CN110452245B - Vsig3小分子抑制剂的医药用途及其药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了VSIG3小分子抑制剂的医药用途及其药物组合物，本发明如化合物K284‑3046或E894‑0141或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备VSIG3抑制剂中的应用，化合物K284‑3046、E894‑0141结构如下：

Description

VSIG3小分子抑制剂的医药用途及其药物组合物

技术领域

本发明属于医药范畴，具体涉及一种VSIG3小分子抑制剂的医药用途及其药物组合物。

背景技术

VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation)是一种新型的免疫检查点分子，为免疫球蛋白家族成员，2011年由Li Wang团队首次报道。VISTA主要在脾脏、骨髓等免疫器官中表达，其在自身免疫性疾病中发挥重要作用，VISTA基因敲除小鼠在肺、肝脏、胰腺发现有免疫细胞浸润，且在血清中细胞趋化因子聚集。在银屑病模型小鼠中，VISTA通过调节IL-23/IL-17炎症轴调节银屑病的进展。同时很多研究表明，VISTA在肿瘤免疫中作为一个很关键的免疫调节分子。MCA105肿瘤细胞中过表达VISTA，降低了由肿瘤疫苗治疗而诱导的T细胞活化的肿瘤免疫增强。在黑色素瘤小鼠模型中，进行肿瘤疫苗多肽治疗时，VISTA敲除小鼠与野生型小鼠相比，更有效地抑制了肿瘤的生长。VISTA的受体至今仍未明确，有文献报道VISTA与VISTA自身能够结合，但未有明确研究证明VISTA作为配体与T细胞受体VISTA结合抑制T细胞活化。

目前已被报道的VISTA配体为VSIG3(V-Set and Immunoglobulin domaincontaining 3)和VSIG8(V-set and immunoglobulin domain containing 8)，且VSIG3与VISTA的亲和力要强于VSIG8，VSIG3作为配体与T细胞表面受体VISTA结合抑制T细胞活化。VSIG-3也被称作IGSF11(immunoglobulin superfamily 11 gene)，因为其在脑(Brain)和睾丸(Testis)中高表达，所以又被称作BT-lgSF11。VSIG3为I型跨膜蛋白，胞外段包含V型和C2型免疫球蛋白结构域以及C末端的PDZ结构域。基于总体结构的相似性和氨基酸序列，VSIG3为免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily,IgSF)成员。VSIG3与柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)及内皮细胞选择性粘附分子(ESAM)有高度同源性。VSIG3具有细胞粘附分子功能，并且是以不依赖于Ca2+/Mg2+方式介导同嗜性粘附。在斑马鱼模型中，VSIG3通过控制黑色素的生成和迁移来调节成年斑马鱼色素图案的形成。VSIG3通过与突触后密度蛋白PSD-95和AMPA谷氨酰胺相互作用来调节突触传递和可塑性。VSIG3的表达在正常组织中较低，但是在肠型胃癌中显著上调，这表明VSIG3蛋白对早期的胃癌治疗有一定的临床应用价值。针对VSIG3这一肿瘤相关抗原(tumor-associated tumor,TAA)设计合成的多肽疫苗能够激活特异性的CTL(cytotoxic T lymphocyte)杀伤肿瘤细胞，提高胃癌患者生存率。VSIG3作为VISTA的天然配体介导共抑制信号通路抑制T细胞活化，其在正常组织中几乎不表达，而在肿瘤微环境中高表达，符合“肿瘤免疫正常化”治疗策略的靶点要求。所以针对VSIG3设计的单抗或小分子抑制剂具有一定的治疗价值。

迄今，尚无任何文献报道涉及VSIG3小分子抑制剂。因此，研制VSIG3小分子抑制剂具有重要的临床应用价值，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供如化合物K284-3046或E894-0141或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备VSIG3抑制剂中的应用；本发明K284-3046或E894-0141或其药学上可接受的盐或溶剂化物与VSIG3蛋白有很高的结合率，因而可作为VSIG3小分子抑制剂用于肿瘤免疫治疗，具有重要的临床应用价值

