CN110368387B - Vsig8小分子抑制剂的医药小分子化合物及其医药用途和药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了VSIG8小分子抑制剂的医药小分子化合物及其医药用途和药物组合物，本发明如化合物L557‑0155或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备VSIG8抑制剂中的应用；化合物L557‑0155结构如下：

Description

VSIG8小分子抑制剂的医药小分子化合物及其医药用途和药 物组合物

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及VSIG8小分子抑制剂的医药小分子化合物及其医药用途和药物组合物。

背景技术

T细胞激活抑制物免疫球蛋白可变区结构域(V-domain immunoglobulinsuppressor of T-cell activation，VISTA)是可抑制T细胞免疫应答的负向免疫检查点，其天然结合受体为VSIG8(V-Set andImmunoglobulin domain containing 8,VSIG8)。VISTA是Ⅰ型跨膜蛋白，主要表达于造血细胞、粒细胞和T细胞。VSIG8主要在脾脏，CD3⁺，CD4⁺，CD8⁺T细胞中表达，并且人和鼠的VSIG8具有86％的同源性。流式结果显示VISTA蛋白可以特异性的与VSIG8蛋白结合，并且人VISTA蛋白可以与鼠VSIG8蛋白结合。研究发现，VISTA与VSIG8结合后可以抑制DO11.10T细胞的活性，在肿瘤微环境中，VISTA与VSIG8之间的相互作用可抑制T细胞的应答，抑制T细胞分化为Treg细胞，降低白细胞介素2(IL-2)、干扰素γ(IFN-γ)等细胞因子的产生。VSIG8或VISTA的单克隆抗体可以封闭VISTA与VSIG8的相互结合并可以抑制肿瘤的生长，促进T细胞的分化。但抗体药物具有制备工艺复杂，价格昂贵，使用不便的缺陷，并且VISTA口服药物CA-170作为VISTA、PD-L1双重抑制剂用于治疗实体瘤的临床实验也已进入临床研究(NCT02812875)，证明VISTA作为新靶点在药物开发方面的潜在价值。

迄今，尚无任何文献报道涉及VSIG8小分子抑制剂。因此，研制VSIG8小分子抑制剂具有重要的临床应用价值，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明着眼于开发VSIG8的小分子化合物，在保证效应的同时也消除了抗体药物带来的缺陷选择可以封闭VISTA的受体VSIG8，筛选作用于VSIG8的小分子抑制剂，阻断VISTA与VSIG8的相互作用通路，开发调节VISTA/VSIG8轴生物活性的小分子化合物。

本发明提供如化合物L557-0155或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备VSIG8抑制剂中的应用；本发明化合物L557-0155或其药学上可接受的盐或溶剂化物与VSIG8蛋白有很高的结合率，因而可作为VSIG8小分子抑制剂剂用于肿瘤治疗，为研究研制VSIG8小分子抑制剂具有重要的临床应用价值。

本发明还提供一种预防或治疗肿瘤疾病的药物组合物。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的如化合物L557-0155或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备VSIG8抑制剂中的应用，化合物L557-0155结构如下：

所述化合物L557-0155可以通过商业途径购买，化合物L557-0155的CAS:1115893-25-8。

其中，所述化合物L557-0155与VSIG8蛋白结合，进而可促进IFN-γ、TNF-α细胞因子的释放在制备VSIG8小分子抑制剂中的应用。

作为优选，所述化合物L557-0155可作为药用盐使用或者溶剂化物组成的药物组合物，所述盐为化合物与金属离子或药学上可接受的胺或铵离子形成的盐。

进一步地，所述金属离子包括钠、钾或钙离子，所述胺包括乙二胺或氨丁三醇。

本发明所述化合物L557-0155或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为VSIG8抑制剂在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。

其中，所述肿瘤疾病包括但不限于血液癌症、神经系统癌症、胃肠癌、食道癌、泌尿系统癌症、肺癌、肝癌、皮肤癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、血管瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、脑癌、黑色素瘤和鳞癌。

优选地，所述肿瘤疾病为黑色素瘤、鳞癌、肺癌、胰腺癌和多发性骨髓瘤。

本发明所述的预防或治疗肿瘤疾病的药物组合物，其含有所述的化合物L557-0155或其药学上可接受的盐或溶剂化物和药学上可接受的载体。

作为优选，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

在本发明的药物组合物中可任意混合的辅料根据剂型、给药形式等可以改变。辅料包括赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂和甜味剂等。所述药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜或静脉等。所述药物组合物可以是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂等制剂学上常规的制剂形式。

