KR100460478B1 - 신규한 ｄｎａ 결합 단백질 및 이를 이용한 유전자 발현시스템 - Google Patents

신규한 ｄｎａ 결합 단백질 및 이를 이용한 유전자 발현시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 DNA 결합 단백질 및 이를 이용한 유전자 발현 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 퓨린 억제인자의 DNA 결합 도메인(DBD)과 퓨린 억제인자의 힌지 영역 및 Gal4의 이합영역 (DD)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 신규한 DNA 결합 단백질을 제공한다. 본 발명은 아울러 상기 DNA 결합 단백질에 전사 활성 도메인(AD)이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 신규한 전사인자, 상기 전사인자에 리간드 결합 도메인 (LBD)이 결합된 것을 특징으로 하는 신규한 인공 핵 수용체 및 이들을 이용한 유전자 발현 시스템을 제공한다. 본 발명의 인공 핵 수용체는 세포 내의 유전자 발현을 조절하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 ＤＮＡ 결합 단백질 및 이를 이용한 유전자 발현 시스템{Novel DNA-binding proteins and inducible gene expression systems using thereof}
본 발명은 신규한 DNA 결합 단백질 및 이를 이용한 유전자 발현 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 특정 염기서열을 인식하여 결합하는 변형된 E. coli의 퓨린 억제인자 DNA 결합 도메인을 포함하는 신규한 DNA 결합 단백질, 전사활성 인자 및 인공 핵 수용체 구조물에 관한 것이다.
인위적인 유도성 유전자 발현 시스템(inducible gene expression system)은 유전자 치료 또는 세포내 단백질의 기능을 밝히기 위해 개발되었다. 유전자의 발현(gene expression) 조절은 정상적인 개체 발생, 조직발달 및 면역반응에 있어서 필수적인 것이며, 만일 유전자 발현이 정상적으로 조절되지 못하는 경우에는 심각한 질병이 유발될 수 있다. 유전자 발현은 주로 유전자 전사단계에서 조절되며 일부 단백질 합성단계 및 단백질 분비단계에서도 조절되기도 한다.
세포내 유전자의 전사는 특정 유전자의 프로모터(promoter) 및/또는 조절부위(control element)에 범용전사인자(general transcription factor) 및/또는 전사 활성인자(transcription activator)가 결합하여 상호작용함으로써 조절된다. 전사 활성인자는 특정 DNA 염기서열을 인식하여 DNA에 결합하는 부위인 DNA 결합 도메인(DAN-binding domain: DBD)과 전사를 활성화시키는 활성화 도메인 (activator domain: AD)의 두 가지 기능적 도메인으로 이루어져 있다 (Wendt H., et al., J. Biol. Chem., 273, 5735-5743 (1998); Kang J. S. and Kim J. S., J. Biol. Chem., 275, 8742-8748 (2000)). 이들은 기능상 서로 독립적으로 작용하기 때문에 각기 다른 전사인자에서 유래한 DBD와 AD를 재조합하여 인위적으로 새로운 전사인자를 제작할 수 있다.
특히 동물세포 자체의 유전자 발현에 영향을 주지 않으면서 목적유전자 발현만을 조절할 수 있는, 동물세포에서 작용하는 인공 전사인자를 개발하기 위하여는 효모나 무핵세포에서 유래되는 DBD를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 인공 전사인자의 개발에 널리 사용되는 DBD로는 효모 Gal4 전사 인자, LexA, GCN4 및 아연 핑거 등이 있으나(Marostein R. et al., Nature, 356, 408-414 (1992); Hollenbeck J. J. and Oakley M. G., Biochem., 39, 6380-6389 (2000); Dterding C. J. et al., Bioconjug. Chem, 11, 335-344 (2000); Kang J. S. and Kim J. S., J. Biol. Chem., 275, 8742-8748 (2000); Lin Q., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 5525-5530 (1997); Kim J.S. and Pabo C.O., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 2812-2817 (1998)), 현재 사용 가능한 DBD 종류는 아직 제한적이라고 할 수 있다.
전사단계 조절을 통한 유도 발현 시스템에 대한 연구로는 IPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyrano side)를 유도원(inducer)으로 사용한 lac 억제자/조절자 시스템(lac repressor/operator system)(Baim S. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5072-5076 (1991); Figge J. et al., Cell, 52, 713-722 (1998)), 테트라사이클린(tetracycline)을 이용한 Tet 억제자 시스템 (Tet repressor system)(Bohl D. and Heard J. M., Cell Biol. Toxicol., 14, 83-94 (1998); Gossen M. and Bujard H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 5547-5551 (1992))), 라파마이신(rapamycin)을 유도원으로 사용한 라파마이신-유도 시스템(rapamycin-inducible system)(Hall C. V. et al., J. Mol. Appl. Genet, 2, 101-109 (1983); Schumacher M. A. et al., Science, 266, 763-770 (1994))), 스테로이드 호르몬을리간드로 사용한 인공 핵 수용체를 이용한 유도 시스템(inducible system) 등이 있다(Beerli R. R. et al., J. Biol. Chem., 275, 32617-32627 (2000); Littlewood T. D. et al., Nucleic Acids Res., 23, 1686-1690 (1995); Wang Y. et al., Gene Ther., 4, 432-441 (1997); Thurmond D.C. et al., J. Biol. Chem., 273, 15373-15381 (1998); Kim J. S. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 3616-3620 (1997))
한편, 유도 발현 시스템에 있어서 원하는 세포에서, 원하는 시기에, 원하는 양 만큼만 유전자가 발현되도록 하기 위해서 외부 신호에 반응하는 시스템을 개발하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 핵 호르몬 수용체 패밀리(nuclear hormone receptor family)에 속하는 스테로이드 호르몬 수용체(steroid hormone receptor)의 경우 호르몬이 없을 때에는 비활성화 상태였다가 호르몬이 결합되면 수용체가 활성화되어 핵으로 이동하여 특정 유전자의 전사를 유도하는데 이러한 호르몬 반응성 발현 시스템이 바로 외부의 신호에 의하여 유전자 발현이 조절되는 대표적인 예이다. 때문에 스테로이드 호르몬 수용체의 리간드-결합 도메인(ligand-binding domain: LBD)을 이용한 유도 발현 시스템(inducible expression system)이 개발되었으며, 특히 사람 프로게스테론 수용체(human progesterone receptor: PR)의 리간드-결합 도메인이나 쥐의 에스트로겐 수용체(murine estrogen receptor: ER) 리간드-결합 도메인을 이용한 것들이 많이 연구되고 있다.
사람 프로게스테론 수용체(PR) LBD의 경우 그 카르복시 말단의 915-933 아미노산을 제거하면 생체 호르몬인 프로게스테론과는 결합하지 않고 프로게스테론 길항물질(progesterone antagonist)인 RU486 (mifepristone)에만 특이적으로 반응하는 변형된 도메인이 얻어진다. 에스트로겐 수용체(ER)의 경우에는 525번째 글리신(glycine)을 아르기닌(arginine)으로 치환시킬 경우 천연의 에스트로겐과는 결합하지 않고 에스트로겐 길항물질인 4-OHT(hydroxytamoxifen)에만 반응을 나타내는 변형체가 얻어진다. 이처럼 변형된 LBD와 DBD를 결합시킨 발현 시스템의 예로는 아연 핑거 DBD와 변형된 LBD를 결합시킨 것이 보고되었다 (Beerli R. R. et al., J. Biol. Chem., 275, 32617-32627 (2000)).
본 발명자들은 유핵세포 내에서 작용하는 유도 발현 시스템을 연구하던 중 변형된 E. coli 퓨린 억제인자의 DNA 결합 도메인이 유전자의 전사 활성인자로서 매우 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 퓨린 억제인자의 DNA 결합 도메인(DBD)과 퓨린 억제인자의 힌지 영역 및 Gal4의 이합영역 (DD)으로 구성된 것을 특징으로 하는 신규한 DNA 결합 단백질을 제공한다.
본 발명은 퓨린 억제인자의 DNA 결합 도메인(DBD)과 퓨린 억제인자의 힌지영역 및 Gal4의 이합영역 (DD)으로 구성된 것을 특징으로 하는 상기 신규한 DNA 결합 단백질에 전사 활성 도메인이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 신규한 전사인자를 제공한다. 본 발명의 한 양태는 상기 전사 활성 도메인이 SREBP1a의 전사 활성 도메인인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 퓨린 억제인자의 DNA 결합 도메인(DBD)과 퓨린 억제인자의 힌지영역 및 Gal4의 이합영역 (DD)으로 구성된 것을 특징으로 하는 신규한 DNA 결합 단백질, 전사 활성 도메인 (AD), 그리고 리간드 결합 도메인 (LBD)이 결합된 것을 특징으로 하는 신규한 인공 핵 수용체를 제공한다. 본 발명의 한 양태는 상기 리간드 결합 도메인이 호르몬 결합 도메인인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 신규한 DNA 결합 단백질, 전사 활성인자 또는 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산서열을 제공한다. 본 발명의 핵산 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함한다.
본 발명은 상기 DNA 결합 단백질, 전사 활성인자 또는 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산서열을 함유하는 벡터를 제공한다. 본 발명 벡터의 한 양태는 이들 단백질을 무핵세포 또는 유핵세포 내에서 과발현시키는 발현벡터이다. 본 발명은 상기 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 상기 전사 활성인자를 코드하는 핵산 구조물 및 상기 전사 활성인자가 결합하는 DNA를 포함하는 핵산 구조물로 구성된 유전자 발현 시스템을 제공한다. 본 발명은 상기 유전자 발현 시스템을 함유하는 숙주세포 및 상기 발현 시스템을 사용하여 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산 구조물 및 상기 인공 핵 수용체가 결합하는 DNA를 포함하는 핵산 구조물로 구성된 유전자 발현 시스템을 제공한다. 본 발명은 상기 유전자 발현 시스템을 함유하는 숙주세포 및 상기 발현 시스템을 사용하여 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은 인공 핵 수용체를 함유하고, 특정 리간드에 반응하는 유도성 유전자 발현 시스템을 제공한다.
본 발명은 상기 전사 활성인자 또는 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산서열 및상기 전사 활성인자 또는 인공 핵 수용체에 반응하는 리포터 유전자 구조물로 구성된 유전자 발현 시스템을 제공한다.
본 발명은 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산서열 및 상기 핵 수용체에 반응하는 리포터 유전자 구조물로 구성된 유전자 발현 시스템을 이용하여 인공 핵 수용체에 결합하는 리간드의 길항물질을 검출하는 방법을 제공한다.