本发明还提供一种预防或治疗肿瘤疾病的药物组合物。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的如化合物K284-3046或E894-0141或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备VSIG3抑制剂中的应用，化合物K284-3046、E894-0141结构如下：

所述K284-3046或E894-0141可以通过商业途径购买；化合物K284-3046，CAS：451463-81-3；化合物E894-0141，CAS：894549-52-1。

其中，所述化合物K284-3046或E894-0141与VSIG3蛋白结合，进而可促进IFN-γ、IL-17A炎症因子的释放在制备VSIG3小分子抑制剂中的应用。

作为优选，所述化合物K284-3046或E894-0141可作为药用盐使用或者溶剂化物组成的药物组合物，所述盐为化合物与金属离子或药学上可接受的胺或铵离子形成的盐。

进一步地，所述金属离子包括但不限于：钠、钾、钙等离子；药学上可接受的胺包括但不限于：乙二胺、氨丁三醇等。

本发明所述化合物K284-3046或E894-0141或其药学上可接受的盐或溶剂化物作为VSIG3抑制剂在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。

作为优选，所述肿瘤疾病包括血液癌症、神经系统癌症、胃肠癌、食道癌、泌尿系统癌症、肺癌、肝癌、皮肤癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、血管瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、脑癌、黑色素瘤和鳞癌。

本发明所述的预防或治疗肿瘤疾病的药物组合物，其含有所述的化合物K284-3046或E894-0141或其药学上可接受的盐或溶剂化物和药学上可接受的载体。

作为优选，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

在本发明的药物组合物中可任意混合的辅料根据剂型、给药形式等可以改变。辅料包括赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂和甜味剂等。所述药物组合物的给药途径可以为口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜或静脉等。所述药物组合物可以是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂等制剂学上常规的制剂形式。

VISTA为新型免疫检查点，其在髓系细胞高表达。VSIG3在正常组织中几乎不表达，在肠胃癌、肝癌高表达，为该类”肿瘤相关抗原”，已经有文献报道VSIG3作为VISTA配体激活共抑制信号通路抑制免疫应答，从而协助肿瘤的发生发展。针对VSIG3设计的小分子抑制剂抑制VSIG3/VISTA信号通路的激活，从而恢复机体对肿瘤正常的免疫应答。且VSIG3在正常组织中几乎不表达，针对VSIG3设计的小分子抑制剂符合肿瘤免疫正常化治疗策略，该小分子抑制剂对机体的免疫毒性较低。所以，针对VSIG3设计的小分子抑制剂对于肿瘤的治疗是非常有意义的。

本发明以VISTA的配体VSIG3为研究对象，利用真核细胞CHO表达系统表达出VSIG3蛋白，通过虚拟筛选与分子对接的方法筛选小分子药物。再通过分子水平上的亲和力评价与细胞水平上的功能性研究，筛选出有活性的亲和力小分子，为VSI3小分子抑制剂的开发提供新思路。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次提供了VSIG3小分子抑制剂，本发明通过蛋白和细胞水平实验首次发现化合物K284-3046和E894-0141均可显著地与VSIG3蛋白结合，进而可促进IFN-γ、IL-17A等炎症因子的释放，因而可作为VSIG3小分子抑制剂的开发，可用于防治肿瘤。

本发明提供了一种针对VSIG3设计的全新的VSIG3小分子抑制剂，可显著地与VSIG3蛋白结合，化合物K284-3046、E894-0141能够降低VSIG3蛋白对PBMC活化的抑制作用，促进PBMC细胞因子如IL-17A、IFN-γ的分泌，同时促进了PBMC的增殖。VSIG3蛋白具有抑制T细胞免疫应答的功能，针对VSIG3筛选或设计的小分子抑制剂抑制VSIG3的生物学功能，促进T细胞活化；小分子抑制剂是通过促进免疫用于肿瘤的防治。而包括本发明的VSIG3小分子抑制剂如化合物K284-3046或E894-0141的药物组合物可以成为新型的预防或治疗肿瘤疾病的药物组合物。

附图说明

图1为本发明转染后人VSIG3蛋白表达量随表达时间的变化示意图；其中，D2、D3、D4、D5、D6、D7和D8分别为转染后第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天和第8天；