本发明以VISTA的受体VSIG8为研究对象，利用真核细胞CHO表达系统表达出VSIG8蛋白，通过虚拟筛选与分子对接的方法筛选小分子药物。再通过分子水平上的亲和力评价与细胞水平上的功能性研究，筛选出有活性的亲和力小分子，为VSIG8及VISTA的药物开发提供新思路。

本发明首次提供了VSIG8小分子抑制剂，并通过体外实验证明所述化合物可用于防治肿瘤疾病。

在防治肿瘤疾病的作用机制方面，众所周知，各种肿瘤疾病中，T细胞的活化与增值受到抑制，导致肿瘤细胞发生逃逸，促进了肿瘤的发生发展。本发明发现，VSIG8抑制剂L557-0155可通过与VSIG8蛋白的结合而促进IFN-γ、TNF-α等细胞因子的释放，同时可以促进T细胞的增值进而发挥抗肿瘤疾病的功效。

本发明中的化合物L557-0155的制备可参照文献方法进行合成制备，也可进行商业化购买。所有化合物的纯度在95％以上。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次利用真核细胞CHO表达系统表达出人胞外段VSIG8-His融合蛋白。本发明首次提供了VSIG8小分子抑制剂，本发明通过分子和细胞水平实验首次发现化合物L557-0155可显著地与VSIG8蛋白结合，进而可促进IFN-γ、TNF-α等细胞因子的释放，因而可作为VSIG8小分子抑制剂用于肿瘤疾病的治疗。在防治肿瘤疾病的作用机制方面，众所周知，各种肿瘤疾病中，T细胞的活化与增值受到抑制，导致肿瘤细胞发生逃逸，促进了肿瘤的发生发展。本发明发现，VSIG8抑制剂L557-0155可通过与VSIG8蛋白的结合而促进IFN-γ、TNF-α等细胞因子的释放，同时可以促进T细胞的增值进而发挥抗肿瘤疾病的功效。

本发明提供了一种针对VSIG8设计的全新的VSIG8小分子抑制剂可显著地与VSIG8蛋白结合，化合物L557-0155能够抑制VSIG8的活性，进而促进IFN-γ、TNF-α等细胞因子的释放。而包括本发明的VSIG8小分子抑制剂化合物L557-0155的药物组合物可以成为新型的预防或治疗肿瘤疾病的药物组合物。

附图说明

图1为人VSIG8蛋白表达量随表达时间的变化图，其中，D2、D3、D4、D5、D6和D7分别为转染后第2天、第3天、第4天、第5天、第6天和第7天；

图2为Western Blot鉴定洗脱组分中人VSIG8蛋白分布情况图；

图3为人VSIG8蛋白最佳包被浓度筛选示意图；

图4为MST检测人VISTA蛋白与人VSIG8蛋白亲和力测试结果示意图；

图5为MST检测化合物L557-0155与人VSIG8蛋白亲和力测试结果示意图；

图6为竞争性ELISA实验检测化合物L557-0155与人VSIG8蛋白结合EC₅₀值结果；

图7为人VSIG8蛋白抑制PBMC细胞IFN-γ分泌的效应图；

图8为化合物L557-0155影响人VSIG8蛋白对PBMC细胞上清中IFN-γ分泌的影响图；

图9为化合物L557-1055影响人VSIG8蛋白对PBMC细胞上清中TNF-α分泌的影响图；

图10为PBMC细胞在未激动与Anti-CD3激动之后的增值效应图；

图11为人VSIG8蛋白抑制PBMC细胞增殖效应图；

图12为化合物L557-1055影响人VSIG8G蛋白抑制PBMC细胞增殖效应图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明做进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

人胞外段VSIG8-His融合蛋白的表达制备

兔抗人VSIG8抗体(ab83852)购于Abcam公司；兔二抗(CW0156)购于碧云天生物科技有限公司；

1、ExpiCHO-STM细胞的复苏培养

将冻存的ExpiCHO-STM细胞从液氮出取出，浸于38-39℃水浴中融化，并一直不停摇动，使其快速融化至管中只剩下非常少量的冰块，将细胞从水浴中取出，喷过75％酒精后于超净台中打开，将冻存管中的细胞悬液(1mL)转移到事先准备好的含有29mL Expi CHO表达培养基(Gibco，A2910001)的细胞摇瓶中，将细胞摇瓶置于37℃，CO₂浓度为8％，摇床转速为130rpm的孵箱中培养。

