KR101362129B1

KR101362129B1 - 혈청/글루코코르티코이드 조절 키나제의 용도

Info

Publication number: KR101362129B1
Application number: KR1020077013023A
Authority: KR
Inventors: 에카르트 바르트닉; 토마스 아이그너; 우베 디츠; 아네트 브리머
Original assignee: 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 2004-12-10
Filing date: 2005-12-01
Publication date: 2014-02-14
Also published as: WO2006061130A2; CA2590212A1; AU2005313576B2; IL212857A0; JP2008522596A; CN101073011A; KR20070085965A; DE102004059781A1; IL183466A; BRPI0518894A2; MX2007006680A; AU2005313576A1; WO2006061130A3; EP1825271B1; US20080274487A1; EP1825271A2; IL183466A0; JP4971991B2

Abstract

본 발명은 퇴행성 연골 변화의 예방 또는 치료를 위한 활성 성분의 탐색을 목적으로 하는, SGK 단백질, 이의 기능성 유도체 또는 단편, 또는 이러한 단백질, 단편 또는 유도체를 암호화하는 핵산의 용도에 관한 것이다.

퇴행성 연골, SGK 단백질, 혈청/글루코코르티코이드 조절 키나제

Description

혈청/글루코코르티코이드 조절 키나제의 용도{Use of a serum/glucocorticoid-regulated kinase}

본 발명은 활성 성분을 탐색하기 위한 혈청/글루코코르티코이드 조절 키나제(SGK)의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 관점은 퇴행성 연골 변화를 동정하는 방법 및 검사 키트에 관한 것이다.

혈청 및 글루코코르티코이드에 의해 유도되는 키나제 SGK-1은 1993년에 처음으로 래트 유방암종 세포주의 조기반응유전자(immediate early gene)로서 설명되었다(Webster et al., 1993a; Webster et al., 1993b). 이들 세포에는 글루코코르티코이드의 투여에 대한 조기반응으로서 SGK-1 유전자 활성이 유도되고, 이 결과로서 SGK-1 mRNA의 함량이 크게 증가한다. 또 다른 연구에서는 SGK-1과 이의 유도성이 다양한 세포주와 정상 조직의 세포에서도 모두 나타난다는 것을 밝힌 바 있다(Brennan et al., 2000; Naray-Fejes-Toth et al., 2000; Cooper et al., 2001; Mikosz et al., 2001). SGK-1은 지금까지 SGK-1, SKG-2 및 SKG-3으로서 언급되는 3개 구성원이 공지된 세린/트레오닌 키나제의 계열에 속한다. SGK-3은 SGKL(SGK 유사) 및 CISK라는 명칭으로 기재된다. 이것의 촉매 도메인에 있어서, 3개의 이소형(isoform)이 단백질 수준에서 서로 적어도 80%가 상동성이다.

SGK-1은 지금까지 검사된 거의 모든 조직에서 발현되지만, mRNA의 발현양은 함량은 조사된 조직 유형의 성질에 따라 크게 다르다(Gonzalez-Robayna et al., 1999; Waldegger et al., 1999; Alliston et al., 2000; Klingel et al., 2000; Lang et al., 2000; Loffing et al., 20001; Fillon et al., 2002; Warntges et al., 2002a). 또한, SGK-1 mRNA는 전형적인 배아 조직에서 발견된다. 마우스 배아형성 동안, SGK-1 mRNA는 배아의 특정 조직(탈락막, 난황주머니, 귀소포)에서 발생 동태적 변화를 나타내고, 폐아, 뇌, 심장, 간, 흉선 등의 기관형성 동안 검출이 가능하다(Lee et al., 2001). SGK-2는 상피 조직, 예컨대 신장, 간, 췌장 및 뇌의 특정 영역 등의 상피 조직에서 최대로 발현된다(Kobayashi et al., 1999b). SGK-3은 지금까지 검사된 모든 조직에서 검출되었고, 특히 성인 심장과 비장에서 발견되었다(Kobayashi et al., 1999b; Liu et al., 2000).

하지만, 퇴행성 또는 퇴행 연골 조직에서 SGK의 발현에 대한 증거는 아직까지 밝혀진 바가 없다.

골관절염(OA)은 가장 일반적인 퇴행성 관절 장애 중 하나이며 진행된 단계에서 관절 기능 상실을 유도한다. 이 질병의 만성기간에는 기저 골조직으로 진행되는 관절 연골의 파괴가 나타나, 이 질병에 걸린 환자는 관절 대체 수술을 받아야 한다. 연골 파괴외에도, 윤활막 및 인대에서도 병리학적 변화를 관찰할 수 있다. 이 질병은 류마티스성 관절염처럼, 일부 경우에 염증성 과정을 수반하지만 당해 관절염과는 다르다.

이 장애의 정확한 원인은 아직 알려지지 않았지만, 대사 변화, 기계적 스트 레스, 유전자 결함 또는 관절 손상 등과 같은 다양한 요인이 관여할 수 있다.

촉발원과 관계없이, OA의 일반적인 병리학적 특징은 관절 연골의 퇴화이다. OA 병리학적 상태의 주요 특징은 콜라겐 및 프로테오글리칸의 단백질 분해 절단이다. 이와 동시에, 동화작용성 복구 기작, 세포의 재생적 분화 또는 세포사와 같은 일련의 추가 전과정이 일어난다. 이러한 과정의 상세한 분자 기작은 여전히 완전하게 이해되지 못한 상태이다.

건강한 성인 연골의 기능은 고압에 대한 내성 및 이 조직의 필수적인 탄력성을 보장하는 고유 생체역학적 성질에서 유발된다. 이는 연골 조직의 특이적인 구성이 이에 대해 결정적이다. 대부분의 다른 조직과 달리, 연골세포는 직접 접촉해 있지 않고 세포외 기질(ECM)에 서로 별도로 매립되어 있다. 이 ECM의 거대분자는 관절 연골 및 관절의 작용 능력을 보증한다.

ECM의 기본 구조는 타입 II, IX 및 XI 콜라겐의 섬유로 형성된 그물구조로 이루어진다. 여기에 주로 어그리칸(aggrecan)인 프로테오글리칸이 매립되어 있어, 극히 높은 삼투성 수결합능을 갖게 된다. 이로 인해 발생되는 팽창압과 함께 콜라겐성 기본 구조 성질은 연골의 특이적인 성질을 보장한다.

OA의 발병기전의 주요 특징은 연골 및 관절 연골 조직에서의 ECM의 상실이다. 따라서, OA에 걸린 관절의 기능은 제한적이거나 상실된다. 또한, 이 질병 과정 중에는 통증과 같은 다양한 증상 변수가 나타난다.

현재 골관절염을 치료하는 방법은 대부분 증상적 호소증상의 경감에 국한되고 있다. 약물 치료를 기본으로 하는 연골 퇴행의 경감을 유도하는 원인 요법은 현 행 지식의 상태에 따라서는 불가능하다. 특히, 이러한 이유 때문에 골관절염의 예방 및/또는 치료를 위한 신규 활성 성분이 절실히 요구되고 있다. 또한, 가능하다면 이 질병 초기에 치료를 개시할 수 있도록 하기 위해 관절 연골의 퇴행성 변화를 조기에 확실하게 진단할 수 있는 가능성도 요구되고 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 퇴행성 연골 변화를 억제하는 활성 성분을 동정할 수 있는 신규 가능성을 제공하는 것이다.

이러한 목적은 퇴행성 연골 변화를 예방 또는 치료하는 활성 성분의 탐색에 있어서 SGK 단백질 또는 이의 기능성 유도체 또는 단편(또는 이러한 단편의 기능성 유도체), 또는 이러한 단백질, 이의 기능성 단편 또는 유도체를 암호화하는 핵산( 및 이의 기능성, 예컨대 안정화된 유도체)을 사용하여 본 발명에 따라 달성된다.

사람 SGK 유전자의 서열은 공지되어 있다. 이러한 유전자의 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열은 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스에서 번호 NM_005627, AF153609(SGK-1), AF169034, AF186470(SGK-2), NM_013257, AF085233, AF169035(SGK-3)로 전송받을 수 있다. 마찬가지로, 이의 단백질 서열은 번호 NP_005618(SGK-1), NP_733794, NP_057360(SGK-2), Q96BR1(SGK-3)로 NCBI 단백질 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 사람 SGK 유전자는 여러 염색체 위에 위치해 있다. SGK-1은 염색체 6 위에 위치해 있고(6q23), SGK-2는 염색체 20(20q13.2) 위에, SGK-3은 염색체 8(8q12.3-8q13.1) 위에 위치해 있다. NCBI는 국립 생명공학 정보 센터이다(주소: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; 웹 주소: www.ncbi.nhm.nih.gov). SGK-1 유전자의 클로닝은 특히 문헌[참조: Webster et al., 1993a; Waldegger et al. 1997; 1998]에 기술되어 있고; SGK-2 및 SGK-3의 클로닝에 대해서는 문헌[참조: Kobayashi et al., 1999b]에서 처음으로 기재되었다.

많은 다른 키나제 중에서 SGK를 구별하는 1가지 특징은 이 분자의 전사, 세포 국재화 및 효소 활성화(Firestone et al., 2003)가 엄중하게 자극에 의존하여 조절되는 특징이다.

SGK-1의 전사를 활성화시키는 것으로 알려진 자극은 다수가 공지되어 있다.

여기에는 미네랄로코르티코이드(Brennan et al., 2000; Shigaev et al., 2000; Bhargava et al., 2001), 고나도트로핀(Richards et al., 1995; Gonzalez-Robayna et al., 2000), 1.25(OH)₂D₃(Akutsu et al., 2001), p53, 삼투압 변화, 세포 부피 변화 및 저장성(hypotonic) 변화(Waldegger et al., 1997; Klingel et al., 2000; Waldegger et al., 2000; Rozansky et al., 2002; Warntges et al., 2002a), GM-CSF 및 TNF-알파와 같은 사이토킨(Cooper et al., 2001) 또는 TGF-베타(Kumar et al., 1999; Waldegger et al., 1999; Lang et al., 2000)가 있다. SGK의 유도는 또 다른 성장 의존적 시그널 전달 경로에서 혈청(Webster et al., 1993a), 인슐린 및 IGF-1(Kobayashi et al., 1999a; Park et al., 1999; Perrotti et al., 2001), FSH(Alliston et al., 2000), Erk 시그널 전달 캐스캐이드의 활성인자(Hayashi et al., 2001) 및 TPA(Mizuno et al., 2001)에 의해 일어난다.

SGK-1 활성화를 수반하는 일부 병리학적 변화도 공지되어 있으며, 그 예에는 뇌의 허혈성 손상(Imaizumi et al., 1994), 바이러스 간염(Fillon et al., 2002), 폐 섬유증(Warntges et al., 2002b) 또는 심장 섬유증(Funder 2001)이 있다. 하지만, 퇴행성 관절 장애 과정에 SGK의 연루에 대해서는 아직 알려진 바가 없다.

세포외 자극은 본래 SGK-1의 활성화를 대체로 유발시키지 못한다. 따라서, 예를 들어, 헤파린의 투여 후, 혈관계의 증식성 평활근 세포에서는 SGK-1 전사가 억제된다(Delmolino et al., 1997).

SGK-1이 이의 기능성 형태로 전환되기 위해서는 인산화에 의해 활성화되어야 한다. 이것은 포스파티딜이노시톨(PI)-3 키나제 및 3-포스포이노시타이드 의존적 키나제 PDK1 및 PDK2가 관여하는 시그널 전달 캐스캐이드에 의해 매개된다.

PI-3 키나제 시그널 전달 경로에 의한 SGK-1의 활성화는 인슐린, IGF 및 성장인자에 대한 반응인 것으로 알려져 있다. 활성화는 2개의 아미노산 잔기, 즉 T 루프 위의 트레오닌²⁵⁶ 및 단백질의 소수성 모티프 위의 세린⁴²²이 인산화되어야 한다. 트레오닌²⁵⁶ 위의 인산화는 PDK1에 의해 매개되고 세린⁴²²의 인산화는 아직까지 알려지지 않은 추정상의 PDK2에 의해 촉매된다고 한다(Kobayashi et al., 1999a; Park et al., 1999; Biondi et al., 2001).

PDK1에 의한 활성화는 트레오닌²⁵⁶과 세린⁴²² 인산화 부위의 돌연변이에 의해서도 관찰되었다. 트레오닌²⁵⁶의 알라닌으로의 돌연변이는 인산화를 80 내지 90%를 감소시키고 SGK-1의 PDK1 의존적 활성화를 차단한다. 이와 동일한 효과는 트레오닌²⁵⁶과 세린⁴²²이 알라닌으로 돌연변이된 경우에도 관찰되었다. 이와 반대로, 세린⁴²²의 아스파르테이트로의 돌연변이는 PDK1에 의한 인산화 및 활성화를 약 6배 증가시킨다(Kobayashi et al., 1999a).

생리적 또는 병리학적 과정에서의 SGK의 기능은 아직까지 알려진 바가 없다. SGK의 기능과 관련하여 현재 밝혀진 일련의 연구들은 SGK-1, -2 및 -3이 세포막의 채널(channel)에 조절 영향을 미친다는 것뿐이다. 즉, 신장 세관의 미네랄로코르티코이드 조절 Na⁺ 재흡수의 주요 수송체인 상피 Na⁺ 채널(ENaC)은 SGK-1, SGK-2 및 SGK-3의 표적 분자이다(Alvarez de la Rosa et al., 1999; Bohmer et al., 2000; Wagner et al., 2000a; Wang et al., 2001; Faletti et al., 2002; Friedrich et al., 2003). ENaC와 SGK의 상호작용은 직접 인산화에 의해서가 아니라(Lang et al., 2000), SGK에 의한 인산화 결과로서 유비퀴틴 리가제 Nedd4-2의 불활성화에 의해(Debonneville et al., 2001; Snyder et al., 2002) 일어난다. 이로 인해 세포막에 ENaC의 양 및 체류 시간이 증가한다(Staub et al., 1997; Alvarez de la Rosa et al., 1999; Wagner et al., 2000a). 또한, 많은 실험들에서는 ROMK1이 SGK의 표적 분자라고 밝히고 있다. 하지만, ROMK1은 SGK에 의해 직접 조절되지 않고 이 목적을 위해 매개 분자로서 "Na⁺/H⁺ 교환 조절 인자 2"(NHERF2)를 필요로 한다(Shenolikar et al., 2001; Yun et al., 2003). SGK의 또 다른 표적 분자인 Na⁺/H⁺ 수송체 NHE3도 이와 마찬가지이다(Yun et al., 2002). 또한, 제노푸스 난모세포에서의 실험에 따르면 SGK는 Kv1.3 채널 의존적 K⁺ 전류에 영향을 미치는 것으 로 밝혀져 있다(Gamper et al., 2002b; Warntges et al., 2002a). 또한, SGK는 아미노산 수송체 42F/LAT 및 SN1을 조절하는 것으로 보고되어 있다(Wagner et al., 2000b; Bohmer et al., 2003a, b).