图2为本发明Western Blot鉴定洗脱组分中人VSIG3蛋白分布情况示意图；

图3为本发明考马斯亮蓝染色鉴定洗脱组分中人VSIG3蛋白与杂蛋白分布情况示意图；

图4为ELISA评价VSIG3蛋白与VISTA蛋白的之间的相互结合示意图；

图5为ELISA评价VSIG3抗体是否能阻断VSIG3蛋白与VISTA蛋白之间的结合示意图；

图6为本发明MST检测化合物K284-3046与人VSIG3蛋白亲和力示意图；

图7为本发明MST检测化合物E894-0141与人VSIG3蛋白亲和力示意图；

图8为本发明不同浓度的VSIG3蛋白对PBMC的IFN-γ分泌的影响图；

图9为本发明不同浓度的VSIG3蛋白对PBMC的IL-17A分泌的影响图；

图10为化合物K284-3046对人VSIG3蛋白对PBMC上清中IL-17A分泌抑制作用的影响图；

图11为化合物K284-3046对人VSIG3蛋白对PBMC上清中IFN-γ分泌抑制作用的影响图；

图12为化合物E894-3041对人VSIG3蛋白对PBMC上清中IFN-γ分泌抑制作用的影响图；

图13为化合物K284-3046对人VSIG3蛋白对PBMC增殖抑制作用的影响图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明做进一步的详细描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

人VSIG3胞外段蛋白的表达制备

ExpiChO-STM Cells(Gibco，A29127)、ExpiFecta mineTM ChO Transfection Kit(Gibco，A29129)购自于Thermofisher Scientific公司；人VSIG3-his质粒上海捷瑞生物科技有限公司合成；绵羊抗VSIG3抗体(AF4915)购于美国R&D Systems；绵羊二抗(CW0240S)购自康为世纪生物科技有限公司；增强型BCA蛋白浓度检测试剂盒(P0009)购于碧云天生物科技有限公司。

1、ExpiChO-STM细胞的复苏培养

将冻存的ExpiChO-STM细胞从液氮出取出，浸于38-39℃水浴中融化，并一直不停摇动，使其快速融化至管中只剩下非常少量的冰块，将细胞从水浴中取出，喷过75％酒精后于超净台中打开，将冻存管中的细胞悬液(1mL)转移到事先准备好的含有29mL Expi ChO表达培养基(Gibco，A2910001)的细胞摇瓶中，将细胞摇瓶置于37℃，CO₂浓度为8％，摇床转速为130rpm的孵箱中培养。

复苏三天后，当细胞密度达到4×10⁶–6×10⁶个活细胞/mL时进行细胞传代，将细胞以密度为0.2×10⁶–0.3×10⁶个活细胞/mL接种于ExpiCHO表达培养基中，细胞培养体积为30mL。将细胞放回37℃，CO₂浓度为8％，摇床(振幅为19mm)转速为130rpm的孵箱中培养。

2、细胞转染

采用ExpiFectamine^TM CHO Transfection Kit(Gibco，A29129)，培养ExpiChO-S^TM细胞密度达到4×10⁶–6×10⁶个活细胞/mL，对细胞进行分瓶(此时为第一天)，使分瓶后细胞的终密度为3×10⁶–4×10⁶个活细胞/mL，将细胞放回孵箱中生长过夜。第二天检查细胞密度和活细胞率。细胞应该达到7×10⁶–10×10⁶个活细胞/mL，活细胞率在95％-99％。将细胞用新鲜预热至37℃的ExpiChO^TM Expression Medium(Gibco，A2910001)稀释至6×10⁶个活细胞/mL，保证转染体积为25mL。轻轻旋动细胞培养瓶以混匀细胞。轻柔的上下颠倒充分混匀ExpiFectamine CHO Reagent。用OptiPRO SFM稀释人VSIG3蛋白质粒和转染试剂ExpiFectamine CHO Reagent，晃动离心管混匀。一边旋动离心管一边向人VSIG3-his质粒DNA稀释液中加入稀释过的ExpiFectamine CHOReagent。室温孵育ExpiFectamine CHO/DNA复合物5min，然后把复合物溶液慢慢加入细胞培养瓶中，边加边轻轻摇动细胞培养瓶。最后将细胞培养瓶放回37℃，CO₂浓度为8％，摇床转速为130rpm的孵箱中。转染20h后，向细胞培养瓶中加入150μL ExpiCHO Enhancer和6mL ExpiCHO Feed，然后把培养瓶放回孵箱继续培养8天(表1)。

