JP2011016723A - 骨及び軟骨形成タンパク質を含有する医薬品及び医療器具 - Google Patents

Abstract

【課題】生体内で強い炎症などの副作用を引き起こさず、骨芽細胞が存在するところでのみ作動し、軟骨形成を伴い自然治癒と同じ経過で骨形成を速やかに誘導する医薬の提供。
【解決手段】本発明は、炎症を起こさずに骨を処置するための、ＮＥＬＬ１を含む骨治療剤を提供することによって上記課題を解決した。本発明は、病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術、歯槽骨再生、人工歯根周囲の顎骨再生等において用いられる。
【選択図】なし

Description

本発明は、骨治療およびスクリーニング法に関する。より詳細には、Ｎｅｌｌ1タンパク質を用いた骨治療およびスクリーニング法に関する。

骨、軟骨、歯を欠損した部位に、骨、軟骨、歯を再生する事は臨床分野（整形外科、形成外科、口腔外科、脳外科、歯科）において非常に重要である。現在は、骨形成因子（BMP）が米国で実用化され、同領域において使用されている。しかし、ＢＭＰはＴＧＦβファミリーに属する強力な分化誘導因子であり、基本的に忌避物質であり、投与箇所には強い炎症等の副作用が引き起こされる。また、骨芽細胞が存在しない場所でも骨芽細胞を誘引するほど強力で、臨床応用でコントロールが困難（過剰形成）であった。また、一部では正常な骨形成に必須な軟骨の形成が不全となることも知られていた。

特許文献１は、ＮＥＬＬ１の遺伝子を用いた骨処置について記載している。しかし、タンパク質を用いた処置は、実質的に記載されておらず、通常の骨処置が可能であるか記載されていない。また、メカニズムについてはなんらの分析もされていない。そして、炎症などの副作用を回避することができるか記載されていない。また、ＮＥＬＬ１タンパク質による細胞内シグナリングカスケードの検討は開示されていない。このような開示からは、炎症を起こさずに骨を治療することは予想できず、ＮＥＬＬ１タンパク質によるＭＡＰＫカスケード依存的、かつ、Ｓｍａｄカスケード非依存的な骨誘導脳は予想できない。

特許文献２（特表２００７−５２４３６０に対応）は、ＮＥＬＬ１に関する事項を開示する。しかし、タンパク質を用いた処置により通常の骨処置が可能であるか記載されていない。また、メカニズムについてはなんらの分析もされていない。そして、炎症などの副作用を回避することができるか記載されていない。また、ＮＥＬＬ１タンパク質による細胞内シグナリングカスケードの検討は開示されていない。このような開示からは、炎症を起こさずに骨を治療することは予想できず、ＮＥＬＬ１タンパク質によるＭＡＰＫカスケード依存的、かつ、Ｓｍａｄカスケード非依存的な骨誘導脳は予想できない。

特許文献３（特表２００６−５１２２９２に対応）は、ＮＥＬＬ１に関する事項を開示する。しかし、タンパク質を用いた処置により通常の骨処置が可能であるか記載されていない。また、メカニズムについてはなんらの分析もされていない。そして、炎症などの副作用を回避することができるか記載されていない。また、ＮＥＬＬ１タンパク質による細胞内シグナリングカスケードの検討は開示されていない。このような開示からは、炎症を起こさずに骨を治療することは予想できず、ＮＥＬＬ１タンパク質によるＭＡＰＫカスケード依存的、かつ、Ｓｍａｄカスケード非依存的な骨誘導脳は予想できない。

特許文献４は、ＮＥＬＬ１に関する事項を開示する。しかし、タンパク質を用いた処置により通常の骨処置が可能であるか記載されていない。また、メカニズムについてはなんらの分析もされていない。そして、炎症などの副作用を回避することができるか記載されていない。また、ＮＥＬＬ１タンパク質による細胞内シグナリングカスケードの検討は開示されていない。このような開示からは、炎症を起こさずに骨を治療することは予想できず、ＮＥＬＬ１タンパク質によるＭＡＰＫカスケード依存的、かつ、Ｓｍａｄカスケード非依存的な骨誘導脳は予想できない。
国際公開２００６／０８９０２３パンフレット 国際公開２００４／０７２１００パンフレット 国際公開２００４／０２４８９３パンフレット 国際公開０１／０２４８２１パンフレット

ＢＭＰは、Ｓｍａｄ転写因子群とＭＡＰＫカスケードの２つの細胞内シグナル経路を活性化させる。両シグナルは共役的に作動し、ＢＭＰの強力な骨分化活性支えている。そこで、生体内で強い炎症などの副作用を引き起こさず、骨芽細胞が存在するところでのみ作動し、軟骨形成を伴い自然治癒と同じ経過で骨形成を速やかに誘導するＢＭＰに替わる骨形成因子の登場が待たれていた。

上記課題を解決するために、本発明者らが鋭意検討した結果、今回、本発明者らは独自に発見した新規骨・軟骨誘導タンパク質であるヒトＮＥＬＬ１を大量に昆虫細胞で製造し、各種細胞を用いて関与するシグナル経路がＭＡＰＫカスケードのみであることを示し、その結果、骨形成活性を示すことが判明した。さらに、生体内においてはコラーゲンシート等の臨床使用歴のある簡単な医療器具にヒトＮＥＬＬ１を包含するだけで、自然治癒と同様に強い炎症作用や過剰形成もなく骨及び軟骨形成を速やかに促すことが判明した。この医薬品及び医療器具は、骨、軟骨、歯の欠損を伴う疾患治療において、従来使用されてきたＢＭＰよりも安全で使いやすく効率の良いものになる可能性が高いことを示している。

本発明において、ＮＥＬＬ１は、Ｓｍａｄ転写因子群とは無関係に、ＭＡＰＫカスケードのみを活性化させて、骨芽細胞に対して非常に効率よく分化誘導を促す新規タンパク質であることが判明した。ここでは、医薬品及び医療器具として使用するために、コラーゲンフィルムなどのキャリアと組み合わせて、それらが生体内で非常に強い骨形成を誘導することが判明した。

ＮＥＬＬ１は、骨芽細胞の骨分化および骨形成を誘導する細胞外のタンパク質である。ＮＥＬＬ１が誘発した細胞内シグナル伝達カスケードを解明するために、本発明者らは、ＮＥＬＬ１タンパク質がＭＡＰＫシグナル伝達カスケードを一時的に活性化し、Ｃｂｆａ１のリン酸化を誘導し、チロシンリン酸化タンパク質の迅速な細胞内蓄積を促進することを示した。ＢＭＰ２と異なり、ＮＥＬＬ１タンパク質はＳｍａｄシグナル伝達カスケードを活性化しない。これらの発見によって、特定のレセプターに結合する際、ＮＥＬＬ１が骨形成のシグナルを変換し、ＭＡＰＫカスケードに関連した所定のチロシンキナーゼの活性化を通じてＮＥＬＬ１が骨形成のシグナルを変換し、最終的に骨分化を導くということが示される。

間葉の多能性細胞の骨分化は、多様な可溶性タンパク性因子によって調節される［Ｈｕｇｈｅｓ，Ｆ．Ｊ．，Ｔｕｒｎｅｒ，Ｗ．，Ｂｅｌｉｂａｓａｋｉｓ，Ｇ．ａｎｄ Ｍａｒｔｕｓｃｅｌｌｉ，Ｇ．（２０００）Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．４１，４８−７２１］。特に、ＢＭＰ（骨形成因子）は、本来、骨芽細胞マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）およびオステオカルシン（ＯＣＮ）の発現を誘発するのみでなく鉱化を刺激する能力から示唆される［Ｃａｎａｌｉｓ，Ｅ．，Ｅｃｏｎｏｍｉｄｅｓ，Ａ．Ｎ．ａｎｄ Ｇａｚｚｅｒｒｏ，Ｅ．（２００３）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２４，２１８−２３５］ように、間葉細胞の骨芽細胞系列への分化を促進する分子として同定された。ＢＭＰシグナル経路において、Ｓｍａｄタンパク質は、標的遺伝子の活性化を通じて骨分化において大きな役割を果たしている。加えて、Ｃｏｒｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ α１／ｒｕｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ２（Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２）が骨芽細胞分化および骨形成に不可欠であることが示された［Ｃｈｅｎ，Ｄ．，Ｚｈａｏ，Ｍ．ａｎｄ Ｍｕｎｄｙ，Ｇ．Ｒ．（２００４）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ２２，２３３−２４１］。

以前、一側性冠状骨癒合症の縫合において過剰発現され、成長する頭蓋骨前面の早期融合を引き起こす遺伝子を同定し、ＮＥＬＬ１（新規上皮成長因子（ＥＧＦ）様タンパク質１）と命名した［Ｔｉｎｇ，Ｋ．，Ｖａｓｔａｒｄｉｓ，Ｈ．，Ｍｕｌｌｉｋｅｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｓｏｏ，Ｃ．，Ｔｉｅｕ，Ａ．，Ｄｏ，Ｈ．，Ｋｗｏｎｇ，Ｅ．，Ｂｅｒｔｏｌａｍｉ，Ｃ．Ｎ．，Ｋａｗａｍｏｔｏ，Ｈ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．ａｎｄ Ｌｏｎｇａｋｅｒ，Ｍ．Ｔ．（１９９９）Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅ．Ｒｅｓ．１４，８０−８９］。図１に示すように、ＮＥＬＬ１タンパク質は、約８１０個のアミノ酸残基（ａａ）からなり、約２０−ａａシグナルペプチド、約１２８−ａａラミニンＧドメイン（以前はＮ末端トロンボスポンジン（ＴＳＰ）様モジュールとして知られていた）、５つのフォン・ビルブラント因子Ｃドメイン、および３つのＣａ２＋結合型を含む６つのＥＧＦ様ドメインを有する［Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．，Ｏｙａｓｕ，Ｍ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｍ．，Ｋａｎａｙａｍａ，Ｎ．，Ｔａｎｉｚａｗａ，Ｋ．，Ｓａｉｔｏ，Ｎ．，Ａｂｅ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｈａｓｈｉ，Ｓ．ａｎｄ Ｔｉｎｇ，Ｋ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６５，７９−８６］。生理学的機能に関して、ＮＥＬＬ１遺伝子はラット胎児頭頂骨（ＲＦＣ）由来初代培養細胞の骨分化を誘導することが示され、ＮＥＬＬ１遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスは、頭蓋骨早期癒合症（ＣＳ）様の表現型を示した［Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｄ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｉ．，Ｓｏｏ，Ｃ．，Ｍｏａｔｓ，Ｒ．，Ｉｉｄａ，Ｋ．，Ｗｉｓｎｅｒ，Ｅ．，Ｈｕ，Ｆ．Ｙ．，Ｍｉａｏ，Ｓ．，Ｂｅａｎｅｓ，Ｓ．，Ｄａｎｇ，Ｃ．，Ｖａｓｔａｒｄｉｓ，Ｈ．，Ｌｏｎｇａｋｅｒ，Ｍ．，Ｔａｎｉｚａｗａ，Ｋ．，Ｋａｎａｙａｍａ，Ｎ．，Ｓａｉｔｏ，Ｎ．ａｎｄ Ｔｉｎｇ，Ｋ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１８，２１２６−２１３４］。一方、ＮＥＬＬ１欠乏マウスでは細胞外基質タンパク質のレベルが減少し、その結果、脊柱および胸郭の骨格の欠陥が生じた［Ｄｅｓａｉ，Ｊ．，Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．，Ｒｕｆｆ，Ｄ．Ｗ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｌ．Ａ．，Ｋｅｒｌｅｙ，Ｍ．Ｋ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ｒｉｎｃｈｉｋ，Ｅ．Ｍ．ａｎｄ Ｃｕｌｉａｔ，Ｃ．Ｔ．（２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５，１３２９−１３４１］。これらの所見によって、動物モデルにおける骨の欠陥に対するＮＥＬＬ１タンパク質の治療効果を試験する最近の試みが容易になった。［Ａｇｈａｌｏｏ，Ｔ．，Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｈｏｕ，Ｙ．Ｆ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｌｅｅ，Ｈ．，Ｍｉａｏ，Ｓ．，Ｈｏｎｇ，Ｎ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．，Ｗｕ，Ｂ．，Ｔｉｎｇ，Ｋ．ａｎｄ Ｓｏｏ，Ｃ．（２００６）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６９，９０３−９１５、Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｊｉａｎｇ，Ｘ．，Ｈｓｕ，Ｔ．，Ｓｏｏ，Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｂ．，Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｚ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．，Ｗｕ，Ｂ．，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｚｈａｎｇ，Ｘ．ａｎｄ Ｔｉｎｇ，Ｋ．（２００７）Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．２２，９１８−９３０］。しかしながら、ＮＥＬＬ１タンパク質がどのようにして骨芽細胞において細胞内シグナル伝達カスケードを誘発するのかについては解明されていない。

この研究では、高度に精製した組換えヒトＮＥＬＬ１（ｈＮＥＬＬ１）を得、ＲＦＣ細胞に対するｈＮＥＬＬ１タンパク質の直接的効果を検討した。著しく低いモル濃度で添加されたｈＮＥＬＬ１タンパク質が様々な骨芽細胞においてＭＡＰＫシグナリングカスケードを一時的に活性化することが可能であり、Ｓｍａｄ非依存シグナル伝達カスケードを通じてそのシグナルを伝達することを本明細書において示す。さらに、ｈＮＥＬＬ１タンパク質を添加した結果、Ｃｂｆａ１のリン酸化およびチロシンリン酸化タンパク質の急速な蓄積が生じた。

したがって、本発明は、以下を提供する。

一つの局面において、本発明は、炎症を起こさずに骨を処置するための、ＮＥＬＬ１を含む骨治療剤を提供する。

一つの実施形態において、本発明では、前記骨は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とするものである。

他の実施形態において、本発明では、前記骨は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とする疾患、障害または状態を有する。

他の実施形態において、本発明の骨治療剤は、病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術、歯槽骨再生または人工歯根周囲の顎骨再生において使用するためのものである。

他の実施形態において、本発明では、前記骨は、頭頂骨、側頭骨、蝶形骨、上顎骨、下顎骨、上腕骨、りょう骨、尺骨、手骨、鎖骨、胸骨、肋骨、寛骨、仙骨、尾骨、髄、大腿骨、膝蓋骨、腓骨、脛骨および足骨からなる群より選択される。

他の実施形態において、本発明では、前記ＮＥＬＬ１は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体を含む。

他の実施形態において、本発明では、前記ＮＥＬＬ１は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体と、Ｃ末端にタグ（配列番号９）とを含むポリペプチドである。

他の実施形態において、本発明では、前記ＮＥＬＬ１は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０と、Ｃ末端にタグとを含むポリペプチドである。

他の局面において、本発明は、ＮＥＬＬ１と薬学的に許容可能なキャリアとを含む、炎症を起こさずに骨を処置するための骨治療器具を提供する。

他の実施形態において、本発明の骨治療器具では、前記キャリアは、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物、およびポリ乳酸−ポリエチレングリコールからなる群より選択される。

別の局面において、本発明は、炎症を起こさずに骨を処置するための方法を提供する。この方法は、骨処置を必要とする被験体にＮＥＬＬ１を投与する工程を包含する。

一つの実施形態において、本方法では、前記投与は、前記処置を必要とする部位にＮＥＬＬ１を含む骨治療剤を移植することによって達成される。

他の実施形態において、本方法では、前記処置を必要とする部位は、頭頂骨、側頭骨、蝶形骨、上顎骨、下顎骨、上腕骨、りょう骨、尺骨、手骨、鎖骨、胸骨、肋骨、寛骨、仙骨、尾骨、髄、大腿骨、膝蓋骨、腓骨、脛骨および足骨からなる群より選択される。

他の実施形態において、本発明では、前記ＮＥＬＬ１は、薬学的に許容可能なキャリアとともに投与される。

他の実施形態において、本発明では、前記キャリアは、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物、およびポリ乳酸−ポリエチレングリコールからなる群より選択される。

他の実施形態において、本方法では、前記ＮＥＬＬ１は、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり、０．００１μｇ〜３００μｇ（１．６μｇ〜５０ｇ／ｋｇ体重）以下で前記被験体に投与される。

他の実施形態において、本方法では、前記骨は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とするものである。

他の実施形態において、本方法では、前記処置は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とする疾患、障害または状態に対するものである。

他の実施形態において、本方法では、前記処置は、病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術、歯槽骨再生または人工歯根周囲の顎骨再生に対するものである。

一つの局面において、本発明は、ＮＥＬＬ１を生産する方法を提供する。この方法は、
Ａ）ＮＥＬＬ１およびシグナル配列をコードする核酸をインフレームで作動可能に連結した核酸構築物を提供する工程；
Ｂ）該核酸構築物を細胞に導入する工程；
Ｃ）ＮＥＬＬ１を発現する条件下に、該細胞を配置する工程；および
Ｄ）発現された該ＮＥＬＬ１を回収する工程
を包含する。

一つの実施形態において、本方法では、前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸は、前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体をコードする。

他の実施形態において、本方法では、前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸は、前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列を含むポリペプチドをコードする。

他の実施形態において、本方法では、前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０と、Ｃ末端にタグとを含むポリペプチドをコードする。

他の実施形態において、本方法では、前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸は、配列番号１（ヒトＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の塩基１８３〜２５６４、配列番号３（マウスＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の塩基１０３〜２４７２、配列番号５（ラットＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の塩基１２２〜２４９１および配列番号１２（ツメガエルＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の成熟配列からなる群より選択される核酸を含む。

別の実施形態において、本方法では、前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）である。

別の実施形態において、本方法では、前記細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来の細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞およびヒト胎児腎臓由来の細胞からなる群より選択される細胞である。

別の実施形態において、本方法では、前記細胞は、昆虫細胞である。

別の実施形態において、本方法では、前記細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来の細胞である。

別の実施形態において、本方法では、前記細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞である。

別の実施形態において、本方法は、さらに、Ｅ）前記回収したＮＥＬＬ１を精製する工程を包含する。

別の実施形態において、本方法では、前記Ｅ）工程は、
Ｅ−ｉ）前記回収されたＮＥＬＬ１を、Ｎｉレジンアフィニティカラムにかける工程；および
Ｅ−ｉｉ）１００ｍＭ〜１．５Ｍのイミダゾールで溶出する工程
を包含する。

好ましい実施形態において、本発明の方法は、前記Ｅ−ｉｉ）工程において、前記イミダゾールが、１００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度である。

好ましい実施形態において、本発明の方法ではシグナル配列は、ＮＥＬＬ１に対して内因性である。

より好ましい実施形態では、ＮＥＬＬ１およびシグナル配列をコードする核酸は、配列番号１の塩基１３５〜２５６４、配列番号３の塩基４０〜２４７２および配列番号５の塩基５９〜２４９１からなる群より選択される。

他の好ましい実施形態において、本発明の方法は、
ａ）Ｖ５タグ、ヒスチジンタグ、内因性シグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号１のヌクレオチド１３５〜２５６４、配列番号３のヌクレオチド４０〜２４７２、配列番号５のヌクレオチド５９〜２４９１など）を含むＮＥＬＬ１（ｈＮＥＬＬ１） ｃＤＮＡを含む核酸構築物を提供する工程；
ｂ）該核酸構築物によりＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞にトランスフェクトする工程；
ｃ）ＮＥＬＬ１を発現することができる条件下で、該Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞を培養する工程；
ｄ）該Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞から分泌されたＮＥＬＬ１を含む培養上清を回収する工程；
ｅ）回収されたＮＥＬＬ１を、Ｎｉレジンアフィニティカラムにかけ、５００ｍＭ イミダゾールで溶出することにより、回収された該培養上清から該ＮＥＬＬ１を精製する工程を包含する。

別の局面において、本発明は、炎症を起こさずに骨形成を促進する因子をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、
Ａ）候補化合物を提供する工程；
Ｂ）該候補化合物についてＭＡＰキナーゼの活性化能を検出する工程；
Ｃ）該候補化合物について、Ｓｍａｄの活性化能を検出する工程；
Ｄ）該候補化合物から、ＭＡＰキナーゼを活性化し、かつＳｍａｄを活性化しない化合物を炎症を起こさずに骨形成を促進する因子として選択する工程
を包含する。

別の局面において、本発明は、炎症を起こさずに骨形成を促進する因子の候補化合物を生産する方法を提供する。この方法は、
Ａ）候補化合物を提供する工程；
Ｂ）該候補化合物についてＭＡＰキナーゼの活性化能を検出する工程；
Ｃ）該候補化合物について、Ｓｍａｄの活性化能を検出する工程；
Ｄ）該候補化合物から、ＭＡＰキナーゼを活性化し、かつＳｍａｄを活性化しない化合物を炎症を起こさずに骨形成を促進する因子の候補化合物として選択する工程を包含する。

別の局面において、本発明は、炎症を起こさずに骨を処置するための骨治療剤の製造のための、ＮＥＬＬ１の使用を提供する。

さらなる局面において、本発明は、骨治療処方物を提供する。この骨治療処方物は、炎症を起こさずに骨を処置するための、ＮＥＬＬ１を含む骨治療処方物であって、該ＮＥＬＬ１は、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり、０．００１μｇ〜３００μｇ（１．６μｇ〜５０ｇ／ｋｇ体重）以下で投与される。

従って、本発明のこれらおよび他の利点は、以下の詳細な説明を読めば、明白である。

本発明では、ＮＥＬＬ１の製造法において、従来技術より生産効率が改善されたＮＥＬＬ１が提供される。本発明では、細胞内シグナルカスケードが同定されたことにより、骨治療剤のスクリーニングの効率よい手法が提供される。また、副作用を回避するための情報も提供される。本発明を用いる場合、単純な生体用ポリマーとの組み合わせで生体内での十分な骨形成を行うことが達成される。また、本発明では、自然治癒の様に軟骨形成を経て骨形成し、炎症誘導の著しい減少することが判明した。また、本発明を用いると、過剰な骨形成が減少する。そして、本発明では、従来顕著と言われていたＢＭＰと同等の生体内骨形成速度が達成される。したがって、本発明を用いることによって、骨治療における飛躍的な改善が達成される。

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当上記分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。

本明細書において「ＮＥＬＬ１」とは、Ｔｉｎｇ，Ｋ．らによって見出された遺伝子であり、ＮＥＬＬ１遺伝子として、頭蓋骨早期癒合症の原因遺伝子として同定されたものが最初である（特許文献１〜４等）。そして、発明者らがＹｅａｓｔ Ｔｗｏ Ｈｙｂｒｉｄ法を用いて、タンパク質としてのＮＥＬＬ１を発見するに至った（Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．，Ｏｙａｓｕ，Ｍ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｍ．，Ｋａｎａｙａｍａ，Ｎ．，Ｔａｎｉｚａｗａ，Ｋ．，Ｓａｉｔｏ，Ｎ．，Ａｂｅ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｈａｓｈｉ，Ｓ．ａｎｄ Ｔｉｎｇ，Ｋ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６５，７９−８６）その後、ＮＥＬＬ１遺伝子を過剰発現するマウスを作成したところ、頭蓋骨早期癒合症様のフェノタイプが確認された。また、アデノウイルスを用いて、ＮＥＬＬ１遺伝子をマウス前駆骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１に導入すると、骨分化早期マーカーである細胞内アルカリフォスファターゼの活性の上昇が確認され、さらに分化細胞内において、中期・後期マーカーであるＯｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ，ＯｓｔｅｏｃａｌｓｉｎのｍＲＮＡの発現が上昇すること、最終的にＮＥＬＬ１遺伝子を導入した細胞はカルシウムの沈着を誘発したことも知られている（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，Ｋｕｒｏｄａ，Ｓ．，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ｄ．，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，Ｉ．，Ｓｏｏ，Ｃ．，Ｍｏａｔｓ，Ｒ．，Ｉｉｄａ，Ｋ．，Ｗｉｓｎｅｒ，Ｅ．，Ｈｕ，Ｆ．Ｙ．，Ｍｉａｏ，Ｓ．，Ｂｅａｎｅｓ，Ｓ．，Ｄａｎｇ，Ｃ．，Ｖａｓｔａｒｄｉｓ，Ｈ．，Ｌｏｎｇａｋｅｒ，Ｍ．，Ｔａｎｉｚａｗａ，Ｋ．，Ｋａｎａｙａｍａ，Ｎ．，Ｓａｉｔｏ，Ｎ．ａｎｄ Ｔｉｎｇ，Ｋ．（２００２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１８，２１２６−２１３４）。

