KR20010040715A - 치료제의 선별 방법 - Google Patents

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KR20010040715A
KR20010040715A KR1020007008596A KR20007008596A KR20010040715A KR 20010040715 A KR20010040715 A KR 20010040715A KR 1020007008596 A KR1020007008596 A KR 1020007008596A KR 20007008596 A KR20007008596 A KR 20007008596A KR 20010040715 A KR20010040715 A KR 20010040715A
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KR
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activin
caga
smad
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KR1020007008596A
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장-미쉘 고티에
스테판 휘
실비아 가브리엘 뎅러
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그레이엄 브레레톤, 레슬리 에드워즈
글락소 그룹 리미티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은, 약제의 존재하에서 Smad 단백질 또는 그의 DNA 결합 단편과 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C,A,G 또는 T이고, Z은 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 간의 결합 또는 전사 활성의 정도 또는 결과를 검출 또는 분석하는 것을 포함하는, 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병과 싸우는 데 사용하기 위한 치료제의 선별 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 방법에 의해 확인된 치료제, 및 Smad-매개 TGFβ-유도 유전자의 비정상 발현과 연관된 질병과 싸우는 데 있어서의 그의 용도가 기재되어 있다.

Description

치료제의 선별 방법 {Method of Screening Therapeutic Agents}
〈110〉 Glaxo Group Limited
Gauthier, Jean-Michel
〈120〉 Method of screening
〈130〉 PF3402
〈140〉 PCT/EP99/00664
〈141〉 1999-02-04
〈150〉 GB 9802475.5
〈151〉 1998-02-06
〈160〉 23
〈170〉 PatentIn Ver. 2.1
〈210〉 1
〈211〉 81
〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence: Synthetic
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〈400〉 1
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〈211〉 467
〈212〉 PRT
〈213〉 Homo sapiens
〈400〉 4
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Gly Trp Lys Lys Ser Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ala Gly Gly Gly Glu
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〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:
Oligonucleotide
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〈220〉
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Oligonucleotide
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〈212〉 DNA
〈213〉 Artificial Sequence
〈220〉
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Oligonucleotide
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〈220〉
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〈220〉
〈223〉 Description of Artificial Sequence:
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〈220〉
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본 발명은 뉴클레오티드 서열, 특히 TGFβ 및 액티빈 유도를 중개하고 Smad 단백질과 결합하는 전사 조절 서열, 및 이 서열의 용도, 예컨데 Smad-매개 TGFβ-유도 유전자의 비정상 발현과 관련된 질병을 퇴치하는 데 사용되는 약제를 선별하는 데 있어서 상기 서열의 용도에 관한 것이다.
형질전환 성장 인자 β(TGFβ)는 액티빈 및 골 형태형성 단백질을 포함하는 사이토킨류에 속하며, 많은 종류의 세포에서 합성되고, 증식, 분화, 이동, 면역의 제어 및 세포외 기질의 변환 (turnover)의 조절을 비롯한 다양한 세포 및 생체 효과를 갖는다. 이러한 많은 효과에 있어서, TGFβ-1와 같은 TGFβ는 전사 활성화인자로서 작용한다. 몇 가지 프로모터가 플라스미노겐 활성화인자 억제인자-유형 1 (PAI-1), α2(I) 프로콜라겐, TGFβ-1 자체, 생식계열 Igα 불변 영역, 사이클린-의존성-키나아제 (CDK) 억제인자 p21 및 p15을 비롯한 TGFβ에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다.
단백질의 Smad 과의 요소들은, 완전히 설명되지 않은 메카니즘을 통해, TGFβ 및 액티빈 전사 활성화를 매개하는 데 중요한 역할을 한다. 초파리 (Drosophila) MAD 오르토로그(ortholog) 단백질의 아미노-말단 부분은 전사 조절을 위해 중요한 흔적 유전자의 인핸서에 결합되는 것으로 밝혀져 있다 (Kim 등, Nature, 1997, 388, 304-308). 손톱개구리 (Xenopus) Smad2 및 Smad4 단백질은, FAST-1 전사 인자를 또한 함유하는 액티빈-반응 인자 (ARF)로 명명된 단백질 복합체의 성분들이다. 액티빈-유도된 손톱개구리 Mix.2 프로모터에 결합하는 ARF 능력은 FAST-1에 의해 부여되며, Smad2/Smad4가 공동-활성화인자로서 작용하는 것이 제안되어 있다 (Chen 등, Nature, 1996, 383, 691-696; Chen 등, Nature, 1997, 389, 85-89). TGFβ 신호화 (signalling)에 관련된 Smad 단백질중에서, Smad6 및 7은 TGFβ 신호화 경로의 억제인자로 작용하는 것으로 공지되어 있고, Smad2 및 3은 TGFβ 신호화 경로를 매개하는 것으로 공지되어 있으며, Smad4는 적어도 Smad2 및 3과 함께 헤테로올리고머를 형성하는 것으로 공지되어 있다 (Heldin 등, Nature, 1997, 390, 465-471). Smad4는 인공 구조물의 DNA 서열을 결합하는 것으로 밝혀졌으나. 이러한 결합 활성은 TGFβ-의존성 전사 활성화를 부여하지 않는다 (Yingling 등, Mol.Cell.Biol., 1997, 17, 7019-7028).
본 발명자들은 2개의 Smad 단백질인 Smad3 및 Smad4와 DNA를 포함한 복합체의 존재를 밝혀내었으며, Smad3, Smad4가 DNA 결합 단백질임을 증명하였다. 본 발명자들은 또한 엑손 3에 접합된 Smad2가 DNA 결합 단백질임을 증명하였다. 더욱이, 본 발명자들은 TGFβ-반응성 프로모터내의 Smad3/4-결합 서열을 확인하였으며, Smad 3/4의 결합이 TGFβ 유도된 전사 효과에 필수적임을 밝혀내었다.
섬유증 질병, 비정상적인 창상 치유, 비정상적인 골 형성, 암의 발생, 조혈, 신경보호 및 면역 및 염증 장애를 포함하여, 다수의 질병 상태가 TGFβ에 의해 제어되는 유전자의 발현에서의 변이와 관련되는 것으로 공지되어 있다. PAI-1 유전자는 가장 많이 연구되는 TGFβ에 의해 활성화되는 유전자중의 하나이다. PAI-1 단백질은 내피세포, 섬유아세포, 상피세포 및 간 실질세포를 포함한 여러 세포 유형의 세포에 의해 생성된다. 이것은 우로키나아제 (U-PA) 및 조직 플라스미노겐 활성화인자 (t-PA)에 대한 저해 작용에 의하여 세린 프로테아제 플라스민의 활성을 간접적으로 제어하며, 이들은 각각 플라스미노겐으로부터 플라스민의 형성에 촉매작용을 한다.
플라스민은, 세포외 기질의 형성 및 유지에 있어서, 기질 성분들을 소화시킴으로써 직접적으로, 그리고 기질 분해 효소의 잠재 형태를 활성화시키는 능력에 의해 간접적으로 중요한 역할을 한다. 플라스민의 주요한 역할은 피브린 괴를 제거하는 것이다. 따라서, 플라스민은 혈관계 (즉, 피브린) 및 기질에 대해 이중 특이성을 갖는다. 플라스민 수준은 PAI-1에 의해 제어되기 때문에, 따라서 PAI-1은 섬유소용해 균형에 영향을 미치고 섬유형성 병변의 양을 제어하는데 중요한 역할을 한다. 기질 침착을 조정하는 능력은, 창상 치유, 비대 반흔, 해족종, 공피증, 간 및 담즙 섬유증, 폐 섬유증, 신장 섬유증, 심장 섬유증 및 수술후 유착증을 포함한 다수의 적응증에서 치료적으로 중요하다. (Franklin. Int. J. Biochem. Cell Biol., 1997, 29, 78-89). 현재, 섬유증에 대한 치료법은 존재하지 않는다.
엑손 3에 접합된 Smad3, Smad4 및 Smad2가 PAI-1과 같은 TGFβ 활성화 프로모터에 결합되는 DNA 결합 단백질이라는 본 발명자들의 발견은, 엑손 3에 접합된 Smad3 또는 Smad4 또는 Smad2 (또는 임의의 Smad3 또는 Smad4 함유 단백질 복합체)의 그의 인지 서열에 대한 결합 또는 전사 활성을 조정함으로써 Smad-매개 TGFβ유전자 조절과 연관된 질병과 싸우기위한 새로운 방책을 개발하는 길을 열었으며, 또한 그의 인지 서열에 결합하는 Smad 함유 복합체 (즉, 엑손 3에 접합된 Smad 3 및 Smad 4 및 Smad 2)의 정도에 영향을 미치거나, 또는 작용을 받은 유전자의 프로모터에서 인지 서열에 결합된 Smad 함유 복합체 (즉, 엑손 3에 접합된 Smad 3 및 Smad 4 및 Smad 2)의 전사 능력에 영향을 미침으로써 치료에서 사용하기 위한 TGFβ-조절된 유전자의 발현을 조정할 수 있는 제약학적 약제의 선별 방법을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명의 한 가지 측면에 따르면, 본 발명은 Smad 및 TGFβ또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병을 퇴치하는 데 사용하기 위한 약제의 선별 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 약제의 존재하에서 Smad 단백질 또는 그의 DNA 결합 단편과 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C,A,G 또는 T이고, Z는 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 간의 결합 또는 전사 활성의 정도 또는 결과를 검출 또는 분석하는 것을 포함한다.