하지만, 이러한 발견에도 불구하고, 지금까지 생리적 또는 병리적 과정에서 SGK 기능의 구도를 재현하는 것은 단지 부분적으로만 가능했다.

SGK의 단편은 말단이 하나 이상의 아미노산의 결실이나 자연 발생의 SGK, 바람직하게는 사람 SGK, 특히 서열번호 1, 2 또는 3에 제시된 서열 중 하나에 따른 SGK의 내부 아미노산의 결실을 통해 상이한 폴리펩타이드 또는 올리고펩타이드(또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드)이다. 바람직한 기능성 단편의 예에는 SGK 키나제 도메인을 함유하거나 이로 이루어진 것이다(Kobayahi et al., 1999a 참조). 이와 관련하여 특히 바람직한 것은 서열번호 7 내지 12에 제시된 서열을 함유하는 단편, 특히 이 서열들로 이루어진 단편이다. SGK 유도체는 자연 발생의 SGK 단백질, 바람직하게는 사람 SGK 및 특히 서열번호 1, 2 또는 3에 제시된 서열 중 하나에 따른 SGK 유래의 1 이상의 아미노산의 교환 및/또는 1 이상의 아미노산의 첨가 및/또는 1 이상의 아미노산의 화학적 변형, 예컨대 비오티닐화, 인산화 등에 의해 상이한 SGK 기능을 보유한 폴리펩타이드 또는 올리고펩타이드이다.

SGK의 기능성 단편 또는 유도체는 SGK의 적어도 하나의 기능을 보유하는 폴리펩타이드 또는 올리고펩타이드 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드이다. SGK의 다양한 기능은 다음과 같다: 예컨대 세포 부피의 조절(Fillon et al., 2001), 상피 Na 채널(ENaC)의 활성화(Debonneville et al., 2001); Na+ 수송의 활성화(Rozansky et al., 2002 또는 Lang and Cohen, 2001) 또는 아미노산 수송의 활성화(Wagner et al., 2000), 또는 KCNE1 의존적 K+ 유량 조절; SGK의 키나제 활성, 예컨대 유비퀴틴 리가제 P의 인산화 또는 세린 444 및/또는 세린 338에서 Nedd4-2의 인산화(Synder et al., 2002); 자가인산화 성능 또는 특정 펩타이드의 인산화 능력(예컨대, Kobayashi et al., 1999a 참조). 특정 단백질, 에컨대 전술한 것 중 하나와 상호작용하는 능력도 마찬가지로 SGK의 기능에 속한다. 특히 본 발명과 관련하여, Arg-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thr 모티프(Kobayashi et al., 1999a 참조)에서, 특히 서열 GRPRTSSFAEG를 함유하거나 이로 구성된 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드에서 Ser 및 Thr 잔기를 인산화하는 SGK의 능력이다. 또한, 특정 SGK 서브타입의 단편 또는 유도체는 모든 SGK 서브타입에 공통적인 하나 이상의 기능을 보유할 수 있다(예컨대, Arg-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thr 모티프 또는 서열 GRPRTSSFAEG의 펩타이드에서 Ser 및 Thr 잔기를 인산화하는 SGK의 능력). 특히 바람직한 기능은, 각 서브타입에 특이적인 기능(예컨대, 서열이 다른 특정 합성 펩타이드들의 인산화에 있어서 다른 활성)이다(예컨대 Kobayashi et al., 1999a 참조).

단백질 활성을 탐색하는 방법은 당업자에게 충분히 잘 알려져 있다. 즉, 통상의 방법을 이용하면 예컨대 인산화 활성, 특정 표적 단백질 또는 이의 단편과의 상호작용 또는 특정 이온 채널 및 수송체(이와 관련하여 이하 설명 참조)의 활성을 변조하는 SGK의 능력을 측정할 수 있다. 편의적 양태에서 SGK는 분리된 분자로서 이용된다.

본 발명에서 폴리펩타이드/단백질/폴리뉴클레오타이드/핵산 및 이의 단편 및 유도체와 관련하여 사용된 "분리된"이란 용어는 이러한 분자들이 자연원에서 정제한 것이거나 재조합적으로 제조한 뒤 정제(여기서, "정제한"이란 용어는 "부분 정제한" 것도 포함한다)한 것일 수 있음을 의미한다.

분리된 SGK 분자의 제조는 당업자에게 충분히 잘 알려져 있다. 즉, 공지된 게놈 또는 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열을 기초로 하여, 원하는 길이의 폴리뉴클레오타이드를 폴리머라제 연쇄 반응으로 증폭시킨 다음, 숙주 세포에서 클로닝을 통해 증폭시킬 수 있다(이와 관련하여 이하에 상세히 설명한 표준 문헌을 참조한다). 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)은 2개의 공지된 서열을 양 측면에 배치한 폴리뉴클레오타이드 분절을 특이적으로 증폭시키는 시험관내 기술이다. 이와 관련하여, 증폭될 서열의 5'에 위치한 서열이 공지된 것이면 충분하다. 이러한 경우에 종래 기술(예컨대 제한효소 분해 등)은 증폭될 단편의 분절을 생산하는데 사용할 수 있고, 이의 3' 말단에 공지된 서열의 DNA 분자(소위 링커)를 연결시킨 뒤, 마지막으로 증폭될 서열 옆에 2개의 공지된 서열을 양 측면에 배치한다(소위 링커 매개 PCR, ImPCR).

간단히 설명하면, 증폭된 폴리뉴클레오타이드의 양 측면에 배치한 DNA 또는 RNA 주형의 서열 영역에 상보적인 짧은 일본쇄 DNA 분자(프라이머)를 증폭에 사용한다. 정해진 반응 조건 하에서 상기 프라이머는 폴리머라제(주형으로서 DNA를 인식하고 DNA 가닥을 생산하는 DNA 폴리머라제 또는 주형으로서 RNA를 인식하고 DNA 가닥을 생산하는 역전사효소)라 불리는 특정 효소에 의해 일본쇄 변성 매트릭스를 따라 데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTP)의 존재 하에 연장되어, 주형의 서열에 상보적인 서열을 가진 새로운 DNA 가닥을 생산한다. 이것은 새로 생성된 폴리뉴클레오타이드 가닥이 변성되고, 그 다음 이 위에 프라이머가 하이브리드화되며, 마지막으로 새로운 연장 반응이 일어나는 온도 등을 주기적으로 반복하는 특정 온도 순서를 선택하면 확실하게 수득된다. 이후에 새로운 효소를 첨가하지 않고도 변성에 필요한 온도를 이용할 수 있기 위해, 폴리머라제는 열안정성 폴리머라제, 예컨대 Taq 폴리머라제(써머스 아쿠아티커스(Thermus aquaticus) 유래의 DNA 폴리머라제)를 이용하는 것이 편리하다. 적당한 폴리머라제의 선택은 사용 목적에 따라 달라지며 당업자라면 잘 알고 있다. 즉, PCR이 클로닝 목적이라면, 오류를 교정하는 능력(소위 프루프리딩(proofreading))이 있는 폴리머라제를 선택하는 것이 바람직하다.

전형적인 PCR 혼합물은 폴리뉴클레오타이드 주형외에도 2개의 적당한 프라이머, 예컨대 0.2 내지 2μM 사이의 농도, dNTP, 예컨대 dNTP당 200μM 농도, MgCl₂ 1 내지 2mM 농도 및 열안정성 DNA 폴리머라제, 예컨대 Taq, 1 내지 10 유니트, 그리고 예컨대 0.01 내지 20ng의 폴리뉴클레오타이드(즉, DNA 또는 RNA) 주형을 함유한다.

프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드는 종래 프로토콜에 따라 화학합성법으로 생산한다. 더욱이, 이 합성법은 특히 MWG Biotech와 같은 상품 공급업체에 의해 통상적으로 수행되는 방법이다. 다양한 기원의 cDNA는 Promega, Stratagene 등의 공급업체에서 시판되고 있다. PCR을 수행하는 적당한 완충액 및 효소도 마찬가지로 당업자에게 공지되어 있고, 역시 시판되고 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열을 분리 생산하는 또 다른 방법은 목적 서열을 공지된 방법으로 클로닝하고, 그 다음 적당한 유기체, 바람직하게는 적당한 세균 또는 효모 균주와 같은 단세포 유기체에서 발현시킨 뒤, 발현된 폴리뉴클레오타이드를 정제(적어도 부분 정제)하는 것으로 구성된다.

PCR 반응은 예컨대 클로닝용 폴리뉴클레오타이드 단편의 제조에 적합하다. 이러한 경우에는 5' 부위에 제한 엔도뉴클레아제의 인식 서열(소위 제한효소 절단 부위)을 보유한 적어도 하나의 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다.

이러한 절단 부위를 보유하는 2개의 프라이머인 경우, 두 절단 부위는 동일한 것 또는 다른 것을 선택하는 것일 수 있다. 통상의 제한 효소의 예는 다음과 같다: BamHI(GGATCC), ClaI(ATCGAT), EcoRI(GAATTC), EcoRV(GATATC), HindIII(AAGCTT), NcoI(CCATGG), SalI(GTCGAC), XbaI(TCTAGA) 등. 적당한 제한효소 및 적당한 반응 조건의 선택은 당업자에게 충분히 잘 알려져 있다. 클로닝 시, 벡터의 DNA는 적당한 제한 엔도뉴클레아제에 의해 절단("분해")되며, 이 제한효소 인식 부위는 클로닝될 cDNA 단편의 프라이머 서열에도 있어야 한다. PCR 등에 의해 생산된 단편은 분리 및 동일 제한효소로의 처리를 통해 "분해"된 벡터와 화합성이 되도록 만든다. 그 다음, 벡터 및 처리된 단편을 정제한 후, 적당한 반응 조건(이 조건은 당업자에게 공지되어 있다) 하에 DNA 리가제를 이용하여 연결시킨다.

벡터는 원형 또는 선형의 DNA 분자로서, 그 예로는 플라스미드, 박테리오파 지 또는 코스미드가 있고, 이의 도움으로 DNA 단편은 적당한 유기체에서 특이적으로 증폭될 수 있다(소위 클로닝). 적당한 유기체는 대부분 성장 속도가 빠른 단세포 유기체, 예컨대 세균 또는 효모이지만, 다양한 유기체에서 생성된 세포주(예컨대, 스포돕테라 프루지페르다(Spodoptera Frugiperda) 유래의 SF9 세포 등) 등과 같은 다세포 군집 유래의 세포일 수 있다. 적당한 벡터는 당업자에게 충분히 잘 알려져 있고 생명공학 공급업체, 예컨대 Roche Diagnostics, New England Biolabs, Promega, Stratagene 등에서 시판되고 있다.

분리된 폴리펩타이드의 재조합 생산도 역시 클로닝된 폴리뉴클레오타이드를 기초로 하여 종래 기술에 또한 알려져 있는 적당한 특정 벡터를 이용하여 수행할 수 있다. 이것은 적당한 숙주 세포, 예컨대 세균(바람직하게는 이.콜리 균주) 또는 진핵세포 숙주(예컨대, SF9 세포 등)에서의 발현에 의해 수행될 수 있으며, 이러한 각 경우마다 폴리뉴클레오타이드가 특정 발현 벡터에 클로닝된 다음 적당한 세포에 삽입된다. 형질전환 및 형질감염의 적당한 방법도 역시 세포배양 및 단백질 발현 유도와 마찬가지로 당업자에게 공지되어 있다(예컨대 첨부된 기본서 참조). 분리된 폴리펩타이드를 재조합 생산할 수 있는 또 다른 방법은 시험관내 해독이다. 이 목적의 경우에도 폴리뉴클레오타이드는 적당한 벡터에 클로닝된 다음, 적당한 완충액 및 세포 추출물(예컨대 망상적혈구 용해물)에서 시험관내 발현한다. 벡터, 추가 필요한 시약 및 조건도 역시 충분히 잘 알려져 있고 시판되고 있다(예, Invitrogen).

3가지 SGK 서브타입(SGK1 내지 3)은 종래 기술에 공지되어 있다. 따라서, 이 러한 3가지 계열 구성원의 하나 이상의 사용, 그러나 바람직하게는 SGK1의 사용은 본 발명의 다양한 관점의 상황에, 예컨대 이러한 3가지 계열 구성원 중 적어도 하나의 발현, 특히 SGK1의 발현에 대한 본 발명에 따른 검출 등에 바람직하다.

본 발명은 건강한 연골 조직과 퇴행/퇴행성 연골 조직의 세포 총 RNA 시료를 유전자 발현 분석으로 비교한 결과, 혈청/글루코코르티코이드 조절성 키나제-1(SGK-1)이 퇴행/퇴행성 골관절염 연골에서 발현되는 반면, 건강한 관절 연골 조직에서는 검출할 수 없음을 보여주는 본 발명자들의 놀라운 발견에 기초한 것이다. 연골 조직에서 상기 분자의 검출은 여기서 처음이었다. 또한, 본 발명자들의 추가 실험들은 퇴행성 연골 변화의 발달에 SGK의 원인적 연루성에 대한 최초 증거를 제공했다.