本明細書で、通常「ＮＥＬＬ１」というときは、成熟配列のものをさすことが理解される。したがって、本発明では、通常「ＮＥＬＬ１」というときは、シグナル配列（リーダー配列）が含まれないことに留意すべきである。
ＮＥＬＬ１のヌクレオチド配列は、具体的には、以下のようにあらわされる。
（１）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列；
（２）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列において、１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＮＥＬＬ１の活性を示す、アミノ酸配列；および
（３）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を、アミノ酸配列；および
（４）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列またはそれに相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（５）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列またはそれに相補的な核酸配列と中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（６）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列に少なくとも７０％の相同性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列；
（７）（１）〜（６）のホモログまたは対立遺伝子変異体
などを挙げることができる。

ＮＥＬＬ１をコードする核酸またはＮＥＬＬ遺伝子は、以下のように表すことができる。
（１）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列；
（２）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列において、１または数個の置換、付加および／または欠失を含み、かつ天然型ＮＥＬＬ１の活性を示す、アミノ酸配列をコードする核酸配列；および
（３）配列番号２、４、６または１３（ＮＥＬＬ１のアミノ酸配列）に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の相同性を、アミノ酸配列をコードする核酸配列；および
（４）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列またはそれに相補的な核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
（５）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列またはそれに相補的な核酸配列と中程度のストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
（６）配列番号１，３，５または１２（ＮＥＬＬ１をコードする核酸配列）に示される核酸配列に少なくとも７０％の相同性を有する核酸配列；
（７）（１）〜（６）のホモログまたは対立遺伝子変異体
などを挙げることができる。

ここで、上記配列番号において、配列番号１は、ヒトＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基１３５〜１８２、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１８３〜２５６４であり、配列番号２は、ヒトＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜１６、成熟ペプチドは残基１７〜８１０である。

配列番号３は、マウスＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基４０〜１０２、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１０３〜２４７２であり、配列番号４は、マウスＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜２１、成熟ペプチドは残基２２〜８１０である。

配列番号５は、ラットＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基５９〜１２１、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１２２〜２４９１であり、配列番号６は、ラットＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜２１、成熟ペプチドは残基２２〜８１０である。

したがって、本発明において、当業者は、上記シグナル配列および成熟配列の情報に基づいて、本発明において利用することができることが理解される。

配列番号１２および１３については、部分配列であるが、当業者は、上記情報を元に、シグナル配列および成熟配列（すなわち、成熟部分の該当するアミノ酸からなるポリペプチドまたはそれをコードする核酸配列）を同定し、本発明において利用することができることが理解される。

本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプ チド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。

本明細書において、「アミノ酸」は、本発明の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。

本明細書において「アミノ酸誘導体」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのようなアミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。本明細書では、アミノ酸誘導体およびアミノ酸アナログは、アミノ酸と同じ生物学的機能を提供し得る限り代替として使用され得ることが理解される。

本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。

本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。

本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。

本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。あるいは、対立遺伝子変異体もこの範囲内に入る。

本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。

本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド型核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。

本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。

本明細書において、ハイブリダイゼーションのための「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して類似性または相同性を有するヌクレオチド鎖の相補鎖が標的配列に優先的にハイブリダイズし、そして類似性または相同性を有さないヌクレオチド鎖の相補鎖が実質的にハイブリダイズしない条件を意味する。ある核酸配列の「相補鎖」とは、核酸の塩基間の水素結合に基づいて対合する核酸配列（例えば、Ａに対するＴ、Ｇに対するＣ）をいう。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、そして種々の状況で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨでの特定の配列についての熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔ_ｍは、規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で、標的配列に相補的なヌクレオチドの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である。「ストリンジェントな条件」は配列依存的であり、そして種々の環境パラメーターによって異なる。核酸のハイブリダイゼーションの一般的な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ、第２章 「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅａｓｓａｙ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見出される。

代表的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ^＋未満であり、代表的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａ^＋濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃、そして長いヌクレオチド（例えば、５０ヌクレオチドより長い）については少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。本明細書におけるストリンジェントな条件として、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（３７℃）の緩衝溶液中でのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣで６０℃での洗浄が挙げられる。

本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、本発明で具体的に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、９０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。

本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ_４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。

ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔ_ｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ^＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ^＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。

本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。

本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。

約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ
Ｕｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。

配列番号＊のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸は、本質的に１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ_４）；１ｍＭ ＥＤＴＡ；４２℃の温度で ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に２×ＳＳＣ（６００ｍＭ ＮａＣｌ；６０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；５０℃の０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、さらに好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；５００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ_４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ； ７％ ＳＤＳ を含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に５０℃の１×ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ；３０ｍＭ クエン酸ナトリウム）；１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下、最も好ましくは本質的に５０℃の温度での１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；２００ｍＭ リン酸ナトリウム（ＮａＰＯ_４）；１５％ホルムアミド；１ｍＭ ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳを含むハイブリダイゼーション緩衝液、および本質的に６５℃の０．５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ；１５ｍＭ クエン酸ナトリウム）；０．１％ ＳＤＳを含む洗浄緩衝液によって定義される低ストリンジェント条件下に配列表に示す配列の１つまたはその一部とハイブリダイズし得る。

アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。

本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。

本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９（２００４．５．１２ 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。

本明細書において、「対応する」アミノ酸とは、あるタンパク質分子またはポリペプチド分子において、比較の基準となるタンパク質またはポリペプチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸をいう。

本明細書において、「対応する」遺伝子とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子（例えば、ＮＥＬＬ１）に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、ヒトの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウサギ、モルモット、ウシ、ヒツジなど）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。

本明細書において「断片」または「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において有用なフラグメントの長さは、そのフラグメントの基準となる全長タンパク質の機能のうち少なくとも１つの機能が保持されているかどうかによって決定され得る。

本明細書において「相同性」は、２以上の配列の比較において、それらの配列が進化的に祖先を共有することを示す。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなうか、またはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。配列の直接の比較により類似性に基づいた判定をおこなう場合、その類似性測定過程のアライメントにおける最も単純な解釈として、同一な（もしくは等価である）文字列（塩基、アミノ酸残基など）で並置されている文字列が、これらの領域が祖先配列のまま変化しなかったものであることを示し、同一でない（もしくは、等価でない）文字列が、突然変異が一方の配列で起こったものであるとの考察が可能である。アライメントにおけるギャップ（インデル）は、配列の一方で、挿入または欠失が起こったものであると考えられる。つまり、それらの配列の同一性または類似性は高いことは、それらの配列における相同性を強く示唆することが理解される。相同性は、発現抑制剤の設計において参照される。

本明細書において「相補的」または「相補体」という用語は、本明細書では、相補領域全体がそのまま別の特定のポリヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成することのできるポリヌクレオチドの配列を示す。本発明の目的で、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその相補塩基と対になっている場合に、この第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドと相補であるとみなす。相補塩基は一般に、ＡとＴ（あるいはＡとＵ）、またはＣとＧである。本願明細書では、「相補」という語を「相補ポリヌクレオチド」、「相補核酸」および「相補ヌクレオチド配列」の同義語として使用する。これらの用語は、その配列のみに基づいてポリヌクレオチドの対に適用されるものであり、２つのポリヌクレオチドが事実上結合状態にある特定のセットに適用されるものではない。

本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、オルソログもまた、本発明において有用であり得る。

本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。このような塩基配列の改変法としては、制限酵素などによる切断、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、ＤＮＡリガーゼなどによる処理等による連結等の処理、合成オリゴヌクレオチドなどを用いた部位特異的塩基置換法（特定部位指向突然変異法；Ｍａｒｋ Ｚｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓｍｉｔｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４６８−５００（１９８３））が挙げられるが、この他にも通常分子生物学の分野で用いられる方法によって改変を行うこともできる。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。

あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、リガンド分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。

上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。

あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、リガンド結合能において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタ ミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（− ２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。

本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。

このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。

本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加および／または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わること、または取り除かれることをいう。このような置換、付加および／または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。基準となる核酸分子またはポリペプチドにおけるこれらの変化は、目的とする機能（例えば、骨化など）が保持される限り、この核酸分子の５’末端もしくは３’末端で生じ得るか、またはこのポリペプチドを示すアミノ酸配列のアミノ末端部位もしくはカルボキシ末端部位で生じ得るか、またはそれらの末端部位の間のどこにでも生じ得、基準配列中の残基間で個々に散在する。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ＡＧＥの認識能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１５％以内、１０％以内、５％以内、または１５０個以下、１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。

（疾患およびその処置）
本明細書において「炎症」とは、当該分野において通常用いられる意味で用いられ、損傷に対する局部組織の反応．発光，腫脹，苦痛および発熱が特徴であり、たとえば、細菌感染・化学的作用・物理的作用などによる組織の傷害に反応して、身体の一部に発赤・腫脹・疼痛・発熱などを起すことおよびその症状が含まれる。炎症はまた、異物の侵入または異物化した組織を排除しようとする生体の防御反応によっても生じる。炎症は、手術によっても生じる。そして、手術中の炎症の発生は、現在問題となっており解決が望まれていた。

本明細書において「骨」とは、骨格として身体の支柱をなす。骨はその形状により短骨、長骨、扁平骨に分類される。短骨としては椎骨椎体、手根骨、足根骨などを挙げることができるがこれらに限定されない。長骨としては上腕骨、撓骨、尺骨、大腿骨、脛骨、腓骨、中手骨、中足骨などを挙げることができるがこれらに限定されない。両骨とも中央部は中空で骨髄腔が形成される。骨端部は皮質骨と海綿骨、骨幹部は層板系から成る緻密性の厚い皮質骨から形成される。扁平骨は、力のかかり方のやや特殊なところにみられ、例えば、頭蓋冠や肋骨などを挙げることができるがこれらに限定されない。内外両面に丈夫な緻密骨を有し、その間に海綿骨が存在する。骨形成過程には、二つの機序が存在する。一つは軟骨組織が骨組織に置き換えられる様式で、軟骨性骨と呼ばれ、多くの短骨、長骨はこの過程を経て形成される。他の形成様式は膜性骨と呼ばれ、結合組織が直接骨組織を形成するもので、多くの扁平骨がこの様式により形成される。本発明は、二つの骨形成様式により形成される異なる３つの骨群すべてに応用される。

本明細書において「骨の処置」とは、当該分野においてもっとも広義に用いられ、骨の状態を維持または改善するための任意の過程・プロセスをいう。骨の処置としては、たとえば、骨髄炎、骨腫瘍における病巣掻爬、切除後の骨欠損の補填（整形外科、形成外科、口腔外科）、海綿骨、ブロック骨、血管柄付移植骨の代用、骨折の治癒遷延、偽関節に対して（整形外科、形成外科、口腔外科）、仮骨延長術（整形外科、形成外科、口腔外科）、骨系統疾患による下肢長左右差、奇形による顎骨劣成長に対して、延長部の骨化促進、人工関節置換術（整形外科）、変形性関節症、関節リウマチ、大腿骨頭壊死症に対する、全関節置換術において、骨セメントの代用、あるいは関節再生、脊椎固定術（整形外科）、脊椎脱臼骨折、脊椎カリエス、脊椎腫瘍、椎間板症、椎間板ヘルニア、脊椎すべり症に対する、椎間固定材料、軟骨移植（形成外科）、各種奇形、外傷後の再建（鼻翼、耳介）、顎裂骨移植（形成外科、口腔外科）、唇顎口蓋裂等の奇形における、顎骨欠損部の補填、外傷による骨欠損部補填（整形外科、形成外科、口腔外科）粉砕骨折部の再建、開頭術後骨欠損補填（脳外科）、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術（歯科）、人工歯根（インプラント）埋入に際し、骨量の不足を補填すること、歯周病における歯槽骨再生（歯科）、歯周病により吸収された歯槽骨の再生などを挙げることができるがそれらに限定されない。

本明細書において「骨治療剤」とは、骨を処置するための任意の薬剤をいい、どのような形態であってもよい。具体例としては、たとえば、ｒｈＢＭＰ−２を挙げることができる。

本明細書において「骨治療器具」とは、骨を処置するための任意の医療器具をいい、どのような形態であってもよい。具体例としては、たとえば、固定プレート、固定ピン・ビス、固定スクリュー、仮骨延長器、ギブス、および骨欠損領域における薬剤や充填剤維持のための保護膜、チタンメッシュなどを挙げることができる。

本明細書において使用される「軟骨内骨化」(ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とは、まずガラス軟骨組織が形成され，それがさらに骨組織で置換されるもので，大部分の骨の骨化の初期で見られる骨化の形態である。

本明細書において使用される「膜性骨化（ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」または「線維性骨化（ｆｉｂｒｏｕｓ ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、膜，あるいは軟骨原基の軟骨膜に直接骨組織の形成される骨化の形態をいう。この型によって生成した骨を膜性骨あるいは膜骨（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｏｎｅ）という。

本明細書において「石灰化」とは、生物体で石灰質が沈着することをいい。骨化の程度を観察するために用いることができる。本明細書において生体内で「石灰化する」かどうかは、アリザリンレッド染色、カルシウム濃度を測定することによって判定することができ、移植組織を取り出し、酸処理などにより組織切片を溶解させ、その溶液を原子吸光度などの微量元素定量装置により測定し、定量することができる。

本明細書において、骨が「治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とする」とは、骨が何らかの障害または状態に陥っており、その回復または改善のために軟骨内骨化の誘導が必要されることをいう。このような状態としては、たとえば、病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術、歯槽骨再生、人工歯根周囲の顎骨再生などを挙げることができるがこれらに限定されない。従来、軟骨内骨化の誘導を起こすような因子は特定されておらず、骨化させるＢＭＰなどでも観察されていない。軟骨内骨化の誘導を経由することにより、副作用が減少し、過剰骨形成が減少することから、より自然に近い治癒を達成することができる。

本明細書において「病巣掻爬」とは、良性腫瘍が骨髄腔内にある場合、骨皮質の一部を開窓して腫瘍組織を掻爬することをいう。

本明細書において「切除後の骨欠損補填」とは、腫瘍等で切除されて生じた骨欠損部を骨移植などの手段で骨組織で補填することをいう。

本明細書において「骨折の治癒遷延」とは、骨折治癒に予想される期間を過ぎても骨癒合が認められないものをいう。

本明細書において「偽関節」とは、骨折部の癒合過程が止まり、間隙が瘢痕組織で充満され異常可動性を示す状態をいう。

本明細書において「仮骨延長術」とは、骨切後、延長器を装着し、同部への仮骨新生により骨延長を図る術式をいう。

本明細書において「人工関節置換術」とは、関節の一部または全部を金属、セラミックスなどの生体材料で置換し関節機能の獲得をはかる手術をいう。

本明細書において「脊椎固定術」とは、不安定性のある脊椎に対し支持性を獲得させるための手術をいう。この脊椎固定術が適応される主な例としては、例えば、椎間板ヘルニア、脊椎変形が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において「軟骨移植」とは、鼻形態を修正するために、鼻中隔、鼻翼に自家軟骨（例えば、耳介から採取したもの）を移植することをいう。

本明細書において「顎裂骨移植」とは、唇顎口蓋裂によって生じた上顎の裂隙に骨移植を行って、上顎骨の連続性を回復をはかる手術をいう。

本明細書において「外傷による骨欠損部補填」とは、粉砕骨折により生じた骨欠損を骨組織で補填することをいう。

本明細書において「開頭術後骨欠損補填」とは、脳手術のアプローチのために生じた頭蓋骨の欠損部を補填することをいう。

本明細書において「歯槽堤形成術」とは、萎縮した歯槽堤の高さを回復させ、義歯、人工歯根などの補綴処置を容易にする目的で行われる処置をいう。

本明細書において「上顎洞底挙上術」とは、上顎洞底と歯槽骨が近接している場合に、上顎洞底粘膜を挙上してできたスペースに骨組織を新生させる術式をいう。この上顎洞底挙上術は、人工歯根の埋入を目的として行われ得る。

本明細書において「歯槽骨再生」とは、歯周病などで喪失した歯牙、人工歯根周囲の骨組織の再生をいう。埋入時に不足した人工歯根周囲の骨組織を補填するために行われ得る。

本明細書において「人工歯根周囲の顎骨再生」とは、人工歯根を埋入する前処置としての骨領域増加と埋入後の骨領域増加を目的とする術式をいう。

本発明が対象とする骨の「疾患」としては、骨の変性、壊死、損傷などを伴う任意の疾患をいい、例えば、変形性関節症、骨軟骨損傷、難治性骨折、骨壊死、軟骨損傷、半月損傷、靭帯損傷、腱損傷、軟骨変性、半月変性、椎間板変性、靭帯変性または腱変性、骨腫瘍、先天性骨系統疾患など、組織に傷害がある任意の疾患であり得る。

本発明が対象とする骨の「障害」としては、骨の変性、壊死、損傷などを伴う任意の障害をいい、例えば、脳手術のための開頭など組織に傷害がある任意の障害であり得る。

本発明が対象とする骨の「状態」としては、骨の変性、壊死、損傷などを伴う任意の状態をいい、例えば、歯槽堤萎縮など、組織に傷害がある任意の状態であり得る。

本明細書において「予防」（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないようにするか、そのような状態を低減した状態で生じさせるかまたはその状態が起こることを遅延させるように処置することをいう。

本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。たとえば、骨については、骨形成の兆候として島状の骨片が確認することによって、治療状態を確認することができる。本明細書では「根治的治療」とは、病的過程の根源または原因の根絶を伴う治療をいう。従って、根治的治療がなされる場合は、原則として、その疾患の再発はなくなる。また、本明細書では「自然的治療」または「自然的治癒」とは、骨が天然に存在する状態に回復することを言う。そのような自然的治癒は、顕微鏡像から外側を覆う骨にはハバース系の確認、骨細胞の有無、骨表面に付着する細胞種類と数、骨組織内の血管走行によって異常骨形成でないことが確認されることを指標に判定することができる。

連続的な骨形成が見られることも顕著な特徴のひとつである。大腿骨などの骨の発生・成長は軟骨内骨化で行われることから、その再生状況を観察することによって、正常に近い修復像であることが確認される。また、皮質骨様部位のハバース系確認を行うことによって、大腿骨の皮質骨（殻）に相当する部位で修復中にハバース系が確認されることから
正常に近い修復が行われていることを確認することができる。

本明細書において「予後」とは、予後の処置ともいい、ある疾患または障害について、治療後の状態を診断または処置することをいう。

本発明が医薬として使用される場合、本発明の医薬は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。

そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム（ベータＴＣＰとも称される。）、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物およびポリ乳酸−ポリエチレングリコール（ＰＬＡ−ＰＥＧとも称される。）が挙げられるがそれらに限定されない。本発明は、コラーゲンスポンジなどを使用する場合は、医療器具の形態になることがある。

本明細書において使用される場合、好ましいキャリアとしては、コラーゲンスポンジ、特に、Ｉｎｔｅｇｒａから入手可能なＨｅｌｉｓｔａｔ、高研株式会社から入手可能なハニカムまたはインテグラン、デイボールから入手可能なアビテン（シート・粉体）を挙げることができるがそれに限定されない。コラーゲンスポンジは生体親和性が良い半面添加物質の局所維持に劣り、投与量が正確でないが使用には不適切ではない。すなわち、十分な骨形成が可能であることが判明した。

本明細書において、骨治療器具として適切なキャリアとしては、たとえば、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物およびポリ乳酸−ポリエチレングリコールが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において、「コラーゲンスポンジ」とは、コラーゲン分子からなるコラーゲン線維を多孔状に加工したものをいう。

本明細書において、コラーゲンゲルとは、コラーゲン線維をゲル状に加工したものをいう。

本明細書において、コラーゲン硬化物とは、コラーゲンを硬化させたものをいう。

本明細書において、アテロコラーゲンとは、コラーゲン分子からテロペプチドを除いたもので、コラーゲンと比べ抗原性を著しく低下させたものをいう。

本明細書において、ハイドロキシアパタイトとは、Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂で表されるリン酸カルシウムセラミックスで、生体内に存在するもの、もしくは人工的に合成・焼結され、多孔体等に加工されたものをいう。

本明細書において、β−リン酸三カルシウム（ベータＴＣＰとも称される。）とは、β-Ca₃(PO₄)₂で表されるリン酸カルシウムセラミックスで、多孔体等に加工されたものをいう。

本明細書において、オクタカルシウムホスフェイトとは、Ca₈H₂(PO₄)₆5H₂Oで表される無機物質で構成されるものをいう。

本明細書において、ヒアルロン酸とは、グリコサミノグリカンとよばれる硫酸化多糖類の一つで、軟骨や関節液等、細胞外マトリックスとして広く生体内に分布するものをいう。

本明細書において、コンドロイチン硫酸とは、硫酸化多糖類の一つで軟骨の細胞外マトリックス等に含まれるものをいう。

本明細書において、チタンメッシュとは、軽量で非磁性、比強度、耐食性、生体適合性に優れたチタンおよびチタン合金を網状に加工したものをいう。

本明細書において、タンパク添加性チタン合金とは、当該分野において通常使用されるのと同じ意味で使用され、タンパク質が添加された任意のチタン合金をいう。

本明細書において、合成スキャホールドペプチドとは、当該分野において通常使用されるのと同じ意味で使用され、合成された足場（スキャフォールド）となる任意のペプチドをいう。

本明細書において、キチンとは、2-アセトアミド-2-デオキシ-β-D-グルコース（N-アセチルーβ-D-グルコサミン）が(1→4)重合した多糖をいう。

本明細書において、キチン化合物とは、ポリ-β1→4-N-アセチルグルコサミンで、キチンのN-脱アセチル化物等の化合物をいう。

本明細書において、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール（ＰＬＡ−ＰＥＧとも称される。）とは、ポリ乳酸とポリエチレングリコールの共重合体で生分解性のポリマーをいう。

本発明の処置方法において使用される医薬（キャリア組織、併用される医薬化合物など）の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、組織の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。

本明細書中、「投与する」とは、本発明において提供される人工組織、三次元構造体などまたはそれを含む医薬を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて投与することを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、キャリアなどが直接手術によって提供され、他の薬剤は静脈注射によって与えられる場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。

本明細書において「処置を必要とする部位」とは、骨の処置が必要な任意の場所をいう。その場所直接の部位またはその近傍などの処置の目的を達成することができる限り、どのような部位であってもよい。処置を必要とする部位は、骨組織すべてであり得る。好ましくは、たとえば、頭頂骨、側頭骨、蝶形骨、上顎骨、下顎骨、上腕骨、りょう骨、尺骨、手骨、鎖骨、胸骨、肋骨、寛骨、仙骨、尾骨、髄（例えば、脊柱）、大腿骨、膝蓋骨、腓骨、脛骨、足骨が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、骨組織は、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、トリ、ウザギ、ラット、マウスの骨組織であり得る。なぜなら、骨組織は軟骨内骨化と膜性骨化に大別され２種の骨化形式の組み合わせにより骨組織は形成されている。本発明者らは軟骨内骨化部位（大腿骨）と膜性骨化部位（頭蓋骨）の双方において、既知骨修復タンパクとして知られるＢＭＰ−２と同等もしくはそれを上回る骨形成能力を検証した。よって、骨組織すべてにおいてその性能を発揮する。

本明細書において「補強」とは、意図される生体の部分の機能を改善させることをいう。

本発明において使用されるポリペプチド、核酸、医薬ならびにそのようなポリペプチドまたは核酸によって調製された組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。本発明の組成物および医薬は、全身投与されるとき、発熱物質を含ない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払うことを条件として、当業者の技術範囲内である。

本発明の製剤の処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、投与すべき量を決定することができる。

本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、抗体、標識など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、抗体の使い方などを記載した指示書などが含まれる。

本明細書において「指示書」は、試薬の取り扱い、使用方法、調合方法、作成方法、収縮方法など、本発明の医薬などを投与する方法または処置・診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、ＰＤＦ、電子メール）のような形態でも提供され得る。

本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。

本明細書において「生体内」または「インビボ」（ｉｎ ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする物質が配置されるべき位置をいう。

本明細書において「インビトロ」（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。

本明細書において「エキソビボ」（ｅｘ ｖｉｖｏ）とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子または因子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をエキソビボという。

（遺伝子工学）
本発明において用いられる各配列番号に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。

本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。

ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を指向し得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。

従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、哺乳動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

本発明において用いられ得る原核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴ^ＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ、ｐＥＮＴＲ^ＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。原核生物細胞は、遺伝子の増幅、改変などに用いることができる。

本明細書において用いられ得る真核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、
ｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＡｃＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＤｓＲＥＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴａｒｇｅｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。
本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。

本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。

本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。

プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが好ましい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。