본 발명자들은 이러한 서열을 CAGA 박스로 명명하였다. 본 명세서에서 사용된 용어 CAGA 박스는, 본 발명자들이 PAI-1 프로모터에서 확인한 서열 뿐만 아니라 이러한 서열에 대해 기능적으로 균등한 서열, 다시말해서 Smad 단백질을 개별적으로 또는 Smad 단백질의 복합체의 일부로서 결합할 수 있는 임의의 뉴클레오티드 서열을 일컫는데 사용되며, 상기 결합은 기능적 균등 서열의 제어하에서 유전자의 TGFβ 및 액티빈 조절을 위해 필요한 단계이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "선별"은, Smad 단백질 및 CAGA 박스 간의 결합 또는 CAGA 박스에 결합된 Smad 단백질의 전사 능력을 조정하거나, 영향을 미치거나, 좌우하거나, 또는 방해할 수 있는 약제의 작용을 조사하는 임의의 방법 또는 분석을 포함하며, 단일 약제 또는 화합물을 조사하는 결합 분석 뿐만 아니라 화합물의 배열 또는 화합물의 라이브러리와 같은 하나 이상의 화합물을 시험하는 분석법을 포함한다. 1 종 이상의 약제를 시험하는 경우에, 이러한 시험은 동시에 일어나거나 연속적일 수도 있다. 이러한 약제는 엑손 3에 접합된 Smad3 또는 Smad4 또는 Smad2와 같은 Smad 단백질의 CAGA 박스 서열에 대한 결합을 방해, 다시말해서 CAGA 박스에 대한 Smad의 결합을 전체적으로 또는 부분적으로 방지하는 작용을 할 수도 있거나, 또는 Smad 단백질과 CAGA 박스간의 결합을 증강시키는 작용을 할 수도 있다. 또한, 이러한 약제는, 엑손 3에 접합된 Smad3 또는 Smad4 또는 Smad2와 같은, CAGA 박스 서열에 결합된 Smad 단백질의 전사 활성을 조정, 다시말해서 CAGA 박스에 결합된 Smad 함유 복합체의 전사 활성을 감소시키는 작용을 할 수도 있거나, 또는 CAGA 박스에 결합된 Smad 함유 복합체의 전사 활성을 증강시킬 수도 있다. 검출 및 분석 방법은, 결합 또는 전사 활성이 존재하는가의 여부 및 시험되는 약제의 효과에 대한 정량적, 정성적 또는 반정량적 평가를 포함한다. 바람직하게는, 엑손 3에 접합된 Smad3/Smad4/Smad2/TGFβ/액티빈 조절과 관련된 질병과 싸우는데 있어서 치료적 잇점을 가진 약제를 선별하기 위하여, 엑손3에 접합된 Smad3/Smad4/Smad2/DNA 복합체 형성 또는 전사 활성에 대한 조정 효과를 가진 화합물을 선별 시험에 의해 조사한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "Smad 단백질"이란, 엑손 3에 접합된 Smad3 또는 Smad4 또는 Smad2의 단독 또는 단백질 복합체와 같이, 그의 수용체 서열 (CAGA 박스)에 결합되는 Smad 단백질의 결합 특징을 가진 단백질 또는 단백질 복합체를 일컫는 것이며, 엑손 3에 접합된 Smad3 및 Smad4 및 Smad2 단백질 자체 뿐만 아니라 이러한 단백질의 DNA 결합 단편, 이러한 단백질을 함유하는 융합 단백질 및 변이체를 포함한다.
바람직한 측면에 있어서, 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 본 발명자들이 PAI-1 프로모터에서 확인한 서열인 서열 AG(C/A)CAGACA을 포함한다. 본 발명자들은 서열 AG(C/A)CAGACA이 인간 PAI-1프로모터에서 TGFβ전사 유도를 매개하는 것으로 공지된 영역에 3개의 복제로 존재하는 것을 확인하였다. α2(I) 프로콜라겐, 생식계열 Igα 불변 영역 및 TGFβ1 프로모터를 포함하여 TGFβ에 의해 유도될 수 있는 것으로 공지된 기타 프로모터 및 인핸서에서, 이 서열 및 -CAGA-특색을 포함하는 이 서열에 매우 유사한 서열이 또한 확인되었다. 이러한 서열들을 표 1에 나타내며, 용어 CAGA 박스에 포함된다.
프로모터 서열 위치
인간 PAI-1 AGCCAGACA -730
AGACAGACA -580
AGACAGACA -280
인간 TGFβ-1 유전자 AGCCAGACA +22
인간 α2(I)콜라겐 프로모터 ATGCAGACA -264
인간 생식계열 IGα불변 영역 AGCCAGACC -120
GGCCAGACA -35
한가지 측면에서, 본 발명의 선별 시험에서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드는 CAGA 박스 자체를 포함한다. 그러나, CAGA 박스는 한쪽 또는 양쪽 말단에 플랭킹 서열을 포함할 수도 있다. 이러한 서열은, CAGA 박스의 한 가닥의 길이를, 예를들면 한쪽 말단에서 3개의 뉴클레오티드로 또는 한쪽 말단에서 2개의 뉴클레오티드와 다른쪽 말단에서 하나의 뉴클레오티드로 연장시켜 3개 뉴클레오티드 내지 총 12개 뉴클레오티드로 연장시킬 수도 있거나, 또는 한쪽 말단에서 추가의 염기를 갖거나 CAGA 박스 자체의 각각의 말단 사이에서 분리되어 6개의 뉴클레오티드 내지 총 15개의 뉴클레오티드로 서열을 연장시킬 수도 있으며, 또는 플랭킹 서열은 CAGA 박스의 하나의 스트랜드를 예를들어 총 20개의 뉴클레오티드 또는 그 이상, 예컨대 30, 40 또는 50개의 뉴클레오티드 까지 더욱 연장시킬 수도 있다. 본 발명에서 사용하기 위하여, 올리고뉴클레오티드는 CAGA 박스 자체 또는 10개 까지의 뉴클레오티드, 바람직하게는 20개 까지의 뉴클레오티드, 바람직하게는 50개 까지의 뉴클레오티드에 의해 연장된 CAGA 박스를 포함할 수도 있다. 임의로 플랭킹 영역을 가진 CAGA 박스는 본 발명에서 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드에서 예를들면 50회 까지의 반복, 바람직하게는 20회 까지의 반복, 예컨대 10회 까지의 반복으로 반복될 수도 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 시험 올리고뉴클레오티드는 CAGA 박스 및 CAGA 박스를 기초로 한 모든 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 AP-1 결합 부위와는 상이하다.
바람직한 측면에서, Y는 C, A 또는 G이다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위하여, 시험 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성될 수도 있거나, 또는 게놈 또는 cDNA 단편일 수도 있거나, 또는 플라스미드 또는 박테리오파지를 기초로 한 것과 같은 재조합 벡터내에 혼입될 수도 있다.
한 가지 측면에서, 본 발명은, 시험 약제의 존재하에서 Smad 단백질과 시험 올리고뉴클레오티드간의 결합 또는 시험 올리고뉴클레오티드에 결합된 Smad 함유 단백질 복합체의 전사 활성을, 상기 약제의 부재하에서의 것과 비교하는 것을 포함한다.
본 발명자들은 TGFβ유도가능한 CAGA 박스가 Smad 매개 TGFβ유도에 특이적으로 관련됨을 알아내었다. 즉, TK 프로모터의 상류에 다중 복제로 클로닝될 때, CAGA 박스 서열이 HepG2 세포에서 TGFβ매개 전사 유도를 부여하는 것으로 밝혀졌으나, 이러한 서열의 변이된 변형 AGCTACATA, 즉 3개의 점 돌연변이를 함유하는 서열은 TGFβ유도를 부여하지 않았다. 본 발명자들은, TGFβ가 CAGA 리포터 구조물의 발현에 영향을 미치지 않는다면, Smad4가 결핍된 유방암에서 유래된 인간 상피 세포인 MDA-MB4648에 있어서 Smad4가 TGFβ매개 유도에 필수적이라는 것을 알아내었으나, 이러한 세포주가 Smad4를 코딩하는 발현 구축물과 함께 동시 형질감염될 때 TGFβ에 의한 유도가 관찰되었다. 본 발명자들은 TGFβ및 상이한 Smad 단백질에 대한 항체의 존재하에서 HepG2 핵 추출물의 전기영동 이동도-변위 분석 (EMSA)를 사용하여 Smad3 및 4가 TGFβ-의존성 CAGA 박스 결합 복합체에 존재함을 나타내는 CAGA 서열의 결합 특성을 증명하였으며, 또한 본 발명자들은 이.콜리 발현된 Smad 단백질의 존재하에서 EMSA를 사용하여 Smad3 및 Smad4가 직접적 및 특이적인 DNA-결합 활성을 갖고 있음을 증명하였다. 더욱이, 본 발명자들은 밀접하게 관련된 Smad2 단백질이 CAGA-매개 전사를 활성화할 수 없음을 밝혀내었다. 본 발명자들은, Smad2 유전자에서 엑손3에 의해 코딩된 도메인이 Smad2가 CAGA 서열에 결합하는 것을 방지함을 증명하였으며, 또한 엑손3에 상응하는 도메인이 존재하지 않는 Smad2의 변형이 CAGA 박스에 결합하고 이로부터의 전사를 활성화시킬 수 있음을 증명하였다.
본 발명자들의 CAGA 박스에 유사한 서열이, 예컨대 α2(I) 프로콜라겐 유전자, 생식계열 Igα2 구성 영역 유전자 및 TGFβ1 프로모터와 같은, TGFβ에 의해 조절되는 프로모터의 다른 TGFβ유도가능한 영역에서 확인되었다. 이러한 서열들을 표 1에 나타낸다.
CAGA 박스 함유 서열 또는 그와 기능적으로 균등한 서열에 대한, 단독 또는 복합체로서의 하나 이상의 Smad 단백질의 전사 능력 또는 결합을 조정하고, 궁극적으로 Smad-TGFβ유도에 의해 제어되는 유전자의 발현을 변경시키기 위해 잠재적으로 유용한 약리학적 약제의 선별 방법은, 여러가지 직접적 또는 간접적 방식으로 수행될 수도 있다.
방법의 직접적인 유형에서, 단백질 (즉, Smad 또는 그의 CAGA 결합 단편)과 시험 올리고뉴클레오티드 또는 CAGA 함유 뉴클레오티드 서열간의 결합 복합체의 형성을 분석한다. 이를 위하여, 예를들어 엑손3에 접합된 포유동물 Smad3 및/또는 Smad4 또는 Smad2 단백질 또는 그의 CAGA 박스 결합 단편과 같이, CAGA 관련 인식 서열과 복합체를 형성하는 능력을 가진 임의의 Smad 단백질을 단독으로 또는 재조합 폴리펩티드의 일부로 단백질 요소로서 사용하여, 당 기술분야에 공지된 다양한 기술을 이용할 수 있으며, 상기 단백질은 이.콜리와 같은 세균을 사용한 원핵성 발현 체계, 또는 효모 또는 바쿨로비루스와 같은 진핵성 발현 체계, 또는 예를들어 망상적혈구 용해물을 기본으로 하는 시험관내 발현 체계를 포함한 당 기술분야에 공지된 발현 체계로부터 또는 세포로부터 정제될 수도 있다. 이러한 기술은 예를들어 문헌 (Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1989)에 기재되어 있다. 특이적 결합 복합체의 DNA 부분은 CAGA 박스 함유 인식 서열을 포함하는 시험 올리고뉴클레오티드를 포함한 올리고뉴클레오티드를 포함할 수도 있으며, 이러한 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 합성될 수도 있거나 또는 게놈 또는 cDNA 단편일 수도 있고, 또는 예를들어 플라스미드 또는 박테리오파지를 기초로 한 재조합 벡터의 일부일 수도 있다.