复苏三天后，当细胞密度达到4×10⁶–6×10⁶个活细胞/mL时进行细胞传代，将细胞以密度为0.2×10⁶–0.3×10⁶个活细胞/mL接种于Expi CHO表达培养基中，细胞培养体积为30mL。将细胞放回37℃，CO₂浓度为8％，摇床(振幅为19mm)转速为130rpm的孵箱中培养。

2、细胞转染

采用ExpiFectamineTM CHO Transfection Kit(Gibco，A29129)，培养ExpiCHO-STM细胞密度达到4×10⁶–6×10⁶个活细胞/mL，对细胞进行分瓶(此时为第一天)，使分瓶后细胞的终密度为3×10⁶–4×10⁶个活细胞/mL，将细胞放回孵箱中生长过夜。第二天检查细胞密度和活细胞率。细胞应该达到7×10⁶–10×10⁶个活细胞/mL，活细胞率在95％-99％。将细胞用新鲜预热至37℃的ExpiCHOTM Expression Medium(Gibco，A2910001)稀释至6×10⁶个活细胞/mL，保证转染体积为25ml。轻轻旋动细胞培养瓶以混匀细胞。轻柔的上下颠倒充分混匀ExpiFectamine CHO Reagent。用OptiPRO SFM稀释人VSIG8、Human-VISTA质粒和转染试剂ExpiFectamine CHO Reagent，晃动离心管混匀。一边旋动离心管一边向质粒DNA稀释液中加入稀释过的ExpiFectamine CHO Reagent。室温孵育ExpiFectamine CHO/DNA复合物5min，然后把复合物溶液慢慢加入细胞培养瓶中，边加边轻轻摇动细胞培养瓶(表1)。最后将细胞培养瓶放回37℃，CO₂浓度为8％，摇床转速为130rpm的孵箱中。

转染20h后，向细胞培养瓶中加入150μL ExpiCHO Enhancer和6ml ExpiCHO Feed，然后把培养瓶放回孵箱继续培养8天。

表1 25ml转染体积时各试剂添加体积

3、蛋白鉴定

(1)样品制备

取100μL转染后的细胞悬液1000rpm室温离心5min，吸取上清。按照5×Loadingbuffer与β-巯基乙醇按照4：1体积比配制成上样缓冲液(5×Loading buffer 20μL、β-巯基乙醇5μL)，再按上样缓冲液：样品体积比为1：4(25μL上样缓冲液加入到100μL样品中)混合，于100℃下热变性10min。完成后冷却离心，于-20℃冻存。

(2)Western Blot

VSIG8蛋白的预估分子量为35KD，VISTA的质粒图谱判断出蛋白的预估分子量为83.25KD。确定分离胶浓度为8％。按照表2制备8％的分离胶和5％的浓缩胶。

将配好的胶片固定于电泳槽内，倒入电泳缓冲液，清洗各个上样孔之后，将制备的转染后第2天至第6天的细胞上清样品依次加入孔中(每孔10μL)。电泳条件为恒压80V，40min；120V，1h。电泳结束之后将胶片取出，按照“黑胶白膜”的顺序将PVDF膜、凝胶、滤纸放在三明治夹的中间，转膜时在转膜槽内放入冰盒以保证低温。转膜条件为固定电流200mA，转膜时间2.5h。

转膜结束后将膜置于5％脱脂奶粉中，室温条件下摇床缓慢封闭1h。封闭结束后，倒去封闭液，在10mL的VISTA/VSIG8特异性抗体稀释液(按抗体母液：封闭液＝1：200体积比稀释)4℃过夜孵育。第二天，回收抗体，以TBST洗膜，80rpm清洗五次，每次10min。再将膜在10ml的兔抗绵羊二抗稀释液(按抗体母液：封闭液＝1：10000体积比稀释)孵育1h；回收抗体，以TBST洗膜，80rpm洗10min，操作五次。最后将膜置于曝光仪中，均匀涂上ECL发光液(180-5001，天能)(A液：B液＝1：1体积比)，进行曝光。图1和图2结果表明细胞上清中成功表达出VSIG8蛋白，并从第2天开始，随着表达时间的延长，上清中VSIG8蛋白的含量逐渐增多。

表2 5％的浓缩胶和8％分离胶配制

4、蛋白浓缩

将转染后的细胞摇瓶中的培养基收集到50ml离心管里，1000rpm低温离心10min，取上清，再7000rpm低温离心40min，收集上清，并用0.45μm滤膜过滤，滤液收集在50ml离心管中。根据蛋白分子量选用10KD超滤管浓缩细胞上清液，7000rpm离心30min，收集超滤管内管中的浓缩液。