本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技術により、宿主細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、宿主細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、宿主細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、宿主細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリアなど）に含まれるＤＮＡを含む。

大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。

昆虫細胞を宿主細胞をとして使用する場合、例えば、ＯｐｌＥ１プロモーター、ＯｐｌＥ２プロモーター、ＭＴプロモーター、Ａｃ５プロモーター、ｉｅ１プロモーター等を挙げることができる。人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。

本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。

本明細書において細胞内への「導入」とは、目的の核酸を細胞内に配置することであり、この配置によって、目的の核酸によってコードされるタンパク質の発現が実現する。

本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。

また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。

本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。

本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１が例示される。

本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法などが挙げられる。

本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ｄｅｃ；３２ Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。

本明細書において使用される場合、用語「タグ配列」とは、特定の物質を結合するための結合パートナーの役割を果たす物質（例えば、金属イオン−ヒスチジン、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンのような関係を有する）をいう。よって、例えば、タグ配列が結合した特定の物質は、タグ配列の結合パートナーを結合させた基材を接触させることで、この特定の物質を選別することができる。代表的なタグ配列としては、ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡ、Ａｖｉタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。本発明では、タグ配列を標識として使用するほか、精製の向上にも使用することができた。

本明細書において、「シグナル配列」とは、シグナルペプチド、リーダー配列、リーダーペプチドともいい、細胞の外に分泌されるタンパク質や細胞の膜に存在するタンパク質は，まず前駆体タンパク質(プレタンパク質)として合成され，プロテアーゼによる切断(プロセシング)を受けて成熟タンパク質となる．これらの前駆体タンパク質はN末端部位に疎水性アミノ酸に富む15〜30残基の配列を共通にもち、この配列(ペプチド)のことをさす。本発明で用いられるシグナル配列としては、たとえば、ＮＥＬＬ１内因性のものがあり、このような内因性のものを使用して、発現系で大量の生産が可能となったことは、通常考えられないことであり注目に値する。たとえば、Ｈｕｍａｎ ＮＥＬＬ１のオリジナルシグナルペプチドはＭＰＭＤＬＩＬＶＶＷＦＣＶＣＴＡＲＴＶＶＧ（配列番号１０）（内因性というべきである。配列番号２の１〜１６に相当する。）であり、Ｈｏｎｅｙ Ｂｅｅ ＭｅｌｌｉｔｉｎのシグナルペプチドはＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号１１）（外因性というべきである。）である。内因性シグナル配列としては、他に、配列番号４の残基１〜２１（マウス）、配列番号６の残基１〜２１（ラット）などを挙げることができる。当業者は、たとえば、配列番号１３のようにシグナル配列が明示されていない場合でも、容易に同定し使用することができることが理解される。

本明細書において「インフレーム（ｉｎ ｆｒａｍｅ）」とは、コドンの読み枠が連結された配列間で一致していることをいう。

本明細書において「発現」とは、遺伝子にコードされた核酸（代表的にはＤＮＡ）が変化して、ＲＮＡないしコードされるタンパク質または修飾されたタンパク質となることをいう。

本明細書において「ＮＥＬＬ１を発現する条件」とは、ＮＥＬＬ１を発現させる任意の条件をいい、たとえば、以下のような培地、温度、ｐＨ，増殖因子等の条件を挙げることができる。

細胞ならびに培地
昆虫細胞は、ＨｉＦｉｖｅ （インビトロジェン社）を用い、培地はＥｘｐｒｅｓｓＦｉｖｅＳＦＭ（インビトロジェン社 ＃１０４８６−０２５ １Ｌ）に２００ｍＭ Ｌ−グルタミン ９０ｍＬおよび適切な抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を添加したものを使用した。これ以外の添加物なし。

形質導入
形質導入はエレクトロポレーション法により行い、ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いた。幅４ｍｍスリットのキュベット（バイオラッド社）にＤＮＡ １０ｍｇおよび細胞（１ｘ１０^６個）を加え軽く懸濁させ、１０分間氷上冷却の後、１２５μＦ、３００Ｖのパルスを与える。その後、１０分間の氷上冷却の後、培地へ戻し培養を行う。

発現細胞選択（ゼオシン耐性）
本ベクターは、ゼオシン（インビトロジェン社）に耐性をもつため、ゼオシンを最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるように培地に添加し３日間培養を２回繰り返した。また、本ベクターはＧＦＰを共発現するので落射式蛍光顕微鏡下（ＣＫＸ４１オリンパス社）にてＧＦＰ発現を確認することにより形質転換された細胞を確認する。

小量培養
ゼオシン耐性を示した細胞を発現株とし、１０ｃｍディッシュ（ＢＤファルコン）に２０％コンフルエンシーで蒔いた後、４日培養し培養上清を高速遠心分離（５０００ｒｐｍ ２０分）により回収する。尚、培養は例示的に２７度で行う。

タンパク質精製
例示として、精製には、ニッケルセファロースＦＦ６担体（アマシャムバイオサイエンス社）を用いた。エコノカラム（バイオラッド社）に担体１ｍＬを充填し、平衡化バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６）で平衡化を行った後、遠心分離処理した培養上清を直接カラムに流し、自然落下によるアフィニティー結合を行う。その後、洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６）で洗浄した後、溶出バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ， ０．５ｍＭ ＰＭＳＦ， ｐＨ７．６）にて溶出を行う。ニッケルセファロースは、セファロース表面にＮｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉ ａｃｉｄ（ＮＴＡ）が固層されており、ＮＴＡとニッケルの結合を利用して、ニッケルイオンを保持することができる。また、ニッケルとヒスチジンとの結合性を利用してＨｉｓタグを融合しているタンパク質のみを精製してくることができる。溶出は、ヒスチジンと構造が類似している安価なイミダゾール（Ｆｉｇ２）を使用することで、補足されている目的タンパク質中のヒスチジンと置換し、目的のタンパク質を分離する。

本明細書において「配置」とは、細胞の場合は、細胞をある条件下に置くことをいい、
培養を含む。

本明細書において「回収」とは、発現されたタンパク質を取り出すかまたは集めることをいう。

本明細書において「Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの細胞」とは、イラクサギンウワバ の細胞である。この細胞の卵母細胞は発現効率がよいことで注目される。具体的には、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 由来の ＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞、たとえば、ＨｉｇｈＦｉｖｅ^ＴＭが代表的に使用されている。

（精製技術）
本明細書において「Ｎｉレジンアフィニティカラム」とは、ニッケルが樹脂に結合した任意のアフィニティーカラムをいう。このようなカラムとしては、たとえば、ＧＥ ヘルスケアバイオサイエンス、キアゲン、和光純薬、タカラバイオ（ノバジェン社製品）、タカラバイオ（クロンテック）、プロメガ、バイオラッド、シグマアルドリッチから入手可能である。このようなカラムとしては、たとえば、グルタチオンアフィニティカラム、金属キレートアフィニティカラム、抗体結合型アフィニティカラム、糖鎖認識アフィニティカラム、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ提示型アフィニティカラム、カルモヂュリン提示型アフィニティカラム、リジン提示型アフィニティカラム、ヘパリン結合型アフィニティカラム、ストレプトアビジン結合型アフィニティカラムなどがあげられる。

本明細書において、「Ｈｉｓタグ」（ヒスチジンタグ）とは、ヒスチジンが数個（たとえば、５個〜９個）結合したペプチド配列を言う。ニッケルアフィニティーカラムに特異的に結合し、アフィニティー精製することができる。

（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。

本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。

本明細書中で使用される用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。

本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「減少」または「抑制」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。

本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「増加」または「活性化」あるいはその類義語は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。

１実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質または本発明のポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはこれらの活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。

本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。

本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。

本明細書において「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。

本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」（たとえば、活性化する、活性化しない、阻害する、など）とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。
本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。

本明細書において「因子」または「薬剤」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。

分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３７：１２３３。

化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ、上記）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ上記）において示され得る。

本発明は、他の実施形態において、本発明の活性成分（例えば、ポリペプチドまたは核酸）と同等に有効な因子をスクリーニングするための道具として、コンピュータによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して得られる化合物もまた、本発明に包含される。ここで、コンピュータ技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質鋳型、ファーマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化することに対する方法は、ＣＡＴＡＬＹＳＴ^ＴＭ ファーマコフォア法（Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：４７７〜４８９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８８：２１〜２９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：４２９〜４３８，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９１：４２４〜４３３，１９９９）および比較分子電界分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｅｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣｏＭＦＡ）（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２４：１〜６，１９９６）などを使用して示されている。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、ＣＡＴＡＬＹＳＴ^ＴＭバージョン４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を使用して行われ得る。

活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンピュータモデリング技術のいずれかを使用してで行うことができる。視覚による検査および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，１９９２）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１９９２）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：７６５−７８４，１９８４）、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７〜２１７，１９８３）などのようなプログラムを使用して行うことができる。これに加え、ＣＨＡＲＭＭ、ＡＭＢＥＲなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊化されたコンピュータモデリングは、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：８４９〜８５７，１９８５）、ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：２９〜３４，１９９１）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓ ｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１９５〜２０２，１９９０）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１：２６９〜２８８，（１９８２））などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６：６１〜７８，１９９２）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ ａｎｄ Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：８９８５，１９９１）、ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物を設計することができる。

本発明のスクリーニング方法によって得られた物質を含む組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与経路としては経口投与、非経口投与、患部への直接投与などが挙げられる。

（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ
ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

（発明を実施するための最良の形態）
以下に本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。

（骨治療剤・骨治療器具）
１つの局面において、本発明は、炎症を起こさずに骨を処置するための、ＮＥＬＬ１を含む骨治療剤を提供する。

別の局面において、本発明は、ＮＥＬＬ１と薬学的に許容可能なキャリアとを含む、炎症を起こさずに骨を処置するための骨治療器具を提供する。

本発明の開示がある前のこれまでの技術（たとえば、特許文献１〜４あるいは、ＢＭＰ関連の技術（Ｙａｓｋｏ，Ａ，Ｗ：Ｔｈｅ ｈｅａｌｉｎｇ ｏｆ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｈＢＭＰ−２． Ｊ．Ｂｏｎｅ ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ．７４−Ａ：６５９−６７１（１９９２）；Ｋｅｎｌｅｙ，Ｒ．：Ｏｓｓｅｏｕｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｃａｌｖａｒｉｕｍ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｒｈＢＭＰ−２．Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓ．２８：１１３９−１１４７（１９９４）；ＥＬＩＺＡＢＥＴＨ Ａ．ＷＡＮＧら．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｂｏｎｅ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．８５，ｐｐ．９４８４−９４８８（１９８８）；およびＲＡＮＩ Ｓ．ＳＥＬＬＥＲＳら．Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ Ａｒｔｉｃｕｌａｒ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ Ｄｅｆｅｃｔｓ Ｏｎｅ Ｙｅａｒ Ａｆｔｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｂｏｎｅ．Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−２（ｒｈＢＭＰ−２）Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｏｌｕｍｅ．ＶＯＬＵＭＥ ８２−Ａ，ＮＯ．２（２０００））では、炎症を起こさない治療については、記載しておらず、このように炎症を起こさない治療を達成したことは注目に値するというべきである。特に、ＢＭＰを用いた場合、骨形成量の薬剤を与えると、炎症を回避することができなかった。したがって、このような炎症を回避することを本発明は、初めて達成したといえる。以上から、本発明を使用することによって、１．ＮＥＬＬ１使用により、これまで修復不能な大規模骨欠損を修復できる；２．ＮＥＬＬ１使用で骨修復速度は２倍以上になる；３．ＣＴ像から、修復はこれまで広範に使われるＢＭＰと同様に既存骨を覆う形で行われた；４．顕微鏡像から軟骨内骨化を伴う、修復像がみられ、異常骨形成像ではないことが確認された；５．顕微鏡像から外側を覆う骨にはハバース系が確認され異常骨形成でないことが確認された。

なお、成体頭蓋骨欠損モデルでのＮＥＬＬ１による骨再生効果の検討をしたところ、軟骨形成を伴わない（膜内骨化）モデルであっても、この部位の成長・発生過程を再現し、膜内骨化（皮質骨ができる）にて修復が行われ、他、１０μｇ術後２週や、５μｇ投与２、４週でも、軟骨を伴わない同様の骨化が観察された。したがって、このような効果は、顕著であるというべきである。また、術中の傷に対して炎症を誘発しないことが、線維化した治癒像を見て確認することができる。

以上のように、１．ＮＥＬＬ１使用で骨修復は２倍以上またはＢＭＰと同等の速度で可能である；２．軟骨内骨化と膜内骨化部位の両方で正常な成長・発生機序を経た修復ができる；３．術中の傷に対し炎症を誘発せず、損傷修復にのみ、その効果を促進することが示唆されることが判明した。

そして、本来生体が持つ治癒能力を阻害せず、特に骨に対して、高効率で、安全に治癒促進をおこなうことができる。コラーゲンスポンジ浸透で投与しても炎症や異常な治癒をしないことから、広範囲なキャリア（ゲル、シートなど）、広範囲な生体部位、広範囲な疾患に適用可能であることがわかる。

本発明は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とする状態を処置することができる。軟骨内骨化と膜性骨化とは、まったくメカニズムが異なる。本発明において、ＮＥＬＬ−１は頭蓋骨だけでなく大腿骨の欠損をも修復することができることが見出された。ＮＥＬＬ−１により頭蓋骨の骨欠損を修復できることは既に報告されている。一般的な専門家は、頭蓋骨が修復可能である結果から大腿骨修復の結果について予想できない。その理由は以下のとおりである。大腿骨と頭蓋骨の２種骨形成における意義は、骨化における基本的なメカニズムの理解にある。大腿骨は中胚葉由来で軟骨内骨化により軟骨板（骨端軟骨）誘導される骨である。頭蓋骨は外肺葉から新しく中胚葉に陥入した神経堤由来であり膜内骨化という線維性組織から骨化が行われる。まとめると、大腿骨と頭蓋骨は由来の異なる細胞から誘導され、骨化様式も頭蓋骨が線維性骨化であり本来軟骨を誘導しないとされている。大腿骨は軟骨内骨化であり、骨端軟骨により成長をおこなう。これまでの技術では、頭蓋骨のみの知見からなり、本発明者らは、大腿骨（軟骨内骨化部位）で、ＮＥＬＬ１骨誘導を行うことを達成したという点で顕著である。軟骨内骨化と線維性骨化の一番の違いは軟骨誘導の有無であり、頭蓋骨修復では軟骨誘導が見られず、大腿骨修復における骨形成はBMPと比較して大きな軟骨板（骨端軟骨）を持つことを見出し、本発明を完成するに至ったのである。

本発明において、ＮＥＬＬ１遺伝子過剰発現胎児では、骨形成が見られず、全身軟骨となったことがＮＥＬＬ１が軟骨誘導能をもつことを裏付けることにもなる。

ＮＥＬＬ−１の遺伝子とタンパク質の効果について、ＵＣＬＡの出願と本件のデータとを比較し、タンパク質を用いる本発明の方法は顕著に優位である。そして、遺伝子における情報からは予想外に少ない程度にタンパク質量を減らすことが可能であることが見出された。

本発明の例示的実施形態において、頭蓋骨欠損モデルにおいて５μｇ、１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ投与の術後４週ではもっとも多く硬組織形成を行ったのが５μ投与群であることが見出された（欠損体積に対する形成骨体積で評価した。）
通常は、このサイズ（直径１０ｍｍ）の欠損はＢＭＰで２０〜５０μｇの投与が必要であるとされていた。よって、生体内の骨誘導で少なくとも１／４投与量で結果が得られるといえる。用量増加によって、骨形成量が減少する理由は不明であるが、このような現象を見出したこと自体予想外であるといえる。また、より少ない量でも効果があるといえ、たとえば、１μｇ（１／２０ＢＭＰ）でも十分な治療効果が期待される。

１つの実施形態において、培養細胞上でＢＭＰと比較したＡＬＰ活性は、ＮＥＬＬ３７ｎｇがＢＭＰ１００ｎｇと同等の活性誘導、ＮＥＬＬ７４ｎｇではＢＭＰ１００ｎｇの約２０％増の活性誘導となることから、それを裏付ける結果と言える。本発明では、ＢＭＰ２とＮＥＬＬ１の活性の培養細胞上での比較からはモル濃度比で約１０倍ほどＮＥＬＬ１の方が優れていると考えられる。

本発明を実施するにおいて、使用される代表的な動物実験プロトコルは以下のとおりである。

（大腿骨モデル）
１ ウィスターラット(体重約３００ｇ）使用。ネンブタール腹腔内投与による全身麻酔施行する。
２ 大腿外側に皮切を加える。筋肉間を鈍的に剥離して、大腿骨面を全周にわたって露出させる。
３ チタン製マイクロプレート（５穴）を大腿骨に適合させる。中央の１穴を残し、４本のスクリューを使用して、プレートを固定する。
４ 中央の１穴に相当する部分の大腿骨をバーを用いて切除。大腿骨の連続性を5mmの範囲で完全に失わせる（区域切除）。
５ 切除によって生じた骨欠損部に、ＮＥＬＬ１を（適量）滴下したコラーゲンスポンジを挿入する。
６ 筋肉、皮膚の順に縫合、閉創する。

（頭蓋骨欠損モデル）
１ ウィスターラット(体重約３００ｇ）使用。ネンブタール腹腔内投与による全身麻酔施行。
２ 後頚部に皮切を加え、骨膜を保存して、頭蓋骨を全周にわたって露出させる。
３ 直径１０ｍｍのトレフィンバーを用いて、頭蓋骨中央に円形の骨欠損を作成する。
４ 骨欠損部に、適量のＮＥＬＬ１を滴下した、コラーゲンスポンジを挿入する。
５ 骨膜、皮膚の順に縫合、閉創する。

本発明においてＮＥＬＬ１タンパク質を用いることが、遺伝子を用いることに比べて顕著であることが判明した。すなわち、アデノウイルスを用いた骨再生ｉｎ ｖｉｖｏ実験のデータが記載されている論文：Ｓｐｉｎｅ Ｊ．２００７ Ｊａｎ−Ｆｅｂ；７（１）：５０−６０．Ｅｐｕｂ ２００６ Ｎｏｖ １７．において、ｐ５９のＤｉｓｃｕｓｓｉｏｎの項目（Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ｎｅｌｌ−１ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ）に、ＮＥＬＬ１タンパク質を用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験においても、１００％のＦｕｓｉｏｎが確認されたと示されている。上記論文において、アデノウイルスを用いたＮＥＬＬ１遺伝子導入とＮＥＬＬ１タンパク質そのもののインプラント効果とには大差は無く、この事柄がＢＭＰの効果と異なることを示していることから、同じレベルで骨形成がなされたと考えられる。しかし、その効果の評価ができない。むしろ、本発明において、ＢＭＰ換算で１／２０量でも効果が奏されることが判明したという点は、顕著であるといえる。

そして、従来技術ではラット由来ＮＥＬＬ１タンパク質の効果がその欠損箇所（作用部位）は頭蓋骨のみで確認されているのみであり、ヒトのものは確認されておらず、頭蓋骨以外での効果も不明であった。アデノウイルスの危険性を考えると、同じまたはそれ以上治療効果であれば、タンパク質を用いた治療のほうが優れているといえる。

遺伝子を用いる危険性としては、たとえば、１）目的細胞以外への感染の危険
→細胞や器官の機能を損う可能性や、癌化を引き起こす可能性がある；２）ベクターウィルスが病原性を示す可能性がある（不活化処理が不十分である可能性はぬぐいきれない）；３）治療用遺伝子が環境へ流出する可能性（アデノウイルスは感染性が高く、空気感染することから、極めて厳重な管理が必要となる）；４）倫理的・社会的問題が残っている（遺伝子を操作することが、生命の有様や進化を人間自らが操作することが許されるのか？や、宗教的な関知からすると、創造主の神聖な領域を冒すことととらえられる）などを挙げることができる。

本発明は、大腿骨欠損モデルなどの通常の骨格系の骨修復においてその効果を奏する。実施例において記載されているように、ＮＥＬＬ１タンパク質は低濃度で骨形成を誘導する。骨形成に必要なＢＭＰ量は、骨欠損あたり１０〜５０μｇであることが明らかになった。（Ｔｈｅ ｈｅａｌｉｎｇ ｏｆ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔｓ， ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｒｈＢＭＰ−２）． Ａ ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ， ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ，ａｎｄ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｒａｔｓ ＡＷ Ｙａｓｋｏ， ＪＭ Ｌａｎｅ， ＥＪ Ｆｅｌｌｉｎｇｅｒ， Ｖ Ｒｏｓｅｎ， ＪＭ Ｗｏｚｎｅｙ ａｎｄ ＥＡ Ｗａｎｇ Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ． １９９２；７４：６５９−６７０；Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ． １９９４ Ｏｃｔ；２８（１０）：１１３９−４７．Ｏｓｓｅｏｕｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｃａｌｖａｒｉｕｍ ｕｓｉｎｇ ｎｏｖｅｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−２ （ｒｈＢＭＰ−２）．Ｋｅｎｌｅｙ Ｒ， Ｍａｒｄｅｎ Ｌ， Ｔｕｒｅｋ Ｔ， Ｊｉｎ Ｌ， Ｒｏｎ Ｅ， Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ＪＯ．Ａｍｙｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ９２１２６．）。既知の骨形成因子ＢＭＰ２においてもアデノウィルス、タンパク質共に骨形成を行うことが知られているが、低い用量のＮＥＬＬ１タンパク質に骨形成が見出されたことは注目に値する。また、アデノウィルスベクターを用いてもＢＭＰ２は骨修復する（３．３ｘ１０^９ｐｆｕ）。

本発明では、生体内でのＮＥＬＬ１タンパク質の拡散は考慮する必要が無いことも注目すべきである。ＮＥＬＬタンパクは細胞内外で働く時そのレセプタを介して細胞が働く方向性を決定するものであり、速やかに分解される。数週間にわたる骨治癒の開始トリガーとなることは間違いないが、一般的に投与タンパクは数時間後に消滅する。ただし、ＮＥＬＬタンパクは本来生体内で産生されるものであることから、Ａｎｔｉ−ＮＥＬＬ１抗体やＮＥＬＬ１を励起する遺伝子群が周囲に追加発現することが予想される。

したがって、本発明において、NELL1タンパク質がごく低濃度で、しかも短期間に骨修復可能であることをみいだしたことは顕著であるといえる。他の骨形成因子は、結局タンパク質レベルで生体内での濃度の維持が難しいことが知られていることから、本発明のＮＥＬＬ１を用いたことによる生体内濃度の維持もまた顕著な効果であるといえる。

本発明のひとつの実施形態では、治療されるべき骨は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とする疾患、障害または状態を有しうる。本発明は、初めて軟骨内骨化を誘導する薬剤を提供することから、治癒するのに軟骨内骨化が必要とされる疾患、障害または状態をはじめて治療することができるという点で顕著である。

そのような骨の疾患、障害または状態としては、たとえば、病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術、歯槽骨再生、人工歯根周囲の顎骨再生等を挙げることができるがそれらに限定されない。

本発明が対象とする骨の具体的部位は、骨組織すべてであり得る。好ましくは、たとえば、頭頂骨、側頭骨、蝶形骨、上顎骨、下顎骨、上腕骨、りょう骨、尺骨、手骨、鎖骨、胸骨、肋骨、寛骨、仙骨、尾骨、髄（例えば、脊柱）、大腿骨、膝蓋骨、腓骨、脛骨、足骨が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、骨組織は、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、トリ、ウザギ、ラット、マウスの骨組織であり得る。なぜなら、骨組織は軟骨内骨化と膜性骨化に大別され２種の骨化形式の組み合わせにより骨組織は形成されている。本発明者らは軟骨内骨化部位（大腿骨）と膜性骨化部位（頭蓋骨）の双方において、既知骨修復タンパクとして知られるＢＭＰ−２と同等もしくはそれを上回る骨形成能力を検証した。よって、骨組織すべてにおいてその性能を発揮する。

本発明において用いられるＮＥＬＬ１は任意のものであってもよく、たとえば、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列などの公知のアミノ酸配列またはその改変体を含むか、それらの配列からなるものであってもよい。

別の実施形態では、本発明において用いられるＮＥＬＬ１は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体と、Ｃ末端にタグ（例えば、配列番号９）とを含むポリペプチドであってもよい。このようなタグ配列が結合しても、薬効には遜色ないことが本明細書において示された。したがって、本発明は、タグ配列を除去する必要なしに医薬品を製造するという技術をも提供する。

