JP4971991B2 - 血清/糖質コルチコイド調節キナーゼの使用 - Google Patents
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Description
a.SGKタンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメントと、可能性のある活性成分とを接触させる工程;
b.可能性のある活性成分の存在下でSGK活性を測定する工程;
c.可能性のある活性成分の非存在下でSGK活性を測定する工程;
d.b)のSGK活性とc)のSGK活性とを比較する工程、好ましくは、可能性のある活性成分の存在下で、SGK(タンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント)の活性が、その非存在下よりも低いかどうかを決定する工程、
を含み、従って、活性成分は、好ましくは、SGKの活性を阻害するそれらの能力に基づき判別される。
a)少なくとも転写が可能な系中で、SGKタンパク質、機能的な誘導体、または、それらをコードする核酸のフラグメントを含むサンプルと、可能性のある活性成分とを接触させる工程;
b)可能性のある活性成分の存在下で、SGKタンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント、または、それらをコードするmRNAの量を測定する工程;
c)可能性のある活性成分の非存在下でSGKタンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント、または、それらをコードするmRNAの量を測定する工程;
d)b)からのタンパク質またはmRNAの量と、c)からのタンパク質またはmRNAの量とを比較する工程、好ましくは、可能性のある活性成分の存在下で、SGK(タンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント、または、それらをコードするmRNA)の量が、その非存在下よりも低いかどうかを決定する工程、
を含み、従って、活性成分は、好ましくは、利用可能なSGKの量を減少させるそれらの能力に基づき判別される。
a)少なくとも翻訳が可能な系中で、SGKタンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント、または、それらをコードする核酸を含むサンプルと、可能性のある活性成分とを接触させる工程;
b)可能性のある活性成分の存在下で、SGKタンパク質、フラグメントまたは誘導体の活性を測定する工程;
c)可能性のある活性成分の非存在下で、SGKタンパク質、フラグメントまたは誘導体の活性を測定する工程、好ましくは、可能性のある活性成分の存在下で、SGK(タンパク質、それらの機能的な誘導体またはフラグメント、または、それらをコードするmRNA)の活性または量が、その非存在下よりも低いかどうかを決定する工程、
を含み、従って、活性成分は、好ましくは、SGKの活性を阻害するそれらの能力、または、利用可能なSGKの量を減少させるそれらの能力に基づき判別される。
a)調査するために単離された軟骨サンプルのSGKタンパク質またはmRNAの含量を測定する工程;
b)変性していない軟骨の単離されたサンプルのSGKタンパク質またはmRNAの含量と比較する工程、
を含み、ここにおいて、変性した、または、変性中の軟骨におけるSGKの量は、変性していない軟骨中のそれらの量よりも大きい。
a)配列番号1、配列番号2または配列番号3;
b)ストリンジェントな条件下でa)に記載の配列の少なくとも1つとハイブリダイゼーションする、SGKの機能を有するポリペプチドをコードする配列;
c)aまたはbに記載の配列のいずれか1つに関して遺伝子コードに基づき変化している、SGKの機能を有するポリペプチドをコードする配列;
d)SGKの機能を有するポリペプチドをコードするa)、b)またはc)に記載の配列のいずれか1つのフラグメント、好ましくは配列番号7〜9に示される配列のいずれか1つを有するフラグメント(図7);
e)前記配列a)、b)、c)またはd)のいずれか1つを基にして、遺伝子コードの縮重に基づいていない、または、部分的に遺伝子コードの縮重に基づいていない1またはそれ以上の塩基を置換することによって作製された、SGKの機能を有するポリペプチドをコードする配列。
f)配列番号1、配列番号2または配列番号3;
g)ストリンジェントな条件下でa)に記載の配列の少なくとも1つとハイブリダイゼーションする、SGKの機能を有するポリペプチドをコードする配列;
h)aまたはbに記載の配列のいずれか1つに関して遺伝子コードに基づき変化している、SGKの機能を有するポリペプチドをコードする配列;