5、蛋白纯化

纯化使用的Ni Sepharose6Fast Flow亲和层析介质(17-5318-01)柱材购自GE生命科学公司。

(1)样品制备

过柱前，先用1×镍柱平衡缓冲液将蛋白浓缩液的体积置换成缓冲液成分。置换通过超滤管进行，将蛋白浓缩液与平衡缓冲液1:1稀释后，7000rpm低温离心30min，反复两次。

(2)装柱

充分摇匀以重悬树脂，吸取2ml浆液至新的层析柱中，层析柱中预先加入2ml平衡缓冲液。让树脂自然沉降，流出平衡缓冲液。加入10ml平衡缓冲液至层析柱中平衡树脂，按约1ml/min的流速流出平衡缓冲液。

(3)层析纯化

样品按照约1mL/min的流速上样至层析柱中，收集流出液，标记为Flow Through，即FT。分别用20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、250mM、500mM的咪唑缓冲液洗涤树脂，流速维持约1mL/min，各个咪唑梯度冲洗20mL缓冲液体积，每2mL收集为一个组分。洗脱结束后用20mL1×镍柱缓冲液冲洗柱材，最后将柱材浸泡在20％乙醇溶液中，4℃保存。纯化过程中收集到的组分均经过Western Blot鉴定。图2结果表明人VSIG8蛋白在250mM咪唑浓度被洗脱。

5×镍柱平衡缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O 17.9g，NaCl 73.125g，加超纯水溶解后定容至500mL，室温保存。

1×镍柱平衡缓冲液：5×镍柱平衡缓冲液100mL，超纯水400mL，使用时先加超纯水300mL，用浓盐酸调PH为7.4，再用超纯水定容至500mL；0.22μm滤膜过滤后使用，室温保存。

500mM咪唑缓冲液：1×镍柱平衡缓冲液250mL，咪唑8.51g，加超纯水溶解后，用浓盐酸调pH为7.4，再用超纯水定容至250mL；0.22μm滤膜过滤后使用，室温保存。

6、蛋白收集与定量

(1)蛋白收集：收集经Western Blot验证含有目的蛋白的洗脱组分，并用10KD超滤管浓缩，离心条件为7000rpm低温离心40min。浓缩后，再将蛋白保存体系置换成PBS缓冲液，即将浓缩液与PBS缓冲液1:14混合，7000rpm低温离心40min，反复两次。最后收集蛋白，分装后冻存于-80℃。

(2)BCA定量：根据增强型BCA蛋白浓度检测试剂盒的说明配置蛋白标准品。将工作液A和B以50:1的比例配成混合液，向96孔板中每孔加入20μl的蛋白标准品，再向每孔中加入200μl的混合液，每个浓度做3个副孔，37℃孵育30min后，在562nm波长处测定OD值，根据标准曲线计算人VSIG8蛋白浓度为1.5mg/ml，表明成功表达制备出人VSIG8蛋白。

实施例2

竞争性ELISA法筛选VSIG8蛋白的亲和分子

竞争性ELISA法筛选VSIG8蛋白的亲和分子，通过简单的共孵、洗涤和显色步骤即可表征筛选对象对于VSIG8蛋白亲和力的高低。主要依靠辣根过氧化物酶与TMB显色液反应发生颜色变化而进行检测。实验时将VSIG8蛋白通过物理吸附作用包被在酶标板上，经过洗涤与封闭步骤去除板底存在的未被蛋白饱和的非特异性结合位点，再加入待测对象与VSIG8特异性抗体混合物，最后加入二抗、TMB显色，检测450nm处吸光度。若检测对象不与VSIG8蛋白结合，检测抗体将完全与VSIG8反应，此反应组吸光度值为最大，即阳性对照。若检测对象与VSIG8蛋白结合，由于检测对象占据了VSIG8蛋白的一部分结合位点，检测抗体与VSIG8蛋白的结合减少，其450nm出吸光度值也会降低。利用吸光度值的强弱即可反映出筛选对象对于VSIG8蛋白亲和力的高低。

蛋白为实施例1表达制备的人VSIG8蛋白，实验筛选的化合物由江苏省新药筛选重点实验室提供，购于美国ChemDive公司，化合物L557-0155的CAS:1115893-25-8。实验筛选化合物母液为10mg/ml，筛选终浓度为10μg/ml；一抗为VSIG8抗体(ab83852)购于abcam；二抗为兔二抗(CW0156)购自康为世纪生物科技有限公司。