본 발명에 따른 DNA와 단백질 간의 상호작용을 검색하는 방법은 당 기술분야에 공지되어 있다. 공지된 양의 단백질과 DNA를 혼합할 수 있고, 복합체 형성이 일어난 후에 복합되지 않은 DNA 또는 단백질의 양을 결정할 수 있다. 복합되지 않은 단백질은, 일단 복합체를 분리한 후에, 예를들어 효소 결합 항체면역흡착 분석 (ELISA) 및 표준 단백질 측정 기술, 예컨대 로우리 (Lowry), 뷰렛 또는 브래드포드(Bradford) 분석에 의한 항체 검출을 포함하는 다양한 기술에 의해 측정될 수 있다. 복합되지 않은 DNA는 당 기술분야에 공지된 다양한 기술, 예를들어 바이오틴 또는 방사능 표지와 같은 검출가능한 표지화 프로브와의 하이브리드 형성에 의해 다시 결정될 수도 있으며, 여기에서 상기 프로브는 고정화될 수도 있거나 용액상태일 수도 있다. 폴리펩티드와 DNA 간의 복합체는 또한 족적법, EMSA, 섬광 근접 분석 (PSA), 비아코어 (biacore) 또는 바이오칩/DNA 칩 기술을 포함한 당 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 측정될 수도 있다.
대안적으로는, 전사에 대해 미치는 효과에 의하여, 폴리펩티드-DNA 복합체 형성의 정도 또는 폴리펩티드-DNA 복합체의 전사 능력을 결정할 수 있다. 전사 선별법으로서 공지된 방법에서, 본 발명은 세포막으로부터 핵까지의 TGFβ또는 액티빈 신호전달 경로 (transduction pathway)를 활성화하거나 억제하여, 결국 CAGA 박스-매개 전사 조절을 이끌어내는 약제를 선별하는 데 사용될 수도 있다. 이러한 접근법에서, CAGA 박스 함유 올리고뉴클레오티드 서열을 리포터 벡터와 같은 벡터, 예를들어 플라스미드내에 검출가능한 단백질 (예를들어, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, β-갈락토시다제)을 발현하는 뉴클레오티드 서열을 제어하는 프로모터 및/또는 인핸서에 조작가능한 연결로 클로닝할 수도 있으며, 이러한 구조물에서 리포터 유전자의 발현 수준은 리포터 구조물이 진핵 세포내로 일시적 또는 안정하게 형질감염된 후에 검출될 수 있다. 따라서, 이러한 전사 선별법에서, CAGA 박스 함유 뉴클레오티드 서열은 시험관내 체계로 검출될 수 있는 생성물의 유전자의 조절 영역내에 통합되며, 형질감염된 세포를 시험 약제의 존재하에 (및 TGFβ또는 액티빈의 존재 또는 부재하에) 배양시켰을 때 세포에서 발현되는 생성물의 수준을, 시험 약제의 부재하에 (및 TGFβ또는 액티빈의 존재 또는 부재하에) 배양된 형질감염된 세포에서 발현되는 생성물의 수준과 비교한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법의 이러한 측면에서 사용하기 위한 리포터 벡터에서, 폴리-아데닐화 시그날 등과 같은 프로모터/인핸서 영역에 추가로, 번역, 예를들어 정지, 개시 코돈 및 제어 요소와 같은 적절한 발현 제어 서열이 제공된다.
바람직한 측면에서, 본 발명의 방법은, 섬유증, 비정상적인 창상 치유, 암, 조혈 또는 면역 또는 염증 장애와 같이, TGFβ에 의해 제어되는 유전자의 비조절 발현이 연관된 것으로 공지된 질병의 치료에서 잠재적인 용도를 갖는 약제를 선별하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 이러한 약제는, TGFβ또는 액티빈에 의해 매개된 DNA에 대한 Smad의 결합을 방해하거나 또는 DNA에 결합된 Smad의 전사 능력을 방해함으로써, 플라스미노겐 활성화인자 억제인자 유형 1의 합성을 조정하게되고, 따라서 플라스민 수준에 영향을 미치고, 이에 의해 기질 형성 및/또는 섬유소용해를 조정한다.
다른 측면에서 볼때, 본 발명은 Smad 매개 TGFβ또는 액티빈 활성화와 관련된 질병과 싸우기에 적절한 약제를 선별하기위한 키트를 제공하며, 상기 키트는
- 상기 정의된 것과 같은 Smad 단백질
- TGFβ 또는 액티빈
- 임의로 프로모터 서열 및 검출가능한 생성물의 유전자의 코딩 영역과 조작가능하게 연결되어진, 상기 정의된 바와 같은 서열 5'WXYCAGACZ3'를 포함하는 이중 가닥 DNA 분자
를 포함한다.
본 발명에 따른 CAGA 관련 서열을 Smad에 의한 TGFβ또는 액티빈 전사 조절을 위해 필요한 것으로서 인식하는 것은, 특정 유전자의 TGFβ조절과의 관련이 존재하는 섬유증, 비정상적인 창상 치유, 조혈 또는 면역 또는 염증 장애, 및 암과 같은 질병의 치료에 대한 새로운 유전적 접근법을 제공한다.
또다른 측면에서 볼때, 본 발명은 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병의 치료 방법을 포함하며, 상기 방법은 상기 정의된 서열 5'WXYCAGACZ3'을 포함하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함한다.
이러한 방법에서, Smad 단백질은 외래 투여된 DNA에 의해 격리되며, 이에 의해 내인성 유전자의 TGFβ매개 유도를 방지한다.
또다른 측면에서 볼때, 본 발명은 상기 정의된 서열 5'WXYCAGACZ3'을 포함하는 단리된 이중 가닥 DNA 분자를 제공한다. 바람직하게는, 서열은 AG(C/A)CAGACA이다. 본 발명은 또한 상기 정의된 것과 같은 시험 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단리된 DNA 분자를 제공한다.
또 다른 측면에서 볼때, 본 발명은 상기 정의된 선별법에 의해 확인된 임의의 약제, 및 Smad/TGFβ유전자 활성화와 연관된 질병과 싸우는데 있어서 그의 용도를 제공한다.
또 다른 측면으로서, 본 발명은 하나 이상의 Smad 단백질과 TGFβ또는 액티빈의 유전자 조절에 연관된 프로모터 또는 인핸서와의 결합 또는 전사 활성을 억제 또는 활성화하는 임의의 약제를 제공하며, 상기 프로모터는 뉴클레오티드 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C, A 또는 G이고, Z은 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함한다.
이러한 약제는 소 유기 분자, 단백질, 또는 폴리펩티드, 또는 핵산 분자를 포함한 여러 유형의 분자일 수도 있다. 바람직한 효과를 갖는 것으로 확인된 약제는 섬유증, 창상 치유, 암, 조혈, 신경보호, 면역 또는 염증의 적절한 모델에서 더욱 시험될 수도 있다.
전사 선별법으로서 공지된 방법에서, 본 발명은 세포막으로부터 핵까지의 TGFβ 또는 액티빈 신호전달 경로를 활성화 또는 억제하고, 결국 CAGA 박스-매개 전사 조절을 이끌어내는 약제를 선별하기 위해 사용될 수 있다.
리포터 벡터는 리포터 유전자, 예를들어 개똥벌레 루시퍼라제 유전자를 함유하는 플라스미드에 CAGA 박스를 포함하는 전사 영역을 클로닝함으로써 생성될 수 있으며, 따라서 이러한 전사 CAGA 함유 영역은 리포터 유전자의 전사를 제어한다. 특히, PAI-1 프로모터는 개똥벌레 루시퍼라제 유전자의 상류에 클로닝될 수 있다.
대안적으로는, CAGA 서열을 함유하는 화학적으로 생성된 올리고뉴클레오티드를 프로모터 또는 인핸서 구조에 클로닝하여, 그 결과 개똥벌레 루시퍼라제 유전자의 전사를 조절하는 인공 구조물을 합성할 수 있다. 이러한 구조물을 도 1에 나타내며, 여기에서 CAGA 올리고뉴클레오티드는 TK 또는 MLP 프로모터의 상류에 클로닝된다. 이러한 TGFβ-유도가능한 CAGA 서열-함유 리포터 벡터는, 칼슘-포스페이트 침전, DEAE-덱스트란, 리포좀-매개 또는 에렉트로포레이션 (electroporation) 방법과 같은 각종 전통적인 방법에 의해, 진핵 세포내로, 바람직하게는 포유동물 세포주, 예를들어 HepG2 세포주내로 형질감염되어야 한다.
바람직하게는, 형질감염은 CAGA 박스 함유 리포터 트랜스유전자를 안정하게 발현하는 클론 세포주를 생성한다. 이는 네오마이신 또는 히그로마이신과 같은 약물에 대한 내성 유전자를 코딩하는 내성 플라스미드를 동시-형질감염하고, 내성 플라스미드의 안정한 통합에 의하여 언급된 약물에 대한 내성을 획득한 형질감염된 세포를 선택함으로써 수득될 수 있다.
바람직하게는, 안정한 세포주는 예를들면 발현된 생성물이 측정가능한 활성을 갖고 있는 레닐라(renilla) 루시퍼라제와 같이 안정하게 통합된 다른 트랜스유전자를 갖는다. 이 트랜스유전자의 발현은 TGFβ또는 액티빈에 의해 조절되어서는 안되고, 다시말해서 그의 조절 영역에 CAGA 서열을 함유하지 않아야 한다. 예를들면, 레닐라 루시퍼라제 유전자는 RSV (루 사르코마 바이러스(Rous Sarcoma Virus))프로모터 또는 SV (시미안 바이러스 40 (Simian Virus) 부터 전사될 수 있다. 개똥벌레 루시퍼라제 트랜스유전자의 형질발현을 변경시키는, 다시말해서 CAGA 서열을 통한 작용을 갖는 약리학적 약제를 선별할 때, 레닐라 루시퍼라제 트랜스유전자의 발현은 특이성 대조군으로서 사용된다. 이는 CAGA 박스-매개 전사를 통해 특이적으로 작용하는 약제가 개똥벌레 루시퍼라제 활성에 대해서는 효과를 갖지만 레닐라 루시퍼라제 활성에는 효과를 갖지 않음을 의미한다. 특히, CAGA 박스-매개 전사의 억제인자를 선별할 때, 레닐라 루시퍼라제 활성은, CAGA 박스-매개 전사를 특이적으로 억제하는 약제와 독성인 약제를 구별한다.