더욱이 연골 조직에서 SGK-1의 발현은 종래 기술에서 연골 조직에서 SGK 역할 또는 연골 세포에서 병리적 및 발달 특이적 변수 하에 SGK의 발현에 대한 가능한 조절 기작에 관한 연구가 전혀 공개되어 있지 않기 때문에 전적으로 새로운 발견인 것이다. 또한, 본 발명자들의 연구에 기초하여, 최초로 SGK가 연골의 병리적 상태와, 예컨대 류마티스성 관절염 또는 골관절염의 관점에서, 특히 골관절염의 관점에서, 특이적으로 연관이 있다는 결론을 내릴 수 있을 것이며, 따라서 SGK는 연골 분해 과정을 유도하는 주요 분자이다.

SGK 계열 구성원 간에는 상동성이 상당하기 때문에 SGK-2 및 SGK-3도 마찬가지로 사용될 수 있을 것으로 추정해 볼 수 있다.

이러한 관계의 최초 동정에 따라, SGK 활성 및/또는 SGK 수준에 영향을 미칠 가능성이 있는 활성 성분의 효과를 공지된 검사 방법으로 밝힘으로써, 퇴행성 연골 변화의 예방 또는 치료용 활성 성분을 찾을 수 있게 되었다. 더욱이 퇴행성 관절 장애의 발달에 있어서 SGK의 원인적 연루성으로 인해, 연골의 정상 세포 생리 상태를 복원시키는 조절 기작에 목표를 두고 있는 치료적 활성 성분을 특이적으로 조사할 수 있게 되었다.

따라서, 본 발명의 다른 관점은 퇴행성 연골 변화의 예방 또는 치료를 위한 활성 성분의 동정 방법으로서,

a. SGK 단백질, 이의 기능성 유도체 또는 단편을 잠재성 활성 성분과 접촉시키는 단계,

b. 잠재성 활성 성분의 존재 하에 SGK 활성을 측정하는 단계,

c. 잠재성 활성 성분의 부재 하에 SGK 활성을 측정하는 단계,

d. 상기 b에서 수득한 SGK 활성을 상기 c에서 수득한 활성과 비교하고, 바람직하게는 SGK(단백질, 이의 기능성 유도체 또는 단편) 활성이, 잠재성 활성 성분의 부재 하에서보다 그 존재 하에서 더 낮은 것인지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는 동정 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 본 발명은 퇴행성 연골 변화의 예방 또는 치료를 위한 활성 성분의 동정 방법으로서,

a) SGK 단백질, 이를 암호화하는 핵산의 기능성 유도체 또는 단편을 함유하는 시료를 적어도 전사를 수행할 수 있는 시스템에서 잠재성 활성 성분과 접촉시키는 단계,

b) SGK 단백질, 이의 기능성 유도체 또는 단편, 또는 이들을 암호화하는 mRNA의 양을 잠재성 활성 성분의 존재 하에 측정하는 단계,

c) SGK 단백질, 이의 기능성 유도체 또는 단편, 또는 이들을 암호화하는 mRNA의 양을 잠재성 활성 성분의 존재 하에 측정하는 단계,

d) 단계 b) 및 c)에서 수득된 단백질 또는 mRNA 양을 비교하고, 바람직하게는 잠재성 활성 성분의 부재 하에서보다 그 존재 하에서 SGK(단백질, 이의 기능성 유도체 또는 단편, 또는 이들을 암호화하는 mRNA의 양) 양의 저하 여부를 측정하여, 바람직하게는 그 활성 성분의 이용가능한 SGK 양의 저하 능력에 기초하여 활성 성분을 구별하는 단계를 포함하는 동정 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 퇴행성 연골 변화의 예방 또는 치료를 위한 활성 성분의 동정 방법으로서,

a) SGK 단백질, 이의 기능성 유도체 또는 단편, 또는 이를 암호화하는 핵산을 함유하는 시료를 적어도 해독을 수행할 수 있는 시스템에서 잠재성 활성 성분과 접촉시키는 단계,

b) SGK 단백질, 단편 또는 유도체의 활성을 잠재성 활성 성분의 존재 하에서 측정하는 단계,

c) SGK 단백질, 단편 또는 유도체의 활성을 잠재성 활성 성분의 부재 하에서 측정하고, 바람직하게는 잠재성 활성 성분의 부재 하에서보다 그 존재 하에서 SGK 활성 억제 또는 이의 양(단백질, 이의 기능성 유도체 또는 단편, 또는 이들을 암호화하는 mRNA의 양)의 저하 여부를 측정하여, 바람직하게는 그 활성 성분의 이용가능한 SGK 양 저하 능력에 기초하여 활성 성분을 구별하는 단계를 포함하는 동정 방법에 관한 것이다.

잠재성 활성 성분의 부재 하에서보다 그 존재 하에서 SGK 활성의 저하 여부는 예를 들어 합성 펩타이드 또는 다른 SGK 기질의 인산화 능력을 측정하여 확인할 수 있다 (자가인산화도 포함한다). 이와 관련하여, 서열 모티프 Arg-Xaa-Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thr, 바람직하게는 모티프 RPRTSS, 특히 모티프 GRPRTSSFAEG를 함유하거나, 또는 이로 구성된 폴리펩타이드 또는 올리고펩타이드를 사용하는 것이 바람직하다. 또 다른 방법은 특정 이온 채널의 활성을 변조하는 SGK의 능력을 측정하는 것으로서, 이것은 예를 들어 세포내 이온 농도를 통해 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 이용하여 측정할 수 있다.

이와 관련하여, SGK 활성은 SGK의 모든 기능을 의미한다(앞의 설명 참조). 이러한 활성은 단백질 활성에 영향을 미치는(예컨대 키나제 도메인과의 직접 상호작용에 의해; 단백질 활성에 영향을 미칠 수 있는 해독후 변형, 단백질 폴딩 또는 SGK의 자연 억제제 또는 활성제, 예컨대 PI3K에 의한 활성화에 영향을 미치는) 모든 수준에서 잠재성 활성 성분에 의해 변조될 수 있다. SGK의 양은 시스템, 예컨대 세포 또는 생화학적 혼합물에서 특정 시기에 나타나는 활성 SGK 밸런스와 관련이 있다. SGK의 양은 더욱이 SGK 발현 또는 SGK 분해의 모든 수준(전사체 프로세싱 및 세포 핵으로부터 방출을 포함한 전사, 또는 단백질 안정성에 영향을 미칠 수 있고 이로써 유용한 활성 SGK 밸런스에 영향을 미칠 수 있는 해독이나 해독후 변형)에서 변조될 수 있다.

SGK 활성 및/또는 SGK의 함량을 변조, 바람직하게는 감소시키는 능력을 보유한 활성 성분은, 연골 세포의 퇴행성 상태로의 변화에 있어서 SGK의 기능적 연루성으로 인해, 더욱이 퇴행성 연골 변화의 발달을 억제하고, 바람직하게는 억제하며, 및/또는 기존 연골 변화의 영향를 축소 및 바람직하게는 중단시켜야 한다.

이러한 잠재성 활성 성분의 활성 변수로서 체내의 특정 표적 분자(여기서, SGK)(소위 표적, 보통 단백질 또는 핵산)의 활성, 농도 또는 함량을 측정하는 적당한 분석 방법 또는 시스템, 소위 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 이 방법은 예컨대 시험관내 분석법일 수 있으며, 이것은 분리된 또는 부분 분리된 성분을 배합하여 반응 혼합물을 만든 뒤 잠재성 활성 성분의 활성을 측정할 수 있는 수단을 이용하는 생화학적 분석법을 의미한다. 또 다른 방법으로는, 표적 단백질(여기서 SGK)의 활성 및 세포 환경에서 이 표적 분자의 활성에 영향을 미치는 잠재성 활성 성분의 활성을 측정할 수 있는 세포 검사 시스템(분석법)이 있다.

이와 관련된 분석법은 생물학적 과정을 모니터하는 것이 가능한 수단에 의한 임의 종류의 분석 방법이다. 이것은 통상적으로 생리학적 대사 경로의 일부 및 조절 기작을 나타내는 분자 가공 과정 및 시그널 전달 캐스캐이드 뿐만 아니라, 세포 또는 생화학적계에서와 유사한 병리학적 상태를 수반한다. 그 다음, 활성 성분의 약리학적 활성은 상기 경로 및 기작을 방해하는 활성 성분의 능력을 기초로 하여 측정할 수 있다.

활성 성분의 탐색, 특히 활성 성분의 고처리량 스크리닝을 위해, 분석법은 재현적이어야 하며, 비교할 수 있고 확고(외부 영향에 대한 민감도가 낮은 것을 의 미한다)한 것이 바람직하다. 이러한 분석법은 바람직하게는 표적 분자의 활성에 영향을 미치는 물질의 능력을 분석하는 화학적 물질의 고처리량 스크리닝에 적합해야 한다. 이러한 종류의 분석법은 특히 사용된 표적 분자의 성질(예컨대, 생화학적 기본 분자, 예컨대 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 정확한 종류 또는 성질) 및 판독, 즉 표적 분자의 활성이 측정되는 변수에 따라 달라진다. 현재 당업계에는 다양한 분석 종류가 공지되어 있고, 대부분 산업체에서 시판하고 있다.

2개의 결합 파트너의 상호작용을 측정하기에 적합한 분석법으로는, 예컨대 방사성동위원소 또는 형광 분석법, 예컨대 Panvera, Perkin-Elmer Life Sciences(NEN™, LANCE™) 또는 Packard BioScience(HTRF; ALPHAscreen™) 등에서 시판하는 형광편광 분석법이 있다. 전술한 분석법들은 표지된 성분과 표지되지 않은 성분의상호작용을 측정하기에 적합하다(예컨대, 표지된 단백질과 표지되지 않은 리간드의 상호작용).

또 다른 분석법의 예로는 세포주가 필요할 때, 재조합 단백질을 안정적으로(유도적 또는 구성적, 염색체적 또는 에피솜적으로) 또는 일시적으로 발현하는 세포 분석법이 있다. 이러한 분석법에는, 예컨대 관련 프로모터의 조절 하에 발현이 조절되는 리포터 효소의 활성에 의해, 특정 프로모터의 조절 또는 시그널 전달 경로 또는 시그널 전달 캐스캐이드 구성원의 조절이 측정되는 리포터 유전자 분석법이 있다. 이러한 종류의 분석에서는, 역시 조사를 받고 있거나 또는 조사되는 시그널 전달 캐스캐이드에 의해 조절되는 일정 프로모터의 제어 하에 리포터 유전자를 발현하는 재조합 세포주가 제조되어야 한다. 적당한 리포터 효소는 일반적으로 당 업자에게 공지되어 있고, 그 예로는 개똥벌레 루시퍼라제, 레닐라 루시퍼라제(둘 다 Packard Reagents에서 시판 중이다), β-갈락토시다제 등이 있다. 적당한 세포주의 선택은 당업자라면 잘 알고 있으며, 특히 분석 표적 또는 판독에 따라 좌우된다. 이러한 세포주에는 통상 배양 및 형질감염하기 쉬운 세포주, 예컨대 HeLA, COS, CHO 또는 NIH 3T3 세포가 있다.

세포내 이온 농도를 측정하는 분석법에는, 예컨대 소위 FLIPR™(Molecular Devices 제품인 형광 조영 평판 판독기) 분석법이 있으며, 이 분석법은 냉각 CCD 카메라와 함께 아르곤 레이저 광원을 이용하여 384웰 평판에서 배양된 세포(예, 재조합적 또는 자연적으로 특정 이온 채널을 발현하는 세포)의 여러 혼합물에 존재하는 세포내 이온 농도(예, Na⁺ 또는 Ca²⁺ 등)를 동시에 측정한다. 또한, 이러한 FLIPR™ 분석법을 이용하여, 예컨대 세포내 칼슘 수준을 특정 형광색소, 예컨대 Fluo-3, Fluo-4를 통해, 세포내 pH를 BCECF, BCPCF 또는 특정 FLIPR™ 분석 키트를 이용하여, 막 전위의 변화를 DiBAC 또는 특정 FLIPR™ 분석 키트 등을 이용하여, 또는 막 편광의 변화를 측정하는 것이 가능하다. 다른 염료도 아연, 나트륨 등의 다른 이온의 농도를 측정하는데 적합하며, 이 역시 현재 당업계에 공지되어 있고 시판되고 있다.

특정 이온 채널(예컨대, 세포내 이온 농도를 조절하여, 그 활성이 특정 이온의 세포내 농도에 기초하여 측정될 수 있는)의 활성을 측정하기에 적합한 분석법 및 염료의 예에는 막 전위의 변화에 민감하게 반응하는 것, 예컨대 DiBAC 또는 Molecular Divices 제품인 FLIPR™ 분석용 막 전위 분석 키트, FLIPR™ 기술과 JC- 1 염료에 의한 미토콘드리아 막 분극의 측정; 세포내 이온 농도의 측정에 사용되는 FLIPR™ 기술과 함께 Molecular Devices 제품인 칼슘 분석 키트 또는 Fluo-3, Fluo-4와 같은 이온 민감성 염료; 세포내 나트륨 농도의 측정에 사용되는 Molecular Probes 제품과 같은 나트륨 민감성 염료; 세포내 칼슘 농도의 측정에 사용되는, 원자흡수분광분석법 등을 이용하는 루비듐 이온 유출 측정 또는 패치 클램핑을 기초로 한 분석법이 있다. 또한, 세포의 특정 변화 및 상태를 측정 및 결정하는 자동 장치 및 로봇은 당업자에게 공지되어 있고, 그 예로는 적당히 표지된 대상물 분포의 3차원 구성을 가능하게 하는 형광계 레이저 스캐닝 판독 장치인, Acumen Bioscience 사제 Acumen™ 검출기가 있다.

단백질 인산화 또는 키나제 활성을 측정하기에 적합한 예에는, 형광 편광, 예컨대 Panvera 시판품, 균질 시간 분할 형광 분석(HTRF, Cis Bio) 및 LANCE™ 분석법(Perkin Elmer Life Sciences) 또는 증폭된 발광 근접 등질분석(ALPHAScreen™, Packard BioScience 제품)이 있다.