好ましい実施形態では、本発明において用いられるＮＥＬＬ１は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０と、Ｃ末端にタグとを含むポリペプチドである。本発明のこの実施形態では、ヒト型のＮＥＬＬ１が非常に効率よく薬効を示すことが示された。

本発明の骨治療器具において、キャリアは、どのようなものを使用してもよく、たとえば、コラーゲンスポンジ、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物、ポリ乳酸−ポリエチレングリコールなどを使用することができるが、これらに限定されない。なぜなら、これらのキャリアは、酵素的メカニズムまたは加水分解メカニズムで分解可能であり、生体内での貪食系細胞や異物排除機構によっても排除されるものであれば使用することができるからである。

好ましい実施形態では、コラーゲンスポンジが使用され得る。なぜなら、コラーゲンスポンジは、ＮＥＬＬ１の投与は微量なタンパク質を大規模骨欠損部に投与するため、欠損空間維持による新生骨の付形、投与タンパクの均一な分布、患部湿潤な環境を保つこと容易にするからである。

別の実施形態において、本発明は、炎症を起こさずに骨を処置するための、ＮＥＬＬ１を含む骨治療処方物であって、該ＮＥＬＬ１は、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり、０．００１μｇ〜３００μｇ（１．６μｇ〜５０ｇ／ｋｇ体重）以下で投与される、骨治療処方物を提供する。本発明では、従来知られていたよりも驚くほど少ない量で、炎症を起こすことなく骨治療を実現することができた。したがって、このような低用量医薬が提供されたことは注目に値するといえる。好ましくは、ＮＥＬＬ１は、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり、タンパク質量で、好ましくは、０．０１μｇ〜１００μｇ（０．３〜１６ｇ／ｋｇ体重）、である。よって、より好ましくは、０．０１μｇ〜０．０２μｇ、最も好ましくは、０．０１μｇ（１６μｇ／ｋｇ体重）以下で投与される。なぜなら、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり投与タンパク質量の０．０１μｇ〜０．０２μｇの範囲と０．０２μｇ〜０．１μｇの範囲において骨形成の量依存性が変化するからである。

（骨処置・手術・治療法）
別の局面において、炎症を起こさずに骨を処置するための方法であって、骨処置を必要とする被験体にＮＥＬＬ１を投与する工程を包含する、方法。本発明の治療法の開示がある前のBMPなどを用いたこれまでの技術では、炎症を起こさない治療については、記載しておらず、このように炎症を起こさない治療を達成したことは注目に値するというべきである。特に、ＢＭＰを用いた場合、骨形成量の薬剤を与えると、炎症を回避することができなかった。したがって、このような炎症を回避することを本発明は、初めて達成したといえる。

本発明の治療法において、治療剤または治療器具の投与または移植は、どのような形態であってもよく、たとえば、処置を必要とする部位にＮＥＬＬ１を含む骨治療剤を移植することによって達成されてもよい。好ましくは、処置を必要とする部位にＮＥＬＬ１を含む骨治療剤を移植することによって達成される。理論に束縛されることを望まないが、本発明の効果をより効率よく達成するには、NELL１タンパク質が、治療されるべき部位に維持されることが必要であるからである。

１つの実施形態では、このような処置を必要とする部位は、骨組織すべてであり得る。好ましくは、たとえば、頭頂骨、側頭骨、蝶形骨、上顎骨、下顎骨、上腕骨、りょう骨、尺骨、手骨、鎖骨、胸骨、肋骨、寛骨、仙骨、尾骨、髄（例えば、脊柱）、大腿骨、膝蓋骨、腓骨、脛骨、足骨が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、骨組織は、ヒト、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌ、トリ、ウザギ、ラット、マウスの骨組織であり得る。なぜなら、骨組織は軟骨内骨化と膜性骨化に大別され２種の骨化形式の組み合わせにより骨組織は形成されている。本発明者らは軟骨内骨化部位（大腿骨）と膜性骨化部位（頭蓋骨）の双方において、既知骨修復タンパクとして知られるＢＭＰ−２と同等もしくはそれを上回る骨形成能力を検証した。よって、骨組織すべてにおいてその性能を発揮する。

好ましくは、ＮＥＬＬ１は、薬学的に許容可能なキャリアとともに投与される。このようなキャリアを用いることによって、ＮＥＬＬ１タンパク質が治療されるべき部位に保持され、治療効果が促進されるからである。ここで使用されるキャリアは何でもよいが、たとえば、コラーゲンスポンジが挙げられる。好ましい性質としては、生物学的に適合性であり、別の好ましい性質としては、生物学的に分解性であることが有利でありうる。術後にキャリアを取り出す必要を回避することができるからであるが、それに限定されない。

使用されうるキャリアとしては、コラーゲンスポンジのほか、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物およびポリ乳酸−ポリエチレングリコールであり得る。

１つの実施形態において、本発明において使用されるＮＥＬＬ１は、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり、０．００１μｇ〜３００μｇ（１．６μｇ〜５０ｇ／ｋｇ体重）以下で投与される、骨治療処方物を提供する。本発明では、従来知られていたよりも驚くほど少ない量で、炎症を起こすことなく骨治療を実現することができた。したがって、このような低用量医薬が提供されたことは注目に値するといえる。好ましくは、ＮＥＬＬ１は、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり、タンパク質量で、好ましくは、０．０１μｇ〜１００μｇ（０．３〜１６ｇ／ｋｇ体重）、である。よって、より好ましくは、０．０１μｇ〜０．０２μｇ、最も好ましくは、０．０１μｇ（１６μｇ／ｋｇ体重）以下で投与される。なぜなら、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり投与タンパク質量の０．０１μｇ〜０．０２μｇの範囲と０．０２μｇ〜０．１μｇの範囲において骨形成の量依存性が変化するからである。

１つの実施形態では、本発明の治療法は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とする状態（たとえば、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とする疾患、障害または状態）を処置することができる。軟骨内骨化と膜性骨化とは、まったくメカニズムが異なる。本発明において、ＮＥＬＬ−１は頭蓋骨だけでなく大腿骨の欠損をも修復することができることが見出された。ＮＥＬＬ−１により頭蓋骨の骨欠損を修復できることは既に報告されている。一般的な専門家は、頭蓋骨が修復可能である結果から大腿骨修復の結果について予想できない。大腿骨と頭蓋骨は由来の異なる細胞から誘導され、骨化様式も頭蓋骨が線維性骨化であり本来軟骨を誘導しないとされている。大腿骨は軟骨内骨化であり、骨端軟骨により成長をおこなう。これまでの技術では、頭蓋骨のみの知見からなり、本発明者らは、大腿骨（軟骨内骨化部位）で、ＮＥＬＬ１骨誘導を行うことを達成したという点で顕著である。軟骨内骨化と線維性骨化の一番の違いは軟骨誘導の有無であり、頭蓋骨修復では軟骨誘導が見られず、大腿骨修復における骨形成はＢＭＰと比較して大きな軟骨板（骨端軟骨）を持つことを見出されている。そして、このような効果は、治療法という観点では、従来知られていたよりも驚くほど少ない量で、炎症を起こすことなく骨治療を実現することができ、このような低用量医薬が提供されたことは注目に値するといえる。

本発明の治療法は、病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術、歯槽骨再生、人工歯根周囲の顎骨再生等に対するものでありうる。

本発明の治療法は、上記のほか、本明細書に記載される他の事項（たとえば、（骨治療剤・骨治療器具）に記載される事項）を特定の実施形態として使用することができることが理解される。

（ＮＥＬＬ１の精製・生産方法）
別の局面において、本発明は、ＮＥＬＬ１を生産する方法を提供する。この方法は、Ａ）ＮＥＬＬ１およびシグナル配列をコードする核酸をインフレームで作動可能に連結した核酸構築物を提供する工程；Ｂ）該核酸構築物を細胞に導入する工程；Ｃ）ＮＥＬＬ１を発現する条件下に、該細胞を配置する工程；およびＤ）発現された該ＮＥＬＬ１を回収する工程を包含する。

他の局面において、本発明は、ＮＥＬＬ１を精製する方法を提供する。この方法は、Ａ）ＮＥＬＬ１およびシグナル配列をコードする核酸をインフレームで作動可能に連結した核酸構築物を提供する工程；Ｂ）該核酸構築物を細胞に導入する工程；Ｃ）ＮＥＬＬ１を発現する条件下に、該細胞を配置する工程；Ｄ）発現された該ＮＥＬＬ１を回収する工程およびＥ）該ＮＥＬＬ１を精製する工程を包含する。必要に応じて、本発明の生産方法は、さらに、Ｅ）前記回収したＮＥＬＬ１を精製する工程を包含しうる。

別の局面において、本発明の精製方法は、上記Ａ）〜Ｄ）の方法に加えて、Ｅ）前記回収したＮＥＬＬ１を精製する工程を包含してもよい。

本発明の生産方法は、従来技術に比べて、大腸菌や他の宿主を用いた系と比較すると、ＮＥＬＬ−１を１０倍効率よく生産できるようになった。

本明細書の好ましい実施形態では、Ｈｕｍａｎ−ｎｅｌｌ１遺伝子をｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ発現ベクターに組み込み、ＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞を用いてＮＥＬＬ１−Ｖ５−Ｈｉｓタンパク質を発現させ、ＥｘｐｒｅｓｓＦｉｖｅＳＦＭ培地に分泌。培養上精はＮｉレジンカラムを用いてアフィニティー精製を行っている。 この方法によれば、本発明の方法によって、ＮｅＬＬ１タンパク質が予想外の純度で予想外の効率で生産することが可能となった。発現ホスト細胞においては、分泌発現が可能で、安定発現株を樹立できるものが望ましい。このような細胞として昆虫細胞（ＨｉｇｈＦｉｖｅ、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｍｉｍｉｃ Ｓｆ９など）が非常に望ましい。また、哺乳類細胞（ＣＨＯ，ＨＥＫ２９３など）も上記条件に含まれる。

本発明の生産方法、精製方法において、予想外に、オリジナルシグナルペプチドが顕著な発現効率を示すことが示された。これは、より強いとされているシグナルペプチドを使用している特許文献１〜４における記載からはまさに予想外の結果であるといえる。

１つの好ましい実施形態では、発現効率を上げるために、浮遊培養をしてもよい。

本発明では、シグナルペプチドを変える必要がない程、発現・精製可能である。特許文献２のｐ５９、Ｌｉｎｅ１６−１８において、Ｈｕｍａｎ ＮＥＬＬ１のオリジナルシグナルペプチドがタンパク質の分泌発現に効果的ではないと記載されている。したがって、本発明は、従来予想し得なかったほどの生産効率を示す点で顕著であるといえる。

本発明との関係でシグナルペプチドに関してＢＬＡＳＴサーチをしたところ、ＮＥＬＬ１タンパク質と同様のシグナルペプチドは存在しないと考えられる。したがって、ＮＥＬＬ１タンパク質に対応するシグナルペプチドを用いて精製が上昇することは驚くべきといえる。さらに、メリチンシグナルを用いた系ではＢＯＸ内に記載したとおりＡＤＡＰと余計なアミノ酸が4個、Ｎ末端側に追加されるが、これでも治療効果が挙げられたことは注目に値する。上記のことから、内在性シグナルペプチドが昆虫細胞を用いた発現系に優位であったということと、余計なペプチドの追加が無く、より生体内に存在するＮＥＬＬ１タンパク質に近いといえる。

本発明では、好ましい実施形態では、タグはモニタリングのみならず、アフィニティ精製のためにも使用している。そのような二重の役割を期待して使用する例はない。たとえば、特許文献２にはアフィニティ精製の可能性を示唆する請求は無い。そして、シグナルでは内在性であり、その意味で、天然に近いものが薬効を示し、大量生産が可能であるという意味で注目されるべきである。また本方法により大変純度の高い精製ＮＥＬＬ１が得られたということも注目されるべきである。ＬＣ−ＭＳ/ＭＳ同定解析の結果より、他のシグナルが検出できなかったことおよび電気泳動の結果から、同定物は目的としたＮＥＬＬ１であり、夾雑物は含まれていないことが確認された。

また、ＮＥＬＬ１タンパク質のＮ末端側が天然に近いことから、Ｃ末端側のタグを消去しても本発明のＮＥＬＬ１と同等の効果を達成することが可能と考えられる。Ｃ末端側のタグを消去する方法としては、例えば、Ｈｉｓタグ部分はプロテアーゼであるトロンビンやＦａｃｔｏｒＸａ、ＨＲＶ ３Ｃ プロテアーゼなどを用いることが可能である。

これらの性質を持ったＮＥＬＬ１タンパク質が生体内においてタンパク質そのものの効果による骨再生効果が現れたことはこれまでに知られておらず注目すべきである。また、タグが結合したままでも医薬品としての効果が出た点は効率という意味で注目に値する。

１つの実施形態では、本発明の生産方法・精製方法において用いられるＮＥＬＬ１をコードする核酸は、前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体をコードする。

別の実施形態では、本発明において用いられるＮＥＬＬ１をコードする核酸は、前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列を含むポリペプチドをコードしてもよい。

好ましい実施形態では、本発明において用いられるＮＥＬＬ１をコードする核酸は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０と、Ｃ末端にタグとを含むポリペプチドをコードする。

別の実施形態では、本発明において使用されるＮＥＬＬ１をコードする核酸は、配列番号１（ヒトＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の塩基１８３〜２５６４、配列番号３（マウスＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の塩基１０３〜２４７２、配列番号５（ラットＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の塩基１２２〜２４９１および配列番号１２（ツメガエルＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の成熟配列からなる群より選択される核酸を含む。ここで、上記配列番号において、配列番号１は、ヒトＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基１３５〜１８２、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１８３〜２５６４である。配列番号３は、マウスＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基４０〜１０２、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１０３〜２４７２である。配列番号５は、ラットＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基５９〜１２１、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１２２〜２４９１である。

別の実施形態では、本発明において用いられるＮＥＬＬ１をコードする核酸は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）である。配列番号１は、ヒトＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基１３５〜１８２、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１８３〜２５６４である。

本発明の生産方法・精製方法において用いられる細胞は、どんな細胞でもよいが、たとえば、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来の細胞（例えば、ＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＨｉｇｈＦｉｖｅ^ＴＭ細胞等）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の細胞（例えば、ｍｉｍｉｃ Ｓｆ９細胞）、チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）、ヒト胎児腎臓由来の細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より入手可能なＦＬｐ-ＩＮ/Ｔ-Ｒｅｘシステム）などを用いることができる。

したがって、本発明では、使用される細胞は、昆虫細胞であり得、好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの細胞であり得、より好ましくは、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞であり、たとえば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＨｉｇｈＦｉｖｅ^ＴＭ細胞である。

分泌安定発現株を樹立するために好ましい系としては、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なＦＬｐ-ＩＮ/Ｔ-Ｒｅｘシステムが使用され得る。

１つの実施形態では、本発明における精製工程は、大量に生産されたNELL1が精製される限りどのような精製工程を使用してもよい。好ましくは、Ｅ）工程は、Ｅ−ｉ）前記回収されたＮＥＬＬ１を、Ｎｉレジンアフィニティカラムにかける工程；およびＥ−ｉｉ）１００ｍＭ〜１．５Ｍのイミダゾールで溶出する工程を包含する。理論に束縛されることを望まないが、この特定の工程を用いた精製方法を適用することによって、従来よりも純度の高い精製が達成された。

好ましい実施形態では、Ｅ−ｉｉ）工程において、前記イミダゾールが、１００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度である。理論に束縛されることを望まないが、この特定の工程を用いた精製方法を適用することによって、従来よりも純度の高い精製が達成されると期待される）。

好ましい実施形態では、使用されるシグナル配列は、ＮＥＬＬ１に対して内因性である。このように内因性のシグナルでも効率よい生産が可能になったことは予想外の効果である。

より好ましくは、ＮＥＬＬ１およびシグナル配列をコードする核酸は、配列番号１の塩基１３５〜２５６４、配列番号３の塩基４０〜２４７２および配列番号５の塩基５９〜２４９１からなる群より選択される。

１つの好ましい実施形態では、本発明の生産方法は、ａ）核酸構築物を提供する工程であって、該核酸構築物は、Ｖ５タグ、ヒスチジンタグ、内因性シグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号１のヌクレオチド１３５〜２５６４、配列番号３のヌクレオチド４０〜２４７２、配列番号５のヌクレオチド５９〜２４９１など）を含むＮＥＬＬ１（ｈＮＥＬＬ１） ｃＤＮＡを含むみ、好ましくは、この核酸構築物は、配列番号７に示す配列からなる）、工程；ｂ）該核酸構築物によりＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞にトランスフェクトする工程；ｃ）ＮＥＬＬ１を発現することができる条件下（たとえば、下記を参照）で、該Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞を培養する工程；ｄ）該Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞から分泌されたＮＥＬＬ１を含む培養上清を回収する（たとえば、下記を参照）工程；ｅ）回収されたＮＥＬＬ１を、Ｎｉレジンアフィニティカラムにかけ、５００ｍＭ イミダゾールで溶出することにより、回収された該培養上清から該ＮＥＬＬ１を精製する工程を包含する。この方法を採用することによって、生体内で発現しているＮＥＬＬ１タンパク質とほぼ同様の配列を持ったタンパク質を非常に穏やかな条件下（例えば、イミダゾールの濃度を下げての溶出するなど）の元で精製することが可能になった。

好ましい条件としては、たとえば、以下が挙げられる。

細胞ならびに培地
昆虫細胞は、ＨｉＦｉｖｅ （インビトロジェン社）を用い、培地はＥｘｐｒｅｓｓＦｉｖｅＳＦＭ（インビトロジェン社 ＃１０４８６−０２５ １Ｌ）に２００ｍＭ Ｌ−グルタミン ９０ｍＬおよび適切な抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を添加したものを使用した。これ以外の添加物なし。

形質導入
形質導入はエレクトロポレーション法により行い、ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いた。幅４ｍｍスリットのキュベット（バイオラッド社）にＤＮＡ １０ｍｇおよび細胞（１ｘ１０^６個）を加え軽く懸濁させ、１０分間氷上冷却の後、１２５μＦ、３００Ｖのパルスを与える。その後、１０分間の氷上冷却の後、培地へ戻し培養を行う。

発現細胞選択（ゼオシン耐性）
本ベクターは、ゼオシン（インビトロジェン社）に耐性をもつため、ゼオシンを最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるように培地に添加し３日間培養を２回繰り返した。また、本ベクターはＧＦＰを共発現するので落射式蛍光顕微鏡下（ＣＫＸ４１オリンパス社）にてＧＦＰ発現を確認することにより形質転換された細胞を確認する。

小量培養
ゼオシン耐性を示した細胞を発現株とし、１０ｃｍディッシュ（ＢＤファルコン）に２０％コンフルエンシーで蒔いた後、４日培養し培養上清を高速遠心分離（５０００ｒｐｍ ２０分）により回収する。尚、培養は例示的に２７度で行う。

タンパク質精製
例示として、精製には、ニッケルセファロースＦＦ６担体（アマシャムバイオサイエンス社）を用いた。エコノカラム（バイオラッド社）に担体１ｍＬを充填し、平衡化バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６）で平衡化を行った後、遠心分離処理した培養上清を直接カラムに流し、自然落下によるアフィニティー結合を行う。その後、洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ， １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６）で洗浄した後、溶出バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ， ０．５ｍＭ ＰＭＳＦ， ｐＨ７．６）にて溶出を行う。ニッケルセファロースは、セファロース表面にＮｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉ ａｃｉｄ（ＮＴＡ）が固層されており、ＮＴＡとニッケルの結合を利用して、ニッケルイオンを保持することができる。また、ニッケルとヒスチジンとの結合性を利用してＨｉｓタグを融合しているタンパク質のみを精製してくることができる。溶出は、ヒスチジンと構造が類似している安価なイミダゾール（Ｆｉｇ２）を使用することで、補足されている目的タンパク質中のヒスチジンと置換し、目的のタンパク質を分離する。

（骨治療剤のスクリーニング）
別の局面において、本発明は、炎症を起こさずに骨形成を促進する因子をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、Ａ）候補化合物を提供する工程；Ｂ）該候補化合物についてＭＡＰキナーゼの活性化能を検出する工程；Ｃ）該候補化合物について、Ｓｍａｄの活性化能を検出する工程；Ｄ）該候補化合物から、ＭＡＰキナーゼを活性化し、かつＳｍａｄを活性化しない化合物を炎症を起こさずに骨形成を促進する因子として選択する工程を包含する）。

ここで、ＭＡＰキナーゼの活性化能を検出する工程は以下のとおり実施することができる。

ＭＡＰＫファミリーに属するタンパク質を発現している細胞に、スクリーニング対象ライブラリーを添加し、１０−２０分後にその細胞を溶解する。あるいは、ＭＡＰＫファミリーに属するタンパク質を発現していない細胞においても、それらのタンパク質を発現させるベクターを遺伝子導入することにより上記細胞と同様の実験を行うことができる。

溶解した細胞内に、リン酸化されたＭＡＰＫファミリーに属するタンパク質がどの程度存在するかを以下の方法で確認する。

１）細胞溶解液を遠心分離によって不溶画分を除き、可溶画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体を用いたウエスタンブロッティング法によって、解析を行う。

２）上記方法で得た可溶画分は、サンドイッチイライザ法を用いた方法でもリン酸化されたＭＡＰＫファミリーに属するタンパク質を定量することができる。

Ｓｍａｄの活性化能を検出する工程は以下のとおり実施することができる。

Ｓｍａｄファミリーに属するタンパク質を発現している細胞に、スクリーニング対象ライブラリーを添加し、１０−６０分後にその細胞を溶解する。あるいは、Ｓｍａｄファミリーに属するタンパク質を発現していない細胞においても、それらのタンパク質を発現させるベクターを遺伝子導入することにより上記細胞と同様の実験を行うことができる。

溶解した細胞内に、リン酸化されたＳｍａｄファミリーに属するタンパク質がどの程度存在するかを以下の方法で確認する。

１）細胞溶解液を遠心分離によって不溶画分を除き、可溶画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗リン酸化Ｓｍａｄ抗体を用いたウエスタンブロッティング法によって、解析を行う。

２）上記方法で得た可溶画分は、サンドイッチイライザ法を用いた方法でもリン酸化されたＳｍａｄファミリーに属するタンパク質を定量することができる。

また、骨芽細胞や間葉系の未分化細胞などのＮＥＬＬ１刺激により生態応答を示す細胞を用いて、ＮＥＬＬ１タンパク質特異的な受容体タンパク質を同定することで、スクリーニングの感度や信頼性を上げること可能である。

受容体タンパク質の同定は、ＮＥＬＬ１特異的抗体、もしくは抗Ｖ５抗体を用いて、細胞溶解液中のタンパク質を免疫沈降法により回収し、電気泳動法にてタンパク質を分離する。次いで、分離されたタンパク質を既知の染色法を用いて検出し、ＮＥＬＬ１タンパク質と相互作用すると考えられるバンドを質量分析器を用いて解析を行う。最終的にはインシリコの手法を用いて、受容体タンパク質の同定を行う。

候補化合物から、ＭＡＰキナーゼを活性化し、かつＳｍａｄを活性化しない化合物を炎症を起こさずに骨形成を促進する因子として選択することは、研究者の経験に基づいて行うことができる。このような因子を選択するクライテリアを決定することについて、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することは、当業者の技術範囲内である。

ＮＥＬＬ−１と同じ動きをする因子（ラミニン、フィブロネクチン等）が存在するが、骨形成活性が観察されているのはＮＥＬＬ−１のみである。したがって、ＮＥＬＬ−１には見出されラミニン等には見出されない活性を評価することによって、骨形成をより正しく評価することができる。

また、ＮＥＬＬ１の骨形成に関する機能ドメインは、Ｎ末に存在するＴＳＰ−Ｎドメイン（Ｌａｍｉｎｉｎ Ｇ ドメイン）であることが、近年のシグナル伝達経路の研究で明らかとなっている。

このことは、ＮＥＬＬ１のＬａｍｉｎｉｎ Ｇドメインのみを大腸菌で発現させ、そのタンパク質を精製し、その生理活性やその他実験を行うことによって達成することができる。

別の局面では、本発明は、炎症を起こさずに骨形成を促進する因子の候補化合物を生産する方法を提供する。この方法は、Ａ）候補化合物を提供する工程；Ｂ）該候補化合物についてＭＡＰキナーゼの活性化能を検出する工程；Ｃ）該候補化合物について、Ｓｍａｄの活性化能を検出する工程；Ｄ）該候補化合物から、ＭＡＰキナーゼを活性化し、かつＳｍａｄを活性化しない化合物を炎症を起こさずに骨形成を促進する因子の候補化合物として選択する工程を包含する、方法を提供する。