도 1a는 퓨린 억제인자 DNA 결합 도메인의 증폭과정을 도시한 것이다. 하류 프라이머의 5' 부위는 Gal4의 DD 부위에 해당되는 핵산서열을 함유한다. 증폭된 DNA의 3' 말단은 Gal4 DD의 5' 말단의 핵산서열이다.
도 1b는 Gal4 DD의 증폭과정을 도시한 것이다. 상류 프라이머의 5'부위는 퓨린 억제인자 DBD의 핵산서열을 함유한다. 증폭된 Gal4 DD cDNA의 5' 말단부위는 퓨린 억제인자 DBD의 3'말단부위 핵산서열을 함유한다.
도 1c는 퓨린 억제인자 DBD와 Gal4 DD의 연결과정을 도시한 것이다. 도 1a와 도 1b에서 합성한 DNA에 도 1a에서 사용한 상류 프라이머 및 도 1b에서 사용한 하류 프라이머를 첨가하여 PCR을 수행하였다.
도 2는 재조합 DNA 결합 단백질인 GST-PurR, GST-PurG 및 GST-PurHG의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 3은 재조합 DNA 결합 단백질의 EMSA결과이다(래인 1: 0 ng, 래인 2-6: GST-PurR 10ng, 20ng, 40ng, 80ng, 120ng, 래인 7-11: GST-PurHG 10ng, 20, 40, 80, 120ng, 래인 12: GST-PurR 500ng, 래인 13: GST-PurHG 500ng, 래인 14:GST-PurG 500ng).
도 4는 퓨린 억제인자의 DNA 단백질 결합 모식도이다.
도 5는 퓨린 억제인자가 결합하는 천열서열을 나타낸 것이다.
도 6은 여러 변형된 퓨린 억제인자 결합 부위에 대한 PurHG 단백질의 결합능을 측정한 EMSA 결과이다 (프로브 별 래인들은 각각 0, 30, 60, 120 ng의 단백질을 사용한 결과이다).
도 7은 전사인자 과발현 벡터 pCMV-PurAD 및 인공 핵 수용체 과발현 벡터 pCMV-PurANR의 제조과정을 나타낸 모식도이다.
도 8은 pCMV-PurAD와 리포터 구조물의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 9는 유핵세포에서 재조합 전사 활성인자인 PurAD의 활성을 나타낸 그래프이다. 그래프의 바(bar)는 표준편차를 나타낸다.
도 10은 인공 핵 수용체 PurANR을 과발현하는 pCMV-PurANR 구조를 도시한 것이다.
도 11a는 유핵세포에서 RU486의 처리 또는 무처리에 따른 인공 핵 수용체의 전사활성을 나타낸 그래프이다(+ : RU486 처리, - : RU486 무처리).
도 11b는 유핵세포에서 RU486의 처리 농도에 따른 인공 핵 수용체의 전사활성을 나타낸 그래프이다.
도 12는 pCMV-PurANR에서 Gal4 DD 부위를 제거한 pCMV-PurANRΔGal4의 구조 및 pCMV-Gal4ANR의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 13a는 유핵세포에서 pCMV-PurANRΔGal4의 전사활성을 나타낸 그래프이다.
도 13b는 유핵세포에서 pCMV-Gal4ANR의 첨가농도에 따른 pCMV-PurANRΔGal4의 전사활성을 나타낸 그래프이다.
도 14는 PurHG DBD내 Gal4 DD 크기를 달리한 인공 핵 수용체 pCMV- PurANRGal34 및 pCMV-PurANRGal54의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 15는 유핵세포에서 RU486 처리 또는 무처리에 따른 인공 핵 수용체 pCMV-PurANRGa34 및 pCMV-PurANRGal54의 전사활성을 나타낸 그래프이다(+ : RU486 처리, -: RU486 무처리).
도 16은 리포터 구조물 pPuRE-luc, pPuRE4-luc 및 pPuRE5-luc의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 17은 유핵세포에서 변이 컨센서스를 가진 리포터 구조물에 대한 인공 핵 수용체의 전사활성을 나타낸 그래프이다.
도 18은 퓨린 억제인자 DBD와 Gal4 DD 사이에 글리신을 첨가한 인공 핵 수용체 pCMV-PurANR(G1) 및 pCMV-PurANR(G2)의 구조를 나타낸 모식도이다.
도 19는 유핵세포에서 인공 핵 수용체 pCMV-PurANR(G1) 및 pCMV-PurANR(G2)의 전사활성을 측정한 그래프이다.
본 발명은 퓨린 억제인자의 DNA 결합 도메인(DBD)과 퓨린 억제인자의 힌지 영역 및 Gal4의 이합영역 (DD)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 신규한 DNA 결합 단백질을 제공한다.
E. coli의 퓨린 억제인자(purine repressor)는 LacⅠ 패밀리에 속하는 전사 인자로서 341개의 아미노산으로 구성되어 있으며 퓨린(purine)과 피리미딘 (pyrimidine)의 신생경로(de novopathway)를 조절하는 억제 인자이다(Rolfes R. J. and Zalkin H. J., Biol. Chem., 263, 19653-19661 (1988); Choi K. Y. et al., J. Biol. Chem., 269, 24066-24072 (1994)). E. coli 퓨린 억제인자는 아미노 말단에 52개의 아미노산으로 구성되어 있는 DNA 결합 도메인(DBD)과 카르복시 말단에 289개의 아미노산으로 이루어진 보조억제인자(corepressor) 및 이합체형성(dimerization)에 관여하는 CBD (corepressor binding domain)로 구성되어 있다. 상기 두 도메인은 힌지영역(hinge region)에 의해 연결되어 있다.
퓨린 억제인자 DBD는 헬릭스-턴-헬릭스 모티프(helix-turn- helix motif)를 지니고 있어 표적 DNA의 주홈(major groove)에 특이하게 결합한다. α-헬릭스 구조인 "힌지" 헬릭스는 부홈(minor groove)에 결합하여, 퓨린 억제인자의 DNA 결합을 안정화한다 (Choi K.Y. and Zalkin H., J. Bacteriol, 174, 6207-6214 (1992); Choi K. Y. and Zalkin H., J. Bacteriol, 176, 1767-1772 (1994); Schumacher M. A. et al., Science, 266, 763-770 (1994)). 퓨린 억제인자는pyrC,pyrD, purF,purHD,purL등의 유전자 프로모터에 존재하는 16개의 염기쌍(bp)으로 구성되어 있는 퓨린 조절 서열(regulatory sequence)에 결합한다 (Choi K. Y. et al., J. Biol. Chem., 269, 24066-24072 (1994)). 퓨린 억제인자는purF의 조절 서열을 변형시킨 완벽한 16bp 팔린드롬 서열(palindrome sequence)에 가장 친화력이 높다. 퓨린 억제인자는 카르복시 말단에 존재하는 CBD에 하이포크산틴 (hypoxanthine) 또는 구아닌 보조억제인자(guanine corepressor)가 결합하여야만 활성화되어 DNA에 결합하는 것으로 알려져 있다 (Choi K. Y. et al., J. Biol. Chem. 269, 24066-72 (1994)).
Gal4는 효모의 갈락토스와 멜리비오스의 대사효소(catabolic enzyme) 유전자의 발현을 조절하는 전사 활성인자(transcriptional activator)이다 (Choi K. Y. and Zalkin H., J. Bacteriol., 174, 6207-6214 (1992)). Gal4는 DBD, 링커 영역(linker region), 이합영역 (dimerization domain: DD), 활성화 영역(activation domain)으로 구성되어 있다. Gal4의 DBD는 1-65 아미노산으로 아미노 말단에 존재하며 두 개의 Zn2+와 여섯 개의 시스테인으로 구성된 비메탈-티오레이트 클러스터(bimetal-thiolate cluster)형태로 존재한다. DD 부위는 50-64번째의 14개 아미노산이 α-헬릭스(α-helix)형태로 이합체(dimer)를 이루며 평행의 코일-코일 상태로 존재한다. 상기 DBD와 DD를 연결하는 부위에는 41-49 아미노산의 링커가 존재한다(Marmostein R. et al., Nature, 356, 408-414 (1992)). 본 발명에서는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터 유래된 Gal4의 DD부위를 사용하였다.
본 발명자들은 퓨린 억제인자의 힌지 영역을 제외한 DBD만을 포함하는 재조합 단백질 (GST-PurR), 퓨린 억제인자 DBD와 Gal4의 DD로 구성된 재조합 단백질 (GST-PurG), 퓨린 억제인자 DBD와 퓨린 억제인자 힌지 헬릭스 및 Gal4의 DD를 포함하는 재조합 단백질 (GST-PurHG)을 제조하고 (도 2), 이들 재조합 단백질의 퓨린 억제인자 결합 부위(PuRE)에 대한 결합능력을 조사하였다. 구체적으로 각 재조합 단백질을 발현하는 발현벡터 pGEX-PurR, pGEX-PurG, pGEX-PurHG를 만들고 이들을 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 시켰다. 생산된 재조합 단백질들을 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase)를 지니고 있는 글루타치온-아가로스 (SIGMA Chemical Co., USA)를 이용하여 분리한 후 이들 재조합 단백질의 DNA 결합능력을 in vitro 검증법인 EMSA(electromobility shift assay)로 측정하였다.
실험 결과, 퓨린 억제인자 DBD만으로는 DNA와의 결합능을 나타내지 않았으나 퓨린 억제인자 DBD와 힌지 헬릭스 및 Gal4 DD를 포함하는 재조합 단백질 (GST-PurHG)의 경우에는 강력한 DNA 결합능을 나타내었다(도 3). 이 실험은 힌지 영역이 배제된 퓨린 억제인자 DBD만으로는 활성형 상태의 퓨린 억제인자 DBD 구조를 형성할 수 없음을 보여주는 것이기도 하다.
따라서, 본 발명은 퓨린 억제인자의 DNA 결합 도메인(DBD)과 퓨린 억제인자의 힌지영역 및 Gal4의 이합영역 (DD)으로 구성됨을 특징으로 하는 신규한 DNA 결합 단백질을 제공한다. 본 발명 퓨린 억제인자의 "DNA 결합 도메인"은 퓨린 억제인자가 DNA에 결합하는 부위로서, E. coli 퓨린 억제인자의 경우 DNA 결합 도메인은 아미노 말단에서 48번째 아미노산에 이르는 부위를 말한다(서열번호 1). 본 발명에서 퓨린 억제인자의 힌지영역이란 단백질에서 힌지로서의 역할을 수행하는 부분으로서 E. coli 퓨린 억제인자의 경우 아미노 말단에서 제49번 내지 제57번까지의 영역을 말한다(서열번호 1). 본 발명에서는 퓨린 억제인자가 보조 억제인자 없이도 DNA에 결합할 수 있는 형태를 인위적으로 만들어주기 위해 퓨린 억제인자의 DNA 결합 부위에 단백질의 이합에 필요한 영역을 융합시켰는데, 본 발명의 실시예에서는 이합영역으로 Gal4의 이합영역인 아미노 말단으로 42번 내지 148번 아미노산으로 구성된 부분을 사용하였다(서열번호 2). 본 발명의 새로운 DNA 결합 단백질은, 바람직하게는 [(퓨린 억제인자1-57aa)-(Gal442-148aa)]로 구성된 PurHG이다(서열번호 3). 본 발명의 DNA 결합 단백질이 DNA와 복합체를 이루는 결합 모식도를 도 4에 나타내었다.