表1 25mL转染体积时各试剂添加体积

3、蛋白鉴定

(1)样品制备

取100μL细胞悬液1000rpm室温离心5min，吸取上清。按照5×Loading buffer与β-巯基乙醇按照4：1体积比配制成上样缓冲液(5×Loading buffer 20μL、β-巯基乙醇5μL)，再按上样缓冲液：样品体积比为1：4(25μL上样缓冲液加入到100μL样品中)混合，将样品至于100℃下热变性10min。完成后放冷离心，于-20℃冻存。

(2)Western Blot

Human-VSIG3-ECD-his蛋白的预估分子量为28KD，确定分离胶浓度为8％。按照表2制备8％的分离胶和5％的浓缩胶。

将配好的胶片固定于电泳槽内，倒入电泳缓冲液，清洗各个上样孔之后，将制备的转染后第2天至第8天的细胞上清样品依次加入孔中(每孔10μL)。电泳条件为恒压80V，40min；120V，1h。电泳结束之后将胶片取出，按照“黑胶白膜”的顺序将PVDF膜、凝胶、滤纸在三明治夹的中间，转膜时在转膜槽内放入冰盒以保证低温。转膜条件为固电流200mA，转膜时间2h。

转膜结束后将膜置于5％脱脂奶粉中，室温条件下摇床缓慢封闭1h。封闭结束后，倒去封闭液，加入VSIG3特异性抗体稀释液1mL(绵羊抗VSIG3抗体)(按抗体母液：封闭液＝1：200体积比稀释)4℃过夜孵育。第二天，回收抗体，以TBST洗膜，80rpm清洗五次，每次10min。再将膜以兔抗绵羊二抗稀释液1mL(按抗体母液：封闭液＝1：10000体积比稀释)孵育1h；回收抗体，以TBST洗膜，80rpm洗10min，操作五次。最后将膜置于曝光仪中，均匀涂上ECL发光液(180-5001，天能)(A液：B液＝1：1体积比)，进行曝光。图1结果表明细胞上清中成功表达出人VSIG3胞外段蛋白，并从第2天开始，随着表达时间的延长，上清中VSIG3蛋白的含量逐渐增多。

表2 SDS-PAGE凝胶配制

4、蛋白浓缩

将转染后的细胞摇瓶中的培养基收集到50mL离心管里，1000rpm低温离心10min，取上清，再7000rpm低温离心40min，收集上清，并用0.45μm滤头过滤，滤液收集在50mL离心管中。根据蛋白分子量选用10KD超滤管浓缩细胞上清液，7000rpm离心30min收集超滤管内管中的浓缩液。

5、蛋白纯化

纯化使用的Ni Sepharose6Fast Flow亲和层析介质(17-5318-01)柱材购自GE生命科学公司。

(1)样品制备

过柱前，先用1×镍柱平衡缓冲液将蛋白浓缩液的体积置换成缓冲液成分。置换通过超滤管进行，将蛋白浓缩液与平衡缓冲液1:1稀释后，7000rpm低温离心30min，反复两次。

(2)装柱

充分摇匀以重悬树脂，吸取2mL浆液至新的层析柱中，层析柱中预先加入2mL平衡缓冲液。让树脂自然沉降，流出平衡缓冲液。加入10mL平衡缓冲液至层析柱中平衡树脂，按约1mL/min的流速流出平衡缓冲液。