분석 혼합물은 적절한 세포 배양 배지중에서 배양된 형질감염된 세포 및 하나 또는 수개의 후보(candidate) 약리학적 약제를 포함한다. 억제인자를 선별하는 경우에, 세포 배양 배지는 CAGA 서열-매개 전사를 활성화시키기 위하여 TGFβ또는 액티빈 (바람직하게는 0.1 ng/ml 내지 50 ng/ml의 농도)을 함유한다. 활성화인자를 선별하는 경우에는 TGFβ또는 액티빈의 존재가 필요없다. 하나 또는 수개의 후보 약리학적 약제가 존재하는 혼합물과 이러한 후보 약제를 함유하지 않는 혼합물 사이에서 개똥벌레 루시퍼라제 활성에서의 차이는, 이러한 약제들이 CAGA 서열에 대한 Smad 단백질의 결합에 의해 매개되는 전사 활성을 조정할 수 있음을 나타낸다.
후보 약제들은 전형적으로 유기 화합물이긴 하지만 다수의 화학적 부류, 바람직하게는 분자량이 50 내지 2500, 더욱 바람직하게는 약 1000 미만인 작은 유기 화합물을 포함한다. 후보 약제들은 또한 펩티드, 당류, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 유도체, 구조적 유사체 또는 이들의 조합 등을 포함한 생체분자중에서 발견된다. 후보 약제들은 랜덤하고 직접적인 합성, 조합 (combinatorial) 화학 및 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함한 다양한 종류의 원천에서 수득된다.
본 명세서에 기재된 방법은 고-처리량 선별에 특히 적절하다. 방법을 자동화하기 위하여, 형질감염된 세포들을 96 웰 또는 384 웰 마이크로평판에 접종 및 배양한다. 축 회전 팔을 포함하는 컴퓨터 조절 전자기계 로봇의 프로그램을 짜서, 상이한 시험 단계를 실행한다: 세포 접종, TGFβ또는 액티빈의 존재 또는 부재하에 배지중의 배양, 시험 약리학적 약제와의 배양, 세포 세척 및 루시퍼라제 활성 검사. 통상적으로 입수가능한 키트를 사용하는 고전적인 방법, 바람직하게는 로봇에 연결되고 마이크로평판을 해독할 수 있는 이중 주입기 발광측정기를 사용하여 루시퍼라제 활성을 판독한다.
본 발명을 이하 비-제한적 실시예를 참고로 하여 설명하겠다:
도 1: CAGA 박스는 TGFβ-유도가능한 DNA 요소이다.
도 1a: 인간 PAI-1 프로모터에서, 두꺼운 막대로 표시된 2개의 영역은 TGFβ에 반응하는 것으로 설명된다. 이 프로모터에서 발견된 3개의 CAGA 박스의 서열을 나타낸다.
도 1b: HepG2 세포를 HSV1-티미딘 키나아제 프로모터 (TK)의 상류에 클로닝된 CAGA 서열의 9개 복제를 함유하는 상이한 벡터로 형질감염하였다. AGCCAGACA는 PAI-1 프로모터에서 -730 위치에서 발견되는 서열이고, AGACAGACA는 PAI-1 프로모터의 2개의 다른 CAGA 박스의 서열이다 (위치 -580 및 -280). 마지막 구조물은 표시된 3개의 pb상에 돌연변이된 CAGA 박스를 함유한다. 루시퍼라제 활성을 나타내고, TGFβ에 의한 폴드(fold) 유도를 나타낸다.
도 1c: HepG2 및 Mv1Lu 세포를 p3TP-Lux 또는 최소의 아데노비루스 주요 후기 프로모터 (MLP; Major Late Promoter)의 상류쪽에 CAGA 박스의 9개 또는 12개 복제를 함유하는 벡터로 형질감염하였다. HepG2 세포에 대해 TGFβ에 의한 폴드 유도를 나타낸다. Mv1Lu 형질감염된 세포에 대해 기본적 및 TGFβ-유도 루시퍼라제 수준을 나타낸다.
도 2: 인간 PAI-1 프로모터의 CAGA 박스는 TGFβ에 의한 유도를 위해 필요하다. 부위 특이적 변이유발에 의해 PAI-1 프로모터에 CAGA 박스의 변이를 도입하였다. 야생형 AG(C/A)CAGACA 부위를 변이된 AG(C/A)TACATA 서열로 대체하였다. 변이된 박스를 교차표시된 직사각형으로 나타낸다. TGFβ부재하의 기본 수준 및 형질감염된 HepG2 세포에서 TGFβ존재하의 폴드 유도를 나타낸다.
도 3: CAGA 박스는 TGFβ및 액티빈 신호화에 대해 반응하지만 BMPs 경로에는 반응하지 않는다.
도 3a: Mv1Lu 세포를 (CAGA)12-MLP-Luc 리포터 구조물과 TGFβ, 액티빈 또는 BMPs 신호화에 특이적인 세린/트레오닌 키나아제 수용체의 구조적으로 활성화된 변형을 코딩하는 발현벡터로 동시형질감염한다. Alk-2는 ActR-1 수용체이고, Alk-3은 BMPR-1A 수용체이고, Alk-4는 ActR-1B 수용체이고, Alk-5는 TGFβR-1수용체이고, Alk-6은 BMPR-1B 수용체이다.
도 3b: HepG2 세포를 (CAGA)12-MLP-Luc 리포터 구조물로 형질감염하고, BMP-7, 액티빈 또는 TGFβ(각각 100 ng/ml, 20 ng/ml 및 10 ng/ml)로 유도하였다.
도 4: Smad 단백질은 CAGA 박스에 의해 매개되는 TGFβ-유도 전사에 관련된다.
도 4a: HepG2 세포를 (CAGA)9-MLP-Luc 리포터 구조물 및 증가되는 양 (0, 10, 15, 20, 30 및 40 ng)의 Smad7 저해 단백질을 코딩하는 발현 벡터로 동시형질감염한다.
도 4b: MDA-MB468 세포를 (CAGA)9-MLP-Luc 리포터 구조물 및 증가되는 양 (0, 250, 500, 750 ng)의 Smad4 단백질을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염하였다. 표시된 경우에 500 ng의 Smad4 발현 구조물과 250 ng의 Smad7 발현 벡터를 동시형질감염하였다.
도 5: Smad3 및 Smad4는 TGFβ-유도가능한 CAGA 박스에 직접적으로 결합된다.
도 5a: CAGA 서열을 함유하는33P-표지화 프로브 및 TGFβ에 의해 30분 유도되거나 유도되지 않은 HepG2 세포로부터의 핵 추출물을 사용하여 EMSA를 실행하였다. 특이적 TGFβ-유도된 복합체에 상응하는 띠를 표시한다. 야생형 및 돌연변이된 CAGA 서열을 포함하여, 각종 비방사성 올리고뉴클레오티드의 50 또는 100 몰 과량을 경쟁물질로서 첨가하였다.
도 5b: 특이적 항-Smad 항혈청을 CAGA 프로브와 혼합하기 전에 TGFβ-유도된 HepG2 핵 추출물과 배양하였다. 과변위된 복합체를 표시한다. 항- Smad3 및 항-Smad4 항혈청의 특이성을 나타내기 위하여, 반응성 항-혈청을 생성하기 위해 사용되는 항원 펩티드를 레인 7 및 레인 9에 첨가하였다.
도 5c: 보존된 카르복시-말단 MH2 영역이 결실된, 이.콜리 발현된 GST-Smad 1, 2, 3 및 4 단백질을,33P-표지화 CAGA 프로브와 배양하였다. 표시된 경우에, 비방사성 올리고뉴클레오티드 경쟁물질의 50 몰 과량을 첨가하였다. 핵 DNA-결합 복합체의 위치를 나타내기 위하여 TGFβ-처리된 HepG2 세포의 핵 추출물을 레인 2에서 프로브에 첨가하였다.
도 5d: GST 도메인에 융합되고, 세균에서 생성되는, 전체 길이 Smad 단백질을 사용하는 유사한 실험을 나타낸다.
도 6: Smad3 과다발현 (overexpression)은 리포터 벡터의 TGFβ활성화를 모방하는데 대하여 Smad2 과다발현은 그렇지 않다. HepG2 세포를 (CAGA)9MLP-Luc 리포터 벡터로 일시적으로 형질감염하였다. 표시된 바와 같이 Smad 발현 벡터로 동시-형질감염된 세포를 혈청-결핍시켰으나, TGFβ로 처리하지 않았다.
도 7: 전사 불활성의 원인이 되는 Smad2 도메인의 지도화
도 7a: Smad2 및 Smad3의 인간 단백질 서열. 검정색 박스는 2개 단백질의 서열간의 차이점을 나타낸다. MH1 및 MH2 도메인을 각각 직선 및 점선으로 밑줄을 그어 나타낸다. GAGA 및 TID 도메인을 또한 나타낸다.
도 7b: Smad2 및 Smad3 도메인 교체 키메라의 개략도.
도 7c: HepG2 세포에서 Smad2 및 Smad3 변이주에 의한 (CAGA)9MLP-Luc 리포터 벡터의 유도. 세포를 동일한 농도의 표시된 변이체 구조물과 함께 (CAGA)9MLP 리포터 벡터로 형질감염하고, TGFβ의 부재하에 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 7d: Smad2 또는 Smad3 변이체를 발현하는 HepG2 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석. 형질감염후에, 세포를 이중-루시퍼라제 분석 키트 (프로메가 (Promega))에 공급된 세포용해 완충액으로 세포용해시키고, 단백질을 8.5 % SDS-PAGE상에서 분리한 다음, 항-Smad2/Smad3 다클론성 항체 (sc-6032, 산타 크루즈 (Santa Cruz))로 블로팅하였다. 세포용해물을 항-β-액틴 다클론성 항체 (sc-1615, 산타 크루즈)로 이뮤노블로팅하여, 동일한 단백질 부하량을 평가하였다. 1차 항체들은 말 과산화효소에 결합된 2차 항체와의 화학발광성에 의해 나타났다.