본 발명의 DNA 결합 단백질은 천연형 퓨린 억제인자가 결합하는 서열, 바람직하게는 천연의 서열뿐만 아니라 그의 변형체인 16 bp의 팔린드롬 서열 또는 팔린드롬 유사 서열에 결합할 수 있다. 퓨린 억제인자가 결합하는 천연서열로는 purF, purMN, purL, purC, purEK, purHD, purB, quaBA, purR1, purR2, pyrC, pyrD, prsA, glyA, glnB 및 speA가 있다(도 5).
본 발명의 DNA 결합 단백질에는 상기 PurHG 단백질과 실질적으로 동일한 활성을 나타내면서 70% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 보이는 기능적 동등물 (functional equivalent) 및 기능적 유도체(functional derivative)가 포함된다. 본 발명의 정의상 PurHG의 "기능적 동등물"에는 퓨린 억제인자가 결합하는 천연서열, 완전한 16bp 팔린드롬인 PuRE 및 PuRE의 변형된 형태인 mPuRE4, mPuRE5에 결합하되 mPuRE1, mPuRE2, mPuRE3에는 결합하지 않으며, 리포터 유전자인 루시퍼라제 활성을 증가시키는 것을 말한다. 상기 "기능적 동등물"은 적어도 60%이상의, 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 천연형의 단백질과 90%이상의 서열 상동성을 갖는 것이다. "기능적 유도체"는 상기 PurHG 단백질의 단편, 상기 단편을 포함하는 단백질 또는 단백질의 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키기 위한 변형을 가한 단백질을 의미한다. 본 발명자들의 위와 같은 연구결과는 무핵세포의 전사인자의 DBD를 유핵세포에서 작용할 수 있도록 변형할 수 있었으며, 이러한 가능성은 무핵세포에서 발견된 많은 종류의 전사인자들의 DBD, 특히 LacI 패밀리의 전사 인자들의 DBD 역시 인공 전사인자 개발에 사용할 수 있음을 시사한다.
본 발명은 퓨린 억제인자의 DNA 결합 도메인(DBD)과 퓨린 억제인자의 힌지영역 및 Gal4의 이합영역 (DD)으로 구성되는 것을 특징으로 하는 신규한 DNA 결합 단백질에 전사 활성 도메인(AD)이 추가로 결합됨을 특징으로 하는 신규한 전사인자를 제공한다. "(전사) 활성화 도메인(AD)"은 전사인자들의 유전자 전사를 활성화시키는 도메인을 말한다. 활성화 도메인은 전사를 자극할 수 있는 아미노산의 임의의 서열일 수 있다. 활성화 도메인은 일반적으로 전사 인자 또는 보조활성화인자로부터 유도되고, 전사에 관여하는 다른 단백질과 상호 작용하는 단백질의 일부분이어서, 전사 과정을 자극한다. DNA 결합 도메인과 전사 활성 도메인이 기능적으로 독립하여 작용하는 것은 이미 공지된 사실이다. 따라서, 전사를 자극할 수 있는 임의의 활성화 도메인을 사용하여 본 발명을 실행할 수 있다.
바람직한 활성화 도메인은 산성 전사 활성화 도메인으로 예를 들면, VP16, NF-kappaB의 p65 서브유닛에서 유래된 AD를 사용할 수 있다. 더욱 바람직하게는 SREBP1a AD를 사용할 수 있다. SREBP1a의 아미노 말단의 산성 도메인(acidic domain)은 CBP (CREB-binding protein), p300 (CBP-related protein)과 같은 보조활성인자(coactivator)와 특이하게 결합하며, 또한 16개 이상의 보조인자들의 복합체로 이루어진 ARC(activator-recruited coactivator complex)와도 직접적으로 결합하여 매우 강하게 전사를 활성화시킨다고 알려져 있다(Naar A. M. et al., Genes Dev 1, 3020-31 (1998); Oliner J. D. et al., Genes Dev, 15, 2903-11 (1996); Naar Am et al, Nature, 29, 828-32 (1999)). 본 발명에서는 상기 PurHG에 SREBP1a의 활성 도메인인 아미노 말단으로 79번까지의 아미노산 부위를 융합시켰을 때, 숙주세포에 같이 형질전환된 리포터 유전자의 전사를 활성화시킴은 실험으로확인하였다 (도 8 및 도 9). 본 발명의 전사 활성인자는 바람직하게는 (퓨린 억제인자1-57aa)-(Gal442-148aa)-(제1링커)-(AD), 더욱 바람직하게는 (퓨린 억제인자1-57aa)- (Gal442-148aa)-(제1링커)-(SREBP1a의 AD), 특히 바람직하게는 (퓨린 억제인자1-57aa)- (Gal442-148aa)-(제1링커)-(SREBP1a1-79aa)로 구성되는 전사 활성인자이다(서열번호 4). 링커(linker)는 임의의 서열을 갖는 아미노산으로 상기 기능상의 도메인을 연결할 수 있으면 어느 것이든 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 제1링커는 DNA 결합 단백질과 전사활성 도메인 또는 DNA 결합 단백질과 리간드 결합 도메인을 연결시키는 부위이다. 링커영역은 1-10개의 임의의 아미노산으로 구성될 수 있으며 바람직하게는, 1-6개의 임의의 아미노산, 더욱 바람직하게는 2개의 아미노산으로 구성될 수 있다. 본 발명에서 예시된 제1링커는 Gly-Ser(글리신-세린)이다.
본 발명은 퓨린 억제인자의 DNA 결합 도메인(DBD)과 퓨린 억제인자의 힌지영역 및 Gal4의 이합영역 (DD)으로 구성됨을 특징으로 하는 신규한 DNA 결합 단백질, 전사 활성 도메인 (AD), 그리고 리간드 결합 도메인 (LBD)이 결합됨을 특징으로 하는 신규한 인공 핵 수용체를 제공한다. "핵 수용체"란 단백질 발현 후 유핵세포의 핵 내로 위치되어 지며 (localize), 세포의 생리 활성을 조절할 수 있는 리간드와 결합하는 능력이 있는 리간드 수용체를 말한다. 본 발명은 상기 전사 활성인자에 리간드 결합 도메인이 융합된 신규한 핵 수용체를 제공하는데, 본 발명의 리간드 및 그 수용체는 유전자의 전사를 조절하는 역할을 하는 물질로 알려진 것은 어느 것이든 본 발명의 목적에 필요한 변형을 가하여 사용할 수 있다. 본 발명의 리간드 결합 도메인은 바람직하게는 호르몬 결합 도메인, 더욱 바람직하게는 스테로이드 호르몬 결합 도메인, 더더욱 바람직하게는 프로게스테론 또는 에스트로겐 결합 도메인이다.
사람 프로게스테론 수용체(PR) LBD의 경우 그 카르복시 말단의 915-933 아미노산을 제거하면 생체 호르몬인 프로게스테론과는 결합하지 않고 프로게스테론 길항물질(progesterone antagonist)인 RU486 (mifepristone)에만 특이적으로 반응하는 변형된 도메인이 얻어진다. 에스트로겐 수용체(ER)의 경우에는 525번째 글리신(glycine)을 아르기닌(arginine)으로 치환시킬 경우 천연의 에스트로겐과는 결합하지 않고 에스트로겐 길항물질인 4-OHT(hydroxytamoxifen)에만 반응을 나타내는 변형체가 얻어진다. 이와 같이 변형된 호르몬 결합 도메인은 본 발명에 특히 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 RU486 (mifepristone)에만 특이적으로 반응하는 인간 프로게스테론 수용체의 LBD 부위, 즉 673-891 아미노산에 해당하는 부위를 사용하였다. 본 발명의 실시예 8에서 제조한 단백질 PurANR인 (퓨린 억제인자1-57aa)-(Gal442-148aa)-(제1링커)-(hPR673-891aa)-(제2링커)-(SREBP1a1-79aa)(서열번호 5)은 본 발명에 따른 인공 핵 수용체의 일 예이다. 본 발명의 인공 핵수용체는 리간드인 RU486에 반응하여 유전자 전사를 조절하였다. 링커(linker)는 임의의 서열을 갖는 아미노산으로 상기 기능상의 도메인을 연결할 수 있으면 어느 것이든 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 제1링커는 DNA 결합 단백질과 전사 활성화 도메인 또는 DNA 결합 단백질과 리간드 결합 도메인을 연결시키는 부위이며 제2링커는 리간드 결합 도메인과 전사활성 도메인을 연결시키는 부위이다. 링커영역은 1-10개의 임의의 아미노산으로 구성될 수 있으며 바람직하게는, 1-6개의 임의의 아미노산으로 구성될 수 있다. 본 발명에서 예시된 제1링커는 Gly-Ser(글리신-세린)이며 제2링커는 Glu- Phe-Arg-Ser(글루탐산-페닐알라닌-아르기닌-세린)이다.
인공 핵 수용체인 PurANR을 만들어 세포 내에서의 활성을 측정한 결과, RU486에 의해 루시퍼라제 유전자 발현이 현저히 증가하였다. 이러한 RU486에 의한 세포내의 유전자 발현 정도는 기존에 개발된 Gal4, Zif268이나 GCN4 등의 DBD를 이용한 인공 전사인자들의 실험 결과들과 비교시, 비슷한 정도의 유전자 발현이 이루어짐을 알 수 있었다.
