mit der mutierten RXR-Ligandenbindungsdomäne zeigten
eine 10fache Abnahme ihrer Aktivierungsstärke gegenüber Dimeren mit einer Wildtyp-Ligandenbindungsdomäne. Siehe 2. Ähnliche
Ergebnisse wurden mit RXR- und RXRm-Rezeptoren in der Gesamtlänge beobachtet
(Daten nicht gezeigt).
-
Um
die Eignung dieser Mutante weiter zu bestätigen, wurde die Fähigkeit
von Wildtyp-RXR und RXRm zur Bindung von DNA und zur Rekrutierung
von Coaktivator als Reaktion auf einen Liganden verglichen. Es wurden
Versuche zur Verschiebung der elektrophoretischen Mobilität durchgeführt, wobei
zuerst eine Mischung von 1,2 μl
in vitro translatierter RXR (3, oberes
Feld) oder RXRm (3, unteres Feld), 5 μg gereinigtem
rekombinantem GST-GRIP1-Coaktivator (unten beschrieben) und einer 32P-markierten DR1-Sonde (5'-AGCTACCAGGTCAAAGGTCACGTAGCT,
SEQ-ID-Nr. 2) gemeinsam mit steigenden Mengen des RXR-Liganden LG268
(0–1000
nM) inkubiert wurde. Die DR1-Sonde von SEQ-ID-Nr. 2 wurde für alle RXR-Homodimertests offenbart.
Jede im wesentlichen zu der DNA-Bindungszielsequenz der Domäne homologe
Nukleinsäuresonde
kann in solchen Assays verwendet werden, solange das mit Ligand
besetzte Heterodimer mit für das
verwendete Nachweisverfahren ausreichender Avidität an die
Sonde bindet. Gleichermaßen
kann zur Verwendung mit den erfindungsgemäßen Verfahren jede zum Nachweis
der Gegenwart von Komplexen in der Mischung genügend empfindliche, geeignete
Markierung für
die Nukleotidsonde in Betracht kommen.
-
Während der
Inkubation bilden sich Komplexe, bei denen Dimere Coaktivator rekrutieren
und an die markierte DNA-Sonde binden. Nach der Inkubation wird
die Mischung der Elektrophorese unter nicht denaturierenden Bedingungen
unterworfen. Bei diesem Assay werden die Komplexe über ein
5%iges Polyacrylamidgel in 45 mM Borsäure und 1 mM EDTA enthaltendem
45 mM Tris-Puffer bei Raumtemperatur elektrophoretisch getrennt.
Zum Nachweis der markierten Komplexe und weiterer Komponenten wird
das Gel der Autoradiographie unterworfen.
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In 3 zeigt
CoA eine die drei Rezeptorinteraktions-Domänen des Coaktivators GRIP1
enthaltende GST-Fusion an. Die Ergebnisse der elektrophoretischen
Mobilitätsverschiebung
zeigen, dass RXRm in Vergleich zu Wildtyp-RXR den Coaktivator mit
100facher Abnahme rekrutiert. Während
sowohl die mutierten als auch die Wildtyp-Rezeptoren DNA binden
(3, Bahn 1), scheitert RXRm bei der Coaktivatorrekrutierung
bei für
die maximale Rekrutierung durch den Wildtyp-Rezeptor ausreichenden Konzentrationen
(3, vgl. oberes und unteres Feld, Bahnen 2–6).
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Die
Quantifizierung der in 3 gezeigten Menge an RXR-Coaktivatorkomplex
wurde durch Phosphorimageranalyse des Autoradiogramms bestimmt und
als Funktion der LG268-Konzentration aufgetragen. Die Daten zeigen,
dass die Rekrutierung von Coaktivator durch RXRm 100fach höhere Ligandenkonzentrationen erforderte
(4). Da die RXR-Mutante die Fähigkeit zur Bindung von DNA
als Hetrodimer mit FXR beibehielt (5 und nicht
gezeigte Daten), ihr aber die Fähigkeit
stark auf niedrige Ligandenkonzentrationen zu reagieren fehlte,
konnten FXR-RXRm-Heterodimere verwendet werden, um die Aktivierung
von FXR- Untereinheiten in
Tests mit verschiedenen Liganden zu verifizieren. Solche Heterodimere
könnten
deshalb vorteilhaft in einem Verfahren zum Screenen nach Verbindungen
eingesetzt werden, die den nuklearen FXR-Gallsäurerezeptor aktivieren und
damit nach Verbindungen, die zur Modifizierung der durch den Rezeptor
regulierten Gentranskription in der Lage sind.
-
Die
Bestätigung
des analytischen Verfahrens wurde durch Testen von FXR-RXR- und FXR-RXRm-Dimeren
auf Aktivierung durch RXR- und FXR-Liganden erzielt. CV-1-Zellen wurden mit
die in 5 gezeigten Rezeptordomänen beherbergenden Plasmiden
transfiziert und entweder mit 100 nM LG268 (linkes Feld) oder einem
Methanolextrakt aus Schweinegalle (200 μg/ml, rechtes Feld) behandelt.
Während
LG268 RXR- (GAL-L-RXR) und FXR-RXR-Heterodimere aktivierte, zeigte
FXR-RXRm wenig bis
keine Reaktion auf den RXR-spezifischen Liganden LG268 (5,
linkes Feld). Im Gegensatz dazu behielt der Gallextrakt die Fähigkeit
zur Aktivierung von FXR-RXRm bei, hatte aber nur geringe Wirkung
auf GAL-L-RXRm (5, rechtes Feld). Ähnliche
Ergebnisse wurden erhalten, wenn RXRm durch eine andere, eine defekte
AF2-Transaktivierungs-Domäne
(Phe450→Ala,
Schulman et al., Mol. Cell. Biol. 16, 3807–3813, 1996) enthaltende RXR-Mutante
ersetzt wurde (Daten nicht gezeigt). Dieser Assay-Typus kann daher
spezifisch zwischen der Aktivierung durch RXR-Liganden und FXR-Liganden
unterscheiden. Diese speziellen Ergebnisse zeigen, dass Gallextrakt einen
FXR-spezifischen Aktivator enthält.