(3)层析纯化

样品按照约1mL/min的流速上样至层析柱中，收集流出液，标记为Flow Through，即FT。分别用20mM、40mM、60mM、80mM、100mM、250mM、500mM的咪唑缓冲液(配制方法见表3)洗涤树脂，流速维持约1mL/min，各个咪唑梯度冲洗20mL缓冲液体积，每2mL收集为一个组分。洗脱结束后用20mL1×镍柱缓冲液冲洗柱材，最后将柱材浸泡在20％乙醇溶液中，4℃保存。纯化过程中收集到的组分均经过Western Blot鉴定。图2结果表明人VSIG3-his蛋白在250mM咪唑浓度被洗脱。

表3不同浓度咪唑梯度溶液的配制

5×镍柱平衡缓冲液：Na₂HPO₄·12H₂O 17.9g，NaCl 73.125g，加超纯水溶解后定容至500mL，室温保存。

1×镍柱平衡缓冲液：5×镍柱平衡缓冲液100mL，超纯水400mL，使用时先加超纯水300mL，用浓盐酸调PH为7.4，再用超纯水定容至500mL；0.22μm滤膜过滤后使用，室温保存。

500mM咪唑缓冲液：1×镍柱平衡缓冲液250mL，咪唑8.51g，加超纯水溶解后，用浓盐酸调pH为7.4，再用超纯水定容至250mL；0.22μm滤膜过滤后使用，室温保存。

6、蛋白收集与定量

(1)蛋白收集：收集经Western Blot验证过含有目的蛋白的洗脱组分，并用3KD超滤管浓缩，离心条件为7000rpm低温离心40min。浓缩后，再将蛋白保存体系置换成PBS缓冲液，即将浓缩液与PBS缓冲液1:14体积比混合，7000rpm低温离心40min，反复两次。最后收集蛋白，并取样进行考马斯亮蓝染色鉴定纯度后分装冻存于-80℃。纯化后蛋白的考马斯亮蓝染色结果如图3所示，表明制备的蛋白纯度高，没有其他分子量杂蛋白。

(2)BCA定量：根据增强型BCA蛋白浓度检测试剂盒的说明配置蛋白标准品。将工作液A和B以50:1的比例配成混合液，向96孔板中每孔加入20μL的蛋白标准品，再向每孔中加入200μL的混合液，每个浓度做3个副孔，37℃孵育30min后，在562nm波长处测定OD值，根据标准曲线计算目的蛋白浓度为1.3mg/mL，表明成功表达制备出人VSIG3-his胞外段蛋白。

实施例2

争性ELISA法筛选VSIG3蛋白的亲和分子

竞争性ELISA法筛选VSIG3蛋白的亲和分子，通过简单的共孵、洗涤和显色步骤即可表征筛选对象对于VSIG3蛋白亲和力的高低。主要依靠辣根过氧化物酶与TMB显色液反应发生颜色变化而进行检测。实验时将VSIG3蛋白通过物理吸附作用包被在酶标板上，经过洗涤与封闭步骤去除板底存在的未被蛋白饱和的非特异性结合位点，再加入待测对象与VSIG3特异性抗体混合物，最后加入二抗、TMB显色，检测450nm处吸光度。若检测对象不与VSIG3蛋白结合，检测抗体将完全与VSIG3反应，此反应组吸光度值为最大，即阳性对照。若检测对象与VSIG3蛋白结合，由于检测对象占据了VSIG3蛋白的一部分结合位点，检测抗体与VSIG3蛋白的结合减少，其450nm出吸光度值也会降低。利用吸光度值的强弱即可反映出筛选对象对于VSIG3蛋白亲和力的高低。

1、ELISA评价VSIG3与VISTA结合实验

VSIG3蛋白为实施例1表达制备的蛋白，VISTA为RD公司购买的生物素化重组蛋白(BT7126-050)，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(hRP-Strepavidin)、TMB显色液购买于BioLegend公司。