도 8: TID 도메인은 Smad2가 CAGA 서열에 결합되는 것을 방지한다.
도 8a: 시험관내 번역된 Smad2 및 Smad3 변이주의 SDS-PAGE 분석 (위쪽 판) 및 CAGA 올리고뉴클레오티드에 대하여 이러한 시험관내 번역된 단백질을 사용하는 겔 변위 분석 (아래쪽 판).
도 8b: 변이된 CAGA 프로브에 대하여 Smad 변이주를 사용한 겔 변위 분석.
실험 방법
플라스미드 구조물
pGL3 기본 플라스미드 (프로메가)를 사용하여 CAGA 리포터 벡터를 생성하였다. TK 또는 MLP 프로모터를 PCR-증폭시키고, BglII 및 Hind III 부위 사이에 삽입하였다. CAGA 박스-함유 올리고뉴클레오티드를 XhoI 부위내에 클로닝하였다. 클로닝된 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
올리고뉴클레오티드를 함유하는 CAGA 박스:
5' TCGAGAGCCAGACAAAAAGCCAGACATTTAGCCAGACAC 3'
3' CTCGGTCTGTTTTTCGGTCTGTAAATCGGTCTGTGAGCT 5'
5' TCGAGAGACAGACAAAAAGACAGACATTTAGACAGACAC 3'
3' CTCTGTCTGTTTTTCTGTCTGTAAATCTGTCTGTGAGCT 5'
CAGA 변이체 올리고뉴클레오티드:
5' TCGAGAGCTACATAAAAAGCTACATATTTAGCTACATAC 3'
3' CTCGATGTATTTTTCGATGTATAAATCGATGTATGAGCT 5'
인간 PAI-1 프로모터의 PCR-증폭된 -806 +72 단편을 pGL3-기본 벡터(프로메가)의 SacI/BglII 부위에 삽입하여 PAI-1-Luc 벡터를 생성하였다. 급속 변화(Quick Change) 부위특이적 돌연변이 키트(스트라타겐(Stratagene))을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라서 인간 PAI-1에서 부위특이적 돌연변이를 수행하였다. GAG 및 TID 도메인을 함유하거나 함유하지 않은 Smad2 및 Smad3 변이주를 생성하기 위하여, AgeI 제한효소 부위를 부위 특이적 돌연변이 (급속 변화 부위 특이적 돌연변이 키트, 스트라타겐) 에 의해 Smad2 및 Smad3을 코딩하는 발현 벡터에 삽입하였다. BsmBI 제한효소 부위를 유사하게 Smad3 발현 벡터에 삽입하였다. 제한효소 부위의 삽입은 단백질의 아미노산 서열을 변경시키기 않았다. 모든 구조물들을 서열-검사하였다.
세포 배양
인간 간암 세포주 HepG2 (HB8065), 인간 유방 선암 세포주 MDA-MB468 (HTB 132) 및 Mv1Lu 밍크 폐 상피 세포주 (CCL 64)를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에서 구입하였다. HepG2 및 Mv1Lu 세포를 각각 10 % 태아 소 혈청, 10 mM 소듐 피루베이트, 100 IU/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민이 보충된 BME 또는 MEM 배지(라이프 테크놀로지즈, 인코포레이티드(Life Technologies, Inc.)) (완전 배지)에서 5 % CO2-95 % 공기 상태에서 증식시켰다. MDA-MB468 세포들을 10 % 태아 소 혈청, 100 IU/ml 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 가진 DMEM/F12 (1:1) 배지 (라이프 테크놀로지즈, 인코포레이티드) (완전 배지)에서 7.5 % CO2-92.5 % 공기 상태에서 증식시켰다.
형질감염 및 루시퍼라제 분석
칼슘 포스페이트 공-침전 방법을 사용하여, 표시된 구조물 및 내부 조절 pRL-TK 벡터로 HepG2 및 MDA-MB468 세포들을 일시적으로 형질감염하였다. 증가하는 양의 발현 벡터가 형질감염되었을 때, pCMV5의 첨가에 의해 총 DNA를 일정하게 유지시켰다. 7 ng/mL의 인간 재조합 TGFβ1 (R ＆ D)으로 자극하기 전에 8 시간동안 세포를 혈청 결핍시키고, 이중 루시퍼라제 분석 (프로메가)을 사용하여 14 시간후에 루시퍼라제 활성을 정량하였다. 액티빈 및 BMP-7 (생성 생체분자 (Creative Biomolecules)) 유도를 위하여, 각각 20 ng/mL 및 100 ng/mL를 사용하였다. pRL-TK로부터 발현된 레닐라 루시퍼라제 활성으로 값을 표준화하였다. Mv1Lu 세포를 DEAE-덱스트란 방법을 사용하여 형질감염하였다. 도면에 나타낸 루시퍼라제 값은 적어도 3회 이상 실시된 형질감염 실험의 대표예이다.
핵 추출물
대조군 및 TGFβ-처리된 HepG2 세포로부터 핵 추출물을 제조하였다. 처리후에 세포를 30 분동안 수집하고, 사도우스키 및 길만의 프로토콜 (Sadowski and Gilman, 1993)에 따라 처리하였다. 간단하게, 8개의 100 mm 디쉬로부터의 융합 세포를 인산염-완충 염수로 세척하고 해체시켰다. 다시 세척한 후에, 세포들을 2 mL의 냉 완충액 A (20 mM HEPES pH 7.9, 20 mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM Na4P2O7, 0.13 μM 오카다산, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.4 mM 암모늄 몰리브데이트, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF 및 1 ㎍/mL의 각각의 류펩틴, 아프로티닌 및 펩스타틴) 에 현탁시켰다. 세포들을 15분 동안 얼음 위에서 팽윤시킨 다음, 다운스(Dounce) 전체 유리 균질화기의 30 회 타격에 의해 세포용해시켰다. 원심분리에 의해 핵을 펠릿화하고, 600 ㎕의 냉 완충액 C (완충액 A, 420 mM NaCl 및 20 % 글리세롤)에 재현탁시켰다. 핵 막을 다운스 전체 유리 균질화기의 15회 타격에 의해 세포용해시켰다. 얻어진 현탁액을 4 ℃에서 30 분동안 교반하였다. 투명 상층액을 분취하고 -80 ℃에서 동결시켰다.
전기영동 이동도 변위 분석
DNA 폴리머라제의 클레노우 단편을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 [α-33P]dCTP 및 [α-33P]dATP로 말단-표지화하였다. 10 ㎍의 핵 추출물 또는 400 ng의 GST-Smad 단백질 또는 16 ㎕의 시험관내 번역된 Smad 단백질 및 2 ng의 표지화 올리고뉴클레오티드를 함유하는 결합 반응을, 18 ㎕의 결합 완충액 (20 mM HEPES pH 7.9, 30 mM KCl, 4 mM MgCl2, 0.1 mM EDTA, 0.8 mM NaPi, 20% 글리세롤, 4 mM 스페르미딘, 3 ㎍ 폴리 dI-dC)중에서 37 ℃에서 20분동안 수행하였다. 단백질-DNA 복합체를 0.5x TBE를 함유하는 5 % 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다. 프로브로서 사용된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
5' TCGAGAGCCAGACAAGGAGCCAGACAAGGAGCCAGACAC
CTCGGTCTGTTCCTCGGTCTGTTCCTCGGTCTGTGAGCTC 5'
경쟁인자 CAGA 변이체 올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다:
5' TCGAGAGCTACATAAAAAGCTACATATTTAGCTACATAC 3'
3' CTCGATGTATTTTTCGATGTATAAATCGATGTATGAGCT 5'
다른 전사 결합 부위를 함유하는 경쟁인자 올리고뉴클레오티드는 다음과 같다:
Fast-1 부위:
5' TCGAGGCTGCCCTAAAATGTGTATTCCATGGAAATGTCTGCCCTTCTCTC 3'
3' CCGACGGGATTTTACACATAAGGTACCTTTACAGACGGGAAGAGAGAGCT 5'
AP-1 부위:
5' CCGGGATGACTCAGC 3'
3' CTACTGAGTCGGGCC 5'
NF-1 부위
5' CCGGTTTGGATTGAAGCCAATATG 3'
3' AAACCTAACTTCGGTTATACGGCC 5'
Sp1 부위
5' TCGAGGACAGGGGGCGGAGCCTC 3'
3' CCTGTCCCCCGCCTCGGAGAGCT 5'
시험관내 번역된 단백질을 사용하여 실현된 겔 변위 실험에서, TNT T7 급속 결합 전사/번역 시스템 (프로메가)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 Smad 단백질을 제조하였다. [35S] 메티오닌으로 표지된 시험관내 합성 단백질을 EMSA에서 이용하기 전에 SDS-PAGE 및 오토라디오그래피에 의해 조절하였다.
Smad 융합 단백질의 제조 및 정제
GST에 융합된 전체-길이 Smad 단백질 및 MH2-결실 변이체를 이.콜리에서 발현시키고, 파르마시아 (Pharmacia)의 프로토콜을 사용하여 컬럼 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제하였다. 간단하게, 세균을 2×YTA 배지에서 증식시키고, 0.1mM IPTG로 유도하였다. 초음파처리후에, 글루타티온 세파로스 4B를 사용하여 GST-융합을 단리하고, 3회 세척하고, 용출시킨 다음, 2 mM DTT 및 0.5 mM PMSF가 보충된 PBS에 대해 투석하였다.
실험 결과
CAGA 박스는 TGFβ-유도가능한 DNA 요소이다
본 발명자들은, 인간 PAI-1 프로모터를 따라 확인된 TGFb-반응 영역에서 컨센서스 서열 특색이 존재할 수 있는 가능성을 일으켰다. 이러한 질문을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 짧은 DNA 상동성 요소를 찾아내었고, 인간 PAI-1 프로모터에서 서열 AG(C/A)CAGACA가 TGFβ-전사 유도를 매개하는 것으로 밝혀진 영역에서 위치 -730, -580 및 -280에 3개의 복제로 존재함을 알아내었다 (도 1a). 본 발명자들은 이 서열을 CAGA 박스로 명명하였으며, TGFβ-유도된 전사에서의 그의 연관성을 결정하기 위해 전사 리포터 체계에 그것을 클로닝하였다. 티미딘 키나아제 (TK) 프로모터의 상류에 다중 복제로 클로닝될 때, 이 DNA 서열은 벡터의 기본 활성에 영향을 미치지 않으면서 HepG2 세포에서 TGFβ-매개 유도를 일으킨다 (도 1b). Mv1Lu 세포 (도 1c) 또는 NIH3T3 세포 (데이타를 나타내지 않음)에서 유사한 결과가 관찰되었다. TATA 박스 및 아데노비루스 주요 후기 프로모터 (MLP)의 개시인자 서열로 구성된 최소 프로모터의 상류쪽에 다중 CAGA 박스가 클로닝될 때, HepG2 세포에서 수 백회의 TGFβ-매개 폴드 유도가 수득되었다 (도 1c). 이러한 유도는 널리 사용되는 TGFβ-반응성 p3TP-Lux 플라스미드에서는 더욱 낮았다. p3TP-Lux가 -730 CAGA 박스를 포함하는 PAI-1 프로모터의 -740/-636 영역을 함유한다는 것은 주목할 만하다. 특이성의 대조로서, 원래의 서열에 비해 3개의 점 돌연변이를 함유하는 변이된 서열 AGCTACATA는 TK 프로모터에 대해 TGFβ유도를 일으킬 수 없었다 (도 1c).