i)SGKの機能を有するポリペプチドをコードするa)、b)またはc)に記載の配列のいずれか1つのフラグメント、好ましくは配列番号7〜9に示される配列のいずれか1つを有するフラグメント(図7);
j)前記配列a)、b)、c)またはd)のいずれか1つを元にして、遺伝子コードの縮重に基づいていない、または、部分的に遺伝子コードの縮重に基づいていない1個またはそれ以上の塩基の置換によって作製された、SGKの機能を有するポリペプチドをコードする配列。
1)50mMのトリス(pH7.5)、1MのNaCl、1%SDS、10%硫酸デキストラン、0.5mg/mlの変性ニシンまたはサケ精子DNA中で、標識されたプローブと、調査しようとするサンプルと、60〜70℃、好ましくは65℃でハイブリダイゼーションすること、または、オリゴヌクレオチドの場合、オリゴヌクレオチド二本鎖およびサンプルの融点(この融点は、いわゆる「アニーリング温度」とも称される)より5℃低い温度で、一晩ハイブリダイゼーションすること;
2)2×SSC中で、室温で10分間洗浄すること;
3)1×SSC/0.1%SDS中で、60〜70℃、好ましくは65℃で(または、オリゴヌクレオチドの場合、アニーリング温度より5℃低い温度で)、30分間洗浄すること;
4)0.2×SSC/0.1%SDS中で、60〜70℃、好ましくは65℃で(または、オリゴヌクレオチドの場合、アニーリング温度より5℃低い温度で)、30分間洗浄すること;
5)0.1×SSC/0.1%SDS中で、60〜70℃、好ましくは65℃で(または、オリゴヌクレオチドの場合、アニーリング温度より5℃低い温度で)、30分間洗浄すること。
遺伝子発現解析は、GPC−バイオテク(GPC−Biotech)に注文生産してもらった骨関節症に特異的なcDNAアレイに基づき、このアレイは、ナイロンメンブレンに付着させた4500種の軟骨関連の遺伝子からなる。アレイへのハイブリダイゼーションのためのプローブとして、健康な関節軟骨、および、変形性関節症の関節軟骨由来のトータルRNA(標準的な方法による調製物)を、逆転写によって、32Pで標識されたヌクレオチドを放射性cDNAに取り込ませて翻訳し、標準的な方法によってアレイのcDNAサンプルとインキュベートした。ハイブリダイゼーションとそれに続くメンブレンの洗浄を行い、続いて、オートラジオグラフィでハイブリダイゼーションシグナルを検出した。健康な軟骨と変形性関節症の軟骨とで差異的に異なって発現した270種の遺伝子を、さらに解析することとした。これらの遺伝子の1つは驚くべきことにSKGであった:発明者等の遺伝子発現解析の発見から、SGK発現は、骨関節症の関節軟骨で誘導されることが初めて示された。この発見は、cDNAライブラリー中のクローン数によって確認することができる:これから、SGKのcDNAは、正常な軟骨のライブラリーに比べて、変形性関節症の軟骨のcDNAライブラリーでは14倍もの頻度で発現されることがわかる。
アレイ製造のためのクローンは、SSH(サブトラクティブ・サプレッション・ハイブリダイゼーション(subtractive suppression hybridization))によって選択された。また、コントロールクローン、および、ハウスキーピング遺伝子のクローンも用いられた。384ウェルのポリプロピレンプレート(ジェネティックス(Genetix),イギリス)で、キアゲン(Qiagen,Hilden UK)製のPCRキットを使用して増幅を行い、ここにおいて、PCR反応(反応体積50μl)では、M13フォワード(5’GCT ATT ACG CCA GCT GGC GAA AGG GGG ATG TG 3’)、および、M13リバースプライマー(5’CCC CAG GCT TTA CAC TTT ATG CTT CCG GCT CG 3’)を製造元(キアゲン,Hilden UK,上記参照)が説明する通りに用いた。この反応混合物に、384個のピンを有するトランスファー装置(ジェネティックス)を用いて、2μlまたはそれより少ない量の細菌培養物を植え付け、プラスチックフィルム(ジェネティックス)でプレートを密封した。PCR増幅は、自動化したウォーターバスシステム(Kバイオシステムズ(KBioSystems,ベイジルドン,イギリス)で、標準的な条件下で行われた(Meier−Ewert,S.等)。4396種のcDNAクローン由来のPCR産物を、Maier等によって説明されているようなロボット利用のアプリケーターを用いて、個々に8×12cmのレプリカのナイロンメンブレン(ハイボンドN+(Hybond N+,アマシャム・ファルマシア・バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech))に移し、空気乾燥させてメンブレンに固定した。さらにPCR産物を、2地点間の距離を850μmとして5×5パターンの形態でメンブレンに2回付着させた。