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Weitere
Ergebnisse zeigten, dass die Aktivierung die AF2-Transaktivierungsdomäne von FXR
erfordert (Daten nicht gezeigt). Außerdem induzierten die Gallsäuren die
Aktivierung mit der erwarteten Kinetik (Aktivität wird innerhalb einer Stunde
nach Ligandenzugabe zu den Zellen beobachtet; Daten nicht gezeigt).
Zusammengenommen zeigen die hier bereitgestellten Ergebnisse, dass
FXR ein endogener Gallsäuresensor
ist, der durch geeignete Liganden exogen zur Regulation von der
Aktivierung durch FXR abhängigen
Genen, zum Beispiel wichtiger, bei der Kontrolle des Cholesterin-Stoffwechsels
beteiligter Gene, manipuliert werden kann.
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Ein
chemisches Fraktionierungsschema wurde entwickelt zur Identifizierung
und Reinigung der Gallkomponenten im Gallextrakt, die an FXR binden
und diesen aktivieren. Als Eingangsschritt wurde der Methanol-Wasser-Gallextrakt über Kieselgelchromatographie
fraktioniert. Kurz gesagt, wurde der Extrakt auf eine Säule aufgetragen
und nacheinander mit Choroform:Methanol im Verhältnis von 8:1 und 4:1 und dann
mit 100% Methanol eluiert. 56 Fraktionen wurden gesammelt, vereinigt
und auf ihre Fähigkeit
zur Aktivierung von FXR-RXRm getestet. Die aktive Fraktion wurde
weiter durch präparative
Dünnschichtchromatographie
(PTLC) gereinigt und in 5 Fraktionen (A–E) aufgeteilt.
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Um
das Material dieser Fraktionen auf FXR-Aktivierung zu testen, wurden
CV-1-Zellen mit
die in 6 angegebenen Rezeptordomänen beherbergenden Plasmiden
transfiziert und mit 25 μg/ml
jeder der 5 PTLC-Fraktionen behandelt. Fraktion B (PTLC 0,35 < Rf < 0,52) war die aktivste
(30fach höhere
Aktivierung von FXR-RXRm bezogen auf die Aktivierung von RXR). Siehe 6.
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Das
aktive Material aus PTLC-Fraktion B wurde weiter durch Umkehrphasen-HPLC
auf einer C18-Säule
gereinigt. Die Absorption wurde bei 200 nm überwacht. Drei Hauptpeaks wurden
aufgelöst
(Peak X, Y und Z, 7). Diese drei Peaks wurden
isoliert gesammelt. Die verbleibenden Fraktionen wurden zur Bildung
einer vierten Fraktion (W) vereinigt. Die vier Fraktionen wurden
wie oben beschrieben auf Aktivierung von FXR-RXRm getestet. Kurz
gesagt wurden CV-1-Zellen mit die in 8 gezeigten
Rezeptordomänen
beherbergenden Plasmiden transfiziert und jeweils mit den HPLC-Fraktionen
in Konzentrationen von 25 μg/ml
behandelt. Die Fraktionen W, X und Y hatten wenig bis keine Aktivität (8).
Bemerkenswerterweise induzierte der Peak Z eine dramatische 102fache
Aktivierung von FXR-RXRm,
hatte aber keine Wirkung auf RXR. Diese Daten zeigen, dass das Material
in Peak Z nicht nur FXR stark aktivierte, sondern auch kein RXR-aktivierendes Material
enthielt. Daher wurde das Material in Peak Z zur strukturellen Analyse
ausgewählt.
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Nach
Methylierung des Materials in Peak Z wurde nacheinander eine Gaschromatographie-Massenspektrometrie
(GC-MS) durchgeführt.
Das Gaschromatogramm zeigte, dass Peak Z einen vorherrschenden Peak
enthielt, was zeigt, dass die aktive Komponente nahezu bis zur Homogenität gereinigt
worden war. Die Verbindung Z hatte in diesem Assay eine Retentionszeit
von 14,41 min und war vom einem synthetischen Chenodesoxycholsäure(CDCA)-Standard
nicht zu unterscheiden. Zur weiteren Bestätigung der Identität dieses Materials,
wurden 13C-NMR-, 1H-NMR-,
DEPT-, DQFCOSY- und HMQC-Spektren erhalten (Daten nicht gezeigt)
und für
mit dem CDCA-Standard identisch befunden. Die den nuklearen Gallsäurerezeptor
in diesem Assay aktivierende Komponente in Schweinegallextrakt wurde
folglich als CDCA identifiziert.
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Eine
Auswahl von kommerziell erhältlichen
Gallsäuren
(Sigma) wurde auf ihre Fähigkeit
zur Aktivierung bekannter FXR-RXR (9, linkes
Feld) und FXR-RXRm (9, rechtes Feld) untersucht.