인간 PAI-1 프로모터에서 CAGA 박스의 돌연변이는 TGFβ반응성을 없앤다
야생형 인간 PAI-1 프로모터는 3개의 CAGA 박스를 함유한다. 이러한 프로모터의 TGFβ-매개 유도에서 상기 박스의 생물학적 중요성을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 TGFβ-비 유도된 변이체 서열을 도입함으로써 3개의 천연 서열의 각각을 변이시켰다 (도 2). 3개 부위중 하나의 변이는 야생형 프로모터에 비해 TGFβ유도를 45 %까지 감소시켰다 (도 2, Δb1, Δb2 및 Δb3 변이체 참조). 2개 부위의 변이에 있어서 더욱 많이 감소되고 (도 2, Δb1+ Δb2, Δb1+Δb3, 및 Δb2+Δb3 변이체 참조), 모든 3개의 부위들이 변이될 때, PAI-1 프로모터는 TGFβ에 거의 반응할 수 없었다 (도 2, Δb1 + Δb2 + Δb3 변이체 참조). TGFβ의 부재하에서 변이체 프로모터의 전사 속도 및 야생형 PAI-1 프로모터의 전사 속도가 서로 필적하기 때문에, 이러한 CAGA 박스는 프로모터의 기본 활성을 상당히 제어하지 않는 것으로 나타난다.
CAGA 박스는 TGFβ및 액티빈에 반응하지만, BMP에 반응하지 않는다.
특이적 세린/트레오닌 키나아제 유형 I 수용체는 TGFβ과 요소의 세포내 신호를 전달한다. BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6) 및 ActR-I (ALK-2)는 BMP 유형 I 수용체인 반면, TGFβ및 액티빈은 각각 TβR-1 (ALK-5) 및 ActR-IB (ALK-4)을 통해 신호를 전한다. TGFβ상과 요소에 대한 CAGA 박스의 특이성을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 TGFβ, 액티빈 및 BMP-7에 반응하는 Mv1Lu 세포들을 유형 I 수용체의 구조적 활성화 변형을 코딩하는 발현 벡터로 형질감염시켰다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, ALK-4/T206D 및 ALK-5/T204D의 발현은 CAGA 박스 리포터 벡터의 전사 활성화를 이끌어낸다. 반대로, ALK-2/Q207D, ALK-3/Q233D 및 ALK-6/Q204D의 발현은 어떠한 효과도 나타내지 않았으며, 이는 CAGA 서열이 TGFβ및 액티빈에 의해 활성화되지만, Mv1LU 세포내에서 BMP-유도된 신호화에 의해서는 활성화되지 않음을 증명하는 것이다. 유형 I 수용체의 구조적으로 활성화된 변형으로 형질감염된 HepG2 세포에서도 유사한 결과가 수득되었다 (데이타는 나타내지 않음). 생리적 조건을 더욱 시험하기 위하여, 본 발명자들은 액티빈 및 BMP-7에 반응하는 HepG2 세포를 CAGA 박스 리포터 벡터로 형질감염하고, 세포를 액티빈 및 BMP-7 (OP-1)과 함께 배양하였다. 도 3b에 나타낸 바와 같이, 리포터를 함유하는 CAGA 박스는 액티빈 및 TGFβ의 존재하에서 각각 25 및 200회 폴드을 유도하는 반면, BMP-7은 어떠한 효과도 나타내지 않았다 (2회 폴드 유도). 따라서, CAGA 박스는 액티빈 및 TGFβ에 대해 특이적으로 반응하지만 BMP 신호화에 대해서는 반응하지 않는다.
Smad 단백질은 CAGA 박스에 의해 매개되는 TGFβ-유도 전사에 참여한다
CAGA 박스에서 관찰되는 TGFβ-유도 전사 활성화에 Smad 단백질이 관여하는가의 여부를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 HepG2 세포를 CAGA 리포터 구조물 및 TGFβ/Smad-매개 전사 효과를 억제하는 것으로 공지된 Smad7 단백질을 코딩하는 발현 벡터로 동시 형질감염시켰다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, Smad7의 과다발현은 CAGA 박스 리포터 구조물의 TGFβ-유도 전사를 50 % 억제시킨다. 유방암에서 유래된 MDA-MB468 세포는 내인성 Smad4 발현이 부족한 인간 상피세포이다. 이러한 세포에서, TGFβ는 CAGA 리포터 구조물에 대해 효과를 갖지 않는다 (도 4b). 그러나, Smad4를 코딩하는 발현 벡터의 동시 형질감염은 CAGA 박스 함유 벡터의 TGFβ전사 유도를 회복시키며, 이는 상기 서열에 의해 매개되는 TGFβ전사 효과에서 Smad4가 필요함을 증명하는 것이다.
CAGA 박스에 결합되는 전사 인자 핵 복합체에 Smad3 및 Smad4가 존재한다
다음 단계에서, 본 발명자들은 TGFβ-반응성 CAGA 서열에 대한 DNA-결합 활성을 특징화하기 위한 시도에서 HepG2 핵 추출물을 사용하여 전기영동 이동도-변위 분석 (EMSA)을 수행하였다. 본 발명자들은 TGFβ에 의해 유도된 세포로부터의 핵 추출물에서만 결합 복합체가 존재함을 확인할 수 있었다 (도 5a, 레인 2 및 3 비교). 최대 결합은 30 분의 TGFβ-유도 시간을 필요로 하지만, 10 분 유도후에도 복합체가 명확히 관찰될 수 있다 (데이타를 나타내지 않음). 이는 새로운 단백질 합성이 필요하지 않고, 기존의 인자가 번역후에 빠르게 변경되거나 핵내로 위치변경됨을 제시하는 것이다. 비방사성 CAGA 올리고뉴클레오티드의 과량은 상응하는 띠를 제거시키지만, 돌연변이된 박스는 그렇지 않으므로, 이러한 DNA-결합 복합체는 특이적이다 (도 5a, 레인 4 및 5). 또한, Sp1, AP-1, NF-1 또는 FAST-1과 같이, TGFβ/액티빈 신호화의 잠재적 매개인자로서 제안된 전사 인자가 결합된 상응하는 DNA 서열에 의해서는 띠가 제거되지 않기 때문에 (도 5a, 레인 6 내지 10), 복합체는 이러한 전사 인자를 함유하지 않는다. Smad 단백질이 CAGA 결합 복합체에 존재하는가의 여부를 검사하기 위하여, Smad1 내지 Smad5에 대한 특정 항혈청과 함께 핵 추출물을 배양하였다. 본 발명자들은 항-Smad3 및 항-Smad4 항혈청에 의한 TGFβ-의존성 결합 복합체의 슈퍼시프트 (supershift)를 검출할 수 있었다 (도 5b, 레인 6 및 8). 이러한 슈퍼시프트는 항혈청을 생성하는 데 사용되는 면역원성 펩티드의 첨가에 의해 경쟁하고, 이는 항체 인식의 특이성을 입증하는 것이다 (도 5b, 레인 7 및 9). 항-Smad1, 항-Smad2 및 항-Smad5 항혈청의 첨가가 영향을 미치지 않기 때문에 (도 5b, 라인 4, 5 및 10), 본 발명자들은 CAGA 박스 DNA-결합 핵 복합체가 TGFβ/액티빈 신호화 Smad3 및 Smad4단백질을 함유하지만, Smad 단백질이나 BMP 신호화 Smad1 및 Smad5 단백질을 함유하지 않는다는 결론을 내렸다. 이는, CAGA 리포터 구조물이 Smad3을 활성화하는 TGFβ및 액티빈 수용체에 의해 활성화되지만, Smad1 및 Smad5를 통해 신호를 전달하는 BMP 수용체에 의해서는 활성화되지 않음을 나타내는 형질감염 실험과 일치하는 것이다 (참조 도 3a 및 3b).
Smad3 및 Smad4는 TGFβ-유도가능한 CAGA 박스에 직접 결합한다
본 발명자들이 설명한 이전의 겔 변위 실험은 핵 CAGA 서열-결합 복합체에서 Smad3 및 Smad4의 존재를 증명하지만, DNA에 대한 Smad3 및 Smad4의 결합이 직접적인지 아닌지의 여부를 결정할 수 없다. 이 문제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 EMSA에서 이.콜리 발현된 GST-Smad 융합 단백질을 사용하였다. 도 5c에 나타낸 바와 같이, MH2도메인을 결실시킨 Smad3 및 Smad4를 CAGA 박스 함유 프로브에 직접적 및 특이적으로 결합시켰다. 슈퍼시프트 실험과 일치하여, Smad1 ΔMH2 및 Smad2 ΔMH2 단백질은 DNA를 결합하지 못하였다. 또한, 초파리 (Drosophila) 매드 단백질의 예와는 반대로, 세균에서 생성되는 전체 길이 Smad4 단백질은 CAGA 서열에 대해 직접적이고 특이적인 DNA-결합 활성을 갖고 있으며 (도 5d), 반면 GST-Smad1, GST-Smad2 및 GST-Smad3은 DNA를 결합할 수 없다.