4つの異なる反応混合物中で、スーパースクリプトII(Superscript II)逆転写酵素(番号18064−071,インビトロジェン)を用いて、トータルRNA(総量2μg)をcDNAに転写した。この場合、この混合物はそれぞれ:スーパースクリプトII(番号18064−071,インビトロジェン)を200ユニット、33Pα−dCTP(番号NEG313H,NENライフサイエンス・プロダクツ社(NEN Life Science Products GmbH))を50μCiを含み、いずれのケースにおいても、スーパースクリプトIIを含む第一の鎖反応緩衝液(インビトロジェン)中に、0.66mMのdATP、dGTP、dTTP、ランダムヘキサマー(アマシャム・ファルマシア・バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech)を0.5μg、および、10mMのDTTを含む。この反応液を42℃で4時間インキュベートし、クイックスピンカラム(quick spin column,ロシュ(Roche),ペンツバーグ,ドイツ)を製造元が説明する通りに用いてcDNAを精製した。変性溶液(1MのNaOH/10mMのEDTA)0.11体積部、および、ヒトCOT−1DNA(15279−011,インビトロジェン)5μgを用いて各プローブを変性させて、70℃で20分間ハイブリダイゼーションを行った。次に、中和溶液(1Mのリン酸ナトリウム/pH7.0)1体積部を70℃で10分間添加することによって各プローブを中和し、これをハイブリダイゼーション混合物に添加した。軟骨トータルRNAから逆転写されたcDNAをプローブとして用いた。
様々なアレイのシグナルのシグナル強度(これらはそれぞれ、個々のクローンに相当する)を含むファイル中の生データを、以下のように解析した:まず最初に、DNAをローディングしていない位置から得られたシグナル強度を差し引くことによってバックグラウンドシグナルを修正した。その後、1クローンあたり6個の異なるレプリカの値(3つのアレイであり、いずれの場合においても2個のデータポイントを有する)を考慮して平均シグナル強度を修正し、対数的に変換し、アレイ上のそれぞれのクローンの標準偏差を決定した。次に、可能性のあるサンプルの異常値を、平均連結法に基づく階層的クラスタ分析のアルゴリズムを用いて個々の患者のサンプルからのデータを組み合わせることによって確認した(Eisen等,1998)。最終的に、差異的に発現されたクローンを、得られた平均シグナル強度を比較すること(OA患者の軟骨由来のcDNAサンプルの特定のクローンの平均シグナル強度と、健康な軟骨由来のcDNAサンプルの平均シグナル強度とを比較すること)によって同定した。
差異的な遺伝子発現を確認するために、上記の手順によって同定された個々のクローンをプローブとして用い、変形性関節症および正常な組織由来の一次cDNAライブラリーが固定されたアレイとハイブリダイゼーションさせた。この場合、一次cDNAライブラリーを標準的な方法によって作製し、細菌に導入し、ライブラリーを示す細菌クローンの選択を単離し、この選択されたクローンを標準的な方法によってマイクロタイタープレートに導入した(Bancroft等,1999を参照)。(1999;Methods in Microbiology 28:67〜82)。上述の方法によって上述のロボット利用システムを用いてアレイを作製したが、いずれの場合においても、23×23cmの大きさであり、二連で付着させた一次cDNAクローンに相当する約〜40000種のPCR産物を含んでいた。これらの実験に2セットのアレイを用いた;5個のアレイからなる第一のセットは、正常な組織由来のcDNAライブラリーの200000種のcDNAクローンに対応し、5個のアレイからなる第二のセットは、変形性関節症の組織由来のcDNAライブラリーの200000種のcDNAクローンに対応する。
遺伝子発現の比較解析によるOAの分子メカニズムの調査から、病理学的な状態の解析、および、薬理学的な介入のための新規の分子レベルの攻撃ポイントの同定への魅力的なアプローチが示される。この目的のために用いられた結果の「ゲノミクス解析」による解釈は複雑であり、これはなぜなら、複数のプロセスを、場合によっては逆方向で、OAに罹患した軟骨中でそれぞれ平行して進行させるためである。ここで述べることができる例は、軟骨形成活性、および、軟骨分解活性の同時出現である。
軟骨におけるSGK−1の機能に関する前記の実験から得られた推測を調べるために、軟骨形成性の細胞系ATDC5でさらなるインビトロでの実験を行った。