表3实验设计

如表3所示，实验分为3组：阴性对照、阳性对照和实验组；阴性对照为不孵育一抗的组别，此时板底VSIG8蛋白结合位点未被占据，该组理论结合率为0％；阳性对照组中，加入了一抗和二抗，板底VSIG8的结合位点应被一抗完全饱和，该组理论结合率为100％；实验组中加入的化合物若能与VSIG8蛋白结合，则该组的吸光度值应下降，结合率在0％-100％。用包被缓冲液将纯化后的VSIG8蛋白稀释成1.129μg/ml(图3所示)，每孔加入100μl的蛋白溶液，4℃包被过夜。第二天弃去包被蛋白液，PBST洗3次，每孔加入200μl封闭液，室温封闭2h后弃去封闭液，PBST洗5次。将配制的100μg/ml样品工作液与一抗1:9体积比混合后加入(混合后样品终浓度为10μg/ml，一抗终浓度为0.5μg/ml)，每孔100μl，室温反应2h后弃去反应液，PBST洗5次。加入二抗anti-sheep-HRP(1:10000)，每孔100μl，室温孵育1h后PBST洗5次。加入100μl TMB显色液，暗处孵育9min，再加入50μl反应终止液后于450nm处读取吸光度值。

包被缓冲液(50mM碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃ 0.375g，NaHCO₃ 0.7325g，溶于超纯水中，定容至250ml，PH为9.6，4℃保存。封闭液/抗体稀释液(2.5％BSA的PBS溶液)：BSA 0.1g，PBS 10ml，现配现用，过0.22μm滤头后使用，4℃保存。反应终止液(2N H2SO4)：取18N浓硫酸4ml超纯水稀释至36ml，室温保存。TMB(P0209)显色液购自碧云天生物试剂公司。

根据吸光度值计算人VSIG8蛋白与筛选化合物的结合率。

结合率％＝(1-(OD-OD阴性对照)/(OD阳性对照-OD阴性对照))×100％

结果显示，本发明筛选化合物46个，其中L557-0155化合物的结合率为16.50％。L557-0155与VSIG8具有最高的结合率。

实施例3

微量热泳动(Microscale Thermophoresis,MST)实验筛选鉴定VSIG8蛋白的亲和分子。实施例2中ELISA方法通过简单的共孵、洗涤和显色步骤即可表征筛选对象对于VSIG8蛋白亲和力的高低。经ELISA实验筛选后的活性较好的分子，后期继续通过MST实验验证该分子与VSIG8蛋白的亲和力。MST实验是指分子在微观的温度梯度场中的定向运动，通过毛细吸管中心的红外激发和外围的冷却，在毛细吸管中产生精确地微观区域的温度梯度差异，将所需要测量的蛋白与小分子混合溶液填充到毛细吸管之中，然后通过监测荧光分子信号的分布即可检测出蛋白与小分子结合能力的强弱。保持荧光标记的蛋白浓度的保持不变，增加待测分子的浓度，通过检测不同浓度的结合物分子对荧光分子热泳动平衡状态的分布的影响，进而获得这两者相互作用的Kd值。

MST实验使用的蛋白荧光标记试剂盒Monolith Protein Labeling KitMicroScale Termophoresis Grade RED-NHS(MO-L001)及上样毛细管MonolithNT.115Series Capillaries MicroScale Termophoresis Grade Standard Treated(MOK002)购自NanoTemper公司。

实验筛选的化合物为经ELISA筛选过有活性的分子。测试时将化合物稀释成一系列的浓度梯度，与荧光标记的蛋白混合共孵后上机检测。实验操作时每孔反应体系中DMSO的终浓度为0.5％。

(1)蛋白溶解体系交换

加3ml双蒸水溶解标记缓冲液中的缓冲盐。将柱A放在1.5ml EP管中，3000rpm离心1min除去柱A中过量的液体，加入300μl的标记缓冲液，再次3000rpm离心1min，反复3次。将100μl 10μM的VSIG8蛋白溶液加入柱A，将柱A放入新的EP管中，4℃下3000rpm离心2min，即得交换缓冲液的蛋白。

(2)蛋白的标记

加入50μL的DMSO溶解固体染料，混匀体系，使得染料充分溶解。在95μl标记缓冲液中加入5μl染料，再与蛋白溶液1:1体积混合，室温避光孵育30min。

(3)蛋白的纯化

倒掉柱B中的储存液，用8ml MST缓冲液平衡柱B。加入200μL体积的标记反应液至柱B中间位置，让反应液完全浸入柱B中，再加入300μL的MST缓冲液至柱B，弃去流出液。待300μL的MST缓冲液完全进入柱B中，加入600μL体积的冲洗液，收集洗脱下来的液体即得荧光标记VSIG8蛋白。