다른 종류의 분석법 및 다른 종류의 판독에 대해서도 역시 당업자에게 충분히 잘 알려져 있다.

본 발명의 또 다른 관점은 전술한 방법 중 하나의 방법을 기초로 하여 활성 성분을 탐색하는 고처리량 스크리닝 방법에 관한 것이다. 고처리량 스크리닝 방법은 본 발명과 관련하여 극히 작은 스케일로, 예컨대 96웰, 386웰 또는 1536웰 평판에서 수행되거나 또는 수 밀리리터에서부터 수 나노리터 범위의 적은 용량의 혼합물에서 수행되어, 극히 짧은 시간 안에 매우 많은 수의 혼합물, 예컨대 500,000개 이상이 분석될 수 있는 방법을 의미한다.

본 발명의 전술한 용도 및 방법, 그리고 전술한 고처리량 스크리닝 방법은 퇴행성 연골 변화의 치료 및/또는 예방을 위한 활성 성분을 찾아낼 수 있다. 특히, 그러한 퇴행성 과정을 유도하고 촉진시키는 SGK의 능력을 억제할 수 있는 활성 성분을 찾아낼 수 있다. 본 발명의 다양한 관점 중에서, 억제성은 SGK 계열 구성원의 적어도 하나의 기능, 바람직하게는 적어도 SGK1의 기능을 억제하기에 적합한 것을 의미한다. 이러한 억제는 매우 다양한 기작에서 유도할 수 있으며, 예컨대 세포 SGK 수준을 저하시키거나(예컨대, 전사 및/또는 해독 감소, 단백질 또는 mRNA의 안정성 저하 등), SGK 효소 활성을 억제하거나 또는 시그널 전달 경로의 상류 또는 하류에 저해 영향을 주어 유도할 수 있다.

이와 관련하여 특히 세포 SGK 수준의 저하 또는 효소 활성의 억제가 바람직하다.

또한, 본 발명은 연골 조직에서 SGK를 검출하는 것을 포함하여, 발달하는 기존 퇴행성 연골 변화를 동정하는 방법에 관한 것이다.

이와 관련하여 SGK 검출은 당업자에게 공지된 방법으로 수행한다. 즉, 퇴행 또는 퇴행성 연골 중의 SGK를 SGK 단백질이나 RNA의 면역조직화학 검출에 기초하여 검출(예컨대, 조직 시료의 조직학적 절편의 면역조직화학적 염색, 면역블롯, ELISA 또는 단백질 마이크로어레이)하는 방법, 또는 기존 또는 발달성 연골 퇴행을 동정하기 위해 연골 조직 내의 SGK의 존재를 사용하는 노던 블롯팅, 정량적 PCR, 동일계 하이브리드화 또는 DNA 마이크로어레이 등에 의해 SGK RNA를 검출하는 방법 등 의 적합한 방법을 이용하는 것이 가능하다. SGK 발현에 적합한 또 다른 검출 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 연골이나 침식된 연골 세포를 함유하는 윤활액과 같은 조직 시료를 수집하고 다양한 분석 방법을 위해 처리하는데 적합한 기술도 마찬가지로 당업자에게 충분하게 공지되어 있다.

SGK 계열 또는 SGK 계열의 단독 구성원을 검출하기에 적합한 항체는 시판되고 있거나(Santa Cruz Biotechnology, Europa Bioproducts Ltd), 또는 SGK 펩타이드, 예컨대 서열번호 4, 5, 6 또는 서열번호 7 내지 12에 제시된 서열을 가진 폴리펩타이드를 표준 프로토콜(예컨대, 이하에 제시된 기본서 참조)에 따라 이용하여 토끼에서 생산할 수 있다. 이러한 항체 생산은 통상 다수의 공급업체, 예컨대 Biotrend(Cologne, Germany) 등에서 상업적으로 수행하고 있다. 이와 관련하여, SGK 계열 구성원 중 하나에 특이적인 항체 또는 항혈청은 바람직하게는 각 계열 구성원의 C-말단 비촉매 영역의 폴리펩타이드 단편, 예컨대 100개, 바람직하게는 80개 이하의 C-말단 아미노산의 폴리펩타이드 단편, 또는 특히 바람직하게는 SGK 단백질의 100개, 바람직하게는 85개 N-말단 아미노산 중에서 선택되는 폴리펩타이드 단편, 구체적으로 각 SGK 계열 구성원의 20 내지 100개, 50 내지 90개, 특히 85개 N-말단 아미노산으로 이루어진 단편(SGK2의 경우, SGK2β의 서열에서부터 시작하는 서열; 특히 이러한 목적에 SGK2α인 경우에는 21개 N-말단 아미노산이 적합하다; Kobayashi et al., 1999b 참조)을 이용하여 생산한다.

노던 및 서던 블롯, DNA 마이크로어레이 또는 동일계 조직 절편 위에 고정된 핵산에 하이브리드화하기에 적당한 프로브 및 PCR에 적당한 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 선택 및 제조에 대해서는 당업자에게 충분히 잘 알려져 있다(이와 관련하여 이하에 제시된 기본서를 참조한다). 이와 관련하여 구별 검출에 적합한 것은, 특히 다양한 SGK 계열 구성원들의 전술한 저상동성 영역을 암호화하는 프로브, 예컨대 암호화 서열의 처음 255개 뉴클레오타이드 중에서 선택되는 프로브(각종 SGK 계열 구성원의 85개 저상동성 N-말단 아미노산에 대응하는 프로브; 및 SGK2α 단백질의 저상동성 N-말단 21개 아미노산에 대응하는 암호화 서열의 처음 63개 뉴클레오타이드 중에서 선택되는 SGK2α 프로브; 상기 참조)이다. 이와 관련하여 SGK1 발현을 검출하는데 적합한 프로브는 서열번호 1에 제시된 서열(도 1), 서열번호 7에 제시된 서열(도 7) 또는 서열번호 13에 제시된 서열(도 8)을 가진 프로브인 것이 바람직하다.

바람직한 양태에 따르면, SGK1은 본 발명의 방법에서 검출된다.

퇴행성 연골 변화를 동정하는 본 발명의 방법은 다음과 같은 단계를 포함하는 것이 바람직하다:

a) 조사되는 연골 분리 시료의 SGK 단백질 또는 mRNA의 함량을 측정하는 단계;

b) 비퇴행 연골의 분리 시료의 SGK 단백질 또는 mRNA의 함량을 비교하는 단계.

여기서, 퇴행 또는 퇴행성 연골에 존재하는 SGK의 함량은 비퇴행 연골에 존재하는 함량보다 많다.

이러한 본 발명의 방법은 분리한 윤활액 또는 조직 시료의 적당한 분석을 통 해 진행성 또는 기존 퇴행성 연골 변화를 간단하고 확실하게 진단할 수 있게 한다.

또한, 본 발명은 SGK를 검출하는 적어도 하나의 수단을 함유하는, 퇴행성 연골 변화의 진단용 검사 키트에 관한 것이다. 본 발명 중에서 부품의 키트(또는 간단히 "키트")는 서로 공간적 병치 하에 기능성 단위로 조합되고 적당한 경우 추가 성분을 함유하기도 하는 상기 성분들의 조합을 의미한다.

이러한 수단은 적어도 하나의 SGK 단백질 또는 단백질 단편에 대한 항체 및/또는 프라이머 세트 및/또는 핵산 프로브(후자 2개는 적어도 하나의 SGK mRNA의 mRNA 발현을 검출하기 위한 것이다)이다. 이러한 수단의 제조는 당업자에게 충분하게 공지되어 있다. 키트는 추가로 적당한 완충액, 효소, 사용 지침서 등과 같은 바람직한 성분을 함유할 수도 있다. 이러한 성분 및 필수 패키지 수단은 시판되는 진단 검사 키트를 통해 당업자에게 알려진 것이다.

본 발명의 다양한 주제 및 관점들의 바람직한 양태에 따르면, SGK는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 사람 SGK 또는 이의 단편 또는 유도체이며, 구체적으로 다음과 같은 서열 중 하나를 함유하거나 서열 중 하나로 구성되는 것이 바람직하다:

a) 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 서열번호 3

b) 엄중한 조건 하에서 상기 a)에 따른 서열 중 적어도 하나와 하이브리드화하고 SGK 기능을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 서열.

c) 유전자 코드에 기초하여, 상기 a) 또는 b)에 따른 서열 중 하나에 대해 축퇴성이고 SGK 기능을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 서열.

d) SGK 기능을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 a), b) 또는 c)에 따른 서열 중 하나의 단편, 바람직하게는 서열번호 7 내지 9에 제시된 서열 중 하나를 가진 단편(도 7).

e) 염기 교환이 유전자 코드의 축퇴성에 기초한 것이 아니거나 또는 전적으로 그 축퇴성에 기초한 염기 교환이 아닌 것이며 SGK 기능을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는, 상기 서열 a), b), c) 또는 d) 중 한 서열에서부터 시작하여 하나 이상의 염기 교환에 의해 만들어진 서열.

또 다른 바람직한 양태에 따르면, SGK 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 함유하거나 그 서열로 이루어진다.

본 발명에 따라 사용된 SGK 단편은 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9(도 7에 제시된 폴리뉴클레오타이드 단편)에 제시된 뉴클레오타이드 서열 중 하나를 함유하거나 그 서열로 이루어진 것이 바람직하다.

본 발명의 다양한 주제 및 관점의 또 다른 바람직한 양태에 따르면, SGK는 폴리펩타이드, 바람직하게는 사람 SGK 또는 이의 단편 또는 유도체이고, 특히 다음과 같은 서열의 적어도 하나를 보유하거나 이 서열 중 하나로 이루어진 핵산에 의해 암호화된 것인 것이 바람직하다:

f) 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3.

g) 엄중한 조건 하에서 상기 a)에 따른 적어도 하나의 서열과 하이브리드화하고 SGK 기능을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 서열.

h) 유전자 코드를 기초로 하여, 상기 a) 또는 b)에 따른 서열 중 하나에 대해 축퇴성이고, SGK 기능을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 서열.

i) SGK 기능을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 상기 a), b) 또는 c)에 따른 서열 중 한 서열의 단편, 바람직하게는 서열번호 7 내지 9에 제시된 서열 중 하나의 서열을 가진 단편(도 7).

j) 전술한 서열 a), b), c) 또는 d) 중 하나의 서열로부터 하나 이상의 염기 교환에 의해 만들어지고 SGK 기능을 가진 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 이 때 염기 교환은 유전자 코드의 축퇴성에 기초한 염기 교환이 아니거나 배타적으로 아니다.

또 다른 바람직한 양태에 따르면, SGK 폴리펩타이드는 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 제시된 아미노산 서열을 함유하거나 또는 그 서열로 이루어진 것이다.

본 발명에 따라 사용된 SGK 단편은 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 아미노산 서열 중 하나를 함유하거나 또는 그 서열로 이루어진 것이 바람직하다(도 7).

엄중도는 2개의 일본쇄 핵산 분자 서로 간에 하이브리드화 또는 어닐링의 특이성에 영향을 미치는 반응 조건을 나타낸다. 엄중도, 즉 반응의 특이성은 이와 관련하여 특히 온도 및 완충액 조건에 따라 달라진다. 즉 엄중도 및 이에 따른 특이성은 온도 상승 및 이온 강도 저하에 의해 증가될 수 있다. 저엄중도 조건(즉, 반응 또는 하이브리드화 특이성이 낮은)은 예를 들어, 하이브리드화가 실온에서 2xSCC 용액 중에서 수행되는 경우이다. 이에 반해, 고엄중도 조건은 하이브리드화가 68℃에서 0.1X SSC 및 0.1% SDS 용액 중에서 수행되는 경우이다.

본 출원의 측면에서 엄중 조건 하에서의 하이브리드화는 더욱이 다음과 같은 것이 바람직하다:

1) 조사되는 시료와 표지된 프로브의 60 내지 70℃에서의 하이브리드화 및 바람직하게는 65℃에서의 하이브리드화 또는 올리고뉴클레오타이드인 경우에는 50mM Tris pH7.5, 1M NaCl, 1% SDS, 10% 덱스트란 설페이트, 0.5mg/ml 변성된 헤링 또는 연어 정자 DNA 중에서 올리고뉴클레오타이드와 시료 이본쇄의 융점보다 5℃ 낮은 온도(이 융점은 "어닐링 온도"라고도 불린다)에서 하룻밤 동안 하이브리드화.

2) 실온에서 10분 동안 2xSSC로 세척.

3) 60 내지 70℃, 바람직하게는 65℃에서 30분 동안 1xSSC/0.1% SDS로 세척(또는 올리고뉴클레오타이드인 경우 어닐링 온도의 5℃ 미만).

4) 60 내지 70℃, 바람직하게는 65℃에서 30분 동안 0.2xSSC/0.1% SDS로 세척(또는 올리고뉴클레오타이드인 경우 어닐링 온도의 5℃ 미만).

5) 60 내지 70℃, 바람직하게는 65℃에서 30분 동안 0.1xSSC/0.1% SDS로 세척(또는 올리고뉴클레오타이드인 경우 어닐링 온도의 5℃ 미만).

올리고뉴클레오타이드는 길이가 15 내지 30개, 바람직하게는 20개 뉴클레오타이드인 DNA 단편인 것이 바람직하다. 이러한 경우에, 어닐링 온도는 식 Tm=2 x (A+T의 수) + 4 x (G+C의 수)℃으로 측정한다. 2x SSC 또는 0.1x SSC 용액은 예를 들어 20x SSC 용액을 적당히 희석하여 제조한다. 20x SSC 용액은 3M NaCl/0.3M Na 시트레이트 x 2H₂O로 구성된다.