軟骨分化中のSGK−1の機能に的を絞った調査のために、MMLV(マウスモロニー白血病ウイルス)から誘導されたレトロウイルスベクター系(pLPCXベクター)によって、ATDC5細胞中でヒトSGK−1を過剰発現させた。ここでは、2種の異なるSGK−1変異体を用いた:キナーゼが欠損した突然変異体(スレオニン256およびセリン422のアラニンへの突然変異=SGK−1KD)、および、天然に存在する機能型(SGK−1wt)。レトロウイルスベクターのみを含みSGK−1を含まない、または、形質転換されていないATDC5細胞を、ウイルスSGK−1の導入のためのコントロールとして用いた。次に、この細胞を、インスリンで刺激して軟骨分化させ、21日間が経過した後に解析した。プロテオグリカン合成を解析することによって軟骨が分化した細胞の程度を調査した。この目的のために、培養物をアルシアンブルーで染色し、軟骨の主要なプロテオグリカンであるアグリカンに関するmRNA発現について試験した(図11)。
図1
NCBIアクセス番号NM_005627、AF153609によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ1(SGK1)のポリヌクレオチドコード配列である(配列番号1)。
NCBIアクセス番号AF169034、AF186470によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ2(SGK2)のポリヌクレオチドコード配列である(配列番号2)。
NCBIアクセス番号NM_013257、AF085233、AF169035によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ3(SGK3)のポリヌクレオチドコード配列である(配列番号3)。
NCBIアクセス番号NP_005618によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ1(SGK1)のアミノ酸の配列である(配列番号4)。
NCBIアクセス番号NP_733794、NP_057360によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ2(SGK2)のアミノ酸の配列である(配列番号5)。この図において、2種の異なるSGK2アイソフォームαおよびβの第一のアミノ酸が太字で示される。これらの2種のサブタイプのDDG/EMBL/GenBankアクセス番号は、AF169034(α)、および、AF186470(β)である。SGK2αは、367個のアミノ酸からなるタンパク質であり、一方、SGK2βは、427個のアミノ酸からなるタンパク質である。
NCBIアクセス番号Q96BR1によるヒト血清中の糖質コルチコイド調節キナーゼ3(SGK3)のアミノ酸の配列である(配列番号6)。SGK3は、429個のアミノ酸からなる長さを有するタンパク質である。
SGKサブタイプ1〜3の機能的なフラグメントのアミノ酸、および、それらをコードするポリヌクレオチド配列である:図7aは、SGK1をコードするポリヌクレオチド配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す(配列番号7);図7bは、SGK2をコードするポリヌクレオチド配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す(配列番号8);図7cは、SGK3をコードするポリヌクレオチド配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す(配列番号9);図7dは、SGK1のアミノ酸配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す(配列番号10);図7eは、SGK3のアミノ酸配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す(配列番号11);図7fは、SGK3のアミノ酸配列のキナーゼドメインを含むフラグメントを示す(配列番号12)。
マウスSGK−1のmRNAのcDNAフラグメントである:
図8は、マウスSGK−1のmRNAからクローニングされ、リボプローブを製造するのに用いられたcDNAフラグメントのヌクレオチドの配列を示す(配列番号13)。
新生児マウスの脛骨の組織切片のインサイチュハイブリダイゼーションによるSGK−1のmRNA発現の検出である。
A:ヘマトキシリンおよびエオシンで染色されたコントロール。
B:ジゴキシゲニン標識アンチセンスリボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーション、および、それに続く色の反応による肥大軟骨細胞中でのCol10a1発現の検出。