Gal4 DD에 의한 이합화(dimerization)가 PurHG의 DNA 결합에 필수적이라는 사실은 Gal4 DD를 제거한 pCMV-PurANRΔGal4에서 전사 활성이 완전히 소실되며, 또한 PurANR에 의한 유전자의 발현이 Gal4 DD를 함유하는 또 다른 인공 핵 수용체인 Gal4ANR에 의하여 억제된다는 실험을 통하여 재차 확인할 수 있었다. PurHG DBD와 Gal4 DD의 이형화 요소(dimerization element) 사이를 연결하는 링커부위 역시 DNA 결합에 많은 영향을 미치는데, PurR DBD와 Gal4 DD사이에 글리신을 삽입시킬 경우, 원래 형태에 비해 모두 그 활성이 증가하였으며, 한 개의 글리신을 첨가시켰을 때, RU486에 대한 반응성이 가장 크게 나타났다. 이러한 사실은 Gal4 DD의 링커 부위의 길이 및 그 유연성(flexibility)이 DNA 결합에 중요한 역할을 할 것으로 추측된다. 따라서 본 발명은 (PurR1-57aa)-(G)n-(Gal4DD42-148aa)-(제1링커)-(hPR673-891aa)-(제2링커) -(SREBP1a1-79aa) (n= 1 또는 2)로 이루어진 전사활성 인자를 제공한다.
본 발명은 상기 신규한 DNA 결합 단백질, 전사 활성인자 또는 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산서열을 제공한다. 본 발명의 핵산 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함한다. 본 발명의 DNA 결합 단백질을 코드하는 핵산서열은 무핵 세포, 바람직하게는 E.coli와 효모로부터 기원하는 것이다. 본 발명이 예시하는 바와 같이, PurHG를 코드하는 핵산 서열을 얻기 위해 구조가 잘 알려진 E. coli의 퓨린 억제인자 DNA 결합 도메인을 포함하는 아미노산 서열과 힌지 헬릭스(hinge helix)의 카복시 말단에 Gal4의 링커 부위와 DD를 포함하는 42-148 아미노산 부위를 PCR 증폭하여 PurHG의 cDNA를 제조하였다. 이와 같은 유전자 조작에 관한 기술은 문헌에 공지되어 있다. 본 발명의 전사 활성인자 및 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산서열의 제조 또한 상기 문헌에 기재된 방법들에 의하여 수행할 수 있다.
본 발명은 상기 DNA 결합 단백질, 전사 활성인자 또는 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산서열을 함유하는 벡터를 제공한다. 본 발명 벡터의 한 양태는 이들 단백질을 무핵세포 또는 유핵세포 내에서 과발현시키는 발현벡터이다. 본 발명은 상기 벡터로 형질 전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 정의상 벡터는 적당한 숙주세포에서 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절서열에 작동 가능하도록 연결된 DNA 서열 및 기타 유전자 조작을 용이하게 하거나 단백질의 발현을 최적화하기 위해 도입되는 서열들을 함유하는 DNA 구조물을 말한다. 벡터는 플라스미드, 바이러스, 파지 또는 게놈에 삽입된 것일 수 있다. 본 발명에서 특히 예시된 것으로는 pGEX-PurHG, pCMV-PurAD 및 pCMV-PurANR이 있다.
본 발명은 (a) 제1 핵산 구조물로서 상기 전사 활성인자를 코드하는 핵산 구조물; 및 (b) 제 2 핵산 구조물로서 상기 전사 활성인자가 결합하는 DNA를 포함하는 핵산 구조물로 구성된 것을 특징으로 하는 유전자 발현 시스템을 제공한다. 본 발명은 상기 유전자 발현 시스템을 함유하는 숙주세포 및 상기 발현 시스템을 사용하여 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 제 1 핵산 구조물로서 상기 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산 구조물; 및 (b) 제 2 핵산 구조물로서 상기 인공 핵 수용체가 결합하는 DNA를 포함하는 핵산 구조물로 구성된 유전자 발현 시스템을 제공한다. 본 발명은 상기 유전자 발현 시스템을 함유하는 숙주세포 및 상기 발현 시스템을 사용하여 유전자를 발현을 조절하는 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 인공 핵 수용체를 함유하고, 상기 핵 수용체의 리간드 결합 부위에 결합하는 특정 리간드에 반응하는 유도성 유전자 발현 시스템 (inducible gene expression system)을 제공한다.
본 발명은 (a) 제1 핵산 구조물로서 상기 전사 활성인자 또는 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산서열; 및 (2) 제 2 핵산 구조물로서 상기 전사 활성인자 또는 인공 핵 수용체에 반응하는 리포터 유전자 구조물로 구성된 유전자 발현 시스템을 제공한다.
본 발명은 (a) 제1 핵산 구조물로서 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산서열; 및 (b) 제 2 핵산 구조물로서 상기 핵 수용체에 반응하는 리포터 유전자 구조물로 구성된 유전자 발현 시스템을 이용하여 인공 핵 수용체에 결합하는 리간드의 길항물질을 검출하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1
발현벡터 pGEX-PurR, pGEX-PurG, pGEX-PurHG의 제조
재조합 단백질 PurR, PurG 및 PurHG를 제조하기 위해 발현 벡터 pGEX-PurR, pGEX-PurG, pGEX-PurHG를 제작하였다. PurR, PurG 및 PurHG의 cDNA는 PCR (polymerase chain reaction)을 이용하여 제조하였다. PurR cDNA는 퓨린 억제인자(purine repressor)의 DNA 결합 영역(DBD)을 포함하는 아미노 말단의 155개의 아미노산 서열에 해당한다 (PurR1-155aa). PurG cDNA는 퓨린 억제인자의 DBD에 해당하는 퓨린 억제인자 아미노 말단의 48 아미노산 서열 부위 (PurR1-48aa)와 Gal4의 이합 영역(dimerization domain: DD)에 해당하는 Gal4 전사인자의 제 42번에서 148번까지의 아미노산 부위 (Gal442-148aa)가 연결된 아미노산 서열을 가지고 있다.
PurR cDNA는 pPR1010 플라스미드(Rolfes R. J. and Zalkin H., J. Biol. Chem., 263, 653-661 (1988))를 주형으로 하고 프라이머 1 (서열번호 6)과 프라이머 2 (서열번호 7)를 사용하여 PCR로 증폭, 제조하였다. PurG cDNA는 먼저, pPR1010 플라스미드를 주형으로 프라이머 1과 프라이머 3 (서열번호 8)을 사용하여 PCR 증폭함으로써 퓨린 억제인자 DBD 부위의 DNA를 합성하였다(도 1a). Gal4 DD의 DNA는 pFA-CMV(Stratagene Co. CA, USA)를 주형으로 프라이머 4 (서열번호 9)와 프라이머 5 (서열번호 10)를 사용하여 PCR 증폭함으로써 합성하였다(도 1b). 합성된 퓨린 억제인자 DBD와 Gal4 DD의 DNA를 프라이머 1과 프라이머 5를 이용하여 PCR 증폭하여 퓨린 억제인자의 아미노 말단 1에서 48 아미노산과 Gal4의 42에서 148까지의 아미노산을 연결한 PurG의 cDNA를 합성하였다(도 1c).
PurHG는 PurG와 동일한 방법으로 프라이머 6 (서열번호 11)과 프라이머 7(서열번호 12)을 사용하여 합성하였다. PurHG는 퓨린 억제인자의 힌지 헬릭스 부위 (AVARSLKVN)가 포함된 아미노산 서열을 코드한다 [(PurR1-57aa)-(Gal442-148aa)]. 사용한 프라이머의 서열을 표 1에 나타내었다. 밑줄로 표시한 부위는 임의로 추가된 제한효소 절단부위이다. 상기 PurR, PurG 및 PurHG의 cDNA를 제한효소 BgⅢ와 BamHⅠ으로 절단한 후, 무핵세포 과발현 벡터 (prokaryotic over-expression vector)인 pGEX-4T1 (Amersham Pharmacia Biotech, Quarry Bay, Hong Kong)의 BamHⅠ부위에 결합시켜 각각 플라스미드 pGEX-PurR, pGEX-PurG, pGEX-PurHG를 제조하였다.
PurR, PurG 및 PurHG의 cDNA 제조를 위한 PCR에 사용된 프라이머
프라이머 핵산서열 서열번호
1 센스 5'-CTGAGA TCTAAT ACC ATG GCA ACA ATA-3' 6
2 안티센스 5'-ATC GGTGGA TCCAGC TTT TGC TTC ACC-3' 7
3 안티센스 5'-CCT TTT GGT TTT GGG GCT AGG GGA GTA GTG TAA TT-3' 8
4 센스 5'-CAC TAC TCC CCT AGC CCC AAA ACC AAA AGG TCT CC-3' 9
5 안티센스 5'-TGA AAA AGTGGA TCCGGG CGA TAC AGT-3' 10
6 센스 5'-CCT TTT GGT TTT GGG GTT AAC CTT CAG GCT ACG CG-3' 11
7 안티센스 5'-AGC CTG AAG GTT AAC CCC AAA ACC AAA AGG TCT CC-3' 12
실시예 2
재조합 단백질 GST-PurR, GST-PurG 및 GST-PurHG의 제조
재조합 PurR, PurG, PurHG 단백질을 얻기 위하여 실시예 1에서 제조된 발현벡터 pGEX-PurR, pGEX-PurG, pGEX-PurHG를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 시켰다. 형질전환된 E. coli의 콜로니 하나를 100μg/ml의 암피실린(ampicillin)이 포함된 5ml 테리픽 브로스(Terrific Broth)에 접종하고 37℃ 배양기에서 12시간 배양하였다. 상기 세포배양액을 100μg/ml 암피실린이 포함된 새 배양액에 1:100의 비율로 희석하여 접종한 다음 600nm에서 흡광도가 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양액에 이소피로필-1-β-D-티오갈락토피라노사이드(isopropyl-1 -β-D-thiogalacto pyranoside; IPTG)를 최종농도가 0.5mM이 되도록 첨가한 후 3시간동안 33℃ 배양기에서 배양하였다.
배양액을 원심분리하여 E. coli 세포를 수거한 다음 PBS(Phosphate Buffered Saline, pH7.4) 용액에 부유시킨 후 얼음위에서 20초간 5회 소니케이션(sonication)하였다. 상기 배양액을 4℃, 12,000rpm으로 15분간 원심분리하여 가용성 분획(soluble fraction)과 불용성 분획(insoluble fraction)으로 분리하였다. 아미노 말단에 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase)를 지니고 있는 글루타치온-아가로스(SIGMA Chemical Co., USA)를 이용하여 재조합 단백질 GST-PurR, GST-PurG 및 GST-PurHG를 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)로 분리하였다. 단백질의 농도는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)한 다음 쿠마시 블루 염색(Coomassie Brilliant Blue)을 통하여 확인하였다. 본 발명에 따른 재조합 DNA 결합 단백질의 구조를 도 2에 나타내었다.
실시예 3
재조합 단백질 GST-PurR, GST-PurG 및 GST-PurHG의 DNA 결합능력 측정
재조합 단백질 GST-PurR, GST-PurG, GST-PurHG가 DBD로서의 활성을 나타내는 가를 알아보기 위하여 그들의 in vitro DNA 결합능력을 EMSA(electromobility shift assay)로 측정하였다. PuRE 프라이머들 (서열번호 13 및 서열번호 14)을 이용하여 (표 2 참조) 퓨린 억제인자의 DNA 결합 부위인 16bp 팔린드롬(palindrome)을 포함하는 서열번호 25의 PuRE EMSA 프로브를 제작하였다(표 3 참조).