하이브리드화를 수행하기 전에, 조사되는 폴리뉴클레오타이드는 전기영동적 분별(소위 서던(DNA) 또는 노던 블롯(RNA)) 후 적당한 경우, 또는 전기영동적 분별없이(소위 도트 또는 슬롯 블롯), 적당한 막, 예컨대 나일론 또는 니트로셀룰로스 막으로 이동시킨다. 하이브리드화는 적당한 방식으로 표지화된 프로브를 이용하여 수행한다. 따라서, 방사성표지화 또는 형광 염료를 이용한 표지화가 유리하지만, 다른 종류의 표지화도 생각할 수 있다. 프로브는 자체가 일본쇄 형태이거나 또는 보통 이본쇄지만 변성된 상태로 이용되는, 일본쇄 폴리리보- 또는 폴리데옥시-리보뉴클레오타이드이다. 이러한 프로브는 역시 일본쇄 형태인 DNA 또는 RNA 프로브에 염기쌍을 형성하며 결합한다.

다양한 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열은 도면에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 다양한 주제 및 관점은 특히 관절염 장애, 바람직하게는 골관절염 또는 류마티스성 관절염, 특히 골관절염의 증례에 사용하기에 적합하다.

참조문헌

표준 방법에 대한 참고문헌:

다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 설명되고 있는 실험 방법들은 이하에 제시한 기본서에 따라 수행되거나 수행될 수 있다.

본 발명은 이하 실시예 및 도면에 의해 상세히 설명되지만, 이들은 본 발명의 주제를 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예 1:

골관절염 어레이를 이용한 유전자 발현 분석

유전자 발현 분석은 GPC-Biotech에 주문 생산되고 나일론 막에 적용된 4500개 연골 관련 유전자로 이루어진 골관절염 특이적 cDNA 어레이를 기초로 했다. 어레이의 하이브리드화를 위한 프로브로서 건강한 관절 연골 및 골관절염 관절 연골 유래의 총 RNA(표준 방법으로 제조)를 P³² 표지된 뉴클레오타이드의 혼입과 함께 방 사성활성 cDNA로 역전사시켜, 상기 어레이의 cDNA 시료와 표준 방법에 따라 항온배양했다. 하이브리드화 및 이어서 막을 세척한 후, 하이브리드화 시그널을 방사능 사진촬영술로 검출했다. 건강한 연골과 골관절염 연골 사이에 다르게 차별 발현된 유전자 270개는 추가 분석에 사용했다. 이러한 유전자 중 하나가 놀랍게도 SGK였다. 이러한 본 발명자들의 유전자 발현 분석의 결과는 SGK 발현이 골관절염의 관절 연골에서 유도된다는 최초의 발견이었다. 이러한 발견은 cDNA 라이브러리의 클론 수를 통해 확인할 수 있었다: 정상 연골의 라이브러리와는 대조적으로 골관절염 연골의 cDNA 라이브러리에서 SGK cDNA가 14배 빈번하게 발현되는 것이 확인되었다.

실시예 2:

어레이 제조 및 하이브리드화

어레이를 제조하기 위한 클론은 SSH(subtractive suppression hybridization)로 선택했다. 또한, 대조 클론 및 관리 유전자의 클론도 사용했다. 증폭은 Qiagen(Hilden, UK)사제 PCR 키트를 사용하여 384웰 폴리프로필렌 평판(Genetix, UK)에서 M13 정배향 프라이머(5' GCT ATT ACG CCA GCT GGC GAA AGG GGG ATG TG 3') 및 M13 역배향 프라이머(5' CCC CAG GCT TTA CAC TTT ATG CTT CCG GCT CG 3')를 이용한 PCR 반응으로 제조자(Qiagen, Hilden UK, 상기 참조)의 지시에 따라 반응 부피를 50㎕로 하여 수행했다. 반응 혼합물은 384핀 전달 장치(Genetix)를 이용하여 세균 배양물 2㎕ 이하와 함께 접종하고, 이 평판을 그 다음 플라스틱 필름(Genetix)으로 밀봉했다. PCR 증폭은 표준 조건(Meier-Ewert, S. et al.) 하에 자동 수조 시스템(KBioSystems, Basildon, UK)에서 수행했다. 4396개의 cDNA 클론 유래의 PCR 산물은 마이어 등(Maier et al.)에 의해 설명된 바와 같이 로보트 적용기를 이용하여 8 x 12cm 레플리카 나일론 막(Hybond N+, Amersham Pharmacia Biotech)으로 1회 전이시킨 다음, 공기 건조하여 막 위에 고정시켰다. 또한, PCR 산물은 점간 거리가 850㎛인 5x5 패턴 형태로 막에 2회 적용했다.

실시예 3:

프로브 표지화, 하이브리드화 및 세척

총 RNA의 총 함량 2㎍을 4가지 다른 반응 혼합물에서 슈퍼스크립트 II 역전사효소(#18064-071, Invitrogen)를 이용하여 cDNA로 전사시켰다. 혼합물은 각각 다음을 함유했다: 슈퍼스크립트 II 제1 가닥 반응 완충액(Invitrogen) 중의 슈퍼스크립트 II(#18064-071, Invitrogen) 200유니트, 0.66mM dATP, dGTP, dTTP 각 경우마다 33P α-dCTP(#NEG313H, NEN Life Science Products GmbH) 50μCi, 랜덤 헥사머(Amersham Pharmacia Biotech) 0.5㎍ 및 10mM DTT. 반응물은 42℃에서 4시간 동안 항온배양하고, 그 다음 cDNA는 퀵 스핀 컬럼(Roche, Penzberg Germany)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 정제했다. 하이브리드화 후, 각 프로브는 변성 용액(1M NaOH/10mM EDTA) 0.11부피와 사람 COT-1 DNA(15279-011, Invitrogen) 5㎍을 이용하여 70℃에서 20분 동안 변성시켰다. 각 프로브는 그 다음 1부피량의 중화 용액(1M Na 포스페이트/pH 7.0)을 첨가하여 70℃에서 10분 동안 중화시키고, 그 후 하이브리드화 혼합물에 첨가했다. 연골 총 RNA로부터 역전사된 cDNA를 프로브로서 이용했 다.

각 하이브리드화 실험을 위해, 3개의 어레이를 하이브리드화 완충액(7% SDS, 50% 탈이온화된 포름아미드, 5x SSC, 50mM Na 포스페이트 완충액 pH 7.0 및 2% 분유 분말) 50ml에서 2시간 동안 예비하이브리드화한 후 프로브를 첨가했다. 프로브 첨가 후, 플라스틱 용기(20cm x 10cm)에서 50℃ 하에 16시간 동안 하이브리드화를 수행했다. 하이브리드화 후, 어레이를 2x SSC, 1% SDS 완충액으로 2회, 0.1% SSC, 0.5% SDS 완충액으로 2회 세척했다. 각 세척 단계는 65℃에서 15분 동안 수행했다. 막을 그 다음 클링필름에 싸서, 포스포-스토리지 스크린(phospho-storage screen)과 5일 동안 접촉시킨 후, 해상도가 25㎛인 FUJI BAS 5000 조영 시스템으로 스캐닝했다. 영상은 어레이에 적용된 각 위치의 평균 시그널 강도를 컴퓨터 판독 데이터로 전환시켜 저장 매체에 파일로서 저장하는 시판 어레이 분석 프로그램(VisualGrid, GPC Biotech AG)을 이용하여 분석했다.

실시예 4:

데이터 분석

다양한 어레이 시그널의 시그널 강도(각각의 클론에 대응한다)가 저장된 파일 중의 미가공 데이터는 다음과 같이 분석했다:

먼저, 배경 시그널은 DNA가 적재되지 않은 위치 유래의 시그널 강도를 공제해서 보정했다. 이어서, 평균 시그널 강도는 클론당 6개(3 어레이가 각각 2개의 데이터 점을 보유)의 다른 레플리카 값을 고려하여 보정하고, 로그값으로 변환시키고, 표준 편차는 어레이 상의 각 클론마다 측정했다. 그 다음, 평균연결법(Eisen et al., 1998)에 기초한 계층적 집단화 알고리듬을 이용하여 각 환자 시료의 데이터를 합산하여 가능한 시료 이상점(outliers?)을 동정했다. 마지막으로, 수득되는 평균 시그널 강도를 비교하여(건강한 연골 유래의 cDNA 시료에서의 평균 시그널 강도와 OA 환자의 연골 유래의 cDNA 시료에 존재하는 특정 클론의 평균 시그널 강도를 비교하여) 다르게 발현된 클론을 확인했다.

또는, 각 OA 환자 그룹의 특정 클론의 평균 시그널 강도는 건강한 연골 시료의 평균 시그널 강도와 비교했다.

각 경우마다 특정 cDNA 클론이 나타내는 특정 조직 시료 중의 유전자 발현 수준은 이 조직 시료에 대응한 프로브를 이용한 하이브리드화 실험으로부터 수득되는 특정 클론의 평균 시그널 강도와 관계가 있다. 더 높은 평균 시그널 강도는 더 높은 발현 수준에 대응했다. 유전자 발현의 유의성은 양측 T 검정법으로 각각 비교하여 측정했다. 유효 역치로서 0.1의 p값을 이용하여, 정상 연골 시료와 비교했을 때 OA 환자 유래의 시료 그룹에서 다르게 발현되는 유전자를 나타내는 클론을 동정했다.

실시예 5:

cDNA 어레이의 하이브리드화

다른 유전자 발현을 확인하기 위하여, 전술한 절차에 따라 동정된 각 클론을 프로브로서 이용하고, 골관절염 조직 및 정상 조직 유래의 1차 cDNA 라이브러리를 고정시킨 어레이와 하이브리드화했다. 여기서 1차 cDNA 라이브러리는 표준 방법에 따라 만들고, 세균에 유입시킨 다음, 이 라이브러리를 나타내는 세균 클론을 선택 분리하고, 이와 같이 선택한 클론을 표준 방법에 따라 미량역가 평판에 주입했다(Bancroft et al., 1999 참조).(1999; Methods in Microbiology 28: 67-82). 이 어레이는 전술한 자동 시스템을 이용하여 전술한 방법에 따라 제조했으나, 각 경우마다 크기는 23x23cm로 하고, 이반복으로 적용한 1차 cDNA 클론에 대응하는 약 40000개 PCR 산물을 함유했다. 본 실험에는 두 세트의 어레이를 사용했다: 제1 세트는 정상 조직 유래의 cDNA 라이브러리의 200,000개 cDNA 클론에 대응하는 5개 어레이이고, 제2 세트는 골관절염 조직 유래의 cDNA 라이브러리의 200,000개 cDNA 클론에 대응하는 5개 어레이이다.

다르게 발현된 유전자를 나타내는 각 클론의 PCR 산물은 표준 방법에 따라 랜덤 프라이밍(DecaPrime system, Ambion)을 이용하여 방사능표지했다. 각각 표지된 클론은 2개의 어레이 세트의 제1 어레이 및 제2 어레이 중 하나의 복제물 위에 하이브리드화하여, 각각 정상 연골 조직 및 골관절염 연골 조직 유래의 200,000개 다른 1차 cDNA 클론을 나타내는 총 10개의 어레이를 만들었다. 이 때, 하이브리드화는 면적이 24x24cm인 플라스틱 접시에서 처치(church) 완충액(7% SDS, 0.5m Na 포스페이트 완충액, pH 7.0, 1mM EDTA)을 이용하여 65℃에서 16시간 동안 수행했다. 세척 단계는 앞에서 기술한 바와 같이 수행했다. 하이브리드화된 어레이를 필름에 싸서 포스포 스토리지 스크린에 하룻밤 동안 노출시킨 후, 어레이를 해상도가 100㎛인 FUJI BAS 1800 II 시스템으로 상기 절차에 따라 스캐닝한 후, 시그널을 저장 데이터로 변환시켰다. 표지된 클론과 하이브리드화된 각 어레이 세트 상의 1차 cDNA 클론의 수는 전술한 영상 분석 시스템을 이용하여 앞에서 설명한 절차에 따라 측정했다. 제1 조직에서 제2 조직보다 높은 발현을 나타내는 특정 유전자는 제2 조직의 라이브러리를 함유하는 어레이 세트 상의 시그널보다 제1 조직의 1차 cDNA 어레이에 대응하는 어레이 세트 상에서 더 많은 수의 하이브리드화 시그널을 산출했다.

실시예 6

비교 유전자 발현 분석에 의한 OA 분자 기작의 연구는 병리학적 상태 분석과 약리학적 중재를 위한 공격의 신규 분자점 동정에 매력적인 시도인 것으로 보인다. 이러한 목적을 위해 사용된 "게놈 분석" 유래의 결과는 복수의 과정, 일부 경우에는 역방향이기도 한 과정이 OA에 걸린 연골에서 서로 나란히 진행함으로 인해 해석하기가 복잡하다. 여기에서 설명하는 예는 연골 제작 활성과 연골 분해 활성의 동시 발생의 경우이다.

정상 연골과 비교했을 때 OA에서 다르게 발현되는 유전자의 잠재 기능에 대하여 가장 먼저 접근하기 위하여, 연골 분해 활성과 연골 제작 활성이 각각 가시화될 수 있는 시스템이 있어야 한다.

이러한 목적에 적합한 시스템의 일 예는 골격 발달 모델인 연골내 골화 모델이다. 연골내 골화 동안에는 연골 합성과 연골 분해도 역시 동시에 일어난다. 하지만, 이것은 OA와 달리 서로 분명하게 분리되고 분화되는 세포 종류도 다른 구역에서 일어난다. 증식성 연골 세포의 구역은 세포 부피 증가를 통해 형태학적으로 분명하게 확인할 수 있는 소위 비대성 연골 세포 영역과 다른 구역이다. 이 구역에서는 주요 성분이 일반적으로 II, IX 및 XI형 콜라겐 및 프로테오글리칸 어그리칸으 로 구성된 정상 세포외 연골 매트릭스(ECM)의 재배열 및 분해 사건이 일어난다. 이에 반해 비대성 연골 세포는 이 구역에 특이적인 X형 콜라겐을 합성한다. 비대성 연골 구역에서는 조직이 석회화되고, 연골의 항혈관형성 상태 상실 및 이 조직의 혈관신생이 일어나고, 이어서 골격 원기의 비대성 연골 구역 부근에 골 형성을 일으킨다(도 9A). 초기 발달 단계에서 골 형성 부위에는 연골 ECM의 잔류물이 여전히 남아 있고, 이후 분해되거나 또는 다른 세포의 분화 기질로서 작용한다.