C:ジゴキシゲニン標識アンチセンスリボプローブを用いたインサイチュハイブリダイゼーションによる、および、それに続く色の反応による肥大軟骨細胞中でのSGK−1のmRNAmRNAの検出。
図中の図解は、特異的なアンチセンスリボプローブのインサイチュハイブリダイゼーションによる新生児マウスの脛骨の肥大軟骨細胞におけるSGK−1の検出を示す(図9C)。細胞のより優れた同定のために、対応する組織切片を染色したコントロールを示す(図9A)。
様々な分化段階におけるATDC5細胞中のSGK−1、および、Col10a1のmRNA発現の比較である。
1:密集する前段階のATDC5細胞
2:密集したATDC5細胞、
3:インスリン添加して3週間後の軟骨形成により分化したATDC5細胞、
4:2週間にわたりさらに石灰化させた後の、3で説明したのと同じ軟骨形成により分化したATDC5細胞。
図10Aは、SGK−1、および、Col10a1のmRNAの量の定量PCRによる解析を示す。数値単位は、発現の豊富さの程度の指標になるように示される。
図10Bは、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによるSGK−1、および、Col10a1のmRNAの検出を示す。
反応で用いられる細胞のトータルRNAの量を較正するために、AおよびBにおけるβ−アクチンのmRNAの発現を測定した。
SGK−1の安定な過剰発現のためにウイルスによって形質転換されたATDC5細胞である。
ATDC5:コントロールとしての未処理細胞;
pLCPCX:SGK−1を含まない形質導入ベクターの安定な組み込み、同様にコントロール用;
SGK−1wt:機能的なSGK−1の過剰発現;
SGK−1KD:キナーゼが欠損したSGK−1の過剰発現。
細胞が密集した状態に達したら、軟骨形成性の分化状態で21日間細胞を維持した。アルシアンブルーで染色することによって、軟骨形成性の分化、および、プロテオグリカン生産の程度を検出した。
SGK−1を過剰発現する細胞は、軟骨が分化した細胞、および、プロテオグリカン形成の量が有意に減少したことを示したが、それに対して、キナーゼが欠損したSGK−1は、それに関しては作用を示さなかった。
AおよびBは、2つの独立した実験での同一の試験を示す。
定量PCRによる、図11で説明したサンプルのプロテオグリカン発現のアグリカンのmRNAのレベルでの解析である。
AおよびBは、図11AおよびBに示されたサンプルに対応する。
1.ATDC5
2.pLPCX
3.SGK−1wt
4.SGK−1KD
数値単位は、発現の豊富さの程度の指標になるように示される。測定されたアグリカンのmRNAの量はほとんど全て、アルシアンブルー染色によって検出されたプロテオグリカンに関する図11に示される量と共通する挙動を示す。
図11BのpLPCXサンプルだけが、mRNAレベルでの比較において、SGK−1wtサンプルと比較してあまり豊富ではないことを示す。しかしながら、SGK−1wtの過剰発現の後に、ATDC5、および、SGK−1KDと比較してアグリカンのmRNA発現が相当減少したことは、明らかである。
Claims (18)
- 変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分を見出すための、SGKタンパク質、その機能的な誘導体もしくはフラグメント、または、当該タンパク質、フラグメントもしくは誘導体をコードする核酸の使用であって、
ここで、SGKタンパク質、その機能的な誘導体もしくはフラグメントは、以下の配列:
a.配列番号1、配列番号2または配列番号3;
b.ストリンジェントな条件下でa)に記載の配列の少なくとも1つとハイブリダイゼーションし、そしてSGKのキナーセ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
c.aまたはbに記載の配列のいずれか1つに関して遺伝子コードに基づき変化し、そしてSGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
d.SGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、a)、b)またはc)に記載の配列のいずれか1つのフラグメント;
のいずれか1つを有するポリヌクレオチドによってコードされ、
また、当該タンパク質、フラグメントもしくは誘導体をコードする核酸は、以下の配列:
a.配列番号1、配列番号2または配列番号3;
b.ストリンジェントな条件下でa)に記載の配列の少なくとも1つとハイブリダイゼーションし、そしてSGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