상기 올리고뉴클레오티드를 방사선 동위원소로 표지하기 위하여 미세시험관에 센스 올리고뉴클레오티드(10 pmoles/㎕) 1㎕, [γ-32P] ATP(6,000 Ci/mmol, Amersham Co.) 2㎕, 10x T4 폴리뉴클레오티드 키나제 반응 완충용액 (1M Tris-Cl,pH 7.6, 200mM MgCl2200mM β-mercaptoethanol) 1㎕, T4 폴리뉴클레오티드 키나제(10 U/㎕, Promega) 1㎕를 첨가하여 최종 부피를 10㎕로 조절한 후 37℃에서 90분간 반응시켰다. 반응액에 상보적인 염기배열을 갖는 올리고뉴클레오티드 (10pmoles/㎕) 3㎕, 10x H 완충용액 (500mM Tris-HCl, pH7.5, 100mM MgC12, 10mM Dithiothreitol, 1000mM NaCl) 2㎕, 증류수 5㎕를 첨가하여 최종 부피가 20㎕가 되도록 하였다. 반응액을 95℃에서 3분간 반응시킨 후 분당 1℃씩 서서히 온도를 낮추어 30℃까지 냉각시켜 어닐링(annealing)하였다. 여기에 TE (10mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA) 80㎕를 넣어 희석시킨 다음, 세파덱스 G-50(Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals, Sweden) 스펀 컬럼(spun column)을 통과시켜 결합되지 않은 방사선 동위원소를 제거하였다.
EMSA 프로브 제조에 사용된 올리고뉴클레오티드 핵산서열
DS-올리고뉴클레오티드 프라이머 핵산서열 서열번호
PuRE 8 센스 5-CCC TAC GCA AAC GTT TGC GTT TTC TGA GCT-3 13
9 안티센스 5-CAG AAA ACG CAA ACG TTT GCG TAG GGA GCT-3 14
mPuRE1 10 센스 5-CCC TAC GCA AACAGT TTG CGTTTT CTG AGC T-3 15
11 안티센스 5-CAG AAA ACG CAA ACT GTT TGC GTA GGG AGC T-3 16
mPuRE2 12 센스 5-CCC TAC GCA AACAAG TTT GCG TTT TCT GAG CT-3 17
13 안티센스 5-CAG AAA ACG CAA ACT TGT TTG CGT AGG GAG CT-3 18
mPuRE3 14 센스 5-CCC TAC GCA AAC GCG TTT GCG TTT TCT GAG CT-3 19
15 안티센스 5-CAG AAA ACG CAA ACG CGT TTG CGT AGG GAG CT-3 20
mPuRE4 16 센스 5-CCC TAC GCA AAC GTT TAA ACG TTT GCGTTT TCT GAG CT-3 21
17 안티센스 5-CAG AAA ACG CAA ACG TTT AAA CGT TTG CGT AGG GAG CT-3 22
mPuRE5 18 센스 5-CCC TAC GCA AAC GTT TAA ACT TTC TGA GCT-3 23
19 안티센스 5-CAG AAA GTT TAA ACG TTT GCG TAG GGA GCT-3 24
제조한 프로브 50,000cpm과 정제된 GST-PurR, GST-PurG 및 GST-PurHG 단백질 0, 10, 20, 40, 80, 120, 500ng을 각각 반응액(10mM HEPES, pH 7.9, 75mM KCl, 1mM EDTA, 5mM dithiothreitol, 5mM MgCl2, 10% glycerol, 1㎍/㎕ poly(dI-dC), 0.5% fetal bovine serum) 20㎕에 첨가하여 반응시켰다. 상온에서 30분간 반응시킨 후 완충액으로 1x TBE(45mM Tris, 45mM boric acid, 1mM EDTA)를 사용하여 200 V로 1시간동안 4% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동 하였다. 전기영동이 완료된 겔은 와트만 3MM 페이퍼에 부착시켜 겔 건조기에서 건조한 다음 -70℃에서 하룻밤동안 X-레이 필름에 노출시킨 후 현상하여 DNA와 단백질의 결합을 관찰하였다.
실험 결과, 재조합 단백질 중에 퓨린 억제인자의 힌지 영역(hinge region)을 포함하는 DBD 부위와 Gal4 DD를 연결한 GST-PurHG만이 PuRE 이중 가닥 프로브에 높은 친화력을 보였다. Gal4 DD를 함유하지 않은 GST-PurR 또는 힌지 영역이 없는 GST-PurG는 DNA 결합능력이 전혀 없었다 (도 3). 이와 같은 결과는 퓨린 억제인자의 아미노 말단 DBD만으로는 보조 억제인자(corepressor)가 결합된 활성형 상태의 퓨린 억제인자 DBD 구조를 형성할 수 없음을 시사한다. 활성형 상태의 퓨린 억제인자는 DBD의 카복시 말단 부위 힌지 헬릭스(hinge helix)가 서로 근접하도록 이합체(dimer)가 형성됨으로서, 헬릭스-턴-헬릭스 모티브(helix-turn-helix motif)가 주홈(major groove)에 그리고 힌지 헬릭스는 부홈(minor groove)에 결합할 수 있는 구조를 이루게 된다. 본 발명의 재조합 단백질 PurHG에서는 퓨린 억제인자 DBD의 카복시 말단부위에 Gal4의 DD를 연결하여 인위적으로 이합체를 형성시키므로써 활성형 상태의 퓨린 억제인자 DBD 구조를 이룰 수 있었다 (도 4).
실시예 4
퓨린 억제인자 결합 부위의 변형에 대한 PurHG 단백질의 결합능 측정
본 발명에 따른 재조합 단백질 PurHG DBD가 인식하는 DNA 염기서열이 원래의 퓨린 억제인자가 인식하는 염기서열과 차이가 있는지를 조사하고자, 퓨린 억제인자가 결합하는 천연서열인 16bp의 팔린드롬(도 5)을 여러 형태로 변형하여 그 결합정도를 측정하였다. 16bp 팔린드롬 서열 중간에 한 개 또는 두 개의 'A'를 첨가하여 mPuRE1과 mPuRE2를 제조하였고 'CG'를 첨가하여 9개의 완벽한 팔린드롬 형태인 mPuRE3을 제조하였다. EMSA의 프로브 제조에 사용된 핵산서열을 표2에, 제조된 프로브 서열을 표 3에 나타내었다. 상기 변형된 퓨린 억제인자 결합부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 실시예 3과 동일한 방법으로 방사선 원소로 표지한 다음 EMSA를 실시하였다. 이때, 재조합 단백질 PurHG의 양은 0, 30, 60, 120ng을 사용하였다. 실험 결과, 3가지 프로브 모두 PurHG 단백질과 전혀 결합하지 않았다 (도 6).
상기와 같은 결과로 PurHG 단백질이 인식하여 결합하는 총 16bp 팔린드롬 염기서열에서 정 중앙의 염기서열이 DNA 결합에 있어서 매우 중요하다는 것을 알 수 있었다. 이를 확인하고자 16bp 팔린드롬의 반쪽인 8bp와 다음 반쪽의 4bp를 포함하는 24bp 팔린드롬 염기서열을 지닌 mPuRE4와 16bp 팔린드롬에서 3'쪽의 4bp를 변형시킨 mPuRE5를 제조하였다(표 3). 상기 mPuRE4와 mPuRE5를 사용하여 동일한 방법으로 EMSA를 실시하였다.
EMSA 프로브로 사용된 퓨린 억제인자의 결합부위
프로브 핵산서열 서열번호
PuRE ccctACGCAAACGTTTGCGTtttctgagct 25
mPuRE1 ccctACGCAAACAGTTTGCGTtttctgagct 26
mPuRE2 ccctACGCAAACAAGTTTGCGTtttctgagct 27
mPuRE3 ccctACGCAAACG CGTTTGCGTtttctgagct 28
mPuRE4 ccctACGCAAACGTTT AAACGTTTGCGTtttctgagct 29
mPuRE5 ccctACGCAAACGTTTAAACtttctgagct 30
실험 결과, PuRE4의 경우 PurHG 단백질이 강하게 결합하였으나 PuRE에 비해 약한 친화력을 나타냈다. mPuRE5의 경우에도 PurHG 단백질이 약하게 결합함을 알 수 있었다 (도 6). 따라서, 총 16개의 팔린드롬 염기서열 중 중앙에 위치한 염기서열, 특히 5-12번째까지의 염기서열이 DNA-단백질 상호작용에 매우 중요함을 알 수 있었다. 또한, 본 발명에 따른 재조합 단백질 PurHG의 경우 자연 상태의 퓨린 억제인자가 인식하는 핵산서열에서 가장 높은 친화력을 가짐을 확인하였다.
실시예 5
리포터 유전자 구조물의 제조
실시예 3의 PuRE의 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 각각을 미세시험관에 10pmole씩 첨가하고 10㎕의 10x T4 폴리뉴클레오티드 키나제 반응 완충용액, 2㎕의 10mM ATP, 10unit T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 첨가한 후 총 부피가 20㎕가되도록 하여 37℃에서 45분간 올리고뉴클레오티드의 5'말단을 인산화하였다. 상기 두 종류의 반응액을 혼합한 후, 95℃에서 3분간 가열하고 분당 1℃씩 서서히 온도를 낮추어 30℃까지 냉각시켜 어닐링하였다. 이중가닥 올리고뉴클레오티드가 여러번 반복되어 결합하도록 T4 DNA 연결효소(ligase) 1㎕를 첨가한 다음 16℃에서 2시간 동안 반응시켰다. SacⅠ으로 절단한 pACL-60/+67-TATA-luc 벡터 (pACL-60/+67-Luc (K. S. Kim et al., J. Biol. Chem. 275, pp30280-30286)의 GACAAA(-30/-25)를 tAtAAA로 변형한 벡터)100ng을 연결 혼합물(ligation mixture)에 첨가하고 T4 DNA 연결효소 1㎕를 더 첨가한 후 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종료된 반응물을 이용하여 DH5α를 형질전환 시켰다.