따라서, 이러한 골격 발달 모델에서 골관절염 상태 하에 관절 연골에서 발현되는 유전자의 활성을 가시화하기 위해서는 기본적으로 증식성 구역에서 조사되는 유전자의 발현 시 연골 제작 기능이 있고 비대성 구역이나 배아 뼈에서 발현 시 연골 분해 기능이 있어야 한다.

연골 조직에서 SGK-1 발현에 대해 알려진 데이터는 지금까지 전혀 없기 때문에, SGK-1 mRNA의 발현은 전술한 바와 같이 연골내 골화 동안 검사했다. 이 검사의 목적은 이전 어레이 분석에서 검출된 연골 조직 내의 상승된 SGK-1 mRNA 수준의 유의성에 대한 정보를 최초로 수득하기 위한 것이다. 조사할 조직으로서 신생 마우스의 사지를 사용했다. 마우스의 배아 발달 중에는 골격 성장 및 연골내 골화 과정이 여전히 진행된다.

그 다음, SGK-1 mRNA를 동일계 하이브리드화 방법을 이용하여 조사했다.

이를 위해, 다양한 발달 단계의 마우스 배아와 신생 마우스 사지를, 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해된 4% 파라포름알데하이드(PFA)에서 하룻밤 동안 고정시키고, 점증되는 일련의 농도인 에탄올에 단계적으로 이동시켜 탈수시켰다(PBS 용액을 에탄올/PBS 용액으로 교체). 탈수된 조직을 그 다음 자일렌에 옮겨 담고 파라핀 매립시켰다. 이를 위해, 먼저 자일렌/파라핀 혼합물에 넣어 배양한 뒤, 이 조직을 순수 파라핀에 넣고, 자일렌 증발 후 왁스에 매립시켰다. 동일계 하이브리드화를 위한 조직 절편은 파라핀 매립된 배아 및 사지를 직경이 7㎛인 절편으로 분할하여 제조하고, 현미경 슬라이드 위에 담았다. 이 절편을 그 다음 디곡시게닌-11-UTP로 표지화하고, SGK-1 특이적 안티센스 리보프로브와 하이브리드화했다. 이 리보프로브는 플라스미드 벡터 pCR^R-bluntII-TOP^R(Invitrogen)에 클로닝된 SGK-1 cDNA 단편으로부터 T7 RNA 폴리머라제(Roche)를 이용하여 표준 방법으로 전사시켰다. 시험관내 전사 후, SGK_1 cDNA 서열 말단에서 플라스미드를 Kpn1(Invitrogen)로 선형화하여 전사를 종료시켰다.

사용된 쥐 SGK-1(뉴클레오타이드 746 내지 1425)의 cDNA 단편의 서열은 BC005720(뉴클레오타이드 746-1425)으로 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스에 개시된 서열의 부분 서열을 나타내며, 도 8에 서열번호 13으로 표시했다.

이 조직 절편의 동일계 하이브리드화는 문헌[Dietz et al.(1999)]에 기술된 바와 같이 수행했다. 하이브리드화 산물이 검출되면, 절편은 카이저 글리세린 젤라틴(Merck) 커버슬립으로 덮고, Zeiss Axioplan 2 현미경을 사용하여 분석하고 사진촬영했다. 본 발명자들은 전술한 동일계 하이브리드화를 기초로 하여 연골 세포에서 SGK-1 mRNA를 최초로 검출할 수 있었다. 여기서 검출된 SGK-1 mRNA의 발현 도메인은 비대성 연골 세포에 특이적으로 위치했고(도 9c), 증식성 연골 제작 세포에서는 검출할 수 없었다. 이러한 발견은 비대성 연골 세포의 마커 유전자인 콜라겐 X 의 mRNA 발생을 비교하여 분명하게 보여줄 수 있었다(도 9B). 이에 반해 증식성 연골은 SGK-1 mRNA와 관련하여 분명하게 음성이었다(도 9C).

수행된 동일계 하이브리드화 실험의 결과로부터 연골내 SGK-1의 자연 발생은 연골이 합성 및 유지와 관련이 있는 것이 아니라 형질전환(비대) 및 분해하는 기능을 나타내는 것으로 판명되었다.

따라서, 골관절염 연골에서 SGK-1의 발현은 OA 병리 상태의 부분적인 원인이거나 선호하는 과정이다. SGK-1은 조절 성질을 통해 초기 병리학적 연골 변화를 유도할 뿐만 아니라 이후 연골 분해 활성을 유도하는 새로운 핵심 분자인 것으로 생각된다. 이로 인해, SGK-1은 골관절염의 약리학적 중재에 매우 흥미로운 신규 표적 분자이다.

실시예 7

연골 중의 SGK-1의 기능에 대한 이전 실험에서 얻어진 추정을 점검하기 위하여 연골형성 세포주 ATDC5를 가지고 추가 시험관내 실험을 실시했다.

ATDC5는 마우스 기형암종주 AT805에서 수득되는 클론성 세포주이며 인슐린(배양 배지 1ml당 10㎍) 영향 하에서 연골 분화를 일으킨다. 실험을 위해, 세포는 세포 배양접시에서 단층으로 생육시켰다. 융합성 세포 론(lawn)이 형성된 후, 인슐린의 영향 하에 세포 응집이 일어나기 시작하고, 비교적 긴 시간이 지난 후 광굴절성 클러스터를 형성하며 수가 증가한다. 이러한 연골 분화는 연골 프로테오글리칸을 알시안 블루(Shukunami et al., 1996)로 염색하면 쉽게 가시화될 수 있다. 연골내 골화와 유사한 방식으로, 이 세포는 비대 및 석회화에 대한 추가 분화 잠재성을 갖고 있다. 이 과정은 특별 배지와 이산화탄소 조건으로 원조했다. 배양물의 석회화는 알리자린 레드로 Ca²⁺를 염색하여 검출할 수 있다. 분자 수준에서, 비대성 연골 세포의 마커 유전자(Shukunami et al., 1997)인 콜라겐 X의 mRNA가 증가한 것으로 분명하게 드러났다. 여기서 수행된 실험에서는, II형 콜라겐과 같은 정상 연골 마커 유전자와 나란히 소량의 X형 콜라겐도 mRNA 수준에서 검출할 수 있어서 ADTC5 세포의 연골세포 증식 활성과 비대성 분화를 완전히 분명하게 분리시키는 것은 불가능했다. 하지만, 이후 배양물의 석회화 유도는 크게 증가(도 10)한 반면, 콜라겐 II형 mRNA의 함량은 감소했다(도면은 제시하지 않았다).

이러한 상태 하에서 SGK-1 mRNA의 발현은 콜라겐 X(Col10a1) mRNA와 유사했다. ATDC5 세포의 연골성 분화 및 증식 동안에 SGK-1 mRNA의 기본 함량을 검출할 수 있었고, 이후 세포의 비대 및 석회화가 유도된 다음 급격하게 상승했다(도 10). SGK-1 및 Col10a1 mRNA의 함량은 정량적 PCR 실험 및 노던 블롯 하이브리드화를 수행하여 검출했다. 두 분석 방법은 비슷한 결과를 제공했다. 따라서, 동일계 하이브리드화의 결과는 비슷한 시험관내 모델에서도 확인되었다.

실시예 8

연골 분화 동안 SGK-1의 기능을 표적으로 한 조사를 위해, 사람 SGK-1를 MMLV(Murine Moloney Leukemia Virus) 유래의 레트로바이러스 벡터 시스템(pLPCX 벡터)을 이용하여 ATDC5에서 과발현시켰다. 여기서 2가지 다른 SGK-1 변형체, 키나제 결손 돌연변이체(트레오닌²⁵⁶ 및 세린⁴²²의 알라닌으로의 돌연변이 = SGK-1 KD) 및 자연 발생의 기능성 형태(SGK-1 wt)를 사용했다. SGK-1 없이 레트로바이러스 벡터만을 함유하거나 형질도입되지 않은 ATDC5 세포를 바이러스 SGK-1 형질도입의 대조군으로서 사용했다. 그 다음, 세포를 인슐린으로 자극하여 연골 분화시키고 21일 후 분석했다. 연골성 분화된 세포의 정도는 프로테오글리칸 합성 분석을 통해 조사했다. 이를 위해, 배양물을 알시안 블루로 염색하고 연골의 주요 프로테오글리칸인 어그리칸의 mRNA 발현에 대해 검사했다(도 11).

이 실험을 통해, SGK-1의 과발현이 연골 합성의 억제를 일으킨다는 것으로 입증할 수 있었다. 알시안 블루 염색된 프로테오글리칸(도 11) 및 어그리칸 mRNA(도 12)의 함량이 모두 크게 감소되었다. 이에 반해 키나제 결손 SGK-1 형태는 이러한 변수들에 대해 어떠한 부정적 영향도 미치지 않았다(도 11, 도 12). 기재된 대조군은 유사하게 천연의 작용을 나타내었다. 따라서, 연골 합성 및 ECM 형성 억제가 SGK-1의 효과 때문이지 과발현 결과로서 인위적으로 증가된 단백질 양 때문이 아니라는 것을 보여주었다.

이러한 실험으로부터 OA에 걸린 관절 연골에서 SGK-1이 미치는 영향에 대한 다양한 결론이 유도될 수 있다.

첫째, SGK-1 발현성 연골 세포는 조직의 기능에 필수적인 프로테오글리칸과 같은 세포외 기질을 더 이상 충분히 합성할 수 없다. 둘째, 이 연골 세포는 어그리칸과 같은 유전자의 발현을 증가시켜 분화 과정을 보상하거나 복구시키지 못한다. 따라서, SGK-1의 기능은 OA 병리상태의 잠재성 개시제이며 중심 인자인 것으로 확인된다.

따라서, SGK-1은 퇴행성 연골 변화, 특히 골관절염의 치료를 위한 신규 활성 성분의 탐색 및 개발에 극히 흥미로운 표적 분자이다.

관절 연골 세포에서 SGK-1, -2 및 -3의 발현은 당연히 이 분자의 기능을 추가 분석하는데 중요한 정보를 제공할 것이다. 이를 위해 예컨대 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 마우스의 돌연변이 및 녹아웃 모델을 만들고 분석하는 것이 가능할 것이다(예컨대, 표준 방법에 대해 열거된 문헌 참조).

도 1은 NCBI 수탁번호 NM_005627, AF153609(서열번호 1)에 따른 기탁된 사람 혈청 글루코코르티코이드 조절 키나제 1(SGK1)의 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열이다.

도 2는 NCBI 수탁번호 AF169034, AF186470(서열번호 2)에 따른 사람 혈청 글루코코르티코이드 조절 키나제 2(SGK2)의 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열이다.

도 3은 NCBI 수탁번호 NM_013257, AF085233, AF169035(서열번호 3)에 따른 사람 혈청 글루코코르티코이드 조절 키나제 3(SGK3)의 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열이다.

도 4는 NCBI 수탁번호 NP_005618(서열번호 4)에 따른 사람 혈청 글루코코르티코이드 조절 키나제 1(SGK1)의 아미노산 서열이다.

도 5는 NCBI 수탁번호 NP_733794, NP_057360(서열번호 5)에 따른 사람 혈청 글루코코르티코이드 조절 키나제 2(SGK2)의 아미노산 서열이다. 이 도면에서 2개의 다른 SGK2 이소형 α 및 β의 처음 아미노산은 진하게 표시했다. 이들 2개의 서브타입의 DDG/EMBL/GenBank 수탁번호는 AF169034(α) 및 AF186470(β)이다. SGK2α는 367개 아미노산의 단백질이고, SGK2β는 427개 아미노산의 단백질이다.

도 6은 NCBI 수탁번호 Q96BR1(서열번호 6)에 따른 사람 혈청 글루코코르티코이드 조절 키나제 3(SGK3)의 아미노산 서열이다. SGK3은 429개 아미노산의 길이를 가진 단백질이다.

도 7은 SGK 서브타입 1 내지 3의 기능성 단편의 아미노산 및 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열이다: 도 7A는 SGK1 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열의 키나제 도메인을 함유하는 단편(서열번호 7)이다; 도 7B는 SGK2 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열의 키나제 도메인을 함유하는 단편(서열번호 8)이다; 도 7C는 SGK3 암호화 폴리뉴클레오타이드 서열의 키나제 도메인을 함유하는 단편(서열번호 9)이다; 도 7D는 SGK1 아미노산 서열의 키나제 도메인을 함유하는 단편(서열번호 10)이다; 도 7E는 SGK3 아미노산 서열의 키나제 도메인을 함유하는 단편(서열번호 11)이다; 도 7F는 SGK3 아미노산 서열의 키나제 도메인을 함유하는 단편(서열번호 12)이다.

도 8은 마우스 SGK-1 mRNA의 cDNA 단편이다: 도 8은 마우스 SGK-1 mRNA로부터 클로닝되고 리보프로브를 제조하는데 사용된 cDNA 단편의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 13)이다.

도 9는 신생 마우스의 경골의 조직 절편에서의 동일계 하이브리드화에 의한 SGK-1 mRNA 발현의 검출 결과를 도시한 것이다.

A: 헤마톡실린 및 에오신을 이용한 대조 염색.

B: 디곡시게닌 표지된 안티센스 리보프로브와의 동일계 하이브리드화 및 후속 발색 반응에 의한 비대성 연골 세포에서의 Col10a1 발현의 검출.

C: 디곡시게닌 표지된 안티센스 리보프로브와의 동일계 하이브리드화 및 후속 발색 반응에 의한 비대성 연골 세포에서의 SGK-1 mRNA의 검출.

이 도면의 결과는 특정 안티센스 리보프로브의 동일계 하이브리드화에 의해 신생 마우스 경절의 비대성 연골 세포에서 SGK-1이 검출된다는 것을 보여준다(도 9C). 이 세포를 더욱 분명하게 확인할 수 있도록, 조직 절편의 대응 대조 염색도 제시했다(도 9A).