Die RXR-Liganden LG268 und Juvenilhormon III wurden zum Vergleich
ebenfalls als Testliganden eingeschlossen. Für diese Assays wurden CV-1-Zellen
mit CMX-βgal,
EcRE × 6
und FXR + RXR (linkes Feld) oder FXR + RXRm (rechtes Feld) transfiziert
und mit den angegebenen Gallsäuren
(100 μM),
Juvenilhormon III (JH III, 50 μM) oder
LG268 (100 nM) behandelt. Die Gallsäuren in der Figur wurden wie
folgt bezeichnet: CA: Cholsäure,
CDCA: Chenodesoxycholsäure,
DCA: Desoxycholsäure,
LCA: Lithocholsäure;
UDCA: Ursodesoxycholsäure.
Wie aus den Studien mit Gallsäure
zu erwarten, erwies sich CDCA als hochwirksamer Aktivator von FXR
(346fache Aktivierung, 9, linkes Feld). CDCA konnte
keine anderen Rezeptoren, einschließlich RXRα, PPARα, γ und δ, VDR, T3Rβ, RAR, PXR,
LXRα und
CARβ aktivieren
(Daten nicht gezeigt).
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Die
sekundären
Gallsäuren
CDA und LCA waren ebenfalls hochwirksam und induzierten 246- bzw. 106fache
Aktivierungen von FXR-RXR. Qualitativ ähnliche Ergebnisse wurden mit
FXR-RXRm gesehen (9, rechte Tafel), was zeigt,
dass all diese Gallsäuren über die
FXR-Untereinheit wirken. Ursodesoxycholsäure (UDCA, 5β-Cholansäure-3α,7β-diol), das
7β-Epimer
von CDCA, war inaktiv, während
die Substitution einer Hydroxylgruppe durch ein Keton an der Position
7 (7-Ketolithocholsäure, 5β-Cholansäure-3α-ol-7-on) eine
Verbindung mit mittlerer Aktivität
zwischen CDCA und UDCA ergab (9, 15).
Somit ist die Konfiguration um die Position 7 herum eine kritische
Determinante der FXR-Aktivität
mit 7α-OH » 7-Keto » 7β-OH. Der
Vergleich von 7-Ketolithocholsäure
und 3,7-Diketocholansäure (5β-Cholansäure-3,7-dion)
legt nahe, dass ein Keton in 3-Position gegenüber einer 3α-Hydroxyl-Gruppe vorzuziehen
ist. Mehrere Di- und Trihydroxygallsäuren mit einer Hydroxylgruppe
in der Position 6 waren inaktiv (Murocholsäure, Hyocholsäure und α-Muricholsäure) ebenso
wie Dehydrocholsäure
(5β-Cholansäure-3,7,12-trion) Zusammengenommen
legen diese Daten nahe, dass 3,7- und 3,12-substituierte Gallsäuren hochwirksame Aktivatoren
von FXR sind. 12 ist ein zusammenfassender
Vergleich der chemischen Struktur der Schlüsselgallsäuren und ihrer Wirksamkeit
als FXR-Aktivatoren.
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Da
unlängst
für Farnesoid-Metaboliten
gezeigt wurde, dass sie FXR aktivieren (Forman et al., Cell 81, 687–693, 1995)
wurde die Aktivität
eines der stärksten
Farnesoid-Aktivatoren, des Juvenilhormons III (JH III, 50 μM), getestet.
Diese Verbindung war aktiv, hatte aber bezogen auf die wirksamsten
Gallsäuren
eine weit schwächere
Aktivität
(9).
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CDCA
und CA sind beide über
den klassischen Stoffwechselweg produzierte Hauptgallsäuren, jedoch war
CA inaktiv, obwohl CDCA ein extrem wirksamer Aktivator von FXR war.
Sowohl CA als auch konjugierte Gallsäuren sind relativ hydrophile
Komponenten, die aber nicht leicht Zellmembranen passieren. Es war
möglich,
dass nicht deshalb keine Aktivierung des nuklearen Gallsäurerezeptors
in dem Assay nachgewiesen wurde, weil die Verbindungen selbst nicht
aktiv waren, sondern einfach deshalb, weil sie nicht in genügend hoher Konzentration
in die Zelle eindringen konnten. Ein zweiter Assay für die Aktivierung
des nuklearen Gallsäurerezeptors
wurde entwickelt, der wirksam die Aktivierung durch Verbindungen
testen konnte, die nicht ohne Hilfe die Zellmembran überwinden
können.
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Die
Leber und das Ileum exprimieren gewebespezifische Gallsäuretransportproteine
für die
effiziente Aufnahme dieser Verbindungen (Craddock et al., Am. J.
Physiol. 274, G157–169,
1998). Keines dieser Transportproteine (nachfolgend „Transporter" genannt) wird in
den hier verwendeten CV-1/COS-Zellen exprimiert. CV-1-Zellen wurden
deshalb mit einem menschlichen Lebergallsäuretransporter (Akzessionsnummer
L21893) cotransfiziert. Die Verwendung dieser Transporter gestattet
es, eine Auswahl von Gallsäuren
oder von von Gallsäuren
stammenden Verbindungen oder von Verbindungen, die aufgrund ihrer
strukturellen Ähnlichkeit
zu Gallsäuren
von dem Transporter transportiert werden, auf Aktivierung des intrazellulären nuklearen
Gallsäurerezeptors
zu untersuchen. Gallsäuretransporter
aus Nieren- und Dünndarmgewebe
können
ebenfalls wirksam verwendet werden. Jeder geeignete nicht-spezifische
Transporter kann ebenfalls verwendet werden.
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Für den Aktivierungsassay
des nuklearen Gallsäurerezeptors
durch hydrophile Gallsäuren
wurden CV-1-Zellen mit CMX-βgal,
EcRE × 6
und FXR + RXR allein (10, linkes Feld) und zusätzlich mit
dem Lebergallsäuretransporter
(10, rechtes Feld) transfiziert. Nach der Transfektion
wurden die Zellen mit Konzentrationen von 100 μM der angegebenen Gallsäuren behandelt.