형질전환된 균주의 콜로니 여러 개를 취하여 각각을 실시예 2와 같은 방법으로 배양하였다. 암피실린(Ampicillin) 저항성을 나타내는 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고 T7 시퀀싱 킷트(Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, USA)로 핵산서열을 확인하여 5개의 PuRE가 삽입된 플라스미드를 선택하였다. 상기 플라스미드를 pPuRE-Luc라 명명하였다. 플라스미드 pACL-60/+67-TATA-luc 벡터는 pACL60의 ATP 시트르산-분해효소(citrate-lyase) 유전자의 최소 프로모터에서 -30에서 -25까지의 핵산서열 'GACAAA'를 'tAtAAA'로 변환한 벡터이다. 상기와 동일한 방법으로 3 카피(copy)의 mPuRE4가 삽입된 pPuRE4-Luc와 5 카피의 mPuRE5가 삽입된 mPuRE5-Luc를 제조하였다.
실시예 6
전사 활성인자 과발현 벡터의 제조
본 발명에 따른 재조합 PurHG DBD가 유핵 세포내에서 활성을 나타내는 지를 조사하기 위하여 PurHG와 SREBP(sterol regulatory element-binding protein)1a의 활성 도메인(AD, 1-79 아미노산)을 연결하여 전사 활성인자인 PurAD를 제조하고 CMV 프로모터에 의해 발현되도록 pCMV-PurAD를 제조하였다(도 7).
먼저, Gal4의 DBD에 SREBP1a E의 활성 도메인(activation domain: AD, 1-79 아미노산)을 연결한 pCMV-Gal4AD를 제조하였다. pCMV-CSA10(Moon YA. et al., J. Biol. Chem., 275, 30280-30286 (2000))을 BamHⅠ과 SacⅠ으로 절단하고 탈인산화 시킨 pFA-CMV(Stratagene Co. CA, USA) 벡터에 T4 연결효소를 사용하여 연결하였다. 상기 반응물을 DH5α 수용(competent) 세포에 전입하여 카나마이신(kanamycin)이 첨가된 LB 아가 플레이트에서 선별하였다. LB 아가 플레이트에서 선별된 콜로니를 LB 액체배지에서 배양하여 플라스미드를 분리하였다. 분리된 플라스미드를 BamHⅠ과 SacⅠ으로 절단하여 삽입된 DNA 크기를 확인하였다.
PurAD 과발현 플라스미드인 pCMV-PurAD를 제조하기 위하여 실시예 1의 방법으로 제조한 PurHG cDNA를 Bg1Ⅱ와 BamHⅠ으로 처리하고 이를 pcDNA3의 BamHⅠ 제한효소 자리에 정방향으로 서브클론(subclone)하였다. 서브클론된 pcDNA3-PurHG의 BamHⅠ제한효소자리에 pCMV-Gal4AD에서 분리한 AD 유전자인 약 240bp의 BamHⅠ/Bg1Ⅱ DNA 조각을 삽입하여 pCMV-PurAD를 제작하였다.
실시예 7
전사 활성인자 PurAD의 활성 측정
본 발명에 따른 PurHG DBD가 실제로 유핵 세포내에서 활성을 나타내는 지를 조사하였다. 실시예 6에서 제조한 전사 활성인자인 PurAD를 과발현하는 벡터인 pCMV-PurAD와 실시예 5에서 제조한 리포터 플라스미드인 pPuRE-luc을 NIH 3T3세포에 코트랜스펙션(cotransfection)하고 루시퍼라제(luciferase) 유전자의 발현 양을 측정하였다(도 8).
pPuRE-luc는 퓨린 억제인자 반응 요소(purine repressor response element; PurRE) 염기서열이 5회 반복되도록 하고 그 3' 쪽으로 TATA 박스가 포함된 쥐 ACL 최소 프로모터, 루시퍼라제(luciferase) 유전자, SV40 폴리(A) 시그날 서열 순으로 배열하여 제작된 것이다. NIH 3T3세포는 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum), 100unit/ml 페니실린 G-소디움(penicillin G-sodium), 100μg/ml 스트렙토마이신 설페이트(streptomycin sulfate), 0.25μg/ml 암포테리신 B(amphotericin B)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Life Technologies, Inc., USA)에서 배양하였다. 상기 NIH 3T3 세포를 2×105cells/35-mm 디쉬(dish)의 밀도로 도말(plating)하였다. 상기 NIH 3T3 세포에 각각 pPuRE-luc 150ng과 pCMV-β-gal 20ng을 첨가하고 pCMV-PurAD를 0에서 200ng까지 증가시키면서 트랜스펙션하였다. 먼저 pCMV-PurAD 플라스미드를 pPuRE-luc, pCMV-β-gal과 혼합하고 35-mm 디쉬 1웰당 100㎕의 DMEM(free FBS, antibiotics)과 플러스 반응액(Plus reagent, LifeTechnologies, Inc.) 4㎕를 첨가하여 15분간 방치하였다. 100㎕의 DMEM에 리포펙타민 반응액(Liphofectamine regent, Life Technologies, Inc.) 2㎕를 반응액에 첨가하여 상온에서 15분간 방치하였다. 도말한 NIH 3T3 세포는 DMEM 배지를 제거한 다음 PBS 완충용액 1ml로 2회 세척한 후 800㎕의 DMEM 배지를 첨가하였다.
상기 세포에 혼합 반응액 200㎕를 분주하여 37℃의 CO2배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 트랜스펙션한 배지를 모두 제거한 후 다시 새 DMEM 배지로 교환하고 24시간 배양하였다. 24시간 후에 2㎕의 RU486(1mM/㎕)를 처리하여 다시 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 플레이트상의 배양액을 제거하고 2ml의 PBS로 2회 세척하였다. 각 플레이트에 20㎕의 리포터 용해 완충용액(reporter lysis buffer, Promega)을 가한 후 세포를 긁어 회수하였다. 1분간 와동(vortex)하여 완전히 세포를 용해시킨 후 4℃에서 13,000rpm으로 5분간 원심 분리하였다. 상층액을 회수하여 세포 추출용액을 획득하였다. 상기 세포 추출용액 5㎕에 50㎕의 루시퍼라제 분석용 기질(Luciferase Assay Substrate)를 첨가하고 발광측정기(Luminometer)에서 루시퍼라제에 의한 기질 분해정도를 측정하였다. β-갈락토시다제 활성 측정은 세포 추출용액 20㎕에 3.2mg의 ONPG(O-nitrophenyl-β-D-galactopytanoside), 0.1M 나트륨 인산 완충용액(sodium phosphate buffer) pH 7.8, 4ml, 40㎕의 100x Mg용액(0.1M MgCl2, 4.5M β-mercaptoethanol)용액을 180㎕ 첨가하고 37℃, 420nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험 결과, pCMV-PurAD가 증가함에 따라 루시퍼라제 유전자 발현이 크게 증가하였다. 10ng의 적은 농도의 pCMV-PurAD를 첨가한 상태에서도 루시퍼라제 발현이 크게 증가되었고, 50ng에서는 약 100배까지 루시퍼라제 유전자 발현이 증가되었다. 50ng 이상에서는 더 이상 크게 증가하지 않았다(도 9). 상기와 같은 결과는 퓨린 억제인자 DBD와 Gal4 DD로 구성된 새로운 PurHG DBD가 in vitro에서와 마찬가지로 유핵세포 내에서도 리포터 플라스미드 내의 PurRE에 선택적으로 결합하여 루시퍼라제 유전자 발현을 증가함을 의미하는 것이다.
실시예 8
인공 핵 수용체 과발현 벡터의 제조
본 발명에 따른 PurHG를 사용하여, 유핵세포 내에서 유전자 발현이 외부의 시그날에 의해 조절되는 인공 핵 수용체를 제조하였다. PurHG DBD, 변형된 프로게스테론 수용체의 LBD 및 SREBP1a의 AD가 도 10에 나타낸 바와 같은 배열을 갖도록 인공핵 수용체 PurANR를 제조하였으며, CMV 프로모터에 의하여 이를 발현하는 pCMV-PurANR 벡터를 제작하였다.
RU486과 반응하여 유전자 발현을 증가시키는 인공 핵 수용체를 개발하고자 PurHG와 Gal4 DBD를 사용하여 Gal4ANR 및 PurANR를 제조하고 이를 과발현하는 플라스미드 pCMV-Gal4ANR 및 pCMV-PurANR을 제작하였다(도 7).
플라스미드 pET-SREBP1a로부터 EcoRⅠ과 SacⅠ을 처리하여 약 240bp의 SREBP1a의 AD에 해당하는 DNA조각을 획득하였다. 이를 pFA-CMV의 BamHⅠ/SacⅠ제한효소 자리에 서브클론하고 프로게스테론 수용체의 리간드 결합 도메인을 BamHⅠ/EcoRⅠ 제한효소 자리에 서브클론하여 pCMV-Gal4ANR을 제조하였다. 프로게스테론 수용체의 리간드 결합 도메인의 cDNA는 인간의 유방암 조직으로부터 분리한 RNA를 사용하여 RT-PCR로 합성하였다. 합성된 cDNA는 프로게스테론 수용체의 LBD 부위, 즉 673에서 891까지 아미노산 서열에 해당한다. 증폭에 사용된 프라이머는 표 4에 나타낸바와 같다.
프로게스테론 LBD의 cDNA 합성에 사용한 프라이머
프라이머 핵산서열 서열번호
프라이머 20 센스 5'-AGC CAGGGA TCCACT TTT TCA CCA GGT CAA-3' 31
프라이머 21 안티센스 5'-CTG GATGAA TTCATT CAA GCA GTA CAG ATG-3' 32
제조된 pCMV-Gal4ANR을 BamHⅠ과 Bg1Ⅱ를 처리하여 약 900bp의 프로게스테론 수용체 LBD와 SREBP1a AD를 포함하는 DNA조각을 분리하여 pcDNA3-PurHG의 BamHⅠ 제한효소 자리에 정방향으로 삽입하여 pCMV-PurANR을 제조하였다.
실시예 9
인공 핵 수용체 PurANR의 활성 측정
실시예 8의 과발현 벡터에 의해 발현되는 PurANR 인공 핵 수용체가 유핵세포내에서 효과적으로 RU486에 반응하여 특정 유전자 발현을 조절할 수 있는지를 조사하였다. pCMV-PurANR을 실시예 7과 동일한 방법으로 리포터 유전자인 pPuRE-luc과 같이 NIH 3T3 세포에 코트랜스펙션하였다. 이때, NIH 3T3 세포에 각각 pPuRE-luc을 150ng, pCMV-β-gal을 20ng 첨가하고 pCMV-PurANR의 양을 0에서 200ng까지 증가시키면서 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 24시간 후 1μM의 RU486을 처리 또는 처리하지 않고 다시 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 다음 루시퍼라제 활성과 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 또한, NIH 3T3 세포에 pPuRE-luc 150ng, pCMV-β-gal 20ng과 pCMV-PurANR 200ng을 트랜스펙션하고 24시간 후에 RU486의 양을 0에서 1μM까지 증가시키면서 처리하여 다시 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 다음 루시퍼라제 활성과 β-갈락토시다제 활성을 실시예 7과 동일한 방법으로 측정하였다.