Smad2는 CAGA-매개 전사를 활성화하지 않는다
도 6에 나타낸 바와 같이, HepG2 세포에 Smad3의 발현 벡터를 형질감염하여 CAGA 리포터에 대한 TGFβ활성화를 모방할 수 있다. 그러나, Smad3와의 총 92% 동일성을 가진 Smad2 단백질의 형질감염은 CAGA-매개 전사에 대해 영향을 미치지 않았으며, 이는 Smad2 및 Smad3가 기능적으로 동등하지 않음을 나타내는 것이다. Smad3의 MH1 도메인은 CAGA 서열에 대한 특이적 DNA-결합을 위해 충분하다 (도 5c 참조). Smad2와 Smad3 MH1 도메인 간의 비교는, Smad2에 2개의 연속한 아미노 산 범위가 존재하는 반면 Smad3에서는 이것이 부족하다는데 주요한 차이가 있음을 나타낸다 (도 7a). 본 발명자들은21Ser 내지30Gly으로 이루어진 10개의 잔기 (필수적으로 글리신 및 세린)를 함유하는 짧은 N-말단 아미노산 서열을 GAG로 명명하였다. 아미노산 Ser79 내지 Thr108까지의 30개 잔기를 함유하고 세린 및 트레오닌이 풍분한 더욱 긴 서열을 TID 로 명명하였다. 이러한 서열들이 Smad2의 전사 활성의 부족에 연루되어 있는가의 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 양쪽 서열이 결실된 Smad2 단백질을 생성하였다 (도 7b). HepG2 세포에 형질감염된 이러한 변이체는 CAGA 리포터를 야생형 Smad3에 필적하는 수준으로 활성화시켰다 (도 7c). 이 Smad2 ΔGAG ΔTID 변이체는, 도메인 GAG 또는 TID가 Smad2 및 Smad3 사이에서 관찰되는 기능적 차이에 연관됨을 나타낸다. 다음의 단계에서, 본 발명자들은 전사 차이가 단일 도메인에 기인할 수 있는가를 결정하고자 하였다. 이 질문을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 Smad2에서 GAG (Smad2 ΔGAG) 또는 TID (Smad2 ΔTID)서열을 결실시키고, CAGA 리포터 벡터에 대한 변이체의 효과를 시험하였다. 도 7c에 나타낸 바와 같이, Smad2 ΔTID 변이체는 명백히 CAGA 리포터를 활성화할 수 있었으며, 이는 TID 도메인이 Smad2의 전사 능력의 부재에 연관되었음을 나타낸다. 본 발명자들은 Smad2 ΔGAG에 의한 CAGA 리포터의 활성화를 관찰할 수 없었다. 그러나, 본 발명자들은, 웨스턴 블롯에 의해 이 변이체의 발현을 검출할 수 없었기 때문에, 이 실험으로부터 GAG 도메인이 전사 활성화의 부재에 연관되지 않는다는 결론을 내릴 수 없었다 (도 7D 및 나타내지 않은 데이타).
Smad2 결실 변이체에서 수득되는 결과를 보충하기 위하여, 본 발명자들은 Smad3에 GAG 또는 TID 도메인을 도입하였다. 상기 데이타에 일치하여, TID 서열을 함유하는 Smad3 변이체 (즉, Smad3 + GAG + TID 및 Smad3 + TID)는 CAGA 리포터를 활성화시킬 수 없었고, 이는 다시 이 서열의 연관성을 나타낸다. 이러한 전사적으로 불활성인 변이체들이 웨스턴 블롯 분석에서 검출되었기 때문에 이들이 세포에서 발현되었다는 것을 주목할 가치가 있다 (도 7D). Smad3내에 단일 GAG 도메인의 도입은 그의 전사 능력을 변경시키지 않았다 (참조 Smad3 + GAG, 도 7c). 이러한 결과는, Smad3와 Smad2 사이에서 관찰되는 전사 차이가 단일 TID 도메인에 기인한 것이고 GAG 서열에 기인하지 않는다는 것을 명백히 나타낸다.
엑손3에 상응하는 TID 도메인은 Smad2가 CAGA 서열에 결합되는 것을 방지한다
전사를 활성화하는데 있어서 Smad3와 Samd2 능력 간의 차이는 상이한 DNA-결합 능력에 의해 설명될 수 있다. 사실상, TID 도메인은 Smad2와 Smad3간의 전사 차이의 원인이 되기 때문에, 이러한 도메인은 Smad2가 DNA에 결합되는 것을 방지할 수 있다. 이러한 가설을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 시험관내 전사/번역 체계를 사용하여 Smad 변이체 단백질을 제조하였으며, 겔 변위 분석에서 그들의 DNA-결합 능력을 시험하였다. 도 8a에 나타낸 바와 같이, 전체 길이 야생형 Smad3는 Smad2와는 달리 CAGA 올리고뉴클레오티드에 결합되었다. 이 실험에서, Smad3가 GST 도메인에 융합되지 않았다는 것은 주목할 만하며, 이는 여하튼 GST 도메인이 Smad3의 DNA-결합 능력을 변경시킴을 나타낸다 (도 5d 참조). Smad3가 3개 뉴클레오티드에서 변이된 CAGA 서열의 변형을 함유하는 올리고뉴클레오티드 프로브에 결합될 수 없었기 때문에, 이러한 결합은 특이적이었다 (도 8b). 형질감염 실험에 따르면, 양쪽 서열이 결실된 Smad2 (Smad2 ΔGAG ΔTID) 및 Smad2 ΔTID는 CAGA 프로브에 결합될 수 있었으나, Smad2 ΔGAG는 그렇지 않았다. 상기 관찰된 전사 활성과 관련되어, Smad3 + GAG는 CAGA 올리고뉴클레오티드에 결합되지만, Smad3내에 TID 도메인이 도입된 것 (즉, Smad3 + TID 및 Smad3 + GAG + TID)은 Smad3가 DNA에 결합되는 것을 방해한다. 즉, TID 서열은, CAGA 박스에 대한 그의 DNA-결합을 방해함으로써, Smad2가 전사를 활성화시키는 것을 막는다.
현저하게, Smad2에 존재하는 TID 서열은 실제로 엑손 3에 상응한다 (Takenoshita 등, Genomics, 1998, 48, 1-11). 또한, 엑손 3에 접합된 Smad2의 변형이 인간 태반에서 검출되었다 (Takenoshita 등, Genomics, 1998, 48, 1-11). 가능하게, 이러한 접합 사건은 조절될 수도 있고 특정한 세포 유형 및 상태에 특이적일 수 있다. 전체 길이 Smad2와는 달리, 이러한 짧은 형태는 TID 도메인을 함유하지 않기 때문에, 이는 Smad3와 유사하게 전사를 활성화시키며, 다시말해서 결합되고 CAGA 서열로부터의 전사를 활성화시키는 그의 능력에 있어서 적어도 어느 정도까지 Smad3에서와 같이 풍부하다.
CAGA-매개 전사 선별의 특정 예:
CAGA-리포터 세포 클론
안정하게 통합된 TGFβ-반응성 CAGA 박스-함유 리포터를 함유하는 2종의 세포주를 생성하여 고-산출량 전사 선별을 수행하였다. 첫번째 클론 세포주, 클론 F89는, HepG2 세포에 (CAGA)9MLP-Luc 벡터 (최소 MLP 프로모터의 상류에 클로닝된 9개의 CAGA 박스의 제어하의 개똥벌레 루시퍼라제; 도 1에 나타냄) 및 pRc/레닐라 벡터를 안정하게 동시-형질감염함으로써 수득되었다. pRc/레닐라 벡터는 SV40 프로모터 제어하에 네오마이신/게네티신 유전자 내성 및 RSV LTR에 의해 조절되는 레닐라 루시퍼라제 유전자를 함유한다. pRc/레닐라는 루시퍼라제 레닐라 유전자를 함유하는 pRL-SV40 (프로메가)의 HindIII/XbaI 단편을 pRc/RSV 벡터 (인비트로겐 (Invitrogen))의 HindIII/XbaI 부위에 클로닝함으로써 수득되었다. 두번째 클론 세포주, 클론 1613은 HepG2 세포에 야생형 인간 PAI-1-Luc 리포터 벡터 (인간 PAI-1 프로모터 제어하의 개똥벌레 루시퍼라제; 도 2에 기재됨) 및 pRc/레닐라 플라스미드를 안정하게 동시-형질감염함으로써 수득되었다. 양쪽 경우에서, HepG2 세포는 칼슘 포스페이트 공-침전 방법을 사용하여 안정하게 형질감염되었다. 제네티신 내성 클론을 단리하기 위하여, 형질감염된 세포를 1 mg/mL 게네티신 (기브코 (Gibco))의 존재하에 증식시켰다. 이어서 F89 및 1613 클론을 단리하고, 0.5 mg/mL 제네티신의 존재하에 증폭시켜, 고 산출량 선별법을 시행하기 위해 충분한 양의 세포를 수득하였다.
개똥벌레 루시퍼라제 트랜스유전자의 발현을 제어하는 전사 조절 영역 (즉, 프로모터)에서의 CAGA 박스의 존재에 기인하여, 양쪽 클론은 TGFβ의 존재하에서 투여량-의존 방식으로 고 활성화된 개똥벌레 루시퍼라제 활성을 나타낸다. 레닐라 루시퍼라제의 활성은 TGFβ의 존재하에서 거의 변경되지 않는다. 즉, 레닐라 루시퍼라제 활성은 내부 독성 대조로서 사용될 수 있다.
표 2는 증가하는 양의 TGFβ의 부재 또는 존재하에서 클론 F89 및 1613에서 관찰되는 개똥벌레 루시퍼라제 상대 활성 (폴드 유도)을 나타낸다 (값 1은 TGFβ 부재하에서 수득된 개똥벌레 루시퍼라제 상대 활성에 상응한다):
TGFβ (ng/mL) 0 0.2 0.5 1 5 10
클론 F89 1 6 31 109 461 737
클론 1613 1 8 nd 26.2 43.5 50.1
표 3은 증가하는 양의 TGFβ의 부재 또는 존재하에 클론 F89 및 1613에서 관찰되는 레닐라 루시퍼라제 상대 활성 (폴드 유도)을 나타낸다 (값 1은 TGFβ의 부재하에 수득된 레닐라 루시퍼라제 상대 활성에 상응한다):
TGFβ (ng/mL) 0 0.2 0.5 1 5 10
클론 F89 1 1.1 1.1 1.2 1.5 1.8
클론 1613 1 0.8 nd 1 1 1.3
자동화된 로봇에 의한 고 산출량 전사 선별
96 웰-마이크로 평판 형식에서 고-산출량 선별을 수행하기 위하여, 세포 분석을 자동화하였다. 병렬로 시행될 수 있고, 주변 장치 (즉, 축 회전 팔, 회전저장선반, 세포-세척기, 고정피펫 장치, 세포 배양기, 발광측정기 등)를 제어하고 프로그램의 일시적 진행을 최적화하는 컴퓨터 시스템 (CLARA, 사이텍(Scitec))에 의해 전체 과정을 관리하였다. 이러한 고-산출량 선별을 위해 사용되는 일반적 절차는 다음과 같다:
1 일 → 2 일 → 3 일 → …세포 접종 혈청 손실 루시퍼라제 정량화 데이타 분석 후보 약제 배양 TGFβ첨가
1 일에서, 다중적하 장치를 사용하여, 200 ㎕의 혈청-함유 배지중에서 웰 당 35000 세포의 농도로 CAGA-리포터 세포 (즉, F89 또는 1613)를 40 (96 웰) 마이크로평판에 접종하였다. 이러한 평판들을 로봇 라인에 포함된 세포 배양기에 위치시켰다. 이 배양기에는 세포 마이크로평판을 취급하는 축 회전 팔을 도입할 수 있는 문이 설치되어 있다.