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Obwohl
CA in Abwesenheit des Gallsäuretransporters
inaktiv war (10, linkes Feld), ermöglichte es
die Coexpression des Lebergallsäuretransporters
CA eine dramatische 170fache Aktivierung von FXR zu zeigen (10,
rechtes Feld). In ähnlicher
Weise waren diese stärker
hydrophilen Gallsäuren
in den Lebergallsäuretransporter
exprimierenden Zellen hochwirksam, während Glycin- und Taurinkonjugate
von CA, CDCA, DCA und LCA im ersten Assay schwach oder inaktiv waren
(10, vgl. linkes und rechtes Feld). Ähnliche Ergebnisse
waren mit dem ileum-spezifischen Gallsäuretransporter zu sehen (Daten
nicht gezeigt). Somit war dieser Assay in der Lage zu zeigen, dass
intrazelluläre
CA ebenso wie Glycin- und
Taurinkonjugate aktiver freier Gallsäuren ein wirksamer FXR-Aktivator
ist. Der Assay kann sowohl zum Test der durch den Gallsäuretransporter
transportierten Verbindungen verwendet werden als auch für Verbindungen,
bei denen dies nicht der Fall ist. Die Ergebnisse zeigen ebenfalls,
dass FXR und die Gallsäuretransporter
eine überlappende
Spezifität gemeinsam
haben.
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Zusätzlich zu
den Struktur-Aktivitäts-Studien
wurden für
einige Liganden des nuklearen Gallsäurerezeptors Dosis-Reaktions-Analysen
durchgeführt.
Für diese
in 11 gezeigten Analysen wurden CV-1-Zellen wie oben
beschrieben mit dem Lebergallsäuretransporter
transfiziert und dann mit den angegebenen unterschiedlichen Konzentrationen
jeder Gallsäure
behandelt. CDCA, DCA und LCA zeigten jeweils eine EC50 von etwa
50 μM. Das
Struktur-Aktivitäts-Verhältnis (9, 10 und 12)
und das Dosis-Response-Profil (11) der
Gallsäuren
ist für
FXR ähnlich
wie für
den exogenen Gallsäuresensor
beschrieben (Chiang, Front. Biosci. 3, D176–193, 1998, Kanda et al., Biochem.
J. 330, 261–265,
1998, Twisk et al., Biochem. J. 305, 505–511, Zhang et al., J. Biol.
Chem. 273, 2424–2428,
1998). Dies bestätigt
das in diesen Studien verwendete Model, indem gezeigt wird, dass
die in diesen Assays bestimmten Ergebnisse gut mit in vivo Ergebnissen
korrelieren.
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Zusätzlich gibt
es eine enge Korrelation zwischen der EC50 für die Gallsäuren des
nuklearen Gallsäurerezeptors
und der physiologischen Konzentration der Gallsäuren. Zum Beispiel treten transkriptionelle
Wirkungen von CDCA und DCA bei Konzentrationen von etwa 50 bis 250 μM auf (Kanda
et al., Biochem. J. 330, 261–265,
1998; Twisk et al., Biochem. J. 305, 505–511, 1995; Zhang et al., J.
Biol. Chem. 273, 2424–2428, 1998).
Diese Konzentration liegt sehr nah an der für den nuklearen Gallsäurerezeptor
entdeckten (50 μM)
und stimmt überein
mit der endogenen Konzentration dieser Verbindungen in der Galle
(CDCA: 10–150 μM, DCA 5 μM) (Matoba
et al., J. Lipid Res. 27, 1154–1162,
1986) und in der Intestinalflüssigkeit
(CDCA: 50 μM,
DCA: 320 μM,
LCA: 120 μM)
(McJunkin et al., Gastroenterol. 80, 1454–1464, 1981). Die EC50 des nuklearen Gallsäurerezeptors stimmt ebenfalls überein mit
der berichteten Michaelis-Konstante (Km)
von 3–100 μM für die Leber- und Ileumgallsäuretransportproteine
(Boyer et al., Am. J. Physiol. 266, G382–G387, 1994; Wong et al., J.
Biol. Chem. 269, 1340–1347,
1994). Tatsächlich
reagiert der nukleare Gallsäurerezeptor
wirksam auf Gallsäuren
bei den durch die Gallsäuretransporter
festgestellten intrazellulären
Konzentrationen. Siehe 10, rechtes Feld.
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Wie
oben diskutiert, enthalten klassische nukleare Rezeptoren modulartige
LBDs, die heterologen DNA-Bindungsdomänen Reaktionsfähigkeit
auf Liganden verleihen. Um zu testen, ob für den nuklearen Gallsäurerezeptor
eine Interaktion mit einem heterodimeren Partner zur Bindung des
endogenen Liganden mit hoher Affinität erforderlich ist, wurde die
Fähigkeit
einer CDCA und LCA zur Aktivierung des Rezeptors in Zellen untersucht,
die GAL-L-RXR, GAL-L-FXR oder GAL-L-FXR plus L-RXR coexprimieren.
Wie erwartet aktivierten CDCA und LCA die GAL-L-RXR-Chimäre nicht.
Siehe 13. Coexpression von GAL-L-FXR
zusammen mit RXR LBD (L-RXR) führte
jedoch zu einem Komplex, der sowohl auf CDCA als auch auf LCA reagierte (13).