실험 결과, RU486을 처리하지 않은 상태에서는 루시퍼라제 발현이 PurANR에 의해 오히려 억제되었으며 RU486을 처리한 경우, pCMV-PurANR의 양이 증가함에 따라 루시퍼라제 발현이 증가되었다(도 11a). 또한, RU486의 양을 증가시킨 경우 루시퍼라제 발현이 30nM에서 최대에 도달하였다(도 11b). 따라서, 본 발명 PurANR은 유핵세포 내에서 RU486에 의해 특정 유전자 발현을 조절할 수 있음을 보여주었다.
실시예 10
Gal4 이형화 도메인을 변형한 인공 핵 수용체의 활성 변화
Gal4의 DD가 PurHG의 DNA 결합에 필수적임을 일시적인 트랜스펙션을 통해 조사하고자 pCMV-PurANR에서 Gal4 DD 부위를 제거하여 pCMV-PurANRΔGal4를 제작하였다(도 12). pCMV-PurANR을 주형으로 PCR을 실시하였다. PurH DBD와 Gal4 DD 사이에 BamHⅠ 제한효소 인식 부위를 만들기 위해 부위지향 돌연변이화 (site-directed mutagenesis)를 실시하였다. 사용된 프라이머는 표 5에 나타낸 바와 같으며 밑줄 친 부위는 BamHI 제한효소 인식 부위이다.
pCMV-PurANRΔGal4 제조시 사용한 프라이머
프라이머 핵산서열 서열번호
프라이머 22 센스 5'-AGC CTG AAG GTT AACGGA TCCACC AAA AGG TCT CCG CTG-3' 33
프라이머 23 안티센스 5'-CAG CGG AGA CCT TTT GGTGGA TCCGTT AAC CTT CAG GCT-3' 34
변이된 플라스미드를 분리하여 BamHI으로 절단하여 Gal4 DD부위를 제거하고, 벡터만 다시 자가-결합(self-ligation) 시켰다. DH5α에 형질전환 시킨 후 테리픽 브로스(Terrific Broth) 세포배양액에 밤새 키워 플라스미드 미디 킷트(Qiagen Plasmid Midi Kit)로 pCMV-PurANRΔGal4 플라스미드를 분리하였다. 실시예 9의 방법에 따라 RU486을 처리하고 루시퍼라제 활성을 측정하였을 때 PurANR은 Ru486에 반응하여 효과적으로 루시퍼라제 유전자 발현을 증가시키는데 반하여 Gal4의 DD를 제거한 PurANRΔGal4의 경우 RU486에 전혀 반응을 보이지 않았다(도 13a). 상기와 같은 결과는 EMSA의 결과와 일치하는 것으로서 PurHG DBD 단백질이 DNA에 결합할수 있도록 구조적 형태를 유지하는데 Gal4의 DD가 필수적임을 시사한다.
Gal4의 DD가 PurHG를 이합화(dimerization)시킨다는 사실을 증명하기 위하여 PurANR과 RU486을 반응시킬 때 Gal4ANR을 첨가하였다. NIH 3T3 세포에 pCMV-PurANR 200ng, pPuRE-luc 500ng, pCMV-β-gal 20ng과 함께 pCMV-Gal4ANR을 0에서 200ng까지 증가시키면서 형질 전환한 다음 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 이는 Gal4의 DBD 또한 Gal4의 DD를 함유하기 때문에 Gal4ANR은 PurANR과 이형이합체(heterodimer)를 형성 할 수 있고 따라서 PurANR을 비활성 시킬 수 있을 것을 예상된다. 실험 결과, PurANR의 RU486에 대한 반응성은 Gal4ANR의 양을 증가시킴에 따라 억제되었다(도 13b). 이상의 결과를 종합해보면, PurANR의 Gal4 DD 부위가 실제로 세포내에서 이합체 형성에 관여하며 이러한 이합체 형성이 DNA 결합에 필수적임을 알 수 있었다.
실시예 11
PurHG DBD내 Gal4 DD의 크기에 따른 인공 핵 수용체의 전사활성 측정
PurHG의 DBD가 DNA 결합능을 가지기 위한 최소한의 Gal4 DD 부위를 결정하기 위하여 107개의 아미노산으로 이루어진 Gal4 DD의 카복시 말단 부위를 제거하여 그 크기가 32개 아미노산 (Gal4 DD42-73) 또는 54개의 아미노산 (Gal4 DD42-95)으로 이루어진 Gal4 DD를 함유하는 인공핵 수용체를 고안하였으며 이들을 발현하기 위해 pCMV-PurANRGa132, pCMV-PurANRGa154를 제조하였다(도 14). pCMV-PurANRGa132,pCMV-PurANRGa154는 pCMV- PurANR을 주형으로 부위지향 돌연변이화(site-directed mutagenesis)를 시행하였다. 사용한 프라이머는 pCMV-PurANRGA132의 경우 프라이머 24, 25를 사용하였으며 pCMV-PurANRGa154의 경우 프라이머 26, 27을 사용하였다(표 6).
pCMV-PurANRGa132, pCMV-PurANRGa154 제조시 사용한 프라이머
프라이머 핵산서열 서열번호
프라이머 24 센스 5'-ATT TTT CCTGGA TCCGAC CTT GAC ATG-3' 35
프라이머 25 안티센스 5'-CAT GTC AAG GTCGGA TCCAGG AAA AAT-3' 36
프라이머 26 센스 5'-GCA TTG TTA ACAGGA TCCTTT GTA CAA GAT-3' 37
프라이머 27 안티센스 5'-ATC TTG TAC AAAGGA TCCTGT TAA CAA TGC-3' 38
BamHⅠ 제한효소 부위를 만든 후에 각각의 플라스미드를 BamHⅠ으로 절단하여 Gal4 카복시 말단부위를 제거한 다음 자가-연결(self-ligation)시켜 제조하였다. pCMV-PurANRGa132와 pCMV-PurANRGa154을 리포터 유전자와 함께 세포내에 형질전환 시킨 결과, RU486을 처리한 상태에서 pCMV-PurANRGa132 인공 핵 수용체는 pCMV-PurANR과 같은 정도의 발현이 이루어졌으나 pCMV-PurANRGa154의 경우 RU486에 전현 반응을 보이지 않았다(도 15).
실시예 12
변이 컨센서스를 가진 리포터 구조물의 PurANR에 대한 반응측정
PuRE보다는 PurHG DBD의 결합력은 작지만 PurHG가 결합할 수 있는 mPuRE4와 mPuRE5의 핵산서열이 여러 카피수로 삽입된 리포터 구조물(pPuRE4-luc, pPuRE5-luc)을 제조하고 인공 핵 수용체들에 대한 반응성을 조사하였다(도 16). mPuRE4는 시험관내 PurHG에 대한 친화력이 높았음에도 불구하고 mPuRE4 염기서열을 3회 반복시킨 리포터 구조물에서는 반응성이 크게 감소하였다. 반면, pPuRE5-luc는 기초 전사율이 pPuRE-luc에 비해 약 2배 증가되었으며 RU486에 의한 루시퍼라제 발현도 현저히 증가하였다. 그러나, 리간드를 처리하지 않았을 때의 전사율 (기초 전사율)의 증가로 RU486에 의한 발현 증가 비율은 pPuRE-luc의 경우보다는 적었다. 인공 핵 수용체 중에서는 퓨린 억제인자 DBD와 Gal4 DD 사이에 글리신 1개가 첨가된 pPurANR(G1)이 pPuRE-luc, pPURE5-luc 모두에서 가장 효과적으로 루시퍼라제 발현을 증가시켰다(도 17).
실시예 13
퓨린 억제인자 DBD와 Gal4 DD 사이에 글리신 첨가에 따른 PurANR 활성 변화
퓨린 억제인자 DBD와 Gal4 DD 사이에 글리신을 1개 또는 2개 첨가하고 PurANR 활성 변화를 조사하였다. pCMV-PurANR(G1)과 pCMV-PurANR(G2) 2개의 플라스미드를 제조하였다(도 18). 부위지향 돌연변이화(Site-directed mutagenesis)는 퀵채인지 키트(QuickChange Kit, Stratagene Co. CA, USA)를 사용하여 시행하였다. 주형으로는 pCMV-PurANR을 사용하였고 한 개의 글리신 첨가를 위해서는 프라이머28, 29를 두 개의 글리신 첨가를 위해서는 프라이머 30, 31을 사용하였다. 밑줄 친 부위는 첨가한 글리신 부위를 나타낸다(표 7).
pCMV-PurANR(G1) 및 pCMV-PurANR(G2) 제조시 사용한 프라이머
프라이머 핵산서열 서열번호
프라이머 28 센스 5'-AGC CTG AAG GTT AACGGACCC AAA ACC AAA AGG-3' 39
프라이머 29 안티센스 5'-CCT TTT GGT TTT GGGTCCGTT AAC CTT CAG GCT-3' 40
프라이머 30 센스 5'-AGC CTG AAG GTT AACGGA GGCCCC AAA ACC AAA AGG-3' 41
프라이머 31 안티센스 5'-CCT TTT GGT TTT GGGGCC TCCGTT AAC CTT CAG GCT-3' 42
글리신이 첨가된 인공 핵 수용체의 경우 RU486을 처리하지 않은 상태의 활성도가 현저히 낮았다. 또한, RU486에 의한 유전자 발현이 크게 증가하였다. 특히 한 개의 글리신을 첨가한 경우 유전자 발현 증가가 가장 높게 나타났다(도 19).
본 발명의 신규한 DNA 결합 단백질, 전사 활성 인자 및 인공 핵 수용체 단백질, 핵산 서열, 이들을 포함하는 발현 시스템 및 형질전환체 등은 유전자의 발현을 조절하거나 특정 리간드의 길항 물질을 스크린하는데 유용하게 사용될 수 있다.