18 내지 24 시간 (2 일)후에, 100 % DMSO에 희석된, 시험하고자 하는 화학 화합물을 함유하는 마이크로평판을 회전저장선반에 놓고, 세포-배양 절차를 착수하였다. 이어서, TGFβ의 존재하에 시험하고자 하는 화합물과 함께 세포를 배양하기 위하여, 컴퓨터 시스템을 상이한 주변의 장치의 작동과 조화를 이루게 하였다.
세포 및 화합물 마이크로평판을 축 회전 팔에 의해 로봇 라인을 통해 적절한 주변장치로 이동시켰다. 세포를 세척하고 혈청-비함유 배지에서 배양시켰다. 세포를 TGFβ및 시험하고자 하는 화학 화합물과 함께 배양하기 위하여, 고정피펫 장치는 예비 희석을 포함한 상이한 조작들을 실현하였다. 시험에서 사용되는 TGFβ의 최종 농도는 1 ng/mL이고, 화합물을 1 %의 DMSO의 최종 농도에서 10 μM의 최종 농도로 시험하였다. 세포를 TGFβ의 첨가전에 15 내지 30분 동안 시험하고자 하는 화합물과 함께 배양하였다. 시험 반응의 최종 부피는 150 ㎕이었다. 웰 A1 내지 H10은 시험 웰이고, TGFβ의 존재하에 시험하고자 하는 화학적 약제와 함께 배양된 세포를 함유하였다. 각각의 웰은 단지 하나의 화학 화합물을 함유하며, CAGA-매개 전사에 대한 화합물의 효과를 시험할 수 있다. 컬럼 11 및 12를 대조용으로 유지시켰다. 컬럼 11은 8개의 웰을 함유하며, 여기에서 세포를 화학 화합물 없이 TGFβ의 존재하에서만 배양시켰다. 컬럼 11은, 잠재적 억제인자 또는 활성화인자 화합물을 확인하기 위하여, 시험 웰에서 측정된 값을 비교하기 위한 '대조용 TGFβ-유도 개똥벌레 루시퍼라제 값'을 결정한다. 웰 A12 내지 D12에서, TGFβ을 사용하지 않고 배지에서 세포를 증식시켰다. 이러한 점에서 수득된 개똥벌레 루시퍼라제 값은 '개똥벌레 루시퍼라제 기본 활성'을 나타내며, TGFβ유도가 정확하도록 제어할 수 있다. 웰 E12 내지 H12에서, 세포를 TGFβ의 존재하에서 세포 독성 화합물인 500 μM CPO (시클로펜테논, 시그마 (Sigma))와 함께 배양하였다. 개똥벌레 및 레닐라 루시퍼라제의 감소된 활성 (컬럼 11에서 수득된 것의 약 50 %)에 의해 독성이 나타난다. 이러한 점들은 시험이 독성 화합물에 대해 민감한 것을 제어할 수 있다.
12 내지 18 시간 (3 일)후에, 루시퍼라제 정량화 절차를 착수하였다. 프로메가로부터의 이중 루시퍼라제 분석 키트의 시약을 사용하여 하기 반응을 실현하였다. 세포를 세척하고 10 ㎕의 수동 세포용해 완충액 (프로메가)의 첨가에 의해 세포용해시켰다. 15 내지 30분의 교반후에, 평판의 루시퍼라제 활성을 이중-주입기 발광측정기 (BMG 루미스타)에서 판독하였다. 이 목적을 위하여, 50 ㎕의 루시퍼라제 분석 시약 및 50 ㎕의 스탑 앤드 글로 (Stop ＆ Glo) 완충액을 연속적으로 주입하여 양쪽 루시퍼라제의 활성을 정량하였다. 이어서 적절한 소프트웨어를 사용하여 데이타를 처리 및 분석하였다.
CAGA-매개 전사의 억제인자의 설명
상기 기재된 자동화 고 산출량 전사 선별에서 수천개의 화학 화합물을 분석하였다. α-시아노-4-히드록시-3-에톡시-5-페닐티오메틸 신남아미드 화합물 (이하, 화합물 A로 명명)은, 클론 F89 및 1613의 TGFβ-유도된 개똥벌레 루시퍼라제 활성에 대해 저해 효과 (5 내지 10 μM의 IC50)를 갖지만 레닐라 루시퍼라제 활성에 대해서는 효과가 없는 것으로 밝혀졌으며, 화합물의 예는 다음과 같다:
화합물 A (α-시아노-4-히드록시-3-에톡시-5-페닐티오메틸 신남아미드)
표 4는 1 ng/mL의 TGFβ의 존재하에서 클론 F89 및 1613의 개똥벌레 루시퍼라제 활성에 대한 화합물 A의 농도의 증가 효과를 나타낸다 (값 100은 화합물 A의 부재하에 및 1 ng/mL TGFβ존재하에 관찰되는 개똥벌레 루시퍼라제 활성에 상응한다).
화합물 A 농도 (μM) 0 0.1 1 5 10
F89 100 98 95 86 23
1613 100 105 102 65 36

Claims (21)

  1. 치료제의 존재하에서 Smad 단백질 또는 그의 DNA 결합 단편과 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서 W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C,A,G 또는 T이고, Z은 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 간의 결합 또는 전사 활성의 정도 또는 결과를 검출 또는 분석하는 것을 포함하는, 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병을 퇴치하는 데 사용하기 위한 상기 치료제의 선별 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C, A 또는 G이고, Z는 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1 또는 2항에 있어서, 상기 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 서열 5'AG(C/A)CAGACA3' 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1 또는 2항에 있어서, 상기 이중 가닥 올리고뉴클레오티드가 서열 5'ATGCAGACA3' 또는 5'GGCCAGACA3' 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 것인 방법.
  5. 제1 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유증 질병, 비정상적 창상 치유, 비정상적 골 형성, 암 발생, 조혈, 신경보호 및 면역 및 염증 장애의 치료에 사용하기 위한 방법.
  6. - Smad 단백질과,
    - TGFβ 또는 액티빈과,
    - 프로모터 또는 인핸서 서열 및 검출가능한 생성물의 유전자의 코딩 영역과 임의로 작동가능하게 연결될 수 있는, 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C,A 또는 G이고, Z는 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 이중 가닥 DNA 분자를 포함하는,
    하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ 또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병을 퇴치하는 데 적절한 약제의 선별용 키트.
  7. 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C, A 또는 G이고, Z는 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 인간을 비롯한 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ 또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병의 치료 방법.
  8. 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ 또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병을 치료하는 데 있어서, 서열 5'WXYCAGACZ3' (이 뉴클레오티드 서열에서 W는 A 또는 G를 나타내고, X는 G 또는 T를 나타내고, Y는 C,A 또는 G를 나타내고, Z은 A 또는 C를 나타낸다) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 용도.
  9. 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ 또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병의 치료용 약제를 제조하는 데 있어서, 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C,A 또는 G이고, Z은 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 용도.
  10. 뉴클레오티드 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C,A 또는 G이고, Z은 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하며 TGFβ또는 액티빈에 의한 유전자 조절에 관여하는 프로모터 또는 인핸서와 Smad 단백질과의 결합 또는 전사 활성을 억제 또는 활성화하는 약제의 치료량을 인간을 비롯한 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ 또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병의 치료 방법.
  11. 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ 또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병의 치료에 있어서, 뉴클레오티드 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C,A 또는 G이고, Z는 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하며, TGFβ또는 액티빈에 의한 유전자 조절에 관여하는 프로모터 또는 인핸서와 하나 이상의 Smad 단백질과의 결합 또는 전사 활성을 억제 또는 활성화하는 약제의 치료량의 용도.
  12. 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병의 치료용 약제를 제조하는 데 있어서, 뉴클레오티드 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C,A 또는 G이고, Z는 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하며, TGFβ또는 액티빈에 의한 유전자 조절에 관여하는 프로모터 또는 인핸서와 하나 이상의 Smad 단백질과의 결합 또는 전사 활성을 억제 또는 활성화하는 약제의 치료량의 용도.
  13. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 확인된 약제의 치료량을 인간을 비롯한 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ 또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병의 치료 방법.
  14. 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ 또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병의 치료에 있어서, 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 확인된 약제의 치료량의 용도.
  15. 하나 이상의 Smad 단백질 및 TGFβ 또는 액티빈에 의한 유전자 조절과 연관된 질병의 치료용 약제를 제조하는 데 있어서, 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 확인된 약제의 치료량의 용도.
  16. 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C,A,G 또는 T이고, Z는 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하는 단리된 이중 가닥 DNA 분자.
  17. 제16항에 있어서, 서열 5'AG(C/A)CAGACA3'을 가진 단리된 이중 가닥 DNA 분자.
  18. 제16항에 있어서, 서열 5'ATGCAGACA3'을 가진 단리된 이중 가닥 DNA 분자.
  19. 제16항에 있어서, 서열 5'GGCCAGACA3'을 가진 단리된 이중 가닥 DNA 분자.
  20. 뉴클레오티드 서열 5'WXYCAGACZ3' (여기서, W는 A 또는 G이고, X는 G 또는 T이고, Y는 C,A 또는 G이고, Z는 A 또는 C임) 또는 그의 기능적 균등물을 포함하며 TGFβ 또는 액티빈에 의한 유전자 조절에 관여하는 프로모터 또는 인핸서와 하나 이상의 Smad 단백질과의 결합 또는 전사 활성을 억제 또는 활성화하는 치료제.
  21. 제1 내지 4항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 확인된 치료제.
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