도 10은 다양한 분화 단계의 ATDC5 세포에서 나타나는 SGK-1과 Col10a1의 mRNA 발현 비교를 도시한 것이다.

1: 서브컨플루언트 단계의 ATDC5 세포

2: 컨플루언트 ATDC5 세포

3: 인슐린 첨가 3주 후 연골형성 분화된 ATDC5 세포

4: 2주 동안 추가 석회화 후 3에 기술된 바와 같은 연골형성적 분화된 ATDC5 세포.

도 10A는 정량적 PCR에 의해 SGK-1 및 Col10a1 mRNA의 함량을 분석한 결과이다. 수치 단위는 발현 증폭 정도를 나타낸다.

도 10B는 노던 블롯 하이브리드화에 의한 SGK-1과 Col10a1의 mRNA 검출 결과이다.

A 및 B에서는 반응에 이용된 총 세포 RNA의 함량에 대해 보정하기 위하여 β -액틴 mRNA의 발현을 측정했다.

도 11은 SGK-1의 안정한 과발현을 위해 바이러스적 형질도입된 ATDC5 세포이다.

ATDC5: 대조군으로서 미처리된 세포

pLCPCX: 역시 대조군으로서 SGK-1 없는 형질도입 벡터의 안정한 통합.

SGK-1 wt: 기능성 SGK-1의 과발현

SGK-1 KD: 키나제 결손형 SGK-1의 과발현

세포는 컨플루언트에 도달한 후 21일 동안 연골형성 분화 상태 하에서 유지시켰다. 연골형성 분화 및 프로테오글리칸 생산 정도는 알시안 블루 염색으로 검출했다. SGK-1 과발현 세포는 연골성 분화된 세포 함량 및 프로테오글리칸 형성 함량의 유의적인 감소를 나타낸 반면, 키나제 결손형 SGK-1은 이와 관련하여 아무런 영향도 갖지 않았다.

A 및 B는 2개의 독립 실험에서의 동일한 결과를 나타낸다.

도 12는 어그리칸 mRNA 수준에서 도 11에 기술된 시료의 프로테오글리칸 발현에 대한 정량적 PCR 분석을 도시한 것이다.

A 및 B는 도 11A 및 B에 도시된 시료에 대응한다.

1. ATDC5

2. pLPCX

3. SGK-1 wt

4. SGK-1 KD

수치 단위는 발현 증폭 정도를 나타낸다. 측정된 어그리칸 mRNA의 함량은 거의 모두 알시안 블루 염색에 의해 검출된 프로테오글리칸에 대해 도 11에 제시된 함량과 비슷한 양상을 보였다.

유일하게 도 11B의 pLPCX 시료는 mRNA 수준에서의 비교에서 SGK-1 wt 시료에 비해 더 적은 발현 증폭을 보였다. 하지만, SGK-1 wt 과발현 후 어그리칸 mRNA 발현은 ATDC5 및 SGK-1 KD에 비해 크게 감소되는 것이 분명했다.

<110> Sanofi-Aventis Deutschland GmbH <120> USE OF A SERUM/GLUCOCORTICOID-REGULATED KINASE <130> DEAV 2004/0077 <150> DE 10 2004 059 781.2 <151> 2004-12-10 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2370 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cacgagggag cgctaacgtc tttctgtctc cccgcggtgg tgatgacggt gaaaactgag 60 gctgctaagg gcaccctcac ttactccagg atgaggggca tggtggcaat tctcatcgct 120 ttcatgaagc agaggaggat gggtctgaac gactttattc agaagattgc caataactcc 180 tatgcatgca aacaccctga agttcagtcc atcttgaaga tctcccaacc tcaggagcct 240 gagcttatga atgccaaccc ttctcctcca ccaagtcctt ctcagcaaat caaccttggc 300 ccgtcgtcca atcctcatgc taaaccatct gactttcact tcttgaaagt gatcggaaag 360 ggcagttttg gaaaggttct tctagcaaga cacaaggcag aagaagtgtt ctatgcagtc 420 aaagttttac agaagaaagc aatcctgaaa aagaaagagg agaagcatat tatgtcggag 480 cggaatgttc tgttgaagaa tgtgaagcac cctttcctgg tgggccttca cttctctttc 540 cagactgctg acaaattgta ctttgtccta gactacatta atggtggaga gttgttctac 600 catctccaga gggaacgctg cttcctggaa ccacgggctc gtttctatgc 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Ala Arg His Leu Leu Glu Gly Leu Leu Gln Lys Asp Arg 325 330 335 Thr Lys Arg Leu Gly Ala Lys Asp Asp Phe Met Glu Ile Lys Ser His 340 345 350 Val Phe Phe Ser Leu Ile Asn Trp Asp Asp Leu Ile Asn Lys Lys Ile 355 360 365 Thr Pro Pro Phe Asn Pro Asn Val Ser Gly Pro Asn Glu Leu Arg His 370 375 380 Phe Asp Pro Glu Phe Thr Glu Glu Pro Val Pro Asn Ser Ile Gly Lys 385 390 395 400 Ser Pro Asp Ser Val Leu Val Thr Ala Ser Val Lys Glu Ala Ala Glu 405 410 415 Ala Phe Leu Gly Phe Ser Tyr Ala Pro Pro Thr Asp Ser Phe Leu 420 425 430 <210> 5 <211> 427 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Gln Gly Leu Leu Thr Ser Gly Arg Lys Pro Ser Gly Gly Gly Arg 1 5 10 15 Cys Thr Gly Arg Gly Gly Trp Arg Gly Gln Trp Cys Leu Lys Pro Trp 20 25 30 Met Gly Gly Ala Asp Pro Pro Thr Pro Thr Leu Ser Cys Leu Leu Leu 35 40 45 Pro Val Pro Pro Glu Leu Pro Asp His Cys Tyr Arg Met Asn Ser Ser 50 55 60 Pro Ala Gly Thr Pro Ser Pro Gln Pro Ser Arg Ala Asn Gly Asn Ile 65 70 75 80 Asn Leu Gly Pro Ser Ala Asn Pro Asn Ala Gln Pro Thr Asp Phe Asp 85 90 95 Phe Leu Lys Val Ile Gly Lys Gly Asn Tyr Gly Lys Val Leu Leu Ala 100 105 110 Lys Arg Lys Ser Asp Gly Ala Phe Tyr Ala Val Lys Val Leu Gln Lys 115 120 125 Lys Ser Ile Leu Lys Lys Lys Glu Gln Ser His Ile Met Ala Glu Arg 130 135 140 Ser Val Leu Leu Lys Asn Val Arg His Pro Phe Leu Val Gly Leu Arg 145 150 155 160 Tyr Ser Phe Gln Thr Pro Glu Lys Leu Tyr Phe Val Leu Asp Tyr Val 165 170 175 Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Gln Arg Glu Arg Arg Phe Leu 180 185 190 Glu Pro Arg Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Glu Val Ala Ser Ala Ile Gly 195 200 205 Tyr Leu His Ser Leu Asn Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn 210 215 220 Ile Leu Leu Asp Cys Gln Gly His Val Val Leu Thr Asp Phe Gly Leu 225 230 235 240 Cys Lys Glu Gly Val Glu Pro Glu Asp Thr Thr Ser Thr Phe Cys Gly 245 250 255 Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Arg Lys Glu Pro Tyr Asp 260 265 270 Arg Ala Val Asp Trp Trp Cys Leu Gly Ala Val Leu Tyr Glu Met Leu 275 280 285 His Gly Leu Pro Pro Phe Tyr Ser Gln Asp Val Ser Gln Met Tyr Glu 290 295 300 Asn Ile Leu His Gln Pro Leu Gln Ile Pro Gly Gly Arg Thr Val Ala 305 310 315 320 Ala Cys Asp Leu Leu Gln Ser Leu Leu His Lys Asp Gln Arg Gln Arg 325 330 335 Leu Gly Ser Lys Ala Asp Phe Leu Glu Ile Lys Asn His Val Phe Phe 340 345 350 Ser Pro Ile Asn Trp Asp Asp Leu Tyr His Lys Arg Leu Thr Pro Pro 355 360 365 Phe Asn Pro Asn Val Thr Gly Pro Ala Asp Leu Lys His Phe Asp Pro 370 375 380 Glu Phe Thr Gln Glu Ala Val Ser Lys Ser Ile Gly Cys Thr Pro Asp 385 390 395 400 Thr Val Ala Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ser Ala Phe Leu Gly Phe Ser 405 410 415 Tyr Ala Pro Glu Asp Asp Asp Ile Leu Asp Cys 420 425 <210> 6 <211> 496 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Gln Arg Asp His Thr Met Asp Tyr Lys Glu Ser Cys Pro Ser Val 1 5 10 15 Ser Ile Pro Ser Ser Asp Glu His Arg Glu Lys Lys Lys Arg Phe Thr 20 25 30 Val Tyr Lys Val Leu Val Ser Val Gly Arg Ser Glu Trp Phe Val Phe 35 40 45 Arg Arg Tyr Ala Glu Val Asp Lys Leu Tyr Asn Thr Leu Lys Lys Gln 50 55 60 Phe Pro Ala Met Ala Leu Lys Ile Pro Ala Lys Arg Ile Phe Gly Asp 65 70 75 80 Asn Phe Asp Pro Asp Phe Ile Lys Gln Arg Arg Ala Gly Leu Asn Glu 85 90 95 Phe Ile Gln Asn Leu Val Arg Tyr Pro Glu Leu Tyr Asn His Pro Asp 100 105 110 Val Arg Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Pro Lys His Gln Ser Gly Pro 115 120 125 Ser Glu Asp Glu Asp Glu Arg Ser Ser Gln Lys Leu His Ser Thr Ser 130 135 140 Gln Asn Ile Asn Leu Gly Pro Ser Gly Asn Pro His Ala Lys Pro Thr 145 150 155 160 Asp Phe Asp Phe Leu Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys Val 165 170 175 Leu Leu Ala Lys Arg Lys Leu Asp Gly Lys Val Tyr Ala Val Lys Val 180 185 190 Leu Gln Lys Lys Ile Val Leu Asn Arg Lys Glu Gln Lys His Ile Met 195 200 205 Ala Glu Arg Asn Val Leu Leu Lys Asn Val Lys His Pro Phe Leu Val 210 215 220 Gly Leu His Tyr Ser Phe Gln Thr Thr Glu Lys Leu Tyr Phe Val Leu 225 230 235 240 Asp Phe Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Gln Arg Glu Arg 245 250 255 Ser Phe Pro Glu His Arg Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ala Ser 260 265 270 Ala Leu Gly Tyr Leu His Ser Ile Lys Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys 275 280 285 Pro Glu Asn Ile Leu Val Asp Ser Val Gly His Val Val Leu Thr Asp 290 295 300 Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Ala Ile Ser Asp Thr Thr Thr Thr 305 310 315 320 Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Ile Arg Lys Gln 325 330 335 Pro Tyr Asp Asn Thr Val Asp Trp Trp Cys Leu Gly Ala Val Leu Tyr 340 345 350 Glu Met Leu Tyr Gly Leu Pro Pro Phe Tyr Cys Arg Asp Val Ala Glu 355 360 365 Met Tyr Asp Asn Ile Leu His Lys Pro Leu Ser Leu Arg Pro Gly Val 370 375 380 Ser Leu Arg Ala Trp Ser Ile Leu Glu Glu Leu Leu Glu Lys Asp Arg 385 390 395 400 Gln Asn Arg Leu Gly Ala Lys Glu Asp Phe Leu Glu Ile Gln Asn His 405 410 415 Pro Phe Phe Glu Ser Leu Ser Trp Ala Asp Leu Val Gln Lys Lys Ile 420 425 430 Pro Pro Pro Phe Asn Pro Asn Val Ala Gly Pro Asp Asp Ile Arg Asn 435 440 445 Phe Asp Thr Ala Phe Thr Glu Glu Thr Val Pro Tyr Ser Val Cys Val 450 455 460 Ser Ser Asp Tyr Ser Ile Val Asn Ala Ser Val Leu Glu Ala Asp Asp 465 470 475 480 Ala Phe Val Gly Phe Ser Tyr Ala Pro Pro Ser Glu Asp Leu Phe Leu 485 490 495 <210> 7 <211> 846 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 tttcacttct tgaaagtgat cggaaagggc agttttggaa aggttcttct agcaagacac 60 aaggcagaag aagtgttcta tgcagtcaaa gttttacaga agaaagcaat cctgaaaaag 120 aaagaggaga agcatattat gtcggagcgg aatgttctgt tgaagaatgt gaagcaccct 180 ttcctggtgg gccttcactt ctctttccag actgctgaca aattgtactt tgtcctagac 240 tacattaatg gtggagagtt gttctaccat ctccagaggg aacgctgctt cctggaacca 300 cgggctcgtt tctatgctgc tgaaatagcc agtgccttgg gctacctgca ttcactgaac 360 atcgtttata gagacttaaa accagagaat attttgctag attcacaggg acacattgtc 420 cttactgact tcggactctg caaggagaac attgaacaca acagcacaac atccaccttc 480 tgtggcacgc cggagtatct cgcacctgag gtgcttcata agcagcctta tgacaggact 540 gtggactggt ggtgcctggg agctgtcttg tatgagatgc tgtatggcct gccgcctttt 600 tatagccgaa acacagctga aatgtacgac aacattctga acaagcctct ccagctgaaa 660 ccaaatatta caaattccgc aagacacctc ctggagggcc tcctgcagaa ggacaggaca 720 aagcggctcg gggccaagga tgacttcatg gagattaaga gtcatgtctt cttctcctta 780 attaactggg atgatctcat taataagaag attactcccc cttttaaccc aaatgtgagt 840 gggccc 846 <210> 8 <211> 780 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gacttcgact tcctcaaagt catcggcaaa gggaactacg ggaaggtcct actggccaag 60 cgcaagtctg atggggcgtt ctatgcagtg aaggtactac agaaaaagtc catcttaaag 120 aagaaagagc agagccacat catggcagag cgcagtgtgc ttctgaagaa cgtgcggcac 180 cccttcctcg tgggcctgcg ctactccttc cagacacctg agaagctcta cttcgtgctc 240 gactatgtca acgggggaga gctcttcttc cacctgcagc gggagcgccg gttcctggag 300 ccccgggcca ggttctacgc tgctgaggtg gccagcgcca ttggctacct gcactccctc 360 aacatcattt acagggatct gaaaccagag aacattctct tggactgcca gggacacgtg 420 gtgctgacgg attttggcct ctgcaaggaa ggtgtagagc ctgaagacac cacatccaca 480 ttctgtggta cccctgagta cttggcacct gaagtgcttc ggaaagagcc ttatgatcga 540 gcagtggact ggtggtgctt gggggcagtc ctctacgaga tgctccatgg cctgccgccc 600 ttctacagcc aagatgtatc ccagatgtat gagaacattc tgcaccagcc gctacagatc 660 cccggaggcc ggacagtggc cgcctgtgac ctcctgcaaa gccttctcca caaggaccag 720 aggcagcggc tgggctccaa agcagacttt cttgagatta agaaccatgt attcttcagc 780 <210> 9 <211> 780 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 actttgattt cttaaaagtt attggaaaag gcagctttgg caaggttctt cttgcaaaac 60 ggaaactgga tggaaaattt tatgctgtca aagtgttaca gaaaaaaata gttctcaaca 120 gaaaagagca aaaacatatt atggctgaac gtaatgtgct cttgaaaaat gtgaaacatc 180 cgtttttggt tggattgcat tattccttcc aaacaactga aaagctttat tttgttctgg 240 attttgttaa tggaggggag ctttttttcc acttacaaag agaacggtcc tttcctgagc 300 acagagctag gttttacgct gctgaaattg ctagtgcatt gggttactta cattccatca 360 aaatagtata cagagacttg aaaccagaaa atattctttt ggattcagta ggacatgttg 420 tcttaacaga ttttgggctt tgtaaagaag gaattgctat ttctgacacc actaccacat 480 tttgtgggac accagagtat cttgcacctg aagtaattag aaaacagccc tatgacaata 540 ctgtagattg gtggtgcctt ggggctgttc tgtatgaaat gctgtatgga ttgcctcctt 600 tttattgccg agatgttgct gaaatgtatg acaatatcct tcacaaaccc ctaagtttga 660 ggccaggagt gagtcttaca gcctggtcca ttctggaaga actcctagaa aaagacaggc 720 aaaatcgact tggtgccaag gaagactttc ttgaaattca gaatcatcct ttttttgaat 780 <210> 10 <211> 260 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ser Asp Phe His Phe Leu Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys 1 5 10 15 Val Leu Leu Ala Arg His Lys Ala Glu Glu Val Phe Tyr Ala Val Lys 20 25 30 Val Leu Gln Lys Lys Ala Ile Leu Lys Lys Lys Glu Glu Lys His Ile 35 40 45 Met Ser Glu Arg Asn Val Leu Leu Lys Asn Val Lys His Pro Phe Leu 50 55 60 Val Gly Leu His Phe Ser Phe Gln Thr Ala Asp Lys Leu Tyr Phe Val 65 70 75 80 Leu Asp Tyr Ile Asn Gly Gly Glu Leu Phe Tyr His Leu Gln Arg Glu 85 90 95 Arg Cys Phe Leu Glu Pro Arg Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ala 100 105 110 Ser Ala Leu Gly Tyr Leu His Ser Leu Asn Ile Val Tyr Arg Asp Leu 115 120 125 Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Asp Ser Gln Gly His Ile Val Leu Thr 130 135 140 Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Asn Ile Glu His Asn Ser Thr Thr Ser 145 150 155 160 Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu His Lys 165 170 175 Gln Pro Tyr Asp Arg Thr Val Asp Trp Trp Cys Leu Gly Ala Val Leu 180 185 190 Tyr Glu Met Leu Tyr Gly Leu Pro Pro Phe Tyr Ser Arg Asn Thr Ala 195 200 205 Glu Met Tyr Asp Asn Ile Leu Asn Lys Pro Leu Gln Leu Lys Pro Asn 210 215 220 Ile Thr Asn Ser Ala Arg His Leu Leu Glu Gly Leu Leu Gln Lys Asp 225 230 235 240 Arg Thr Lys Arg Leu Gly Ala Lys Asp Asp Phe Met Glu Ile Lys Ser 245 250 255 His Val Phe Phe 260 <210> 11 <211> 260 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Thr Asp Phe Asp Phe Leu Lys Val Ile Gly Lys Gly Asn Tyr Gly Lys 1 5 10 15 Val Leu Leu Ala Lys Arg Lys Ser Asp Gly Ala Phe Tyr Ala Val Lys 20 25 30 Val Leu Gln Lys Lys Ser Ile Leu Lys Lys Lys Glu Gln Ser His Ile 35 40 45 Met Ala Glu Arg Ser Val Leu Leu Lys Asn Val Arg His Pro Phe Leu 50 55 60 Val Gly Leu Arg Tyr Ser Phe Gln Thr Pro Glu Lys Leu Tyr Phe Val 65 70 75 80 Leu Asp Tyr Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Gln Arg Glu 85 90 95 Arg Arg Phe Leu Glu Pro Arg Ala Arg Phe Tyr Ala Ala Glu Val Ala 100 105 110 Ser Ala Ile Gly Tyr Leu His Ser Leu Asn Ile Ile Tyr Arg Asp Leu 115 120 125 Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Asp Cys Gln Gly His Val Val Leu Thr 130 135 140 Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Val Glu Pro Glu Asp Thr Thr Ser 145 150 155 160 Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Arg Lys 165 170 175 Glu Pro Tyr Asp Arg Ala Val Asp Trp Trp Cys Leu Gly Ala Val Leu 180 185 190 Tyr Glu Met Leu His Gly Leu Pro Pro Phe Tyr Ser Gln Asp Val Ser 195 200 205 Gln Met Tyr Glu Asn Ile Leu His Gln Pro Leu Gln Ile Pro Gly Gly 210 215 220 Arg Thr Val Ala Ala Cys Asp Leu Leu Gln Ser Leu Leu His Lys Asp 225 230 235 240 Gln Arg Gln Arg Leu Gly Ser Lys Ala Asp Phe Leu Glu Ile Lys Asn 245 250 255 His Val Phe Phe 260 <210> 12 <211> 260 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Thr Asp Phe Asp Phe Leu Lys Val Ile Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys 1 5 10 15 Val Leu Leu Ala Lys Arg Lys Leu Asp Gly Lys Val Tyr Ala Val Lys 20 25 30 Val Leu Gln Lys Lys Ile Val Leu Asn Arg Lys Glu Gln Lys His Ile 35 40 45 Met Ala Glu Arg Asn Val Leu Leu Lys Asn Val Lys His Pro Phe Leu 50 55 60 Val Gly Leu His Tyr Ser Phe Gln Thr Thr Glu Lys Leu Tyr Phe Val 65 70 75 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ctgtggcacg cctgagtatc tggctcctga ggtcctccat aaacagccgt 120 atgaccggac ggtggactgg tggtgtcttg gggctgtcct gtatgagatg ctctacggcc 180 tgcccccgtt ttatagccgg aacacggctg agatgtacga caatattctg aacaagcctc 240 tccagttgaa accaaatatt acaaactcgg caaggcacct cctggaaggc ctcctgcaga 300 aggaccggac caagaggctg ggtgccaagg atgactttat ggagattaag agtcatattt 360 tcttctcttt aattaactgg gatgatctca tcaataagaa gattacaccc ccatttaacc 420 caaatgtgag tgggcccagt gaccttcggc acttcgatcc cgagtttacc gaggagccgg 480 tccccagctc catcggcagg tcccctgaca gcatccttgt cacggccagt gtgaaggaag 540 cagcagaagc cttcctcggc ttctcctatg cacctcctgt ggattccttc ctctgagtgc 600 tcccgggatg gttctgaagg acttcctcag cgtttcctaa agtgttttcg ttagcctttg 660 gtggagttgc cagctgacag 680