<110> KIM, Kyung Sup <120> Novel DNA-binding proteins and inducible gene expression systems using thereof <160> 42 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 57 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(57) <223> DNA binding domain(1-48) and hinge domain(49-57) of purine repressor <400> 1 Met Ala Thr Ile Lys Asp Val Ala Lys Arg Ala Asn Val Ser Thr Thr 1 5 10 15 Thr Val Ser His Val Ile Asn Lys Thr Arg Phe Val Ala Glu Glu Thr 20 25 30 Arg Asn Ala Val Trp Ala Ala Ile Lys Glu Leu His Tyr Ser Pro Ser 35 40 45 Ala Val Ala Arg Ser Leu Lys Val Asn 50 55 <210> 2 <211> 148 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> DOMAIN <222> (42)..(148) <223> Gal4 DD <400> 2 Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu 1 5 10 15 Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu 20 25 30 Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro 35 40 45 Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu 50 55 60 Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile 65 70 75 80 Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu 85 90 95 Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala 100 105 110 Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser 115 120 125 Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu 130 135 140 Thr Val Ser Pro 145 <210> 3 <211> 164 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA binding protein <400> 3 Met Ala Thr Ile Lys Asp Val Ala Lys Arg Ala Asn Val Ser Thr Thr 1 5 10 15 Thr Val Ser His Val Ile Asn Lys Thr Arg Phe Val Ala Glu Glu Thr 20 25 30 Arg Asn Ala Val Trp Ala Ala Ile Lys Glu Leu His Tyr Ser Pro Ser 35 40 45 Ala Val Ala Arg Ser Leu Lys Val Asn Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro 50 55 60 Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu 65 70 75 80 Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile 85 90 95 Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu 100 105 110 Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala 115 120 125 Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser 130 135 140 Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu 145 150 155 160 Thr Val Ser Pro <210> 4 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> transcription factor <400> 4 Met Ala Thr Ile Lys Asp Val Ala Lys Arg Ala Asn Val Ser Thr Thr 1 5 10 15 Thr Val Ser His Val Ile Asn Lys Thr Arg Phe Val Ala Glu Glu Thr 20 25 30 Arg Asn Ala Val Trp Ala Ala Ile Lys Glu Leu His Tyr Ser Pro Ser 35 40 45 Ala Val Ala Arg Ser Leu Lys Val Asn Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro 50 55 60 Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu 65 70 75 80 Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile 85 90 95 Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu 100 105 110 Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala 115 120 125 Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser 130 135 140 Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu 145 150 155 160 Thr Val Ser Pro Gly Ser Met Asp Glu Pro Pro Phe Ser Glu Ala Ala 165 170 175 Leu Glu Gln Ala Leu Gly Glu Pro Cys Asp Leu Asp Ala Ala Leu Leu 180 185 190 Thr Asp Ile Glu Asp Met Leu Gln Leu Ile Asn Asn Gln Asp Ser Asp 195 200 205 Phe Pro Gly Leu Phe Asp Pro Pro Tyr Ala Gly Ser Gly Ala Gly Gly 210 215 220 Thr Asp Pro Ala Ser Pro Asp Thr Ser Ser Pro Gly Ser Leu Ser Pro 225 230 235 240 Pro Pro Ala Thr Leu 245 <210> 5 <211> 470 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificaial nuclear receptor <400> 5 Met Ala Thr Ile Lys Asp Val Ala Lys Arg Ala Asn Val Ser Thr Thr 1 5 10 15 Thr Val Ser His Val Ile Asn Lys Thr Arg Phe Val Ala Glu Glu Thr 20 25 30 Arg Asn Ala Val Trp Ala Ala Ile Lys Glu Leu His Tyr Ser Pro Ser 35 40 45 Ala Val Ala Arg Ser Leu Lys Val Asn Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro 50 55 60 Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu 65 70 75 80 Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile 85 90 95 Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu 100 105 110 Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala 115 120 125 Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser 130 135 140 Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu 145 150 155 160 Thr Val Ser Pro Gly Ser Thr Phe Ser Pro Gly Gln Asp Ile Gln Leu 165 170 175 Ile Pro Pro Leu Ile Asn Leu Leu Met Ser Ile Glu Pro Asp Val Ile 180 185 190 Tyr Ala Gly His Asp Asn Thr Lys Pro Asp Thr Ser Ser Ser Leu Leu 195 200 205 Thr Ser Leu Asn Gln Leu Gly Glu Arg Gln Leu Leu Ser Val Val Lys 210 215 220 Trp Ser Lys Ser Leu Pro Gly Phe Arg Asn Leu His Ile Asp Asp Gln 225 230 235 240 Ile Thr Leu Ile Gln Tyr Ser Trp Met Ser Leu Met Val Phe Gly Leu 245 250 255 Gly Trp Arg Ser Tyr Lys His Val Ser Gly Gln Met Leu Tyr Phe Ala 260 265 270 Pro Asp Leu Ile Leu Asn Glu Gln Arg Met Lys Glu Ser Ser Phe Tyr 275 280 285 Ser Leu Cys Leu Thr Met Trp Gln Ile Pro Gln Glu Phe Val Lys Leu 290 295 300 Gln Val Ser Gln Glu Glu Phe Leu Cys Met Lys Val Leu Leu Leu Leu 305 310 315 320 Asn Thr Ile Pro Leu Glu Gly Leu Arg Ser Gln Thr Gln Phe Glu Glu 325 330 335 Met Arg Ser Ser Tyr Ile Arg Glu Leu Ile Lys Ala Ile Gly Leu Arg 340 345 350 Gln Lys Gly Val Val Ser Ser Ser Gln Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys 355 360 365 Leu Leu Asp Asn Leu His Asp Leu Val Lys Gln Leu His Leu Tyr Cys 370 375 380 Leu Asn Glu Phe Arg Ser Ser Met Asp Glu Pro Pro Phe Ser Glu Ala 385 390 395 400 Ala Leu Glu Gln Ala Leu Gly Glu Pro Cys Asp Leu Asp Ala Ala Leu 405 410 415 Leu Thr Asp Ile Glu Asp Met Leu Gln Leu Ile Asn Asn Gln Asp Ser 420 425 430 Asp Phe Pro Gly Leu Phe Asp Pro Pro Tyr Ala Gly Ser Gly Ala Gly 435 440 445 Gly Thr Asp Pro Ala Ser Pro Asp Thr Ser Ser Pro Gly Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Pro Pro Ala Thr Leu 465 470 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctgagatcta ataccatggc aacaata 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atcggtggat ccagcttttg cttcacc 27 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccttttggtt ttggggctag gggagtagtg taatt 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cactactccc ctagccccaa aaccaaaagg tctcc 35 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tgaaaaagtg gatccgggcg atacagt 27 <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ccttttggtt ttggggttaa ccttcaggct acgcg 35 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 agcctgaagg ttaaccccaa aaccaaaagg tctcc 35 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ccctacgcaa acgtttgcgt tttctgagct 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cagaaaacgc aaacgtttgc gtagggagct 30 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ccctacgcaa acagtttgcg ttttctgagc t 31 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cagaaaacgc aaactgtttg cgtagggagc t 31 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ccctacgcaa acaagtttgc gttttctgag ct 32 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cagaaaacgc aaacttgttt gcgtagggag ct 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ccctacgcaa acgcgtttgc gttttctgag ct 32 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cagaaaacgc aaacgcgttt gcgtagggag ct 32 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ccctacgcaa acgtttaaac gtttgcgttt tctgagct 38 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cagaaaacgc aaacgtttaa acgtttgcgt agggagct 38 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ccctacgcaa acgtttaaac tttctgagct 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cagaaagttt aaacgtttgc gtagggagct 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PuRE <400> 25 ccctacgcaa acgtttgcgt tttctgagct 30 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPuRE1 <400> 26 ccctacgcaa acagtttgcg ttttctgagc t 31 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPuRE2 <400> 27 ccctacgcaa acaagtttgc gttttctgag ct 32 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPuRE3 <400> 28 ccctacgcaa acgcgtttgc gttttctgag ct 32 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPuRE4 <400> 29 ccctacgcaa acgtttaaac gtttgcgttt tctgagct 38 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mPuRE5 <400> 30 ccctacgcaa acgtttaaac tttctgagct 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 agccagggat ccactttttc accaggtcaa 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 ctggatgaat tcattcaagc agtacagatg 30 <210> 33 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 agcctgaagg ttaacggatc caccaaaagg tctccgctg 39 <210> 34 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cagcggagac cttttggtgg atccgttaac cttcaggct 39 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 atttttcctg gatccgacct tgacatg 27 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 catgtcaagg tcggatccag gaaaaat 27 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gcattgttaa caggatcctt tgtacaagat 30 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 atcttgtaca aaggatcctg ttaacaatgc 30 <210> 39 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 agcctgaagg ttaacggacc caaaaccaaa agg 33 <210> 40 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 ccttttggtt ttgggtccgt taaccttcag gct 33 <210> 41 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 agcctgaagg ttaacggagg ccccaaaacc aaaagg 36 <210> 42 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 ccttttggtt ttggggcctc cgttaacctt caggct 36

Claims (21)

  1. (삭제)
  2. (삭제)
  3. 서열번호 3으로 표시되는 DNA 결합 단백질
  4. (삭제)
  5. (삭제)
  6. (삭제)
  7. 서열번호 4로 표시되는 전사인자.
  8. (삭제)
  9. (삭제)
  10. (삭제)
  11. (삭제)
  12. 서열번호 5로 표시되는 인공 핵 수용체.
  13. 제3항, 제7항 및 제12항 중의 어느 한 항의 단백질을 코드하는 핵산서열.
  14. 제 13항의 핵산서열을 함유하는 벡터.
  15. 제 14항에 기재된 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  16. (a) 제 1 핵산 구조물로서 서열번호 4로 표시되는 전사인자를 코드하는 핵산 구조물; 및 (b) 제 2 핵산 구조물로서 상기 (a) 전사인자가 결합하는 DNA를 포함하는 핵산 구조물로 구성된 것을 특징으로 하는 유전자 발현 시스템.
  17. (a) 제 1 핵산 구조물로서 서열번호 5로 표시되는 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산 구조물; 및 (b) 제 2 핵산 구조물로서 상기 (a) 인공 핵 수용체가 결합하는 DNA를 포함하는 핵산 구조물로 구성된 것을 특징으로 하는 유전자 발현 시스템.
  18. 제 16항 또는 제 17항 기재의 유전자 발현 시스템을 함유하는 숙주세포.
  19. 제 17항 기재의 유전자 발현 시스템을 이용하여 유전자 발현을 조절하는 방법.
  20. (a) 제1핵산 구조물로서 서열번호 4로 표시되는 전사인자 또는 서열번호 5로 표시되는 인공 핵 수용체를 코드하는 핵산 서열; 및 (b) 제2핵산 구조물로서 상기 (a)의 전사인자 또는 인공 핵 수용체에 반응하는 리포터 유전자 구조물로 구성된 것을 특징으로 하는 유전자 발현시스템.
  21. 제 20항 기재의 유전자 발현 시스템을 이용하여 서열번호 5로 표시되는 인공 핵 수용체에 결합하는 Roussel-Uclaf에 의해 제조된 프로게스테론 길항물질인 RU486(mifepristone)을 검출하는 방법.
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