本発明は、このようなスクリーニング方法によって得られた物質またはライブラリーも提供する。

（使用）
別の局面において、本発明は、炎症を起こさずに骨を処置するための骨治療剤の製造のための、ＮＥＬＬ１の使用を提供する。この使用は、本明細書において他の場所に記載された任意の形態を使用することができる（たとえば、（骨治療剤・骨治療器具）を参照）。

本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

以下に、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例において使用した試薬等は、特に断らない限り、ナカライテスク社、大阪薬研、八州薬品、片山化学工業株式会社から入手したものを使用した。また、ＤＮＡなどは、自製したか、シグマジェノシスに注文して作製したものを使用した。動物実験は、大阪大学または昭和大学において規定される倫理規定に基づいて行った。人に対する実験を行う場合は、インフォームドコンセントを得てから行う。

実施例において［］で示した数字は、本明細書の最後に掲載される参考文献の番号を示す。

本実施例では、まず高度に精製した組換えヒトＮＥＬＬ１（ｈＮＥＬＬ１）を得、ＲＦＣ細胞に対するｈＮＥＬＬ１タンパク質の直接的効果を検討した。著しく低いモル濃度で添加されたｈＮＥＬＬ１タンパク質が様々な骨芽細胞においてＭＡＰＫシグナリングカスケードを一時的に活性化することが可能であり、Ｓｍａｄ非依存シグナル伝達カスケードを通じてそのシグナルを伝達することをここに示す。さらに、ｈＮＥＬＬ１タンパク質を添加した結果、Ｃｂｆａ１のリン酸化およびチロシンリン酸化タンパク質の急速な蓄積が生じた。

（実施例１：ｈＮＥＬＬ１タンパク質の産生および精製）
実施例１では、シグマアルドリッチジャパン株式会社、GE ヘルスケアバイオサイエンス （旧アマシャム バイオサイエンス株式会社）、インビトロジェン株式会社、フナコシ株式会社、コスモ・バイオ株式会社、日本バイオラッド、株式会社 キアゲン、プロメガ株式会社、タカラバイオ株式会社、東洋紡績株式会社、第一化学薬品株式会社、株式会社グライナー・ジャパン、DSファーマバイオメディカル（旧大日本製薬株式会社 ラボラトリープロダクツ部）、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、メルク株式会社、ヒドラス化学株式会社、パーキンエルマーライフサイエンスジャパン株式会社、日本ミリポア株式会社、日本ウォーターズ株式会社、東ソー株式会社、ジーエルサイエンス株式会社、株式会社 資生堂、タイテック株式会社、アフィメトリクスジャパン株式会社、アズワン株式会社、東京硝子器械株式会社、ＩＫＡジャパン有限会社、株式会社パーキンエルマージャパン、ロシュダイアグノスティックス株式会社、オリエンタル酵母株式会社、株式会社 医学生物研究所、株式会社 免疫生物研究所、株式会社 ペプチド研究所、東洋紡エンジニアリング株式会社、三光純薬株式会社、株式会社ベリタス、テフコ株式会社、ザルトリウス株式会社、生化学工業株式会社、倉敷紡績株式会社 バイオメディカル部から購入したかまたは入手可能な試薬を使用した。

本実施例では、ｈＮＥＬＬ１タンパク質の産生および精製を行った。

（ｈＮＥＬＬ ｃＤＮＡの単離）
最初に、以下に記載する方法により、２４４８−ｂｐ ｈＮＥＬＬ１ ｃＤＮＡを、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって単離した。

（プラスミドの構築）
プラスミドの構築の概要を示す（図２）。

（１）ヒト脳全体ＲＮＡ（Ｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｗｈｏｌｅ ＲＮＡ）から逆転写反応を用いてヒト脳ｃＤＡＮを調製した。

（２）ヒトＮＥＬＬ−１ ｃＤＮＡをＰＣＲ法により調製を行ったうために、得られたヒト脳ｃＤＮＡより各プライマーを用いて４つのフラグメントを作製した。

（３）得られた４本のフラグメントをさらにＰＣＲ法により２本づつなぎあわせ、２本のフラグメントを作製した。

（４）得られた２本のフラグメントをさらにＰＣＲ法により１本につなぎあわせ、全長を得た。

（５）得られた全長をｐＧＥＭ−Ｔ クローニング用のベクターへＴＡクローニングによりｈｕｍａｎ ＮＥＬＬ１プラスミドを作製した。

（詳細な手順）
ヒト脳ｍＲＮＡから逆転写によって、ヒトＮＥＬＬ１ ｃＤＮＡを作製した。

２μＬのｈｕｍａｎ ｂｒａｉｎ ｗｈｏｌｅ ＲＮＡ（２．５ｍｇ／ｍＬ， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と１．５μＬのＯｌｉｇｏ（ｄＴ）_{１２−１８}（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１３．５μＬのＤＥＰＣ−ＵＰＷをいれた１．５ｍＬチューブに加え混合し、室温で２０分間静置した。その後、このチューブに３μＬの１０ｘＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ （ＧＩＢＣＯ）、１．５μＬの２５ｍＭ ＭｇＣｌ２、３μＬの０．１Ｍ ＤＴＴ、２μＬの２５ｍＭ ｄＮＴＰを加えて良く混ぜてスピンダウンしＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１．５μＬ加えて４２℃で６０分間逆転写反応を行い７２℃で１５分間加熱した後、−２０℃で保存した。

次に、以下の４つのフラグメント１〜４（ｆ１〜４）をＰＣＲにかけて増幅した。

フラグメント１（ｆ１） ５２７ｂｐ
フラグメント２（ｆ２） ６２４ｂｐ
フラグメント３（ｆ３） ６１２ｂｐ
フラグメント４（ｆ４） ８４１ｂｐ
使用したプライマーおよび反応液は、以下のとおりである。

プラスミドＤＮＡ（１０倍希釈） １μＬ
１０×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ．緩衝液 ５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ（ＳＩＧＭＡ） １μＬ
１０μＬプライマー（順方向） １μＬ
１０μＬプライマー（逆方向） １μＬ
ＶＥＮＴ ＤＮＡ ｐｏｌ．（ＮＥＢ） １μＬ
ＵＰＷ ４０μＬ
合計 ５０μＬ

ｆ１は、順方向プライマー＃２（配列番号１９）および逆方向プライマー＃５（配列番号２６）、ｆ２は、順方向プライマー＃３（配列番号２０）および逆方向プライマー＃４（配列番号２５）、ｆ３は、順方向プライマー＃４（配列番号２１）および逆方向プライマー＃３（配列番号２４）、そしてｆ４は、順方向プライマー＃５（配列番号２２）および逆方向プライマー＃２（配列番号２３）の組合せを用いた。

ＰＣＲ反応を、９５℃２分間処理の後、９５℃３０秒、５５℃３０秒および７２℃１分を２５サイクル繰り返し、次いで７２℃７分間処理し、４℃で維持した。

次いで、ｆ１とｆ２、またはｆ３とｆ４とをつなぐために、以下の反応液を調製し、ＰＣＲ反応を行った。

ＰＣＲ反応液（ｆ１およびｆ２またはｆ３およびｆ４） 各１μＬ
１０×Ｐｆｕ緩衝液 ５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ（ＳＩＧＭＡ） ２μＬ
１０μＭプライマー（順方向）＃２または＃４ （１μＬ）
１０μＭプライマー（逆方向）＃４または＃２ （１μＬ）
Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ ｐｏｌ．（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ） １μＬ
ＵＰＷ ３８μＬ
合計５０μＬ

ＰＣＲ反応を、９５℃２分処理の後、９５℃１分、６０℃１分および７２℃２分を３サイクル繰り返した。次いで反応液にプライマーを添加した。さらに、９５℃１分、５５℃１分および７２℃２分を２７サイクル繰り返した後、７２℃１０分反応させ、４℃に維持した。

さらに、ｆ１とｆ２、またはｆ３とｆ４とをつないで作製した２本のフラグメントをつないでヒトＮＥＬＬ１ ｃＤＮＡ全長を得るためにＰＣＲを行った。反応液を以下のように調製した。

ＰＣＲ反応液（ｆ１−２、ｆ３−４） 各１μＬ
１０×Ｐｆｕ緩衝液 ５μＬ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ（ＳＩＧＭＡ） ２μＬ
１０μＭプライマー（順方向）＃２ （１μＬ）
１０μＭプライマー（逆方向）＃２ （１μＬ）
Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡ ｐｏｌ．（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ） １μＬ
ＵＰＷ ３８μＬ
合計５０μＬ

ＰＣＲ反応は、９５℃２分処理の後、９５℃１分、６０℃１分および７２℃２分を３サイクル繰り返した。次いで反応液にプライマー（下記表を参照）を添加した。さらに、９５℃１分、５５℃１分および７２℃２分を２７サイクル繰り返した後、７２℃１０分反応させ、４℃に維持した。この反応液に、Ｄｐｎ Ｉ（ＮＥＢ）を１μＬ加えて３７℃にて１時間反応させた。得られた反応液を、エタノール沈殿して、沈殿をＵＰＷに溶解した。０．５μＬの１０ｍＭ ｄＡＴＰと１０×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼバッファーを２．５μＬ加えた。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを、０．５μＬ加えて、７２℃にで２０分間反応させた。

得られた核酸を、０．５ｍＬチューブにｐＧＥＭ−Ｔベクター １μＬ、２Ｘ Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、ＰＣＲより得られた全長ｈｕｍａｎ ＮＥＬＬ１ １μＬ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ １μＬにＵＰＷを加えて１０μＬとし、室温で１時間のインキュベートを行うことによりＴＡクローニングした。

以下の表は、プライマー設計に用いた情報である。

（ｈＮＥＬＬ１タンパク質の産生および精製）
（概要）
ｈＮＥＬＬ１ ｃＤＮＡフラグメントは、本実施により得られたものを使用した。

ｈＮＥＬＬ１ ｃＤＮＡフラグメントを、ＩｎｓｅｃｔＳｅｌｅｃｔ Ｇｌｏｗ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に含まれる発現ベクターｐＩＺＴ／Ｖ５−ＨｉｓのＯｐＩＥ２プロモーターの下流に挿入しＣ−末端Ｖ５−およびＨｉｓ×６−タグ化形態（ｈＮＥＬＬ１−ＶＨ）を生産した。次に、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ−ｄｅｒｉｖｅｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ^ＴＭ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ＦｕＧｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、得られたプラスミドｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＮＥＬＬ１でトランスフェクトし、無血清培地であるＥｘｐｒｅｓｓ Ｆｉｖｅ ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で４８時間インキュベートした。抗生物質Ｚｅｏｃｉｎ（Ｎａｋａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ、京都、日本）を４００μｇ／ｍｌで培地に添加し、３〜４日毎に培地を交換することによりＺｅｏｃｉｎ耐性細胞を選択した。ｈＮＥＬＬ１−ＶＥタンパク質の細胞外産生をモニタリングするために、培養培地（６ｍｌ）を抗Ｖ５タグ抗体（１μｇ；Ｎａｋａｌａｉ Ｔｅｓｑｕｅ）とともにインキュベートし、沈降物を６％ゲルのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびＰＶＤＦ膜上で上記抗体を用いるウエスタンブロッティングに供した。ｈＮＥＬＬ１−ＶＥタンパク質を大規模でアフィニティ精製するために、３日目の培養培地（５００ｍｌに合わせた）を、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を充填したプラスチックカラム（Φ１．５ × １０ ｃｍ）にかけ、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で充分に洗浄し、ＰＢＳ中の５００ｍＭ イミダゾールで溶出した。この溶出物（約１０ｍｌ）を、４℃で一晩、ＰＢＳに対して充分に透析し、そして、限外濾過により約９００μｇ／ｍｌまで濃縮した。ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０を用いた染色により確認した。

より詳細には以下のとおりである。

（材料および方法）
（発現ベクター）
ヒト脳ｍＲＮＡより合成し、クローニングしたヒトＮＥＬＬ１（ｈＮＥＬＬ１） ｃＤＮＡ（ＯＲＦ ２４３３ｂｐ）を用いて昆虫細胞発現ベクターの構築を行った。発現ベクターは、ｐＩＺＴ／Ｖ５−Ｈｉｓ（インビトロジェン社）を使用した。ｈＮｅｌｌ１を挿入するために、ベクター中のマルチクローニングサイトのＳｐｅＩならびにＳａｃＩＩを使用した。挿入するＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した後、同制限酵素で切断し、ライゲーションを行った。また、融合タグ発現ベクターに関しては、ｈＮＥＬＬ１のストップコドンを除き、融合タグの非発現ベクターに関しては、ｈＮＥＬＬ１のストップコドンを用いた。遺伝子情報ならびにタンパク質情報は、インターネット上のデータベースより検索した。

遺伝子情報 ＮＣＢＩ
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｖｉｅｗｅｒ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｖａｌ＝１８２７４８２
タンパク質情報 Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ
ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９２８３２
タグ部分：ＰＲＦＥＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴＲＴＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号２９）
上記タグ部分中、ＳａｃＩＩ クローニングサイト部分は、ＰＲである。

上記タグ部分中、Ｖ５タグ部分は、ＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ（配列番号２７）をコードする核酸に対応する。

上記タグ部分中、ヒスチジンタグ部分は、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２８）をコードする核酸に対応する。この後にはストップコドンが入る。

（形質導入細胞株の確立）
（細胞ならびに培地）
昆虫細胞は、ＨｉＦｉｖｅ （インビトロジェン社）を用い、培地はＥｘｐｒｅｓｓＦｉｖｅＳＦＭ（インビトロジェン社 ＃１０４８６−０２５ １Ｌ）に２００ｍＭ Ｌ−グルタミン ９０ｍＬおよび適切な抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を添加したものを使用した。

（形質導入）
形質導入はエレクトロポレーション法により行い、ジーンパルサー（バイオラッド社）を用いた。幅４ｍｍスリットのキュベット（バイオラッド社）にＤＮＡ １０ｍｇおよび細胞（１ｘ１０^６個）を加え軽く懸濁させ、１０分間氷上冷却の後、１２５μＦ、３００Ｖのパルスを与えた。その後、１０分間の氷上冷却の後、培地へ戻し培養を行った。

（発現細胞選択（ゼオシン耐性））
本ベクターは、ゼオシン（インビトロジェン社）に耐性をもつため、ゼオシンを最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬとなるように培地に添加し、３日間培養を２回繰り返した。また、本ベクターは、ＧＦＰを共発現するので落射式蛍光顕微鏡下（ＣＫＸ４１オリンパス社）にてＧＦＰ発現を確認することにより形質転換された細胞を確認した。

（小量培養）
ゼオシン耐性を示した細胞を発現株とし、１０ｃｍディッシュ（ＢＤファルコン）に２０％コンフルエンシーで蒔いた後、４日培養し培養上清を高速遠心分離（５０００ｒｐｍ ２０分）により回収した。なお、培養は２７度で行った。

（タンパク質精製）
精製には、ニッケルセファロースＦＦ６担体（アマシャムバイオサイエンス社）を用いた。エコノカラム（バイオラッド社）に担体１ｍＬを充填し、平衡化バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６）で平衡化を行った後、遠心分離処理した培養上清を直接カラムに流し、自然落下によるアフィニティー結合を行った。その後、洗浄バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．６）で洗浄した後、溶出バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，０．５ｍＭ ＰＭＳＦ，ｐＨ７．６）にて溶出を行った。ニッケルセファロースは、セファロース表面にＮｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉ ａｃｉｄ（ＮＴＡ）が固層されており、ＮＴＡとニッケルの結合を利用して、ニッケルイオンを保持することができる。また、ニッケルとヒスチジンとの結合性を利用してＨｉｓタグを融合しているタンパク質のみを精製してくることができる。溶出は、ヒスチジンと構造が類似している（下記化学式を参照。）安価なイミダゾールを使用することで、補足されている目的タンパク質中のヒスチジンと置換し、目的のタンパク質を分離した。

（溶出画分の電気泳導ならびにウエスタンブロッティング）
溶出画分は、６×ＳＤＳサンプルバッファーを添加した後、熱処理により変性を行った。その後、５％もしくは７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥを作製し、電気泳導を行った。タンパク質の検出として電気泳導後、ＣＢＢ染色液（クマーシーブルーＲ２５０）で染色したのち、脱色液（酢酸エタノール）で脱色を行ったあとバンドの確認を行った。また、電気泳導後、ＰＶＤＦメンブラン（ミリポア社）にタンパク質をトランスブロットＳＤセル（バイオラット社）を用い転写（１５Ｖ、３０分）し、５％スキムミルクでブロッキングを行ったのち、各種抗体にて、ウエスタンブロッティングを行った。抗原抗体反応後、発色はＴＭＢ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（プロメガ社）を用いて行った。

（タンパク質定量（ＢＣＡ法））
タンパク質定量は、マイクロＢＣＡプロテインアッセイキット（ピアス社）を用いた。溶出サンプルを純水で１０分の１に希釈しサンプルとした。定量方法はキット添付書に従った。９６穴マルチプレートに調製したサンプルおよび調製試薬を添加し、マイクロプレートリーダーモデル６８０（バイオラッド社）にて波長５９５ｎｍにより測定を行った。なお、スタンダードとしてキット添付のＢＳＡを使用した。

（精製タンパク質同定）
精製タンパク質の同定は、アプロサイエンス株式会社による受託解析により行った。

５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを電気泳導後、ＣＢＢ染色を行い、目的のバンドを切り抜いたものをエッペンチューブに入れ、冷蔵条件で受託解析先へ送付した。その後、サンプルをトリプシンで消化させた後、サンプルの半量をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に供した。分析結果はマスコットサーチ（マトリックスサイエンス社）により解析を行った。

（結果）
（形質導入細胞の確認）
エレクトロポレーション法により昆虫細胞へ発現ベクターの導入を行った後、３日間のゼオシン（最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）による形質導入細胞の耐性培養を２回繰り返した。導入に用いた発現ベクターはＧＦＰを共発現するため蛍光顕微鏡下で観察した結果、ＧＦＰと思われる緑色の発光が確認された（図３）。このことより形質導入に用いた発現ベクターが細胞へ導入されていることが確認された。なお、各細胞の発光度合いの差異は、導入された形質のコピー数の差に拠るものと思われる。ＨｉｇｈＦｉｖｅ昆虫細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（ヤガ科の一種の蛾）の卵細胞由来（ＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４）で、バキュロウイルス発現システムで良く使用されるＳｆ９細胞より分泌タンパク質の発現が２５倍良いとされている。培地上清からの組換えタンパク質の精製を目的とするため、培地は無血清のＥｘｐｒｅｓｓＦｉｖｅ（インビトロジェン社）を使用した。また、ゼオシンは、ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ系の抗生物質で、ＤＮＡの間に入り込んで、ＤＮＡを切断することにより細胞死に至らせる。耐性遺伝子は、Ｓｈ ｂｌｅ遺伝子で、遺伝子産物がゼオシンと結合してＤＮＡとの結合を妨げる。

（ニッケルセファロースを用いた微量精製によるｈＮＥＬＬ１タンパク質の発現確認）
形質導入が確認された細胞の培養上清１０ｍＬを回収し、遠心処理後、ニッケルセファロースを１００ｕＬ添加し、４℃にて２時間のバッチ処理を行った。その後、ニッケルセファロースを洗浄し、１Ｍ イミダゾール １００ｕＬで溶出させた。溶出画分は６×ＳＤＳサンプルバッファーを添加し、熱変性を行った後、５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳導およびマウスモノクローナル抗６×Ｈｉｓ抗体でウエスタンブロッティングを行ったところ、Ｈｉｓタグ発現ベクター導入細胞の培地上清より１１０ｋＤａ付近に目的タンパク質と思われる特異的なバンドが確認された（図４）。

（イミダゾールによる溶出至適濃度検討）
培養上清中に目的タンパク質の発現が確認できため、ニッケルセファロースによるタンパク質精製のイミダゾール至適溶出濃度の検討を行った。担体量１ｍＬに培養上清２００ｍＬをアプライし、それぞれ１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭで溶出を行った。溶出画分はＢＣＡ法により、タンパク質濃度を定量し、６×ＳＤＳサンプルバッファーを添加し、熱変性を行った後、２０μＬを７．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳導ならびにマウスモノクローナル抗６×Ｈｉｓ抗体でウエスタンブロッティングを行った。その結果、タンパク質定量ならびにウエスタンブロットともに、イミダゾール５００ｍＭ区で、もっとも溶出量が高いことが分かった（表２および図５）。従って、イミダゾールによる至適溶出濃度を、５００ｍＭとした。

（ＢＣＡ法による各溶出画分のタンパク質定量）

（目的タンパク質の複合体形成の確認）
ＮＥＬＬタンパク質は、ホモ３量体を形成しているとの報告がある（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２６５，７９−８６（１９９９）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２６５，７５２−７５７（１９９９））ため、本研究で精製したタンパク質に関して確認を行った。精製タンパク質を、５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳導を行う際、サンプルの前処理として、還元剤添加および未添加区ならびに熱変性を行ったのと行わなかった群とに分けた。その結果、還元剤未添加区すべてにおいて、１２０ｋＤａのバンドが見られず、２５０ｋＤａ以上のところへバンドがシフトしたため、非還元条件下では複合体形成で存在したが、還元条件下で結合が解離したと考えられた。ウエスタンブロッティングにおいては、２４０ｋＤａ辺りに２量体と思われるバンドも確認された。従って、非還元下に置いては、３量体を形成していることが示唆された（図６）。

（精製タンパク質同定）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳導時に１１０ｋＤａ付近で見られるバンドを切り出し（図７中点線枠）、エッペンチューブに入れ受託解析先に送付しＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるタンパク質同定を行った。サンプル（全量）をＴｒｙｐｓｉｎ 消化後、消化液の半量をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析に使用した。

分析により得られたＭＳ／ＭＳイオンからＭａｓｃｏｔを用いてデータベース検索を行った。解析結果は、ヒットしたタンパク質をスコア（Ｔｏｔａｌ ｓｃｏｒｅ）の高い順に示したものでタンパク質名の下にはペプチドＱｕｅｒｙ 番号、多価イオン質量（実測値）、ヒットしたペプチドの質量（実測値および理論値）、スコア（Ｉｏｎｓ ｓｃｏｒｅ）、ペプチドの配列などを示す。スコアの有意性は統計学的に有意である値（ｐ＜０．０５）をしきい値として判断し、しきい値を超えたスコアを示すタンパク質は有意であると考えた。その結果、ＮＣＢｉｎｒをデータベースとし、すべての生物種からの検索結果、ヒトＮＥＬＬ１との相同性が解析ソフトにより設定されたしきい値４８に対し３３２という高い値で有意であった。また、それ以外の候補は出てこなかった。従って、本精製タンパクは、当初の目的通り、ヒトＮＥＬＬ１であることが判明した。なお、データベース解析に関する詳細データは、図３３に示した。

（大量生産）
当初１０ｃｍディッシュ５０枚より５００ｍＬの培地上清を回収していたが、大量生産方法の検討として、バッフル付き三角フラスコ（２Ｌ）を用いて、培地量および回転数などの検討を行った。その結果、５００ｍＬ培地量および回転数９０ｒｐｍで４日間の培養で継代できることが分かった。また、６日目には、オーバーグロースによる細胞死が確認された。従って、前培養の５分の１希釈の継代を行い、４日間の継代培養による大量培養方法を確立した。一回のバッチで最大２０本の２Ｌフラスコの旋回培養が可能であるため、１０Ｌの培養が可能となった。精製方法は、材料および方法に記載している通りである。なお、ニッケルセファロース担体を１ｍＬに対し培地上清５００ｍＬの割合で精製を行い、溶出は、担体１ｍＬに対し溶出バッファー３ｍＬとした。初回溶出３ｍＬ画分と次の３ｍＬ画分をそれぞれ、ＨＣ（Ｈｉｇｈ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）およびＬＣ（Ｌｏｗ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）としてタンパク質定量ならびにＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳導を行ったところ、ＬＣ区ではほとんどタンパク質の溶出は見られなかったため、最初の３画分目までを１バッチとした（図８左側）。また、バッチ番号ＺＴ４４ＨＣおよびＺＴ４５での再現性は、非常に高く（図８右側）、現在のところ、培地１Ｌあたり１ｍｇ程度の生産が可能である。