用coating buffer将人VSIG3蛋白稀释成2μg/mL，100μL每孔固化在96孔板上,4℃包被过夜。第二天弃去包被蛋白液，PBST振荡洗3次，每次1min。每孔200μL blockingbuffer封闭1h，弃去封闭液，PBST振荡洗5次，每次1min。然后加入生物素标记人重组VISTA蛋白(Recombinant human VISTA Fc Chimera Biotinylated Protein,CF)10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.15625μg/mL、0.078125μg/mL、0.039625μg/mL(用PBS1：1梯度稀释)，每孔100μL。室温振荡孵育2h弃去生物素标记人重组VISTA蛋白溶液，PBST振荡洗5次，每次1min。然后加入hRP-Strepavidin，室温孵育1h后，PBST振荡洗5次，每次1min。加入100μL TMB显色液，暗处孵育9min左右(出现颜色梯度即停止，防止因作用时间过久而造成各孔颜色一致的情况出现)，最后加入50μL stopsolution，450nm处读板测吸光度(2h内完成)。结果如图4所示，VSIG3与VISTA之间存在明显的结合。

用coating buffer将人VSIG3蛋白稀释成2μg/mL，100μL每孔固化在96孔板上,4℃包被过夜。第二天弃去包被蛋白液，PBST振荡洗3次，每次1min。每孔200μL blockingbuffer封闭1h，弃去封闭液，PBST振荡洗5次，每次1min。然后加入抗人VISG3抗体稀释液20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0μg/mL(用PBS 1：1梯度稀释)，每孔100μL。室温振荡孵育2h弃去抗人VISG3抗体稀释，PBST振荡洗5次，每次1min。每孔加入200μL生物素标记人重组VISTA蛋白5μg/mL，室温振荡孵育2h。弃去VISTA蛋白溶液，PBST振荡洗5次，每次1min。然后加入hRP-Strepavidin，室温孵育1h后，PBST振荡洗5次，每次1min。加入100μL TMB显色液，暗处孵育9min左右(出现颜色梯度即停止，防止因作用时间过久而造成各孔颜色一致的情况出现)，最后加入50μL stop solution，450nm处读板测吸光度(2h内完成)。结果如图5所示，抗人VISG3抗体阻断了VSIG3与VISTA蛋白的结合。

2、ELISA化合物筛选实验

蛋白为实施例1表达制备的人胞外段VSIG3蛋白，实验筛选的化合物由江苏省新药筛选重点实验室提供(化合物K284-3046，CAS：451463-81-3；化合物E894-0141，CAS：894549-52-1)，实验筛选化合物母液为10mg/mL，筛选浓度为10μg/mL；一抗为绵羊抗VSIG3抗体(AF4915)购于美国R&D Systems；二抗(CW0240S)购自康为世纪生物科技有限公司。

表4实验设计

如表4所示，实验分为3组：阴性对照、阳性对照和实验组；阴性对照为不孵育一抗的组别，此时板底VISTA蛋白结合位点未被占据，该组理论结合率为0％；阳性对照组中，加入了一抗和二抗，板底VSIG3的结合位点应被一抗完全饱和，该组理论结合率为100％；实验组中加入的化合物若能与VSIG3蛋白结合，则该组的吸光度值应下降，结合率在0％-100％。用包被缓冲液将纯化后的人胞外段蛋白VSIG3稀释成0.247μg/mL，每孔加入100μL的蛋白溶液，4℃包被过夜。第二天弃去包被蛋白液，PBST洗3次，每孔加入200μL封闭液，室温封闭2h后弃去封闭液，PBST洗5次。将配制的100μg/mL样品工作液与一抗1:9体积比混合后加入(混合后样品终浓度为10μg/mL，一抗终浓度为0.5μg/mL)，每孔100μL，室温反应2h后弃去反应液，PBST洗5次。加入二抗anti-sheep-HRP(1:10000)，每孔100μL，室温孵育1h后PBST洗5次。加入100μL TMB显色液，暗处孵育9min，再加入50μL反应终止液后于450nm处读取吸光度值。

根据吸光度值计算人VSIG3-his蛋白与筛选化合物的结合率。

结合率％＝[1-(OD_化合物-OD_阴性对照)/(OD_阳性对照-OD_阴性对照)]×100％。

结果显示，本发明筛选化合物19个，其中活性较好的化合物数据如表5所示。表5可见，化合物K284-3046和化合物E894-0141与VSIG3蛋白均具有较高的结合率。