Claims

a. 혈청/글루코코르티코이드 조절 키나제 (SGK) 단백질 또는 이의 기능성 유도체 또는 단편의 폴리펩타이드를 잠재성 활성 성분과 접촉시키는 단계;

b. 상기 잠재성 활성 성분의 존재 하에서 SGK 활성을 측정하는 단계;

c. 상기 잠재성 활성 성분의 부재 하에서 SGK 활성을 측정하는 단계 및

d. 상기 b의 SGK 활성과 상기 c의 SGK 활성을 비교하는 단계를 포함하고,

상기 기능성 유도체 또는 단편이 서열번호 10, 11 또는 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어지거나 서열번호 7, 8 또는 9에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인,

퇴행성 연골 변화의 예방 또는 치료를 위한 활성 성분의 동정 방법.
a. SGK 단백질 또는 이의 기능성 유도체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를, 적어도 전사를 수행할 수 있는 시스템에서 잠재성 활성 성분과 접촉시키는 단계;

b. 상기 잠재성 활성 성분의 존재 하에서 SGK 단백질 또는 이의 기능성 유도체 또는 단편의 양 또는 이들을 암호화하는 mRNA의 양을 측정하는 단계;

c. 상기 잠재성 활성 성분의 부재 하에서 SGK 단백질 또는 이의 기능성 유도체 또는 단편의 양 또는 이들을 암호화하는 mRNA의 양을 측정하는 단계 및

d. 상기 b에서 수득된 단백질 또는 mRNA의 양과 상기 c에서 수득된 단백질 또는 mRNA의 양을 비교하는 단계를 포함하고,

상기 기능성 유도체 또는 단편이 서열번호 10, 11 또는 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어지거나 서열번호 7, 8 또는 9에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인,

퇴행성 연골 변화의 예방 또는 치료를 위한 활성 성분의 동정 방법.
a. SGK 단백질 또는 이의 기능성 유도체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를, 적어도 해독을 수행할 수 있는 시스템에서, 잠재성 활성 성분과 접촉시키는 단계;

b. 상기 잠재성 활성 성분의 존재 하에서 SGK 단백질 또는 이의 기능성 유도체 또는 단편의 활성을 측정하는 단계;

c. 상기 잠재성 활성 성분의 부재 하에서 SGK 단백질 또는 이의 기능성 유도체 또는 단편의 활성을 측정하는 단계 및

d. 상기 b의 SGK 활성과 상기 c의 SGK 활성을 비교하는 단계를 포함하고,

상기 기능성 유도체 또는 단편이 서열번호 10, 11 또는 12에 제시된 아미노산 서열로 이루어지거나 서열번호 7, 8 또는 9에 제시된 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인,

퇴행성 연골 변화의 예방 또는 치료를 위한 활성 성분의 동정 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 고처리량 스크리닝으로 수행되는 방법.
퇴행성 연골 변화를 확인하기 위해 분리된 연골 조직 시료에서 SGK를 검출하는 방법.
제5항에 있어서,

a. 조사되는 분리된 연골 조직 시료에 존재하는 SGK 단백질 또는 mRNA의 함량을 측정하는 단계 및

b. 비퇴행 연골의 분리된 시료에 존재하는 SGK 단백질 또는 mRNA의 함량과 비교하는 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, SGK가 분리된 분자로서 사용되는 방법.
제4항에 있어서, SGK가 분리된 분자로서 사용되는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 분석법이 생화학적 분석법 또는 세포 분석법인 방법.
제4항에 있어서, 분석법이 생화학적 분석법 또는 세포 분석법인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, SGK가 사람 SGK인 방법.
제4항에 있어서, SGK가 사람 SGK인 방법.
제11항에 있어서, SGK가 SGK1, 2 또는 3인 방법.
제12항에 있어서, SGK가 SGK1, 2 또는 3인 방법.
제4항에 있어서, SGK 또는 이의 기능성 유도체 또는 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 사용되는 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가,

a. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열;

b. 상기 a에 따른 서열에 대해 유전자 축퇴성을 갖는 서열; 또는

c. 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 서열로 이루어지는 방법.
제4항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드가,

a. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열;

b. 상기 a에 따른 서열에 대해 유전자 축퇴성을 갖는 서열; 또는

c. 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 서열로 이루어지는 방법.
제4항에 있어서, SGK 또는 이의 기능성 유도체 또는 단편이 폴리펩타이드인 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩타이드가,

a. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열;

b. 상기 a에 따른 서열에 대해 유전자 축퇴성을 갖는 서열; 또는

c. 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 서열에 의해 암호화되는 방법.
제4항에 있어서, 폴리펩타이드가,

a. 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열;

b. 상기 a에 따른 서열에 대해 유전자 축퇴성을 갖는 서열; 또는

c. 서열번호 7, 서열번호 8 또는 서열번호 9의 서열에 의해 암호화되는 방법.
제1항에 있어서, SGK 단백질의 폴리펩타이드가 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 제시된 서열로 이루어지는 방법.
제4항에 있어서, SGK 단백질의 폴리펩타이드가 서열번호 4, 서열번호 5 또는 서열번호 6에 제시된 서열로 이루어지는 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, SGK 단백질의 기능성 유도체 또는 단편이 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 서열로 이루어지는 방법.
제4항에 있어서, SGK 단백질의 기능성 유도체 또는 단편이 서열번호 10, 서열번호 11 또는 서열번호 12에 제시된 서열로 이루어지는 방법.
SGK를 검출하기 위한 항체, 프라이머 세트 및 핵산 프로브 중에서 선택되는 하나 이상의 수단을 포함하는, 퇴행성 연골 변화 진단용 검사 키트.
삭제
제25항에 있어서, 진단 방법을 수행하는 사용 지침서를 추가로 포함하는 검사 키트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 퇴행성 연골 변화가 관절 장애인 방법.
제4항에 있어서, 퇴행성 연골 변화가 관절 장애인 방법.
제25항에 있어서, 퇴행성 연골 변화가 관절 장애인 검사 키트.