（脱グリコシル化）
精製したｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質（２μｇ）（配列番号２）を、６０℃で３０分間、０．５ ｍＭ ジチオスレイトールおよび１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの入った１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）で変性させて還元し、次いで室温で３時間、１０ ｍＵ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）および／または１ ｍＵ Ｏ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）とともにインキュベートした。同じサンプルを、上記と同じように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗Ｖ５抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。

（結果）
（昆虫細胞によるｈＮＥＬＬ−ＶＨタンパク質の効率的な産生）
培養細胞に対する細胞外タンパク質因子（例えば、ＢＭＰおよび成長ホルモン）の直接的な影響およびその特定のレセプターへの結合により誘導される後のシグナル伝達を調べるためには、これらのタンパク質の高度に精製された充分量の調製物のアベイラビリティーが必要な条件である。従って、適切な宿主細胞およびプラスミド（真核生物細胞において充分に発現するためのプロモーター、免疫学的検出およびアフィニティ精製に好都合なタグ、ならびに培養培地に分泌するためのシグナルペプチド（例えば、ミツバチメリチンシグナル）を含む）の大規模な調査の後、本発明者らは、安定なＺｅｏｃｉｎ耐性昆虫細胞を用いたｈＮＥＬＬ１−ＶＨについての効率的な生産システムを確立した。抗Ｖ５抗体を用いて培養培地の免疫沈降物をウエスタンブロッティングすることにより確認されるように、形質転換昆虫細胞を無血清培地にて３日間培養した後、培養培地１ｍｌあたり約０．８μｇのｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質の最大分泌が得られた。

分泌されたｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質は、Ｎｉ−キレートアフィニティクロマトグラフィーの一工程により（分泌されたｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質に基づいておよそ９１％の最終収率で）、大規模（合わせて５００ｍｌの培養培地）で、ほぼ均質になるまで簡単に精製することができた（図９、Ａ）。精製したｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約１２０ｋＤａのタンパク質の単一バンドとして移動した（図９、Ａ）。Ｏ結合糖鎖ではなく、Ｎ結合糖鎖の脱グリコシル化後、このタンパク質は約９０ｋＤａのタンパク質として移動した（図９、Ｂ）。これは、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質の計算上の分子量（９０，３４１Ｄａ）に一致する。従って、分泌されたｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質は、Ｎグリコシル化についての可能性のある１４箇所の部位において約３０ｋＤａのＮ結合糖鎖を含んでいた。以前の研究では、ラットＮＥＬＬ１は、約１４０ｋＤａ（５０ｋＤａのＮ結合糖鎖を含む）としてＣＯＳ７細胞により一過性に発現した［５］。グリコシル化の程度の違いは、発現のために使用した細胞型の違いに起因すると考えられる。グリセロール勾配超遠心分析により、この精製したｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質は、約３６０ｋＤａのタンパク質として沈殿した。このことは、ＣＯＳ７細胞により産生されたラットＮＥＬＬ１タンパク質について報告された［５］ように、精製したｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質が非変性条件下でホモトリマーとして存在することを示唆する。

さらに、生体内に投与されたNELL1（図２１〜２５、図３１〜３２）では硬組織形成部位と軟組織の両方で炎症像がみられないことを確認した。これは、ＢＭＰで見られた炎症惹起性の性質と顕著に異なる（J Oral Maxillofac Surg, 9:53-61,2001Ichiro Setoを参照）。加えて上皮組織上BMPとNELL1で炎症有無を確認する皮内注射実験により再確認できる。

（実施例２：ＮＥＬＬ１が誘発した細胞内シグナル伝達カスケードの解明）
ＮＥＬＬ１は、骨芽細胞の骨分化および骨形成を誘導する細胞外のタンパク質である。本実施例では、ＮＥＬＬ１が誘発した細胞内シグナル伝達カスケードを解明するために、オステオマーカーの誘導、ＭＡＰＫの活性化、ＯＰＮ発現に関するＭＡＰＫインヒビターの影響、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化、Ｃｂｆａ１のリン酸化、チロシンリン酸化タンパク質の迅速な蓄積について検討した。

（材料および方法）
（ラット頭頂骨由来初代培養細胞（ＲＦＣ細胞））
ＲＦＣ細胞を、１７ｄｐｃで１２〜１３匹のラット胎児から単離し、そして１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を添加したα改変必須培地（α−ＭＥＭ）中で維持した。分化を誘導するために、これらの細胞を、５％ ＦＢＳ、１０ｍＭ β−グリセロリン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌ アスコルビン酸、およびヒトＢＭＰ２タンパク質（ｈＢＭＰ２；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）またはｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質のいずれかを、それぞれ示される濃度で含むα−ＭＥＭ中で維持した。

（細胞株）
マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（ＲＣＢ１１２６）およびヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２（ＲＣＢ０４２８）を、理研バイオリソースセンター（筑波、日本）から入手し、そして１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ中で維持した。マウス間葉系幹細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２（ＪＣＲＢ０００３）を、ヒューマンサイエンス研究資源バンク（和泉、日本）から入手し、そして１０％ ＦＢＳを含むダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。

（ＡＬＰ活性の測定）
６ウェルプレート中、約５×１０^４個のＲＦＣ細胞を、種々の濃度のｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質または１００ｎｇ／ｍｌのｈＢＭＰ２タンパク質で３日間処理した。これらの細胞を、氷上で、０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（５００μｌ）を含むＴＢＳ（５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．４，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）中に溶解した。上清（５０μｌ）を、等量の４ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）と混合し、２５℃で６０秒間インキュベートした。この反応を、１０μｌの５Ｎ ＮａＯＨで止めた。４１０ｎｍにおける吸光度の増加を、マイクロプレートリーダーＶａｒｉｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐ．，Ｖａｎｔａａ，Ｆｉｎｌａｎｄ）により測定した。ＡＬＰ活性の１単位は、ｐ−ニトロフェノールのモル吸光係数（１７．５×１０^４Ｍ^-１４０５ｎｍにて）を用いて決定した、１分あたり１μｍｏｌｐ−ニトロフェノールの産生に必要とされる酵素の量として定義した。各サンプルのタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準としてＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で決定した。

（オステオポンチン（ＯＰＮ）およびＯＣＮの測定）
培養培地に分泌されたＯＰＮおよびＯＣＮの量を、ラットオステオポンチンアッセイＥＬＩＳＡキット（ＩＢＬ，群馬、日本）およびラットオステオカルシンイミュノアッセイＥＬＩＳＡキット（ＢＴＩ，Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ，ＭＡ）をそれぞれ用いて、製造業者の説明書に従って測定した。培養培地を、それぞれｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）またはｈＢＭＰ２タンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）で、３日間または６日間処理した後、回収した。ＯＰＮの発現について、ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードの関与を調べるために、２０ μＭ ＭＥＫ１／２インヒビターＰＤ９８０５９（Ｍｅｒｃｋ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、２０ μＭ ＪＮＫインヒビターＳＰ６００１２５（Ｎａｋａｌｉ Ｔｅｓｑｕｅ）、および２５ μＭ ｐ３８インヒビターＳＢ２０３５８０（Ｍｅｒｃｋ）を用いた。

（ＭＡＰＫおよびＳｍａｄのウエスタンブロッティング分析）
ＭＡＰＫのリン酸化形態（すなわち、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ１／２／３およびｐ３８α／β／γ）を、ウエスタンブロッティングにより検出した。サブコンフルエントのＲＦＣ細胞、Ｓａｏｓ−２細胞およびＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を、１８時間、血清飢餓（０．１％ＦＢＳ）の状態にした。これらの細胞を、示された時間にわたりｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）またはｈＢＭＰ２タンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて処理し、溶解バッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ ７．５，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，１ ｍＭ ＥＤＴＡ，１ ｍＭ ＥＧＴＡ，１ ｍＭジチオスレイトール，５０ ｍＭ ＮａＦ，１ ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４，１ ｍＭ ＰＭＳＦ、およびバッファー５０ｍｌあたり１錠の完全プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）（Ｒｏｃｈｅ）］で溶解した。この溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および以下のウサギ抗体を用いるウエスタンブロッティングに供した：抗ＥＲＫ１／２抗体（カタログ番号９１０２，ＣＳＴ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（カタログ番号４３７６，ＣＳＴ）、抗ＪＮＫ１／２／３抗体（カタログ番号９２５８，ＣＳＴ）、抗リン酸化ＪＮＫ１／２／３抗体（カタログ番号４６７１，ＣＳＴ）、抗ｐ３８α／β／γ抗体（カタログ番号９２１２，ＣＳＴ）、抗リン酸化ｐ３８α／β／γ抗体（カタログ番号４６３１，ＣＳＴ）、および抗βアクチン抗体（カタログ番号Ａ２０６６，Ｓｉｇｍａ）。免疫反応したバンドを、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、増感化学発光法により視覚化した。ＲＦＣ細胞およびＳａｏｓ−２細胞におけるＳｍａｄ１／５／８のリン酸化形態もまた、上記のウエスタンブロッティングにより検出した。一次抗体は、抗リン酸化Ｓｍａｄ１／５／８抗体（カタログ番号９５１１，ＣＳＴ）および抗Ｓｍａｄ１／５／８抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いた。各タンパク質の相対量を、デンシトメトリーにより定量化した。

（免疫細胞化学的分析）
３５ｍｍグラス底プレート上の血清飢餓状態にしたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（約１０^３細胞）を、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）またはｈＢＭＰ２タンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）で１時間処理し、氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドで、室温で３０分間固定し、そして氷冷したＰＢＳで２回洗浄した。これらの固定した細胞を、室温にて３０分間、０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳに浸透させ、次いで、ブロッキングバッファー［３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２％ＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清、および０．０３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ］とともにインキュベートした。これらの細胞を、抗Ｓｍａｄ４抗体（カタログ番号Ｓ３９３４，Ｓｉｇｍａ）を含むブロッキングバッファー中で、室温にて１時間インキュベートした。これらの細胞を、室温にて、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中、Ａｌｅｘａ−５４６結合体化抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号Ａ−１１００３，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、室温にて３０分間インキュベートした。蛍光発光を、ＵＰｌａｎ ＳＡｐｏ ６０×油浸対物レンズ（ＮＡ １．３５）を備えた共焦点レーザー顕微鏡ＦＶ１０００Ｄ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京、日本）を用いて観察した。写真を、画像の明度およびコントラストを整えるためにのみ、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ８．０ソフトフェアで編集した。

（ルシフェラーゼアッセイ）
Ｓｍａｄ依存性転写を測定するために、ヒトＩｄ１遺伝子（筋発生）のプロモーター［１１］を、ルシフェラーゼアッセイに使用した。プラスミド（ｐＧＬ３−Ｉｄ９８５−ＬｕｃおよびｐＧＬ３−ＩｄＭｕｔＢ−Ｌｕｃ）は、埼玉医科大学片桐岳信教授から入手した。１２ウェルプレートの各プレート中、約２×１０^４個のＲＦＣ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてこのプラスミドによりトランスフェクションした。トランスフェクションの一日後、これらの細胞を、５％ＦＢＳ中、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質（１０もしくは１００ｎｇ／ｍｌ）またはｈＢＭＰ２タンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。これらの細胞を、３００μｌの溶解バッファーで溶解し、透明溶解液（１００μｌ）を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）でアッセイした。転写活性化は、タンパク質濃度により分離された相対的ルミネッセンスユニット（ＲＬＵ）により示された。

（Ｃｂｆａ１についての免疫沈降アッセイ）
６ウェルプレートの各ウェルにおいて、血清飢餓状態のＲＦＣ細胞（約５×１０^４細胞／ウェル）を、０．１％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ中、２０μＭ ＰＤ９８０５９（ＭＥＫ１／２インヒビター）で１時間、前処理し、次いで、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）またはｈＢＭＰ２タンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。これらの細胞を、５００μｌの溶解バッファーで溶解し、抗Ｃｂｆａ１抗体（カタログ番号Ｒ９４０３，Ｓｉｇｍａ）２μｇと混合し、そして４℃で６０分間インキュベートした。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（５０％（ｖ／ｖ）スラリー、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（５０ μｌ）をこの混合物に添加し、４℃で３０分間、回転振蘯させながらインキュベートした。ビーズを洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗リン酸化Ｓｅｒ抗体（ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓｅｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（カタログ番号ａｂ９３３４，ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を用いるウエスタンブロッティングに供した。

（ｈＮＥＬＬ１−ＶＨを用いるプルダウンアッセイ）
１００ｍｍプレート上の血清飢餓状態にしたＲＦＣ細胞（約４×１０^６細胞）を、０．１％ ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ中で、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）で２〜５分間、処理した。氷上ですばやく凍結させ、氷冷ＰＢＳで数回洗浄した後、細胞を、５００μｌ ＲＩＰＡバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ−４０、０．０３％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸塩、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭ ＰＭＳＦ、およびバッファー５０ｍｌあたり１錠の完全プロテアーゼインヒビターカクテル］で溶解し、抗Ｖ５タグ抗体（２μｇ）とともに、４℃で６０分間インキュベートし、次いでプロテインＧセファロースに結合した免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗リン酸化Ｔｙｒ抗体（ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｙｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）（クローン４Ｇ１０，Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いるウエスタンブロッティングに供した。

（結果）
（オステオマーカーの誘導）
ＲＦＣ細胞を、精製したｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質で直接処理した（図９Ａを参照のこと）。図１０Ａに示すように、処理後３日間培養した細胞において、ＡＬＰ活性は、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質の添加量にほぼ依存して増加した。５０〜１００ｎｇ／ｍｌのｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質の添加は、ＡＬＰ活性を約７倍増大させるのに充分であった。そこで、以下の実験において、特に記載しないかぎり、本発明者らは、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質を常に添加した。５０〜１００ｎｇ／ｍｌ ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質で処理した後に誘導されるＡＬＰ活性は、ポジティブコントロールとして試験した、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ２タンパク質で処理した後に誘導されたＡＬＰ活性のおよそ半分しかなかった。しかし、ＢＭＰは、分子量が２０〜２５ｋＤａであり、通常、ホモダイマーとして作用するが、約１２０ｋＤａのｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質は、おそらく溶液中ではホモトリマーである［５］。したがって、モル濃度基準（ｈＢＭＰ２、１００ｎｇ／ｍｌ＝２．５ｎＭ；ｈＮＥＬＬ１−ＶＨ，１００ｎｇ／ｍｌ＝０．２８ ｎＭ）でそれらの濃度を比較すると、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質が、ｈＢＭＰ２タンパク質よりも非常に低い濃度でＡＬＰ誘導活性を有することが示唆される。他のオステオマーカーであるオステオポンチン（ＯＰＮ）およびＯＣＮ（これらは、ＡＬＰの後に分化した骨芽細胞において発現される）はまた、ｈＢＭＰ２タンパク質と同じ効力を有する１００ｎｇ／ｍｌ ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質で処理した後、それぞれ、６日目、９日目にＲＦＣ細胞において誘導された（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。マウス骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１およびヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２を用いても同様の結果が得られた。これらの結果は、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質が、非常に低い濃度で細胞外に添加した場合でさえ、ＲＦＣ細胞においてオステオマーカーの発現を実際に誘導したことを明確に示している。

（ＭＡＰＫの活性化）
骨形成原細胞の骨分化の間、ＭＡＰＫシグナリングカスケードは、種々のオステオマーカーの発現とともに活性化される［１２］。そこで、本発明者らは、血清飢餓状態にしたＲＦＣ細胞を精製したｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質で処理したことによる、ＭＡＰＫシグナリングカスケードに関与するタンパク質のリン酸化に対する影響を調べた。図１１Ａ（左パネル）に示すように、ＥＲＫ１／２およびＪＮＫ１／２／３は、それぞれ、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質での処理の１０分後および２０分後に有意にリン酸化された。デンシトメトリー強度に基づいて、リン酸化されたＥＲＫ１／２およびＪＮＫ１／２／３の量は、未処理のＲＦＣ細胞に比べて約２２倍増加したと評価された。ｐ３８α／β／γの弱いリン酸化（未処理の細胞の約５倍）も１０分後に観察された。これらのリン酸化したＭＡＰＫメンバーは、ＲＦＣ細胞の処理後３０分以内にのみ検出された。このことから、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質は、継続的（１２時間より長い）ではなく一過性なＭＡＰＫメンバーの活性化を誘導することが示された。比較のために、ＥＲＫ１／２、ＪＮＫ１／２／３およびｐ３８α／β／γのリン酸化形態はまた、ｈＢＭＰ２タンパク質でＲＦＣ細胞を処理した後、同様のタイミングで、それぞれ、約２０倍、約２１倍および約１７倍増加した（右パネル）。マウス間葉系幹細胞株Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２では、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質とｈＢＭＰ２タンパク質のいずれも、処理１０分後に、匹敵するレベルでＥＲＫ１／２のリン酸化を誘導した（図１１Ｂ）。ヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ−２では、この２つのタンパク質は、同様に、１０分後にＥＲＫ１／２のリン酸化を誘導したが、ＥＲＫ２のリン酸化を６０分後も持続し（図１１Ｃ）、そしてさらに数時間持続した。以上より、これらの結果は、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質自体が（ｈＢＭＰ２と同様に）種々の骨芽細胞において１０分以内にＭＡＰＫシグナリングカスケードを活性化することができることを実証する。しかし、ＭＡＰＫリン酸化の持続時間は、骨芽細胞の間で３０分から少なくとも数時間にわたって変動した。

（ＯＰＮ発現に対するＭＡＰＫインヒビターの影響）
本発明者らは、次いで、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質で処理した後６日間にわたり培養したＲＦＣ細胞において、ＯＰＣの発現に対するＭＡＰＫインヒビターの影響を調査した。図１２に示すように、ＭＥＫインヒビターＰＤ９８０５９およびＪＮＫインヒビターＳＰ６００１２５のいずれも、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質により誘導されるＯＰＮ産生を有意に抑制したが、ｐ３８インヒビターＳＢ２０３５８０は、本質的に影響を示さなかった。比較として、ｈＢＭＰ２タンパク質で処理した後６日間にわたり培養したＲＦＣ細胞では、以前報告された通り［１３］、ＰＤ９８０５９およびＳＰ６００１２５のいずれも、ＯＰＮ発現に対して類似の阻害効果を示した。

（Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化）
骨芽細胞において、Ｓｍａｄタンパク質は、ＢＭＰシグナリング経路において重要な役割を果たすことが知られている［１４］。次いで、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化（これは、通常、ＢＭＰ Ｉ型レセプター（ＢＭＰ−Ｒ１）およびＢＭＰ ＩＩ型レセプター（ＢＭＰ−Ｒ２）のＢＭＰ依存性オリゴマーによって誘発される）を、次いで、抗リン酸化Ｓｍａｄ１／５／８抗体を用いるウエスタンブロッティングにより、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質で処理したＲＦＣ細胞（図１３Ａ）およびＳａｏｓ−２細胞（図１３Ｂ）において試験した。ｈＢＭＰ２タンパク質は、両細胞において、１０分〜２４０分にわたりＳｍａｄ１／５／８の持続的なリン酸化を誘導した（右パネル）が、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質は、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化状態に対してほとんど影響を示さなかった。Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化後、Ｓｍａｄ４は、リン酸化Ｓｍａｄ１／５／８とのオリゴマーを形成することにより、細胞質から核に転移する。このＳｍａｄオリゴマーは、コアクチベーター（ＣＢＰ、ｐ３００）とともにＢＭＰ標的遺伝子（例えば、Ｉｄ１、Ｈｅｙ１、ＩＴＦ２、ＩＣＳＢＰ）のプロモーター領域に直接結合する［１４］。図１３Ｃに示すように、ｈＢＭＰ２タンパク質で処理したマウス間葉系Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２幹細胞の免疫細胞化学的観察は、６０分以内のＳｍａｄ４の核への転移を示したが、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質で処理した細胞では、処理の６０分後でさえＳｍａｄ４は細胞質に残っていることを示した。このことより、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質での処理後、Ｓｍａｄ１／５／８のリン酸化は存在しないことが確認された。

ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質により誘導されるＳｍａｄ非依存シグナル伝達をさらに確証するために、Ｓｍａｄ依存型ＢＭＰ標的遺伝子の一つであるヒトＩｄ１遺伝子のプロモーター領域（約９８５〜０ｂｐ）を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｉｄ９８５−ｌｕｃ）の上流付近に挿入した［１１］。Ｉｄ９８５−ｌｕ遺伝子でトランスフェクトしたＲＦＣ細胞を、トランスフェクションの１日後に、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質またはｈＢＭＰ２タンパク質のいずれかで処理し、それぞれの細胞溶解物におけるルシフェラーゼ活性を、トランスフェクションの３日後に測定した（図１３Ｄ）。ｈＢＭＰ２タンパク質での処理によって、活性はコントロール細胞のおよそ２倍になったが、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質での処理は、発現されたルシフェラーゼ活性に対して本質的には影響を示さなかった。変異型Ｉｄ９８５−ｌｕｃ遺伝子（Ｉｄ９８５ｍｕｔ−ｌｕｃ）である、Ｓｍａｄ４結合部位（ＢＲＥドメイン）を欠失したＩｄ９８５−ｌｕ遺伝子［１１］でトランスフェクトしたＲＦＣ細胞を、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質またはｈＢＭＰ２タンパク質で処理した場合、ルシフェラーゼ活性の増加は全く観察されなかった。これらのデータは、ＮＥＬＬ１誘導型シグナル伝達経路は、少なくとも骨芽細胞においてＳｍａｄタンパク質のリン酸化に関与していないことを明白に示した。

（Ｃｂｆａ１のリン酸化）
ＦＧＦ２またはＩＧＦ１を用いて骨芽細胞を処理すると、転写因子Ｃｂｆａ１／Ｒｕｎｘ２は、ＥＲＫ１／２によりリン酸化される［１５，１６］。このリン酸化された（すなわち、活性化された）Ｃｂｆａ１は、骨芽細胞分化の間、ＥＲＫ１／２経路の下流において重要な役割を果たす［１７］。本実施例において、ＭＥＫインヒビターＰＤ９８０５９の存在下または非存在下において、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質で１時間処理したＲＦＣ細胞についてＣｂｆａ１のリン酸化を調査した。抗リン酸化Ｓｅｒ抗体を用いた抗Ｃｂｆａ１免疫沈降物のウエスタンブロッティングにより示されるように（図１４）、Ｃｂｆａ１は、ＮＥＫインヒビターの非存在下で、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質またはｈＢＭＰ２タンパク質で処理した細胞において有意にリン酸化された。上述の結果（図１１）およびＭＥＫインヒビター存在下でのＣｂｆａ１リン酸化の抑制に、基づくと、Ｃｂｆａ１は、おそらく、ＥＲＫ１／２によりリン酸化されている。

（チロシンリン酸化タンパク質の迅速な蓄積）
上記の結果により、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質がＳｍａｄ非依存型ＭＡＰＫシグナリングカスケードを通して骨形成シグナルを伝達することが示され、そしてＮＥＬＬ１タンパク質が、Ｒａｓ−ＭＡＰＫカスケードに関連する未同定の特異的レセプターと相互作用することが示唆された［１４］。ＮＥＬＬ１レセプターおよび密接に関連する他のタンパク質の同定に向けての予備的なアプローチとして、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質でＲＦＣ細胞を処理した直後に、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨと相互作用するタンパク質を免疫沈降し、この免疫沈降物を、抗リン酸化チロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。

図１５に示すように、約４５Ｄａおよび約５５ｋＤａのタンパク質が、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質と直接的または間接的に相互作用し、かつこの細胞に結合するＮＥＬＬ１の非常に初期の段階においてチロシンがリン酸化されたものとして同定された。５分後、約２００ｋＤａのわずかにチロシンがリン酸化されたタンパク質も発見された。これらのタンパク質の量は、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨ処理の５分後にはプラトーに達し、そして２０分後でさえ変化なく維持された。ｈＮＥＬＬ−ＶＨタンパク質で処理したＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞においても同様の結果が得られた。まとめると、ＮＥＬＬ１は、特定のレセプターと細胞外複合体を形成し、次いでこの複合体はチロシンキナーゼの活性化、チロシンホスファターゼの不活性化、またはチロシンリン酸化タンパク質の細胞内補充のいずれかを促進することが示唆された。