c.aまたはbに記載の配列のいずれか1つに関して遺伝子コードに基づき変化し、そしてSGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
d.SGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、a)、b)またはc)に記載の配列のいずれか1つのフラグメント;
のいずれか1つを含むか、または、それらからなることを特徴とする、
上記使用。 - 変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分の同定方法であって、
a.SGKタンパク質、その機能的な誘導体またはフラグメントと、可能性のある活性成分とを接触させる工程;
b.可能性のある活性成分の存在下でSGK活性を測定する工程;
c.可能性のある活性成分の非存在下でSGK活性を測定する工程;
d.b)のSGK活性とc)のSGK活性とを比較する工程、
を含み、
ここで、SGKタンパク質、その機能的な誘導体またはフラグメントは、以下の配列:
a.配列番号1、配列番号2または配列番号3;
b.ストリンジェントな条件下でa)に記載の配列の少なくとも1つとハイブリダイゼーションし、そしてSGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
c.aまたはbに記載の配列のいずれか1つに関して遺伝子コードに基づき変化し、そしてSGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
d.SGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、a)、b)またはc)に記載の配列のいずれか1つのフラグメント;
のいずれか1つを有するポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とする、
上記方法。 - 変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分の同定方法であって、
a.少なくとも転写が可能な系中で、SGKタンパク質、その誘導体またはフラグメントをコードする核酸と、可能性のある活性成分とを接触させる工程;
b.可能性のある活性成分の存在下で、SGKタンパク質、誘導体もしくはフラグメントの量、または、それらをコードするmRNAの量を測定する工程;
c.可能性のある活性成分の非存在下で、SGKタンパク質、誘導体もしくはフラグメントの量、または、それらをコードするmRNAの量を測定する工程;
d.b)からのタンパク質またはmRNAの量と、c)からのタンパク質またはmRNAの量を比較する工程、
を含み、
ここで、SGKタンパク質、その誘導体またはフラグメントをコードする核酸は、以下の配列:
a.配列番号1、配列番号2または配列番号3;
b.ストリンジェントな条件下でa)に記載の配列の少なくとも1つとハイブリダイゼーションし、そしてSGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
c.aまたはbに記載の配列のいずれか1つに関して遺伝子コードに基づき変化し、そしてSGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
d.SGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、a)、b)またはc)に記載の配列のいずれか1つのフラグメント;
のいずれか1つを含むか、または、それらからなることを特徴とする、
上記方法。 - 変性性の軟骨の変化を予防または治療する活性成分の同定方法であって、
a.少なくとも翻訳が可能な系中で、SGKタンパク質、その機能的な誘導体もしくはフラグメント、または、それらをコードする核酸と、可能性のある活性成分とを接触させる工程;
b.可能性のある活性成分の存在下で、SGKタンパク質、その機能的なフラグメントまたは誘導体の活性を測定する工程;
c.可能性のある活性成分の非存在下で、SGKタンパク質、その機能的なフラグメントまたは誘導体の活性を測定する工程、
を含み、
ここで、SGKタンパク質、その機能的な誘導体もしくはフラグメントは、以下の配列:
a.配列番号1、配列番号2または配列番号3;
b.ストリンジェントな条件下でa)に記載の配列の少なくとも1つとハイブリダイゼーションし、そしてSGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