(4)人VSIG8蛋白与人VISTA蛋白亲和力检测

MST缓冲液：Tris-HCl 3.94g，NaCl 4.383g，MgCl₂ 0.4761g，0.05％吐温20 250μl，溶于超纯水中，定容至500ml，PH为7.4；0.22μm滤膜过滤后使用，室温保存。

用MST缓冲液将化合物稀释成一系列的浓度梯度，最高浓度设定为50μM，以2倍浓度梯度依次向下稀释8个浓度，控制每个浓度梯度中DMSO的体积分数为1％，每个浓度梯度中化合物体积为10μl。再向每个组分加入10μl标记蛋白，与化合物混合均匀后室温避光孵育30min。孵育结束后，用毛细管吸取少量的化合物蛋白混合液即可上机检测。结果如下：

人VISTA蛋白与人VSIG8蛋白结合的Kd为0.44±1.60μM(如图4所示)。

(5)化合物检测

用MST缓冲液将化合物稀释成一系列的浓度梯度，控制每个浓度梯度中DMSO的含量为1％，每个浓度梯度中化合物体积为10μl。再向每个组分加入10μl标记蛋白，与化合物混合均匀后室温避光孵育30min。孵育结束后，用毛细管吸取少量的化合物蛋白混合液即可上机检测。结果如下：

化合物L557-0155与人VSIG8蛋白结合的Kd为6.70±1.50μM(如图5所示)。

实验结果表明化合物L557-0155与人VSIG8蛋白结合力强。

实施例4

候选化合物小分子EC₅₀测定方法

本实例采用的是间接竞争ELISA法测定候选化合物小分子的EC50，通过孵小分子、洗涤、孵育特异性人VSIG8抗体、洗涤和显色步骤获得候选小分子化合物的EC₅₀。主要依靠辣根过氧化物酶与TMB显色液反应发生颜色变化而进行检测。实验时将VSIG8蛋白通过物理吸附作用包被在酶标板上，经过洗涤与封闭步骤去除板底存未被蛋白饱和的非特异性结合位点，再加入不同浓度的候选化合物小分子孵育，之后洗掉未结合的小分子，加入人VSIG8特异性抗体混合物，最后加入二抗、TMB显色，检测450nm处吸光度(表4)。当候选化合物浓度为0时，检测抗体将完全与人VSIG8结合，此反应组吸光度值为最大，即阳性对照。当候选化合物浓度越大，检测抗体将与人VSIG8结合的越少，由于检测对象占据了VSIG8蛋白的一部分结合位点，检测抗体与VSIG8蛋白的结合减少，其450nm出吸光度值也会降低。利用吸光度值的强弱即可测定出候选化合物小分子的EC₅₀。

表4实验设计

实验中用到的缓冲液等同实例2。用包被缓冲液将纯化后的人VSIG8蛋白稀释成1μg/ml，每孔加入100μl的蛋白溶液，4℃包被过夜。第二天弃去包被蛋白液，PBST洗3次，每孔加入200μl封闭液，室温封闭2h后弃去封闭液，PBST洗5次。将化合物小分子加入板中，使其终浓度分别为10μΜ，5μΜ，2.5μΜ，1.25μΜ，0.625μΜ，0.313μΜ,0.156μΜ，0.078μΜ，每孔100μl，室温反应2h后弃去反应液，PBST洗5次。加入一抗，其终浓度为0.5μg/ml，每孔100μl，室温反应2h。加入二抗anti-sheep-HRP(1:10000)，每孔100μl，室温孵育1h后PBST洗5次。加入100μl TMB显色液，暗处孵育9min，再加入50μl反应终止液后于450nm处读板测吸光度值。

将得到的吸光度数据用GraphPad Prism 5软件分析EC50值。结果如下：

化合物L557-0155的EC₅₀值为4.464±0.023μΜ(如图6所示)。

实验结果表明化合物L557-0155与人VSIG8蛋白结合率强，其50％的结合率为4.464±0.023μΜ。

实施例5

PBMC细胞激动模型的建立

CD3单克隆抗体(OKT3)可特异的识别T细胞表面的CD3分子，通过由T细胞表面TCR-CD3复合物与APC表面MHC-Ⅱ类分子-抗原肽的结合，引起T细胞活化并增值。T细胞活化不仅需要T细胞受体TCR-CD3复合物的第一信号，还需要CD28这一第二信号增强T细胞的活化与增值。CD3抗体和CD28抗体同时存在时，可激活外周血单核细胞(PBMC)。PBMC的活化与增值会使干扰素γ(IFN-γ)分泌增加。在PBMC激活的同时，若体系中存在VSIG8蛋白，则激动效果减弱。在细胞模型的构建过程中，同时给予激动剂与VSIG8蛋白，通过分析细胞上清中细胞因子的分泌情况判断T细胞被活化的情况。