Nur LBD (entweder RXR oder FXR) exprimierende Zellen wurden von
keiner der Gallsäuren
aktiviert. Diese Daten machen deutlich, dass nicht nur die Reaktivität auf Gallsäure durch
die FXR-LBD vermittelt wird, was eine intakte FXR-AF2-Transaktivierungsdomäne erfordert,
sondern dass die Aktivierung des Rezeptors auch eine Assoziation
mit dem Dimerisierungspartner erfordert. Zusätzlich zeigten Versuche zum
zeitlichen Ablauf, dass LCA und CDCA FXR mit den für nukleare
Rezeptorliganden erwarteten Kinetiken aktivieren, d.h. Aktivität wurde
innerhalb 1 h nach Zugabe zu den Zellen beobachtet (Daten nicht
gezeigt).
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Um
die Fähigkeit
von CDCA und LCA zur Induktion der Coaktivatorrekrutierung zu beurteilen,
wurden CV-1-Zellen mit CMX-βgal,
UASG × 4
und GAL-CoA (ein die 3 Rezeptorinteraktionsdomänen des Coaktivators SRC-1
enthaltendes GAL4-Fusionskonstrukt) transfiziert. Wo in 14 angegeben,
wurden die Zellen ebenfalls mit die Ligandenbindungsdomäne von RXR
(L-RXR) und/oder die mit der Ligandenbindungsdomäne von FXR (VP-L-FXR) fusionierte
VP16-Transaktivierungsdomäne
enthaltenden Konstrukten transfiziert. Nach der Transfektion wurden
die Zellen mit 100 μM
CDCA oder LCA behandelt. Weder CDCA noch LCA waren in der Lage,
eine funktionelle Interaktion zwischen einem GAL4-Coaktivatorfusionsprotein
(GAL-CoA) und einer die Transaktivierungsdomäne der FXR-LBD (VP-L-FXR) enthaltenden
Chimäre
zu fördern.
Jedoch induzierten die Gallsäuren
in Gegenwart der RXR-LBD einen 4–7fachen Aktivitätsanstieg
(14).
-
Coaktivatorrekrutierungsassays
sind als ein zuverlässiges
Verfahren zur Identifizierung und Untersuchung der Aktivität von Orphanliganden
etabliert worden (Blumberg et al., Genes Dev. 12, 1269–1277, 1998; Forman
et al., Nature 395, 612–615,
1998; Kliewer et al., Cell 92, 73–82, 1998; Krey et al., Mol.
Endocrinol. 11, 779–791,
1997). Es wurde ein in vitro Coaktivatorrekrutierungs-Säuger-Two-Hybrid-Assay
entwickelt, um zu untersuchen, ob die mutmaßlichen Liganden eine funktionelle
Assoziation zwischen FXR und einem Coaktivitor fördern konnten als Test für die Fähigkeit
eines Liganden, die durch den nuklearen Gallsäurerezeptor regulierte Transkription
von Genen zu modifizieren.
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In
vitro Coaktivatorrekrutierungsassays wurden durch Zugabe von Ligand
zu einer Mischung mit den folgenden Komponenten durchgeführt: nuklearer
Gallsäurerezeptor,
9-cis-Retinolsäure-Rezeptor,
ein Coaktivator, markiertes, nukleares Gallsäurerezeptor-Responseelement
(Sonde). Eine die Rezeptorinteraktionsdomäne des Coaktivators GRIP1 enthaltende
Polyaminosäure
kann als Coaktivator verwendet werden. Jeder funktionelle Coaktivator
oder Coaktivator-Komplex kann zur Verwendung bei diesem Assay in
Betracht kommen. GRIP1 wurde in Bakterien exprimiert und für diesen
Assay gereinigt. Für
die Expression des GRIP1-Coaktivators
in Bakterien wurde das die drei Rezeptorinteraktionsdomänen des
murinen GRIP1 (Arg 625 – Lys 765,
Akzessionsnummer U39060) fusioniert mit der Glutathion-S-Transferase
enthaltende GST-GRIP1-Konstrukt geschaffen. Weitere geeignete Coaktivatoren
zum Beispiel PBD/DRIP 205/TRAP 220 sind dem Fachmann bekannt und
können
mit den hier offenbarten erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Zur Verwendung in diesem Assay geeignete Response-Elemente können alle
möglichen
Nukleinsäuresonden
sein, die im Wesentlichen homolog zu der Ziel-DNA-Sequenz des nuklearen
Gallsäurerezeptors
sind.
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Jedes
mit dem Assaysystem kompatible Response-Element kann verwendet werden.
Oligonukleotidsequenzen, die im Wesentlichen zu der DNA-Bindungsregion
homolog sind, an die der nukleare Rezeptor bindet, kommen zur Verwendung
mit den erfindungsgemäßen Verfahren
in Betracht. Im Wesentlichen homologe Sequenzen (Sonden) sind Sequenzen,
die unter den Assaybedingungen an den durch Ligand aktivierten Rezeptor
binden. Response-Elemente können
zur Steigerung oder Verminderung der Bindung der Response-Elemente
an den nuklearen Rezeptor durch dem Fachmann bekannte Verfahren
modifiziert werden.
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Die
folgenden Response-Elemente wurden in den hier exemplarisch aufgeführten spezifischen
Assays verwendet: hsp27 EcRE × 6
(Yao et al., Nature 366, 476–479,
1993), UASG × 4, PPRE × 3 (Forman et al., Cell 81,
687–693,
1995), βRE2 × 3 (Forman
et al., Nature 395, 612–615,
1998), LXRE × 3
(Willy et al., Genes Dev. 9, 1033–1045, 1995), T3RE
(MLV) × 3
(Perlmann et al., Genes Dev. 7, 1411–1422 (1993), SF1 × 4 (5'-AGCTTAGCCAAGGTCAGAGAAGCTT, SEQ-ID-Nr.