（考察）
本実施例において、ＲＦＣ細胞、Ｓａｏｓ−２細胞またはＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞をｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質で処理した結果、Ｒ−Ｓｍａｄ（Ｓｍａｄ１／５／８）のリン酸化もＣｏ−Ｓｍａｄ（Ｓｍａｄ４）の核移行も生じなかった。さらに、Ｓｍａｄ４−駆動Ｉｄ１プロモーターは、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質で処理してもＲＦＣ細胞において活性化されなかった。これらの結果は、ＮＥＬＬ１がＢＭＰによって活性化されたＳｍａｄ経路とは異なる経路を通じて骨形成シグナルを伝達するということを明確に示している。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞の骨分化［９］に対するＮＥＬＬ１およびＢＭＰ２の相乗効果に関する本発明者らの最近の研究では、ＮＥＬＬ１タンパク質単独ではＥＲＫ、ＪＮＫおよびｐ３８は活性化されなかったが、本研究では、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨおよびｈＢＭＰ２タンパク質の両方について、ＲＦＣ細胞、Ｓａｏｓ−２細胞およびＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞において一時的なリン酸化が明確に示された。ＢＭＰ２を含む様々な骨形成刺激がＭＡＰＫシグナリング分子［１８］の活性化と共にオステオマーカー（ＡＬＰ，ＯＰＮ，ＯＣＮ等）の発現を誘導することが知られている。本発明者らはさらに、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨ誘導性ＯＰＮ発現およびｈＢＭＰ２誘導性ＯＰＮ発現（図１２）のいずれにおいてもｐ３８ではなくＥＲＫおよびＪＮＫの活性化が必要であるということを見出した。ＮＥＬＬ１ホモログであるＮＥＬＬ２が、同じくＥＲＫおよびＪＮＫの活性化を通じて初代培養のニューロンの生存因子として機能する［１９］という点に注目すべきである。

転写因子Ｃｂｆａ１は、骨芽細胞分化における重要な主要調節因子であり、オステオマーカータンパク質に対する遺伝子の転写を増強する［２０］。実際に、Ｃｂｆａ１ノックアウトマウス（−／−）は、骨格において骨芽細胞および骨が不完全であった［２１］。ＥＲＫによるＣｂｆａ１のリン酸化が、Ｃｂｆａ１の転写およびそれに続く骨芽細胞分化の活性を高めるために重要であることが示された［１７，２２］。ＦＧＦおよびＩＧＦ−１［１５，１６］と同様に、ラミニン５［２３］を含む様々な細胞外基質タンパク質がＥＲＫによるＣｂｆａ１のリン酸化と共に骨芽細胞分化を誘発するということが示された。さらに、Ｓｅｒ残基におけるＥＲＫ１／２によるＣｂｆａ１のリン酸化が、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨ処理したＲＦＣ細胞においてもｈＢＭＰ２処理したＲＦＣ細胞においても見られた。したがって、Ｃｂｆａ１がＮＥＬＬ１シグナリングカスケードの下流に位置する転写因子である可能性が最も高い。ｈＮＥＬＬ１遺伝子のプロモーターは、３つのＯＳＥ２ エレメント（Ｃｂｆａ１結合部位）を含み、その発現はＣｂｆａ１によってアップレギュレートされる。このことは、ＮＥＬＬ１誘導性の骨分化を増強するためにＮＥＬＬ１シグナル伝達経路のポジティブフィードバックに寄与し得る。要するに、ＭＡＰＫシグナリングカスケードは、オステオマーカーのＮＥＬＬ１誘導性発現、すなわち骨芽細胞分化における主要な経路であると思われる。

そうであるにもかかわらず、ＭＡＰＫシグナリングカスケードが骨芽細胞の分化に直接的に関与することは依然として論争の的となっている［１８］。２種類のモデルが提案されている。一方のモデルでは、ＭＡＰＫが重要な調節因子であり、骨形成にとってアンタゴニストとして作用し、関連する骨前駆体の宿命を増殖または分化のいずれかに決定する。これに対し、別のモデルでは、ＭＡＰＫが、骨分化を維持するためにＣｂｆａ１の活性化を継続する。図１１に示すように、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質は、ＲＦＣ細胞およびＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞においてＭＡＰＫの一時的な活性化を誘導したが、既に部分的に分化されていると考えられるＳａｏｓ−２細胞においておいてのみ、活性化を継続した（特にＥＲＫ２に対して）。したがって、ＮＥＬＬ１は（ＢＭＰ２も）、ＭＡＰＫシグナリングカスケードに対し、細胞の種類によって異なる影響を与えると考えられる。

Ｃ２Ｃ１２細胞における、アデノウイルスベクターによるＢＭＰ２の発現は、ＮＥＬＬ１の発現とは異なり、ＢＭＰ−Ｒ１ｂおよびＲ２レセプターの遺伝子発現を誘導し、ＮＥＬＬ１は骨形成においてＢＭＰ２と共に相乗的に作用すると考えられ［９］、ＮＥＬＬ１がＢＭＰ−Ｒ１ｂおよびＲ２とは異なる独自のレセプターを有することが示唆された。実際、精製したＮＥＬＬ１ホモログであるＮＥＬＬ２は、インビボの表面プラズモン共鳴アッセイにおいて、可溶性形態のＢＭＰ−Ｒ１と相互作用しなかった［２５］。また、ＮＥＬＬ２も６つのＥＧＦ様ドメインを含むものの（図１参照）、ＮＥＬＬ２は免疫沈降アッセイにおいてＥｒｂＢスーパーファミリー（ＥｒｂＢ−１〜４）と相互作用しなかった。したがって、ＴＧＦβスーパーファミリーレセプターもＥｒｂＢファミリーもＮＥＬＬ１／２レセプターの候補から除外され得る。図１５に示すように、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨ免疫沈降においてチロシン残基のリン酸化タンパク質が発見された。チロシン残基のリン酸化は、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質（２分以内）による処理の直後に起こる。このことから、推定ＮＥＬＬ１レセプターがチロシンキナーゼまたはチロシンホスファターゼの近くに存在し、ＮＥＬＬ１の結合の際にこれらと関連することが示唆される。最近、多様な細胞外基質タンパク質（たとえばラミニン５、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ＴＳＰ１／２）がインテグリン ファミリーと相互作用することがわかった［２６］。リガンド結合性インテグリンは、Ｆｏｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｋｉｎａｓｅ（ＦＡＫ）を活性化した後にＭＡＰＫカスケードを間接的に活性化することによってシグナルを伝達し、次いでＣｂｆａ１を通じて骨分化へと導く［２７］。また、機械力によって誘発されたシグナルは、インテグリンからＣｂｆａ１への同様のシグナリングカスケードを利用する［２８］。ｈＮＥＬＬ１と様々な細胞外基質タンパク質とのアミノ酸配列比較（図１）において、ｈＮＥＬＬ１（ａａ ８５-１７４）のＮ末端領域は細胞外基質タンパク質のラミニンＧドメインと高い類似性を示した［２９］。特に、ヒトＴＳＰ１ は、ｈＮＥＬＬ１の対応領域と最も高い同一性を示した。ラミニンＧドメインは、インテグリンおよび６７ｋＤａラミニンレセプターとの相互作用において機能する［３０］。ＴＳＰ１およびＳＰ２の突然変異分析によって、ｈＮＥＬＬ１の同様の位置に保存されている、β鎖ＤとＥとの間のグルタミン酸残基（Ｇｌｕ−９０）がインテグリンα６β１との相互作用にとって重要であることが示された［２６］（図１）。合わせて考えると、本論文において報告した結果は、ＮＥＬＬ１がＭＡＰＫ やＣｂｆａ１とは関与するがＢＭＰレセプターやＳｍａｄとは関与しない経路を通じて骨形成シグナルを伝達する新規な骨形成因子であることを示す。また、インテグリン関連分子およびチロシンキナーゼがＮＥＬＬ１特異的なレセプターとの結合によって誘発されるＮＥＬＬ１シグナリングカスケードに関与するようである。

（実施例３：大腿骨欠損モデルへのＮＥＬＬ１の移植）
本実施例では、大腿骨欠損モデルへのＮＥＬＬ１の移植を実施した。

（大腿骨欠損モデルの作製）
本実施例では、ＮＥＬＬ１として、実施例１により得られたＮＥＬＬ１−ＶＨを用いた。

８週齢雄性ウィスターラット(体重約３００ｇ）（埼玉実験動物）３０匹を使用した。これらのラットに、ネンブタールを腹腔内に投与することにより全身麻酔をおこなった。ラットの大腿外側に皮切を加えた（約４ｃｍ）。筋肉間を鈍的に剥離して、大腿骨面を全周にわたって露出させた。チタン製マイクロプレート（５穴）（マイクロアダプテーションプレート、シンセス（株）医療用品承認番号２０７００ＢＺＹ００５５８０００）を大腿骨に適合させた。チタン製マイクロプレートの中央の１穴を残し、４本のスクリュー（ＭＦコーテックスクリュー、シンセス（株）医療用品承認番号２０７００ＢＺＹ００５５８０００）を使用して、プレートを固定した。次いで、中央の１穴に相当する部分の大腿骨をバーを用いて切除した。大腿骨の連続性を５ｍｍの範囲で完全に失わせた（区域切除）（図１６を参照のこと。）。

（大腿骨欠損部位へのＮＥＬＬ１の移植）
大腿骨の一部を切除することによって生じた骨欠損部に、２％ ＮＥＬＬ１または１０％ ＮＥＬＬ１（それぞれ、タンパク重量２μｇ、１０μｇ）を滴下したコラーゲンスポンジ（５立方ミリメートル、ＨＥＬＩＳＴＡＴ、白水貿易株式会社、コード４３５０００１０）を挿入した（図１７）。移植部位を、筋肉、皮膚の順に縫合し、閉創した。

ＮＥＬＬ１移植後、１週間、３週間、５週間および６週間に、島津製作所ＳＭＸ−９０ＣＴを用いて、コンピュータ連動断層撮影を行った。

その結果、移植後３週間では、骨形成の兆候として島状の骨片が確認できた（図１８左、矢印先端部を参照のこと。）。移植後５週間では、プレート上部を覆う骨が観察され（図１９矢印Ａ）、移植部位の骨のアイランドは大きくなった（図１９矢印Ｂ）。移植後６週間では、プレート上部の骨は更に肥厚した（図２０矢印Ａ）。図２０矢印Ａ付近において、亀裂に見える部分は、下記の光学顕微鏡観察で軟骨の板と判明した。新生した骨は、欠損部位の両端に到達した（図２０矢印Ｂ）。コラーゲンスポンジは、生体親和性がよいものの、添加物質（ここでは、ＮＥＬＬ１）の局所維持に劣るという性質があるが、本実施例では、ＮＥＬＬ１を投与すると、充分に骨形成が生じることが実証された。

欠損部位において新生した骨体積を測定するために、ＮＥＬＬ１移植後、４週間または７週間において、移植部位を切開し、大腿骨を摘出した（図２１）。摘出した大腿骨では、骨の連続性が確認できた。

骨体積測定は、３Ｄ解析ソフトＴＲＩ／３Ｄ−ＶＩＥ（ラトックシステムエンジニアリング株式会社製）にて３Ｄ高速表示による、新生骨形成状況の３Ｄ描写にて撮影して行う。

（組織学的検索）
ＮＥＬＬ１移植の４週間後に摘出した大腿骨を、プランクリコル脱灰液にて４８時何脱灰後、常法に従いパラフィン包埋し、薄切し、ＨＥ染色に供した。

その結果、プレート上部に肥厚箇所が認められ、アイランドが形成されていることが確認できた（図２２および２３）。ＨＥ組織写真において青く染まる部位は、軟組織である。大腿骨の発生・成長は軟骨内骨化で行われることから、ＮＥＬＬ１移植部位には、正常に近い修復像を示す、軟骨内骨化が誘導されたことが確認できた（図２４）。移植部位には、炎症反応は認められなかった。生体内にＮＥＬＬ１を投与した場合、投与された硬組織形成部位と軟組織の両方において炎症像がみられないことを確認した。（大腿骨の皮質骨（殻）に相当する部位において、骨修復中にハバース系が確認されることからも、ＮＥＬＬ１による骨修復が正常に近い修復であることが確認できた（図２５）。加えて、上皮組織において、ＢＭＰとＮＥＬＬ１とにおいて、皮内注射実験により炎症有無を確認する。

（まとめ）
本実施例の結果より、ＮＥＬＬ１を使用することで、これまで修復不能な大規模骨欠損を修復できることがわかった。

ＣＴ像の結果から、骨修復は、ＢＭＰと同様に既存の骨を覆う形で進行することが分かった。さらに、顕微鏡像から、ＮＥＬＬ１による骨形成では、軟骨内骨化を伴う修復像がみられるので、異常骨形成像ではなく、正常な骨形成が誘導されたことが確認された。また、外側を覆う骨においてハバース系が確認されたことからも、ＮＥＬＬ１による骨形成が異常骨形成でないことが確認された。

（比較例Ａ ＮＥＬＬ１を含まないコラーゲンスポンジの移植）
ＮＥＬＬ１を含まないコラーゲンスポンジを移植すること以外、実施例３と同様の方法により実施した。

コラーゲンスポンジは、ＮＥＬＬ１のかわりに、生理食塩水を含ませた。

移植の１、３、４週間においてＣＴ画像を撮影した。

その結果、移植１、３、４週間後において、固定したチタンプレート、ビス・ワイヤーのみが確認され、欠損部位には骨の形成は認められなかった（図１８左および図２６）。

ＮＥＬＬ１を使わない対象群では、平均して２週で骨形成が見られず、４週より後に骨形成がみられた。このことから、ＮＥＬＬ１を使用すると、ＮＥＬＬ１を使用しないときと比較して、骨修復速度は２倍以上となったことが確認できた。

骨形成の有無および組織学的検索についても、実施例３と同様の方法を用いて実施することができる。

（比較例Ｂ 頭蓋骨欠損モデルへのＮＥＬＬ１の移植）
ＮＥＬＬ１を頭蓋骨欠損部位に移植すること以外、実施例３と同様の方法により行った。

（頭蓋骨欠損モデルの作製）
８週齢雄性ウィスターラット(体重約３００ｇ）を３０匹使用した。ネンブタールを腹腔内に投与することにより全身麻酔を行った。これらのラットの後頚部に皮切を加え（約４ｃｍ）、骨膜を保存して、頭蓋骨を全周にわたって露出させた。直径１０ｍｍのトレフィンバー（トレフンバー ＢＴ１００デンティック株式会社）を用いて、頭蓋骨中央に円形の骨欠損を作製した。

（頭蓋骨欠損部位へのＮＥＬＬ１の移植）
頭蓋骨を切除することによって生じた骨欠損部に、ＮＥＬＬ１（５μｇ、１０μｇ、２５μｇ、および５０μｇを滴下したコラーゲンスポンジ（５立方ミリメートル、ＨＥＬＩＳＴＡＴ、白水貿易株式会社、コード４３５０００１０）を挿入した。移植部位を、骨膜、皮膚の順に縫合し、閉創した。

コントロールとして、ＮＥＬＬ１を含まないコラーゲンスポンジを移植した。

実施例３と同様の方法を用いて、移植の４週間後、ＣＴ画像を撮影した（図２７〜２９）。ＮＥＬＬ１を含むコラーゲンスポンジを移植したラット頭蓋骨において、骨形成が確認された。ＮＥＬＬ１をふくまないものでは、骨形成は確認できなかった。

実施例３と同様の方法を使用して、骨体積を測定した。骨体積測定の結果を以下の表１に示す。術後４週で５μｇ投与群がもっとも多く硬組織形成を行った（図３０）。

（表１）
ＮＥＬＬ１投与量（μｇ） 欠損部体積に対する新生骨体積（％）
５ ２５．１
１０ １．４
２５ ５．４
５０ １４．５５
（組織化学的検索）
移植の２週間後または４週間後に、移植部位を切開し、頭蓋骨を摘出した。実施例３と同様にしてパラフィン包埋し、薄切してＨＥ染色に供した。その結果、ＮＥＬＬ１を含むコラーゲンスポンジを移植した頭蓋骨には、骨形成が確認され、ＮＥＬＬ１をふくまないものでは、骨形成は確認できなかった（図３１および３２）。

ＮＥＬＬ１は、頭蓋骨の成長・発生過程を再現して、膜内骨化（皮質骨ができる）により骨を修復したことが確認できた。ＮＥＬＬ１ １０μｇ投与（移植２週間後）、５μｇ投与投与（移植２または４週間後）においても、軟骨を伴わない膜内骨化がみられた。また、移植の術中の傷に対しても、炎症は誘発されなかった（図３２）。

（実施例３および比較例のまとめ）
大腿骨と頭蓋骨の２種骨の形成における意義を検討した。

大腿骨は中胚葉由来で軟骨板（骨端軟骨）にて軟骨内骨化により骨形成が行われる。頭蓋骨は外肺葉から新しく中胚葉に陥入した神経堤由来であり、線維性組織による膜内骨化から骨形成が行われる。大腿骨と頭蓋骨は由来の異なる細胞から骨が誘導される。

本実施例および比較例では、大腿骨（軟骨内骨化部位）および頭蓋骨（膜内骨化部位）で、ＮＥＬＬ１により骨誘導をおこない、両部位における骨誘導を比較した。その結果、頭蓋骨修復では軟骨誘導が見られず、大腿骨修復で大きな軟骨板（骨端軟骨）を持つことを発見した。軟骨内骨化部位と膜内骨化部位の両方において、正常な成長・発生機序を経た修復がなされたことも確認された。

ＮＥＬＬ１の移植では、術中の傷に対し炎症は誘発されず、損傷修復に対してのみ、影響を与えることが示唆された。このことから、ＮＥＬＬ１は、生体が本来持つ治癒能力を阻害せずに、特に骨に対して、高効率・安全に治癒を促すことが示唆される。

また、ＮＥＬＬ１をコラーゲンスポンジに浸透して投与しても炎症や異常な治癒を起こさないことから、広範囲なキャリア（ゲル、シートなど）、広範囲な生体部位、広範囲な疾患についても適用可能であると考えられる。

本実施例では、頭蓋骨欠損モデルにおいて５μ、１０μ、２５μ、５０μｇをコラーゲンスポンジに添加し、骨形成を観察したところ、術後４週で５μ投与群がもっとも多く硬組織形成を行った。

従来の報告から、直径１０ｍｍ程度の欠損は、ＢＭＰでは２０〜５０μｇ投与必要とされる。ＮＥＬＬ１では、生体内の骨形成は少なくとも１／４投与量で誘導された。

特許文献２において報告された培養細胞上でＢＭＰを用いた場合のＡＬＰ活性（特許文献２図２０）と比較すると、ＮＥＬＬ１ ３７ｎｇがＢＭＰ１００ｎｇと同等の活性誘導能をもつことがわかった。ＮＥＬＬ１ ７４ｎｇでは、ＢＭＰ１００ｎｇの約２０％増の活性誘導となることからも裏付けられる。また、本発明のＮＥＬＬ１とＢＭＰ２の培養細胞上での比較は、モル濃度比でおよそ１０倍と見積もることができる（図１０Ａ）。

（実施例４：マウスＮＥＬＬ１およびラットＮＥＬＬ１の産生および精製）
本実施例では、マウスＮＥＬＬ１およびラットＮＥＬＬ１の産生および精製を行う。

ＮＥＬＬ１のｃＤＮＡについて、マウスＮＥＬＬ１およびラットＮＥＬＬ１を用いること以外、実施例１と同様の方法を用いて実験を行う。

まず、マウスおよびラットのＮＥＬＬ１ ｃＤＮＡを、各々、ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによって単離する。ＮＥＬＬ１ ｃＤＮＡフラグメントを、発現ベクターのプロモーターの下流に挿入し、Ｃ−末端をタグ化した形態を生産する。次に、細胞を、得られたプラスミドでトランスフェクトし、無血清培地でインキュベートする。抗生物質を培地に添加し培養して抗生物質耐性細胞を選択する。ＮＥＬＬ１−タグ化タンパク質の細胞外産生をモニタリングするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングに供する。実施例１と同様の方法を使用して、ＮＥＬＬ１−タグ化タンパク質を大規模でアフィニティ精製する。得られたタンパク質が目的するＮＥＬＬ１であることを確認する。

（脱グリコシル化）
実施例１と同様の方法を用いて、脱グリコシル化を行う。

（シグナルカスケードの検討）
実施例２と同様の方法を使用して、オステオマーカーの誘導、ＭＡＰＫの活性化、ＯＰＮ発現に関するＭＡＰＫインヒビターの影響、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化、Ｃｂｆａ１のリン酸化、チロシンリン酸化タンパク質の迅速な蓄積について検討する。

（移植実験）
実施例３と同様の方法を使用して、ウィスターラットに大腿骨欠損部を作製する。作製された骨欠損部に、本実施例において得られたマウスＮＥＬＬ１またはラットＮＥＬＬ１を滴下したコラーゲンスポンジを移植する。

移植後、ＣＴ画像を経時的に撮影し、骨形成の有無を確認する。さらに、骨の体積を測定する。

移植後、数週間後に、移植した大腿部を摘出する。骨形成の状態を組織学的に検索するために、乗法にしたがって、ＨＥ染色に供する。

コントロールとして、ＮＥＬＬ１を含ませないコラーゲンスポンジを骨欠損部位に移植し、同様の検索を実施する。

膜内骨化により骨修復が起こる部位（例えば、頭蓋骨）についても、比較例Ｂと同様の方法によって、骨欠損部位を作製し、実施例４により得られたマウスまたはラットのＮＥＬＬ１およびコラーゲンスポンジを移植する。移植後、実施例３と同様の方法を用いて、ＣＴ撮影、骨体積測定、ＨＥ染色により骨形成の有無、およびその状態を確認する。

（実施例５：骨治療剤の移植）
本実施例では、本発明の骨治療剤の移植を実施する。

実施例１および実施例４において産生したＮＥＬＬ１を単独あるいはキャリア（例えば、コラーゲンスポンジ等）とともに、インフォームドコンセントを得た骨障害をもつヒト患者または他の実験動物（たとえば、ラット）の病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術または歯槽骨再生に移植する。

移植後、実施例３と同様の方法を用いて、ＣＴ撮影、骨体積測定、ＨＥ染色により骨形成の有無、およびその状態を確認する。

（実施例６：炎症を起こさずに骨形成を促進する因子のスクリーニング）
本実施例では、炎症を起こさずに骨形成を促進する因子のスクリーニングを行う。

炎症を起こさずに骨形成を促進する因子をスクリーニングために、以下の実験を行う。候補化合物となる化合物を準備する。この候補化合物についてＭＡＰキナーゼの活性化能を検出する。そのプロトコールは以下のとおりである。

溶解した細胞内に、リン酸化されたＭＡＰＫファミリーに属するタンパク質がどの程度存在するかを以下の方法で確認する。

細胞溶解液を遠心分離によって不溶画分を除き、可溶画分を得る。

この可溶画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗リン酸化ＭＡＰＫ抗体を用いたウエスタンブロッティング法に供し、リン酸化されたＭＡＰＫファミリーに属するタンパク質がどの程度存在するかを解析する。

また、上記方法で得た可溶画分を、サンドイッチイライザ法を用いた方法に供し、リン酸化されたＭＡＰＫファミリーに属するタンパク質を定量する。

次いで、この候補化合物について、Ｓｍａｄの活性化能を検出する。そのプロトコールは以下のとおりである。

Ｓｍａｄファミリーに属するタンパク質を発現している細胞に、スクリーニング対象ライブラリーを添加し、１０−６０分後にその細胞を溶解する。あるいは、Ｓｍａｄファミリーに属するタンパク質を発現していない細胞においても、それらのタンパク質を発現させるベクターを遺伝子導入することにより上記細胞と同様の実験を行うことができる。

溶解した細胞内に、リン酸化されたＳｍａｄファミリーに属するタンパク質がどの程度存在するかを以下の方法で確認する。

細胞溶解液を遠心分離によって不溶画分を除き、可溶画分を得る。

得られた可溶画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および抗リン酸化Ｓｍａｄ抗体を用いたウエスタンブロッティング法に供し、リン酸化されたＳｍａｄファミリーに属するタンパク質がどの程度存在するかを解析する。

また、上記方法で得た可溶画分を、サンドイッチイライザ法を用いた方法に供し、リン酸化されたＳｍａｄファミリーに属するタンパク質を定量する。

この候補化合物から、ＭＡＰキナーゼを活性化し、かつＳｍａｄを活性化しない化合物を選択する。選択のプロトコールは以下のとおりである。

上記方法によってＭＡＰＫ活性化脳を持ち、Ｓｍａｄ活性化脳を持たない化合物を、上記に記載の通りの実験から骨誘導脳を測定し、新規骨再生薬剤の候補化合物としてスクリーニングを行う。