PBMC(PB005F-C)购自澳赛尔斯生物技术(上海)有限公司；Anti-CD3(317304)，Anti-CD28(302914)购自Biolegand公司；Human IFN-γELISA检测试剂盒(430104)购自Biolegand公司；VSIG8蛋白(9200-VS-050)购买于美国R&D Systems。

1、PBMC细胞复苏与培养

冻存细胞从液氮出取出，将细胞浸于38-39℃水浴中融化并一直不停摇动使其快速融化至管中只剩下非常少量的冰块，将细胞从水浴中取出，喷过75％酒精后于超净台中打开，将冻存管中的细胞悬液(1ml)转移到事先准备有24ml1640完全培养基的细胞培养瓶中，将细胞摇瓶置于37℃，5％CO₂浓度的孵箱中培养。

复苏三天后，当细胞密度达到1×10⁶个活细胞/mL时进行细胞传代，将细胞以密度为0.2×10⁶–0.3×10⁶个活细胞/mL接种于新鲜培养基中，细胞培养体积为25ml。将细胞放回37℃，5％CO₂浓度的孵箱中培养。

2、PBMC细胞激活

第一天：在96孔板中VSIG8蛋白溶液。使用PBS将VSIG8蛋白分别稀释至1.25μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml。每孔加入100μl蛋白溶液。同时每个孔加入2.5μl Anti-CD3和2.5μl Anti-CD28，使其终浓度均为2.5μg/ml，4℃包被过夜(表5)。

第二天：吸去孔中的包被蛋白溶液，用PBS清洗2次，每孔200μl。每孔加入100μl 1×10⁶个活细胞/mL的PBMC细胞，使其为1×10⁵个活细胞/孔。将96孔板放至37℃细胞培养箱内，48小时后收集细胞上清检测IFN-γ的分泌量。结果如图7所示，1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml的VSIG8蛋白均能抑制Anti-CD3和Anti-CD28诱导的PBMC细胞IFN-γ的分泌。

表5 PBMC细胞激活实验组别设置

3、化合物活性检测实验

第一天：在96孔板中包被VISTA蛋白溶液。使用PBS将VSIG8蛋白分别稀释至5μg/ml。每孔加入100μl蛋白溶液，同时每个孔加入2.5μl Anti-CD3和2.5μl Anti-CD28，使其终浓度均为2.5μg/ml，4℃包被过夜(表6)。

第二天：吸去孔中的包被蛋白溶液，用PBS清洗2次，每孔200μl。每孔加入100μl 1×106个活细胞/mL的PBMC细胞，使其为1×105个活细胞/孔。将96孔板放至37℃细胞培养箱内，48小时后收集细胞上清检测IFN-γ和TNF-α的分泌量。实验结果表明小分子L557-0155可以逆转VSIG8蛋白抑制PBMC分泌细胞因子IFN-γ和细胞因子TNF-α的作用，促进PBMC细胞因子IFN-γ(图8)和TNF-α(图9)的释放，是VSIG8蛋白的抑制剂。

表6化合物细胞活性实验组别设置

通过上述实验，通过化合物对PBMC细胞分泌细胞因子的影响实验，发现L557-0155可以翻转VSIG8蛋白对PBMC细胞分泌细胞因子的抑制作用，证明了L557-0155对VSIG8蛋白有抑制作用。实施例5建立了PBMC细胞激动模型，可用于评价VSIG8抑制剂对PBMC细胞分泌细胞因子的影响，促进或者减少PBMC细胞因子的分泌。

本发明在实验模型中，在没有VSIG8蛋白存在时，激动组PBMC细胞分泌细胞因子明显增多，加入了外源的VSIG8蛋白之后，细胞因子分泌减少，随之继续加入外源的L557-0155，细胞因子分泌量又恢复正常(见图8和图9)。

实施例6

CFSE实验检测亲和小分子对PBMC细胞增殖的影响

CFSE是标记活细胞的染料，这种染料可以穿透细胞膜，与胞内的蛋白结合，在细胞的增殖过程中，随着细胞的分裂，CFSE的标记荧光会被平均分配到两个子细胞中，即会出现荧光强度的减弱。通过流式细胞术检测荧光的强弱即可反映出细胞增殖的情况。