3) und DR0 × 2
(5'-AAGCTTCAGGTCAAGGTCAGAGAGCTT, SEQ-ID-Nr.
4).
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Nach
Zugabe des mutmaßlichen
Liganden zu der Mischung der oben beschriebenen Komponenten und
Durchmischung, wurde die Mischung unter definierten Bedingungen
inkubiert. Die Bildung von Komplexen in der Mischung wurde, wie
in 15 gezeigt, durch Verschiebung der elektrophoretischen
Mobilität
analysiert, jedoch kann jedes Verfahren zur Trennung der aus den
einzelnen Komponenten in der Mischung gebildeten Komplexe verwendet
werden, solange es zur Abtrennung der markierten Komplexe von den
anderen Komponenten in der Mischung ausreichend ist. Techniken wie
zum Beispiel Dünnschichtchromatographie, Hochdruckflüssigkeitschromatographie,
Größenausschlusschromatographie,
Sedimentation, Immunseparationstechniken oder jedes weitere geeignete,
dem Fachmann bekannte Verfahren kann verwendet werden.
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Wie
erwartet konnten die FXR-RXR-Heterodimere in Abwesenheit von Ligand
keinen Coaktivator rekrutieren (15, Bahn
1). Wichtig bei den in 15 bereitgestellten Daten ist,
dass die Zugabe von LCA den Hauptanteil der Heterodimere in einen
Komplex mit Coaktivator GRIP1 verschiebt (Bahn 2). Ähnliche
Ergebnisse wurden mit Glyco-LCA (Bahn 3) und mit LG268 (Bahn 4)
gesehen. Um zwischen Bindungen durch die FXR- und RXR-Untereinheiten
zu unterscheiden, wurde der Coaktivatorrekrutierungsassay unter
Austausch von RXRm gegen RXR wiederholt. Siehe 15,
Bahnen 5–8.
Bezeichnenderweise rekrutierten sowohl LCA (Bahn 6) als auch Glyco-LCA
(Bahn 7) Coaktivator, während
LG268 inaktiv war (Bahn 8). Diese in vitro-Ergebnisse zeigen, dass
LCA und ihr Glycin-Konjugat FXR-spezifische
Liganden sind.
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Während LCA
und Glyco-LCA in diesem in vitro-Coaktivatorrekrutierungsassay aktiv
waren, waren eine Standardsonde für Ligandenbindungsaktivität, weitere
aktive Gallsäuren
einschließlich
CA, CDCA und DCA weniger wirksam bei der Rekrutierung von GRIP1
oder den verwandten Coaktivatoren SRC-1 und ACTR (Daten nicht gezeigt).
Basierend auf ihren gemeinsamen Strukturen, Aktivitäten und
Aktivierungskinetiken sind CA, CDCA und DCA alle FXR-Liganden, obwohl
sie auch einen der unlängst
beschriebenen, vielen anderen nuklearen Rezeptor-Coaktivatoren verwenden
können.
Siehe zum Beispiel Blanco et al., Genes Dev. 12, 1638–1651, 1998;
Fondell et al., PNAS USA 96, 1959–1965, 1999).
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Der
Coaktivatorrekrutierungsassay kann effizient Verbindungen nachweisen,
die zur Ausbildung eines funktionellen Bindungsverhältnisses
mit dem das nukleare Gallsäurerezeptor-Zielgen
regulierenden DNA-Responseelement in der Lage sind. Gallsäuren können die
Transkription mehrerer Gene, einschließlich Cyp7a und Sterin-27-Hydrolase
hemmen (Chiang, Front. Biosci. 3, D176–193, 1998). Die Cyp7a-Transkription wird zusätzlich zu
ihrer Hemmung durch ihr Gallsäureendprodukt
durch die Akkumulation ihres Endprodukts Cholesterin stimuliert.
Diese Reaktion auf Cholesterin wird durch den Oxysterin-Rezeptor
LXRα vermittelt
(Peet et al., Cell 93, 693–704,
1998). Damit ist die Kontrolle des Cholesterinabbaus zu Gallsäuren durch
den Cyp7a-Stoffwechselweg Gegenstand einer positiven Rückkopplung
durch Cholesterin und einer negativen Rückkopplung durch Gallsäuren wie
in dem folgenden Diagramm dargestellt:
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LXRα verwendet
RXR als obligatorischen Dimerisierungspartner wie es für den nuklearen
Gallsäurerezeptor
der Fall ist. LXRα-RXR-Heterodimere
sind konstitutiv aktiv (Apfel et al., Mol. Cell. Biol. 14, 7025–7035, 1994;
Forman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 10588–10593,
1997; Willy et al., Genes Dev. 9, 1033–1045, 1995), vermutlich aufgrund
der Anwesenheit endogener LXR-Liganden, jedoch sind sie allein inaktiv.
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FXR
und LXRα werden
in mehreren Geweben coexprimiert (Leber, Darm und Niere). Es sind
deshalb Versuchsreihen zur Bestimmung durchgeführt worden, ob Gallsäuren eine
Auswirkung auf die transkriptionelle Kontrolle durch LXRα haben. Ähnliche
Experimente wurden mit dem Thyroid-Hormon-Rezeptor (T3R)
durchgeführt,
der ebenfalls die Cyp7a-Transkription in der Leber hochreguliert
(siehe Crestani et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 198, 546–553, 1994).