スクリーニングにより得られた因子が、炎症を起こさずに骨形成を促進するか否かを検討する。この検討は、実施例３に記載された方法に基づいて行うことができる。

（実施例７：製剤化）
本実施例では、ＮＥＬＬ１または実施例６でスクリーニングして得られる化合物の製剤化の実験を行う。

製剤化について、種々の条件（例えば、ｐＨ、等張性、安定性）などを考慮することは、当業者の技術範囲内である。適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム（ベータＴＣＰとも称される。）、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物およびポリ乳酸−ポリエチレングリコール（ＰＬＡ−ＰＥＧとも称される。）が挙げられる。本発明は、コラーゲンスポンジなどを使用する場合は、医療器具の形態にすることができる。これらの製剤化の技術は当該分野の公知技術を用いて実施することができる。

以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

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本発明は、骨髄炎、骨腫瘍における病巣掻爬、切除後の骨欠損の補填（整形外科、形成外科、口腔外科）で使用される。本発明は、現在使用されている、海綿骨、ブロック骨、血管柄付移植骨の代用として使用される。本発明は、骨折の治癒遷延、偽関節に対して（整形外科、形成外科、口腔外科）使用される。本発明は、仮骨延長術（整形外科、形成外科、口腔外科）に使用される。本発明は、骨系統疾患による下肢長左右差、奇形による顎骨劣成長に対して、延長部の骨化促進を目的として使用される。本発明は、人工関節置換術（整形外科）に使用される。本発明は、変形性関節症、関節リウマチ、大腿骨頭壊死症に対する、全関節置換術において、骨セメントの代用、あるいは関節再生を目的として使用される。本発明は、脊椎固定術（整形外科）に使用される。本発明は、脊椎脱臼骨折、脊椎カリエス、脊椎腫瘍、椎間板症、椎間板ヘルニア、脊椎すべり症に対する、椎間固定材料として使用される。本発明は、軟骨移植（形成外科）に使用される。本発明は、各種奇形、外傷後の再建（鼻翼、耳介）に対して使用される。本発明は、顎裂骨移植（形成外科、口腔外科）に使用される。本発明は、唇顎口蓋裂等の奇形における、顎骨欠損部の補填を目的として使用される。本発明は、外傷による骨欠損部補填（整形外科、形成外科、口腔外科）粉砕骨折部の再建を目的として使用される。本発明は、開頭術後骨欠損補填（脳外科）に使用される。本発明は、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術（歯科）に使用される。本発明は、人工歯根（インプラント）埋入に際し、骨量の不足を補填することを目的として使用される。本発明は、歯周病における歯槽骨再生（歯科）、歯周病により吸収された歯槽骨の再生を目的として使用される。

以上のように、本発明は、医薬品産業において大いに利用される可能性が存在する。

図１は、ｈＮＥＬＬ１の模式的構造およびラミニンＧファミリータンパク質との配列比較である。タンパク質モチーフを、ＳＭＡＲＴウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ／）にてアクセス可能なＳＭＡＲＴデータベースにおいてサーチし、ラミニンＧドメイン（ＬＧ）、フォン・ビルブラント因子Ｃドメイン（Ｖ）、ＥＧＦ様ドメイン（Ｅ）およびＣａ^２＋結合ＥＧＦ様ドメイン（Ｅ＊）のボックスにより示した。シグナルペプチド（ａａ１−１９）は、グレイのバーにより示した。ラミニンＧドメインの部分的な配列アライメントを、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎのウェブサイトにて利用可能なＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス（ｈｔｔｐ：／／ｃｌｕｓｔａｌｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）を用いて、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプロトコールにより実施した。ｈＮＥＬＬ１、ヒトＮＥＬＬ１；ｈＬＡＭＡ３、ヒトラミニンα３鎖；ｍＬＡＭＡ３、マウスラミニンα３鎖；ｈＣＯＬＡ１、ヒトＩＩ型コラーゲンα３鎖；およびｈＴＳＰ１、ヒトトロンボスポンジン−１。ラミニンＧドメインのコア領域の残基数を余白に示した。βストランド（Ｃ〜Ｊ）についてのストランド割当ては、Ｈｏｈｅｎｅｓｔｅｒら［２９］に従った。保存されたアミノ酸残基は、網掛けにした。インテグリンα６β１に対する結合部位として推定されたグルタミン酸残基は太字で示す。 図２は、ヒトＮＥＬＬ１プラスミド構築の概略図を示す。 図２は、ヒトＮＥＬＬ１プラスミド構築の概略図を示す。 図２は、ヒトＮＥＬＬ１プラスミド構築の概略図を示す。 図３は、蛍光顕微鏡下において、共発現させたＧＦＰの発現を示す。 図４は、構築した発現細胞の培養上清に目的物が発現していることを示すウエスタンブロティングを示す。 図５は、イミダゾール濃度１００〜５００mMで溶出した時のウエスタンブロッティングを示す。 図６は、精製してきたタンパク質が、非還元下において、３量体を形成していることを示す電気泳導およびウエスタンブロティングを示す。 図７は、LC-MS/MS分析に用いたバンドの電気泳動およびウエスタンブロッティングを示す。 図８は、大量生産により精製した各バッチの電気泳導およびウエスタンブロッティングを示す。 図９は、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質の精製を示す。Ａ：精製したｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質（４μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ＣＢＢ Ｒ−２５０で染色した。Ｂ：変性され還元したｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質（２μｇ）をＮ−グリコシダーゼおよび／またはＯ−グリコシダーゼで、室温にて３時間処理し、抗Ｖ５タグ抗体を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。レーン１，グリコシダーゼなし；レーン２，Ｎ−グリコシダーゼ；レーン３，Ｏ−グリコシダーゼ；レーン４，Ｎ−グリコシダーゼ＋Ｏ−グリコシダーゼ。 図１０は、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨによるオステオマーカーの誘導を示す。ＲＦＣ細胞を、種々の濃度（もしくは、ＢおよびＣでは１００ｎｇ／ｍｌ）の精製したｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質または１００ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ２タンパク質で処理した。Ａ：３日目の培養細胞における細胞内ＡＬＰ活性を測定した。Ｂ：６日目の培養培地に分泌されたＯＰＮの量を測定した。Ｃ：９日間目の培養培地に分泌されたＯＣＮの量を測定した。各値は、少なくとも４回の測定の平均±ＳＥＭを示す。アスタリスク（_＊）は、そのデータがコントロールと比べて有意差があることを示す（ｐ＜０．００５、ｔ検定）。 図１１は、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨによるＭＡＰＫの活性化を示す。ＲＦＣ細胞（Ａ）、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞（Ｂ）およびＳａｏｓ−２細胞（Ｃ）を、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質または１００ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ２タンパク質で示した時間処理した。細胞溶解物（１５μｇタンパク質）を、抗リン酸化ＥＲＫ１／２抗体（ｐ−ＥＲＫ１／２）、抗リン酸化ＪＮＫ１／２／３抗体（ｐ−ＪＮＫ１／２／３）および抗リン酸化ｐ３８α／β／γ抗体（ｐ−ｐ３８）のいずれかを用いるウエスタンブロッティングにより分析した。抗ＥＲＫ１／２抗体（ＥＲＫ１／２）、抗ＪＮＫ１／２／３抗体（ＪＮＫ１／２／３）、抗ｐ３８α／β／γ抗体（ｐ３８）および抗βアクチン抗体（Ａｃｔｉｎ）を、内部コントロールとして使用した。すべての実験を、４回以上繰り返した。代表的なデータを示す。 図１２は、ＯＰＮ発現に対するＭＡＰＫインヒビターの影響を示す。ＲＦＣ細胞を、ＭＥＫ１／２インヒビターＰＤ９８０５９（２０μＭ）、ＪＮＫインヒビターＳＰ６００１２５（２５μＭ）、またはｐ３８インヒビターＳＢ２０３５８０（２０μＭ）のいずれかで１時間、前処理し、次いで、１００ｎｇ／ｍｌ ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質または１００ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ２タンパク質で６日間、処理した。培養培地に分泌されたＯＰＮの量を測定した。各値は、３度の測定の平均±ＳＥＭを示す。アスタリスク（_＊）は、そのデータがコントロールと比べて有意差があることを示す（ＤＭＳＯ、ｐ＜０．００５、ｔ検定）。 図１３は、Ｓｍａｄタンパク質のｈＮＥＬＬ１−ＶＨを示す。ＲＦＣ細胞（Ａ）およびＳａｏｓ−２細胞（Ｂ）を１００ｎｇ／ｍｌ ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質または１００ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ２タンパク質で、示した時間、処置した。細胞溶解物（１５μｇタンパク質）を、抗リン酸化Ｓｍａｄ１／５／８抗体（ｐ−Ｓｍａｄ１／５／８）、抗Ｓｍａｄ１／５／８抗体（Ｓｍａｄ１／５／８）、および抗アクチン抗体（Ａｃｔｉｎ）を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。全ての実験を少なくとも３回繰り返した。代表的なデータを示す。Ｃ：Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞を１００ｎｇ／ｍｌ ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質または１００ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ２タンパク質を用いて、３７℃で１時間処理した。Ｓｍａｄ４の細胞内局在化を、抗Ｓｍａｄ４抗体およびＡｌｅｘａ−５４６結合体化抗マウスＩｇＧ抗体を用いる免疫細胞化学法により分析した（バー、５０μｍ）。Ｄ：Ｉｄ１−９８５プロモーターまたは変異Ｉｄ１（Ｉｄ１−９８５ＭｕｔＢ）プロモーター下でルシフェラーゼ遺伝子で形質転換したＲＦＣ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質あるいは１００ｎｇ／ｍｌ ｈＢＭＰ２タンパク質で２４時間処理した。Ｓｍａｄ依存型転写活性を、細胞内ルシフェラーゼ活性として決定した。各値は、４回の測定の平均±ＳＥＭを示す。アスタリスク（_＊）は、そのデータが、コントロールと比べて有意差があることを示す（ｐ＜０．００５、ｔ検定）。 図１４は、Ｃｂｆａ１のリン酸化を示す。ＲＦＣ細胞を、２０μＭ ＭＥＫインヒビターＰＤ９８０５９とともに、またはＭＥＫインヒビターＰＤ９８０５９なしで、１００ｎｇ／ｍＬ ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質または１００ｎｇ／ｍＬ ｈＢＭＰ２タンパク質で処理した。抗リン酸化セリン抗体（Ａｎｔｉ−ｐＳｅｒ）（上パネル）または抗Ｃｂｆａ１抗体（Ａｎｔｉ−Ｃｂｆａ１）（下パネル）を用いるウエスタンブロッティングにより抗Ｃｂｆａ１免疫沈降物を分析した。全ての実験を、４回以上繰り返した。代表的なデータを示す。 図１５は、ｈＮＥＬＬ１−ＶＨと相互作用するチロシンリン酸化タンパク質の検出を示す。ＲＦＣ細胞を１００ｎｇ／ｍｌ ｈＮＥＬＬ１−ＶＨタンパク質で、０、２および５分間処理した。細胞溶解物を、抗Ｖ５抗体を用いる免疫沈降に供し、抗リン酸化チロシン抗体４Ｇ１０を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。親和性レジンから放出されたプロテインＧを、非特異的バンドとして検出した（白アスタリスク）。チロシンリン酸化タンパク質は、矢印で示した。 図１６は、骨全周を５ｍｍ幅で欠損させて骨欠損モデルを作製したときの写真である。 図１７は、コラーゲンスポンジと希釈したＮＥＬＬ１タンパクを欠損部に充填したときの写真である。 図１８は、ＣＴによる３Ｄ像であり。生きたまま撮影をおこなった。ＮＥＬＬ投与群では矢印部にアイランド状の新生骨が観察される。 図１９は、ＣＴによる３Ｄ像である。欠損部周囲を新生骨が取り囲む矢印Ａ側は新生骨がプレートを覆う。Ａ、Ｂ両方でアイランド状骨周囲Ｘ線透過領域は軟骨である。 図２０は、ＣＴによる３Ｄ透過像である。欠損部周囲を新生骨が取り囲む矢印Ａ側は新生骨がプレートを覆う。Ａ、Ｂ両方でアイランド状骨周囲Ｘ線透過領域は軟骨である。 図２１は、大腿骨摘出時の写真である。プレートとそれを覆う骨が観察される。 図２２は、ＨＥ像である。摘出後の骨をＨＥ染色したもの 図２３は、ＨＥ像である。摘出後の骨をＨＥ染色したもの矢印部は軟骨板 図２４は、ＨＥ像である。骨・軟骨境界部の拡大、正常な軟骨内骨化による骨形成が確認される。 図２５は、ＨＥ像である。皮質骨と軟骨の境界領域を拡大したもの、軟骨に接した皮質骨はハバース系と骨細胞がみられ正常皮質骨形態である。 図２６は、ＣＴによる３Ｄ像である。ＮＥＬＬ１を投与しない場合は２、４週ともに骨形成がみられない。 図２７は、ＣＴによる３Ｄ像である。頭蓋骨欠損部ではＮＥＬＬ１投与群に矢印部で骨形成がみられる。（頭頂側からの観察） 図２８は、ＣＴによる３Ｄ像である。頭蓋骨欠損部ではＮＥＬＬ１投与群に矢印部で新生骨形成がみられる。（断面像） 図２９は、ＣＴによる３Ｄ像である。頭蓋骨欠損部ではＮＥＬＬ１投与点線で囲む新生骨形成がみられる。（頭頂側からの観察と断面像） 図３０は、術後４週における１欠損あたりの５，１０，２５，５０μグラム投与時における、新生骨体積の比較を示す。 図３１は、ＨＥ像である。投与群では新生皮質骨が確認される。 図３２は、ＨＥ像である。写真Ａ，Ｂでは投与群の新生皮質骨が確認される。写真Ｃでは軟組織部における線維性治癒が観察され、炎症は見られない。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。 実施例において精製したタンパク質が、ヒトＮＥＬＬ１であることを同定したＭａｓｃｏｔ解析の結果を示す。

配列番号１：ヒトＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基１３５〜１８２、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１８３〜２５６４である。
配列番号２：ヒトＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜１６、成熟ペプチドは残基１７〜８１０である。
配列番号３：マウスＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基４０〜１０２、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１０３〜２４７２である。
配列番号４：マウスＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜２１、成熟ペプチドは残基２２〜８１０である。
配列番号５：ラットＮＥＬＬ１の核酸配列である。シグナルペプチドをコードする領域は塩基５９〜１２１、成熟ペプチドをコードする領域は塩基１２２〜２４９１である。
配列番号６：ラットＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。シグナルペプチドは残基１〜２１、成熟ペプチドは残基２２〜８１０である。
配列番号７：実施例で使用したベクターの配列である。
配列番号８：Ｖ５タグおよびヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）の核酸配列である。
配列番号９：Ｖ５タグおよびヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）のアミノ酸配列である。
配列番号１０：Ｈｕｍａｎ ＮＥＬＬ１のオリジナルシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１１：Ｈｏｎｅｙ Ｂｅｅ Ｍｅｌｌｉｔｉｎのシグナルペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号１２：ツメガエルＮＥＬＬ１の核酸配列である。
配列番号１３：ツメガエルＮＥＬＬ１のアミノ酸配列である。
配列番号１４：ｈＨＥＬＬ１フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号１５：ｈＬＡＭＡ３フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号１６：ｍＬＡＭＡ３フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号１７：ｈＣＯＬＡ１フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号１８：ｈＴＳＰ１フラグメントのアミノ酸配列である。
配列番号１９：順方向プライマー＃２の配列である。
配列番号２０：順方向プライマー＃３の配列である。
配列番号２１：順方向プライマー＃４の配列である。
配列番号２２：順方向プライマー＃５の配列である。
配列番号２３：逆方向プライマー＃２の配列である。
配列番号２４：逆方向プライマー＃３の配列である。
配列番号２５：逆方向プライマー＃４の配列である。
配列番号２６：逆方向プライマー＃５の配列である。
配列番号２７：Ｖ５タグの配列である。
配列番号２８：ヒスチジンタグの配列である。
配列番号２９：実施例で使用したタグ部分の配列である。

Claims (39)

1. 炎症を起こさずに骨を処置するための、ＮＥＬＬ１を含む骨治療剤。
2. 前記骨は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とするものである、請求項１に記載の骨治療剤。
3. 前記骨は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とする疾患、障害または状態を有する、請求項１に記載の骨治療剤。
4. 病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術、歯槽骨再生または人工歯根周囲の顎骨再生において使用するための、請求項１に記載の骨治療剤。
5. 前記骨は、頭頂骨、側頭骨、蝶形骨、上顎骨、下顎骨、上腕骨、りょう骨、尺骨、手骨、鎖骨、胸骨、肋骨、寛骨、仙骨、尾骨、髄、大腿骨、膝蓋骨、腓骨、脛骨および足骨からなる群より選択される、請求項１に記載の骨治療剤。
6. 前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体を含む、請求項１に記載の骨治療剤。
7. 前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体と、Ｃ末端にタグ（配列番号９）とを含むポリペプチドである、請求項１に記載の骨治療剤。
8. 前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０と、Ｃ末端にタグとを含むポリペプチドである、請求項１に記載の骨治療剤。
9. ＮＥＬＬ１と薬学的に許容可能なキャリアとを含む、炎症を起こさずに骨を処置するための骨治療器具。
10. 前記キャリアが、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物、およびポリ乳酸−ポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項９に記載の骨治療器具。
11. 炎症を起こさずに骨を処置するための方法であって、骨処置を必要とする被験体にＮＥＬＬ１を投与する工程を包含する、方法。
12. 前記投与は、前記処置を必要とする部位にＮＥＬＬ１を含む骨治療剤を移植することによって達成される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記処置を必要とする部位は、頭頂骨、側頭骨、蝶形骨、上顎骨、下顎骨、上腕骨、骨、尺骨、手骨、鎖骨、胸骨、肋骨、寛骨、仙骨、尾骨、髄、大腿骨、膝蓋骨、腓骨、脛骨および足骨からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
14. 前記ＮＥＬＬ１は、薬学的に許容可能なキャリアとともに投与される、請求項１１に記載の方法。
15. 前記キャリアは、コラーゲンスポンジ、コラーゲンゲル、コラーゲン硬化物、アテロコラーゲン、ハイドロキシアパタイト、β−リン酸三カルシウム、オクタカルシウムホスフェイト、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チタンメッシュ、タンパク添加性チタン合金、合成スキャホールドペプチド、キチン、キチン化合物、およびポリ乳酸−ポリエチレングリコールからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ＮＥＬＬ１は、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり、０．００１μｇ〜３００μｇ（１．６μｇ〜５０ｇ／ｋｇ体重）以下で前記被験体に投与される、請求項１１に記載の方法。
17. 前記骨は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とするものである、請求項１１に記載の方法。
18. 前記処置は、治癒するのに軟骨内骨化の誘導を必要とする疾患、障害または状態に対するものである、請求項１１に記載の方法。
19. 前記処置は、病巣掻爬もしくは切除後の骨欠損補填、骨折の治癒遷延、偽関節、仮骨延長術、人工関節置換術、脊椎固定術、軟骨移植、顎裂骨移植、外傷による骨欠損部補填、開頭術後骨欠損補填、歯槽提形成術、上顎洞底挙上術、歯槽骨再生または人工歯根周囲の顎骨再生に対するものである、請求項１１に記載の方法。
20. ＮＥＬＬ１を生産する方法であって、該方法は、
    Ａ）ＮＥＬＬ１およびシグナル配列をコードする核酸をインフレームで作動可能に連結した核酸構築物を提供する工程；
    Ｂ）該核酸構築物を細胞に導入する工程；
    Ｃ）ＮＥＬＬ１を発現する条件下に、該細胞を配置する工程；および
    Ｄ）発現された該ＮＥＬＬ１を回収する工程
    を包含する、方法。
21. 前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列からなる群より選択されるアミノ酸配列またはその改変体をコードする、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、前記ＮＥＬＬ１が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０、マウスＮＥＬＬ１（配列番号４）の残基２２〜８１０、ラットＮＥＬＬ１（配列番号６）の残基２２〜８１０およびツメガエルＮＥＬＬ１（配列番号１３）の成熟配列を含むポリペプチドをコードする、請求項２０に記載の方法。
23. 前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）の残基１７〜８１０と、Ｃ末端にタグとを含むポリペプチドをコードする、請求項２０に記載の方法。
24. 前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１（ヒトＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の塩基１８３〜２５６４、配列番号３（マウスＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の塩基１０３〜２４７２、配列番号５（ラットＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の塩基１２２〜２４９１および配列番号１２（ツメガエルＮＥＬＬ１ ＤＮＡ）の成熟配列からなる群より選択される核酸を含む、請求項２０に記載の方法。
25. 前記ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）の残基１７〜８１０である、請求項２０に記載の方法。
26. 前記細胞が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来の細胞、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来の細胞、チャイニーズハムスター卵巣由来の細胞およびヒト胎児腎臓由来の細胞からなる群より選択される細胞である、請求項２０に記載の方法。
27. 前記細胞が、昆虫細胞である、請求項２０に記載の方法。
28. 前記細胞が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来の細胞である、請求項２０に記載の方法。
29. 前記細胞が、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞である、請求項２０に記載の方法。
30. さらに、Ｅ）前記回収したＮＥＬＬ１を精製する工程を包含する、請求項２０に記載の方法。
31. 前記Ｅ）工程は、
    Ｅ−ｉ）前記回収されたＮＥＬＬ１を、Ｎｉレジンアフィニティカラムにかける工程；および
    Ｅ−ｉｉ）１００ｍＭ〜１．５Ｍのイミダゾールで溶出する工程
    を包含する、請求項３０に記載の方法。
32. 前記Ｅ−ｉｉ）工程において、前記イミダゾールが、１００ｎＭ〜５００ｍＭの濃度である、請求項３１に記載の方法。
33. 前記シグナル配列が、前記ＮＥＬＬ１に対して内因性である、請求項２０に記載の方法。
34. 前記ＮＥＬＬ１およびシグナル配列をコードする核酸は、配列番号１の塩基１３５〜２５６４、配列番号３の塩基４０〜２４７２および配列番号５の塩基５９〜２４９１からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
35. ａ）Ｖ５タグ、ヒスチジンタグ、内因性シグナルペプチドをコードする核酸配列（配列番号１のヌクレオチド１３５〜２５６４、配列番号３のヌクレオチド４０〜２４７２または配列番号５のヌクレオチド５９〜２４９１）を含むＮＥＬＬ１（ｈＮＥＬＬ１） ｃＤＮＡを含む核酸構築物を提供する工程；
    ｂ）該核酸構築物によりＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞にトランスフェクトする工程；
    ｃ）ＮＥＬＬ１を発現することができる条件下で、該Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞を培養する工程；
    ｄ）該Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 由来のＢＴＩ Ｔｎ−５Ｂ１−４の細胞から分泌されたＮＥＬＬ１を含む培養上清を回収する工程；
    ｅ）回収されたＮＥＬＬ１を、Ｎｉレジンアフィニティカラムにかけ、５００ｍＭ イミダゾールで溶出することにより、回収された該培養上清から該ＮＥＬＬ１を精製する工程
    を包含する、請求項３０に記載の方法。
36. 炎症を起こさずに骨形成を促進する因子をスクリーニングする方法であって、
    Ａ）候補化合物を提供する工程；
    Ｂ）該候補化合物についてＭＡＰキナーゼの活性化能を検出する工程；
    Ｃ）該候補化合物について、Ｓｍａｄの活性化能を検出する工程；
    Ｄ）該候補化合物から、ＭＡＰキナーゼを活性化し、かつＳｍａｄを活性化しない化合物を炎症を起こさずに骨形成を促進する因子として選択する工程
    を包含する、方法。
37. 炎症を起こさずに骨形成を促進する因子の候補化合物を生産する方法であって、
    Ａ）候補化合物を提供する工程；
    Ｂ）該候補化合物についてＭＡＰキナーゼの活性化能を検出する工程；
    Ｃ）該候補化合物について、Ｓｍａｄの活性化能を検出する工程；
    Ｄ）該候補化合物から、ＭＡＰキナーゼを活性化し、かつＳｍａｄを活性化しない化合物を炎症を起こさずに骨形成を促進する因子の候補化合物として選択する工程を包含する、方法。
38. 炎症を起こさずに骨を処置するための骨治療剤の製造のための、ＮＥＬＬ１の使用。
39. 炎症を起こさずに骨を処置するための、ＮＥＬＬ１を含む骨治療処方物であって、該ＮＥＬＬ１は、骨欠損体積１平方ミリメートルあたり、０．００１μｇ〜３００μｇ（１．６μｇ〜５０ｇ／ｋｇ体重）以下で投与される、骨治療処方物。