蛋白包被Day 1：用PBS将VSIG8蛋白稀释至5μg/ml和10μg/ml。在96孔板中每孔加入100μl不同浓度的蛋白溶液，同时每个孔加入2.5μl Anti-CD3使其终浓度均为1μg/ml，4℃包被过夜。

PBMC增殖实验

Day 2：将PBMC从液氮出取出，于37-38℃水浴中融化并一直不停摇动使其快速融化，将冻存管中的细胞悬液(1ml)慢慢滴加到事先准备有12ml的1640完全培养基的50ml离心管中，混匀后200rpm，离心15min。离心结束弃去上清，2ml的1640完全培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。

取1μl的CFSE染液加到1ml的PBS中配成CFSE工作液，在CFSE工作液中以50×10⁶个细胞/ml重悬上述细胞沉淀，37℃避光孵育20min。孵育结束后加入2ml的1640完全培养基，37℃避光孵育5min，200rpm离心15min，弃上清，加入4ml的1640完全培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。

弃去96孔板中的包被蛋白溶液，用PBS清洗2次，每孔200μl。将进行了CFSE染色的PBMC以每孔100μl 1×10⁶个活细胞/mL加到96孔板中，使细胞密度其为1×10⁵个活细胞/孔。将亲和力小分子用1640完全培养基稀释，使其终浓度为10μM，DMSO含量不超过0.1％。再在每个96孔板中加入100μl稀释后的小分子溶液。不加小分子的孔加入100μl1640完全培养基。最后将96孔板放至37度细胞培养箱内，120小时后收集细胞。

将收集的细胞样品转移到1.5ml离心管中，2000rpm离心5min，弃上清，加入200μl的PBS溶液重悬细胞沉淀，2000rpm离心5min，弃上清，再加200μl的PBS溶液重悬细胞沉淀，即可上机测定细胞增殖情况(图10)。

通过上述实验，发现在VSIG8蛋白单独存在时，对PBMC细胞增殖有抑制作用(图11)，但当加入L557-0155之后，可使PBMC细胞的增殖恢复至正常水平(图12)，进一步说明了L557-0155可以抑制VSIG8蛋白的功能。实施例6建立了通过CFSE实验检测VSIG8小分子抑制剂对PBMC细胞增殖影响的实验方法，实验结果表明，本发明化合物L557-0155可以促进PBMC细胞增殖。

实施例8

化合物L557-0155对小鼠黑色素瘤生长的影响

B16-F10细胞培养在1640完全培养基(含10％FBS)，待细胞处于对数生长期，生长融合度为80％～90％时，胰酶消化传代。其中，B16-F10细胞由军事科学研究院提供。

以PBS为空白对照，以化合物L557-0155为药物，一共3组，包括对照组、化合物L557-0155剂量10mg/kg给药组,化合物L557-0155剂量100mg/kg给药组，每组6只小鼠，实验重复3次。

1)麻醉小鼠：将装有细胞的EP管颠倒混匀6次，去掉注射器针头吸细胞培养液至0.4ml；

2)给每只小鼠的两边腹股沟皮内注射B16F10细胞，每边100μl。植瘤当天记为D0天，D3天开始给药，每隔1天给。

D9天开始，用异氟烷将小鼠麻醉，称重，用游标卡尺测量左右边个肿瘤大小。待对照组的肿瘤体积约为2000mm3时，停止给药，处死小鼠，终止动物实验。植瘤后小鼠肿瘤体积见表7，由表7可知，化合物L557-0155有抑制小鼠肿瘤的作用。

表7植瘤后小鼠肿瘤体积

VSIG8可作为VISTA的受体，与此同时也证明了针对VSIG8的治疗会在肿瘤领域发挥重要作用。经过进一步的实验验证，L557-0155的存在可使受抑制的T细胞功能恢复接近正常的水平，从而认为，其在肿瘤预防中能发挥改善T细胞功能的作用，进一步的体内实验证明VSIG8抑制剂的具有治疗肿瘤的作用。

Claims (4)

1.如化合物L557-0155作为VSIG8抑制剂在制备预防或治疗黑色素瘤药物中的应用，化合物L557-0155结构如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物L557-0155与VSIG8蛋白结合，进而可促进IFN-γ、TNF-α细胞因子的释放作为VSIG8小分子抑制剂在制备预防或治疗黑色素瘤药物中的应用。

3.一种预防或治疗黑色素瘤疾病的药物组合物，其特征在于，其含有权利要求1所述的化合物L557-0155和药学上可接受的载体。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

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