In Rezeptoraktivierungsassays unter Verwendung von LXRE-TK-Luc zeigen
LXRα und
RXR allein wenig Aktivität,
aktivieren aber bei gemeinsamer Expression konstitutiv den LXR-Rezeptor
(Daten nicht gezeigt). Coexpression von RXR hatte nur einen geringen
Effekt auf die T3-Reaktivität, was zeigt,
dass anders als bei LXRα und
FXR endogene Spiegel von RXR zur Unterstützung der Funktion von T3R ausreichen.
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Um
zu bestimmen, ob ein mit Ligand besetzter Gallsäurerezeptor LXRα inhibiert,
wurden CV-1-Zellen mit CMX-βgal,
LXRE × 3
und den die in 16, linke Tafel angegebenen
Rezeptoren enthaltenden Expressionsvektoren transfiziert. Es wurden
in Gegenwart und Abwesenheit eines FXR-Expressionsvektors Assays durchgeführt. Die
Zellen wurden mit 0 μM
oder 100 μM
Konzentrationen von LCA oder CDCA behandelt. Ein Vielfaches der
Hemmung in der Figur bedeutet Inhibition der konstitutiven Aktivität von LXR
durch diese Liganden des nuklearen Gallsäurerezeptors. Das rechte Feld
von 16 zeigt wie oben transfizierte Zellen, wobei T3R × 3
gegen LXRE × 3
ausgetauscht ist. Bei diesen Assays wurden die Zellen mit 100 nM
T3 allein oder in Gegenwart von 100 μM LCA oder
CDCA behandelt. Ein Vielfaches der Hemmung im rechten Feld bedeutet Inhibition
der durch T3 stimulierten Aktivität.
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In
Abwesenheit des nuklearen Gallsäurerezeptors
hat Gallsäure
wenig Wirkung auf die LXRα-Aktivität. In dessen
Gegenwart bewirken LCA und CDCA jedoch eine dramatische 4–8fache
Hemmung der LXRα-Aktivität. Siehe 16.
Diese Inhibition wird durch Zugabe von LXR-Liganden gemildert (Daten
nicht gezeigt). Gallsäure-abhängige Suppression
hatte keine Auswirkung auf die Reaktivität von T3 und
war spezifisch gegenüber
LXRα. Somit
besitzen LXRα und
FXR entgegengesetzte metabolische Funktionen, wobei FXR als Gallsäuresensor
wirkt, der LXRα als
Reaktion auf physiologisch relevante Gallsäuren inhibiert. Da LXRα ein positiver
Regulator der Cyp7a-Transkription ist, stellt dieses molekulare
Bindeglied zwischen LXRα-
und FXR-Signalgebung einen Mechanismus der Gallsäuren zur negativen Regulation
LXRα-abhängiger Gene
bereit. Die hier beschriebenen Assays sind daher nützlich bei
der Selektion von Verbindungen, die ebenfalls die Transkription
dieser Gene modifizieren können.
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Hierin
beschrieben wird ein Verfahren zur Modulation der Transkription
eines nuklearen Gallsäurerezeptor-Zielgens,
das die Einbringung in eine den nuklearen Gallsäurerezeptor (FXR) (und) einen
nuklearen Rezeptorliganden exprimierende Zelle umfasst. Exogene
nukleare Gallsäurerezeptorliganden
können
verwendet werden, um die Regulation der Cyp7a-Transkription oder
der Transkription eines jeden anderen durch FXR oder LXRα regulierten
Gens zu modifizieren. Modifikation der auf Gallsäure reagierenden Gene führt im Gegenzug
zu einer Modifikation des Cholesterinabbaus. Die Manipulation des
nuklearen Gallsäurerezeptors
mit an den Rezeptor bindenden Antagonisten stellt damit eine Behandlung
der Hypercholesterinämie
bereit. Solche Antagonisten können
Derivate natürlicher
Gallsäuren,
synthetische oder halbsynthetische Moleküle sein. Das Verfahren kann
zum Screenen mutmaßlicher
FXR-Liganden verwendet werden, die als Agonisten oder Antagonisten
auf den FXR-Rezeptor wirken können
und die deshalb therapeutisch oder prophylaktisch zur Kontrolle
des Cholesterinstoffwechsels verwendet werden können.
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Die
hier zuvor beschriebenen und unten beispielhaft dargestellten Assays
stellen Verfahren zur Selektion von Verbindungen bereit, die die
Transkription der durch den nuklearen Gallsäurerezeptor regulierten Gene
modulieren können.
Die Erfindung ist in den folgenden, nicht als einschränkend zu
verstehenden Beispielen weiter beschrieben und veranschaulicht.
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BEISPIELE
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Beispiel 1: Transienter
Transfektionsassay für
die FXR-Aktivität
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CV-1-Zellen
wurden in mit 10% über
ein Aktivkohlebett gereinigtem fötalem
Kälberserumalbumin,
50 U/ml Penicillin G und 50 μg/ml
Streptomycinsulfat supplementiertem Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium (DMEM-FBS)
bei 37°C
in 5% CO2 angezogen. Einen Tag vor der Transfektion
wurden die Zellen mit 50 bis 80% Konfluenz unter Verwendung von
phenolrotfreiem DMEM-FBS ausplattiert. Die Zellen wurden wie beschrieben
durch Lipofektion transient transfiziert (Forman et al., Cell 81,
687–693,
1995). Den Thymidinkinase-Promotor (–105/+51) des Herpesvirus verbunden
mit dem Ecdyson-Response-Element (EcRE × 6) enthaltende Luciferase-Reporter-Konstrukte
(300 ng/105 Zellen) und Cytomegalovirus
angetriebene Expressionsvektoren (20–50 ng/105 Zellen)
wurden zusammen mit CMX-βgal
als interner Kontrolle zugegeben. Die Säugerexpressionsvektoren waren
von pCMX abgeleitet, das den Cytomegalovirus-Promotor/Enhancer gefolgt von
einem Promotor des Bakteriophagen T7 zur in vitro-Transkription
enthielt. Zwei Assays wurden parallel durchgeführt, einer unter Verwendung
von mit einem CMX-βgal,
EcRE × 6,
FXR und RXR enthaltendem Expressionsvektor transfizierten Zellen
und einer unter Verwendung von mit einem CMX-βgal, EcRE × 6, FXR und RXRm enthaltendem
Expressionsvektor transfizierten Zellen. Nach Inkubation mit den
Liposomen während
2 h wurden die Liposomen entfernt und die Zellen für etwa 45
h mit phenolrotfreiem, 100 μM
CDCA enthaltendem DMEM-FBS behandelt. Nach Exponieren gegenüber dem
Liganden wurden die Zellen geerntet und gemäß bekannten Methoden in Assays
auf Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivität untersucht.