c.aまたはbに記載の配列のいずれか1つに関して遺伝子コードに基づき変化し、そしてSGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
d.SGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、a)、b)またはc)に記載の配列のいずれか1つのフラグメント;
のいずれか1つを有するポリヌクレオチドによってコードされ、
また、SGKタンパク質、その誘導体またはフラグメントをコードする核酸は、以下の配列:
a.配列番号1、配列番号2または配列番号3;
b.ストリンジェントな条件下でa)に記載の配列の少なくとも1つとハイブリダイゼーションし、そしてSGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
c.aまたはbに記載の配列のいずれか1つに関して遺伝子コードに基づき変化し、そしてSGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列;
d.SGKのキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、a)、b)またはc)に記載の配列のいずれか1つのフラグメント;
のいずれか1つを含むか、または、それらからなることを特徴とする、
上記方法。 - 請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法に基づき活性成分を見出すための、ハイスループットスクリーニング。
- 単離された軟骨組織サンプル中のSGKを検出することを含む、変性性の軟骨の変化の同定方法であって、
a.調査するために単離された軟骨組織サンプルのSGKタンパク質またはmRNAの含量を測定する工程;
b.変性していない軟骨の単離されたサンプルのSGKタンパク質またはmRNAの含量と比較する工程、
を含む、上記方法。 - SGKは、単離された分子として用いられる、請求項1に記載の使用、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法、または、請求項5に記載のハイスループットスクリーニング。
- SGKは、生化学的な分析または細胞レベルの分析で用いられる、請求項1に記載の使用。
- 分析は、生化学的な分析または細胞レベルの分析である、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法、または、請求項5に記載のハイスループットスクリーニング。
- SGKは、ヒトSGKである、請求項1に記載の使用、請求項2〜4のいずれか一項に記載の方法、または、請求項5に記載のハイスループットスクリーニング。
- 血清/糖質コルチコイド調節キナーゼは、SGK1、2または3である、請求項10に記載の使用、方法、または、ハイスループットスクリーニング。
- SGK、または、そのフラグメントもしくは誘導体は、ポリヌクレオチドである、請求項1に記載の使用または請求項5に記載のハイスループットスクリーニング。
- SGKまたはその機能的なフラグメントもしくは誘導体は、ポリペプチドである、請求項1に記載の使用または請求項5に記載のハイスループットスクリーニング。
- ポリペプチドは、配列番号4、配列番号5もしくは配列番号6に示される配列を含む、または、それらからなる、請求項13に記載の使用もしくはハイスループットスクリーニング、または、請求項2もしくは4に記載の方法。
- 機能的なフラグメントまたは誘導体は、配列番号10、配列番号11または配列番号12に示される配列を含む、または、それらからなる、請求項13に記載の使用またはハイスループットスクリーニング、または、請求項2または4に記載の方法。
- SGKを検出するための手段を少なくとも1つ含む、変性性の軟骨の変化を診断するための試験キットであって、
当該手段は、SGKに特異的に結合する抗体、SGKをコードする配列番号1、2または3のヌクレオチド配列を増幅させることができるプライマーセット、または、SGKをコードする配列番号1、2または3のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズする核酸プローブである、試験キット。 - 診断方法を行うための使用説明書をさらに含む、請求項16に記載の試験キット。
- 変性性の軟骨の変化は、関節炎による障害である、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法、使用、ハイスループットスクリーニングまたは試験キット。
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