表5化合物结构与具体活性数据

3、MST筛选实验

MST实验使用的蛋白荧光标记试剂盒Monolith Protein Labeling KitMicroScale Termophoresis Grade RED-NHS(MO-L001)及上样毛细管MonolithNT.115Series Capillaries MicroScale Termophoresis Grade Standard Treated(MOK002)购自NanoTemper公司。

实验筛选的化合物为经ELISA筛选过有活性的分子。测试时将化合物稀释成一系列的浓度梯度，与荧光标记的蛋白混合共孵后上机检测。实验操作时每孔反应体系中DMSO的终浓度为0.5％。

(1)蛋白溶解体系交换

加3mL双蒸水溶解标记缓冲液中的缓冲盐。将柱A放在1.5mL EP管中，3000rpm离心1min除去柱A中过量的液体，加入300μL的标记缓冲液，再次3000rpm离心1min，反复3次。将100μL 10μM的蛋白溶液加入柱A，将柱A放入新的EP管中，4℃下3000rpm离心2min，即得交换缓冲液的蛋白。

(2)蛋白的标记

加入50μL的DMSO溶解固体染料，混匀体系，使得染料充分溶解。在95μL标记缓冲液中加入5μL染料，再与蛋白溶液1:1体积混合，室温避光孵育30min。

(3)蛋白的纯化

倒掉柱B中的储存液，用8mL MST缓冲液平衡柱B。加入200μL体积的标记反应液至柱B中间位置，让反应液完全浸入柱B中，再加入300μL的MST缓冲液至柱B，弃去流出液。待300μL的MST缓冲液完全进入柱B中，加入600μL体积的冲洗液，收集洗脱下来的液体即得荧光标记蛋白。

(4)化合物检测

MST缓冲液：Tris-HCl 3.94g，NaCl 4.383g，MgCl₂ 0.4761g，0.05％吐温20 250μl，溶于超纯水中，定容至500ml，PH为7.4；0.22μm滤膜过滤后使用，室温保存。

用MST缓冲液将化合物稀释成一系列的浓度梯度(稀释后化合物最高浓度为200μM，1：1倍比梯度稀释，共稀释16个浓度)，控制每个浓度梯度中DMSO的体积分数为1％，每个浓度梯度中化合物体积为10μL。再向每个组分加入10μL标记蛋白，与化合物混合均匀后室温避光孵育30min。孵育结束后，用毛细管吸取少量的化合物蛋白混合液即可上机检测。结果如下：

化合物K284-3046与人VSIG3蛋白结合的Kd为11.61±9.12μM(如图6所示)

化合物E894-0141与人VSIG3蛋白结合的Kd为4.37±2.81μM(如图7所示)。

实验结果表明化合物K284-3046和E894-0141与人VSIG3蛋白结合力强。

实施例3

PBMC细胞激动模型的建立，用于鉴定化合物细胞活性

CD3抗体能够与T细胞表面的TCR结合活化T细胞，刺激T细胞的增殖和白介介素2的分泌。在细胞激活的同时，若体系中存在VSIG3蛋白产生的抑制信号，则激动效果减弱。在细胞模型的构建过程中，同时给予激动剂与VSIG3蛋白，通过分析细胞上清中细胞因子的分泌情况判断T细胞被活化的情况。

1、PBMC细胞激活实验

第一天：包被蛋白

在96孔板中分别包被CD-3抗体与VSIG3蛋白的混合液。激动组使用PBS将CD-3稀释至2.5μg/mL，抑制组保持CD-3抗体浓度不变，加入不同浓度的VSIG3蛋白(表6)。设置4个不同VSIG3蛋白浓度，分别为2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL。蛋白均用PBS稀释，包被时每孔加入100μL蛋白溶液，4℃包被过夜。

第二天：吸去孔中的包被蛋白溶液，用PBS清洗2次，每孔200μL。每孔加入100μL分选后的细胞，每孔100000个细胞。用新鲜的完全培养基补足每孔体积至200μL，将96孔板放至37℃细胞培养箱内，48小时后收集细胞上清检测IFN-γ和IL-17A的分泌量。图8表明VSIG3蛋白剂量依赖性地抑制了PBMC IFN-γ细胞因子的分泌，图9表明VSIG3蛋白剂量依赖性地抑制了PBMC IL-17A细胞因子的分泌。