Alle Messpunkte wurden dreifach bestimmt und variierten um weniger
als 15%. Jedes Experiment wurde drei- oder mehrmals mit ähnlichen
Ergebnissen wiederholt.
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Beispiel 2: Für Hydrophile
Verbindungen geeigneter, transienter Transfektionsassay für FXR-Aktivität
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Es
wurde ein Assay wie in Beispiel 1 mit der Ausnahme durchgeführt, dass
die Zellen außerdem
mit einem pcDNA-Expressionsvektor für den menschlichen Lebergallsäuretransporter
cotransfiziert wurden.
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Beispiel 3: Assay zum
Screenen nach Verbindungen, die die Transkription des nuklearen
Gallsäurerezeptor-Zielgens
modulieren
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CV-1-Zellen
werden in mit 10% über
ein Aktivkohlebett gereinigtem fötalem
Kälberserumalbumin,
50 U/ml Penicillin G und 50 μg/ml
Streptomycinsulfat supplementiertem Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium (DMEM)
bei 37°C
in 5% CO2 angezogen: Die Zellen werden einen
Tag vor der Transfektion unter Verwendung von phenolrotfreiem DMEM-FBS
mit 50 bis 80% Konfluenz ausplattiert. Die Zellen werden durch Lipofektion unter
Verwendung von N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-ammoniummethylsulfat
gemäß den Anweisungen der
Herstellers (Boehringer Mannheim) transfiziert.
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Die
CV-1-Zellen werden mit CMX-βgal,
Konstrukten, die die Ligand-bindende Domäne von RXR (L-RXR) und die
Ligand-bindende Domöne
von LXR (L-FXR) enthalten, und einem Luciferasereporter-Konstrukt
transfiziert, das den Thymidinkinase-Promotor des Herpesvirus (–105/+51)
verbunden mit der angegebenen Anzahl von Kopien des Response-Elements
hsp27 EcRE × 6
enthält.
Ein Parallelassay wird durchgeführt,
bei dem die Ligand-bindende Domäne
von RXR (Akzessionsnummer X52773) durch die Ligand-bindende Domäne RXRm
ersetzt wird. Nach der Transfektion werden die Zellen mit verschiedenen
Konzentrationen der als Gallsäurerezeptoragonist-
oder -antagonist als Kandidat in Frage kommenden Verbindungen während 45
h in phenolrotfreiem DMEM-FBS behandelt. Nach Exponieren gegenüber den
Verbindungen werden die Zeilen geerntet und auf Luciferase- und β-Galactosidase-Aktivität im Assay
getestet.
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Beispiel 4: Assay zum
Screenen nach Verbindungen, die die Transkription der nuklearen
Gallsäurerezeptor-Zielgene
modulieren
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Ein
Assay zum Sreenen wird gemäß Beispiel
3 mit der Ausnahme durchgeführt,
dass die Zellen ebenfalls mit einem pcDNA-Expressionsvektor für den menschlichen
Lebergallsäuretransporter
cotransfiziert werden.
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Beispiel 5: Assay zum
Screenen nach Verbindungen, die die Transkription des nuklearen
Gallsäurerezeptorzielgens
modulieren
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Ein
Assay zum Screenen wird gemäß Beispiel
3 mit der Ausnahme durchgeführt,
dass der Parallelassay unter Verwendung des RXRm enthaltenden Expressionskonstruktes
ausgelassen wird.
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Beispiel 6: Coaktivatorrekrutierungsassay
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GST-GRIP1
wurde in E. coli exprimiert und über
Glutathion-Sepharose-Säulen
gereinigt. In vitro translatierte FXR + RXR (15, linkes
Feld) oder FXR + RXRm (15, rechtes Feld) und GST-GRIP1
(5 μg) wurden
während
30 min bei Raumtemperatur mit 100 000 cpm einer Klenow-markierten
hsp27 EcRE-Sonde (5'-AGCTCGATGGACAAGTGCATTGAACCCTTGAAGCTT, SEQ-ID-Nr. 5) in 10 mM
Tris, pH8, 50 mM KCl, 6% Glycerin, 0,05% NP-40, 1 mM DTT, 12,5 ng/μl Poly-dI·dC und
den bezüglich
der Coaktivatorrekrutierung zu testenden Liganden inkubiert. Die
Komplexe wurden über
ein 5%iges Polyacrylamidgel in 0,5 × TBE (45 mM Tris-Base, 45
mM Borsäure,
1 mM EDTA) bei Raumtemperatur elektrophoretisch aufgetrennt. Die
elektrophoretische Mobilität
zeigte die Rekrutierung von Coaktivator.
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