表6细胞激活实验组别设置

2、化合物活性检测实验

第一天：在96孔板中分别包被CD-3抗体或CD-3与VISTA 蛋白的混合液。激动组使用PBS将CD-3稀释至2.5μg/mL，对照组与化合物实验组CD-3浓度为2.5μg/mL，VISTA 蛋白浓度为10μg/mL(表7)。蛋白均用PBS稀释，包被时每孔加入100μL蛋白溶液，4℃包被过夜。

第二天：吸去孔中的包被蛋白溶液，用PBS清洗2次，每孔200μL。每孔先加入100μL的细胞(或100μL CFSE染料标记的PBMC)，每孔细胞100000个。化合物检测组每孔加入100μL，20μM的待测化合物。对照组与空白组均加入加入100μL完全细胞培养基。将96孔板放至37度细胞培养箱内，48小时后收集细胞上清检测IL-17A、IFN-γ的分泌量。图10和图11结果表明化合物K284-3046显著抑制了VSIG3蛋白的生物学功能，促进了PBMC IL-17和IFN-γ细胞因子的分泌。图12结果表明化合物E894-0141显著抑制了VSIG3蛋白的生物学功能，促进了PBMC IFN-γ细胞因子的分泌。120h后收集细胞，流式检测PBMC增殖情况。如图13结果所示，我们发现化合物K284-3046降低了VSIG3对PBMC增殖的抑制作用，剂量依赖性促进了PBMC的增殖。

表7化合物细胞活性实验组别设置

通过包被的外源性VSIG3蛋白剂量依赖性抑制了PBMC活化，降低了PBMC细胞因子如IL-17A、IFN-γ的分泌，抑制了PBMC的增殖。化合物K284-3046、E894-0141能够降低VSIG3蛋白对PBMC活化的抑制作用，促进PBMC细胞因子如IL-17A、IFN-γ的分泌，同时促进了PBMC的增殖。

VSIG3蛋白具有抑制T细胞免疫应答的功能，针对VSIG3筛选或设计的小分子抑制剂抑制，可以抑制VSIG3的生物学功能，促进T细胞活化；小分子抑制剂是通过促进免疫用于肿瘤的防治。

实施例4

化合物K284-3046和E894-0141对小鼠黑色素瘤生长的影响

B16-F10细胞培养在1640完全培养基(含10％FBS)，待细胞处于对数生长期，生长融合度为80％～90％时，胰酶消化传代。其中，B16-F10细胞由军事科学研究院提供。

以PBS为空白对照，以K284-3046和E894-0141为药物，一共5组，包括对照组、K284-3046剂量10mg/kg给药组,K284-3046剂量100mg/kg给药组，E894-0141剂量10mg/kg给药组，E894-0141剂量100mg/kg给药组，每组6只小鼠，实验重复3次。

1)麻醉小鼠：将装有细胞的EP管颠倒混匀6次，去掉注射器针头吸细胞培养液至0.4ml；

2)给每只小鼠的两边腹股沟皮内注射B16F10细胞，每边100μl。植瘤当天记为D0天，D3天开始给药，每隔1天给。

D9天开始，用异氟烷将小鼠麻醉，称重，用游标卡尺测量左右边个肿瘤大小。待对照组的肿瘤体积约为2000mm³时，停止给药，处死小鼠，终止动物实验。植瘤后小鼠肿瘤体积见表8，由表8可知，化合物K284-3046和E894-0141均有抑制小鼠肿瘤的作用。

表8植瘤后小鼠肿瘤体积

进一步的实验验证，化合物K284-3046或E894-0141可使VSIG3抑制住的T细胞的功能恢复接近正常的水平，从而认为，其在肿瘤预防中能发挥改善T细胞功能的作用，进一步的体内实验证明VSIG3抑制剂的治疗肿瘤的作用。

Claims (7)

1.如化合物K284-3046或其药学上可接受的盐作为VSIG3抑制剂在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用，化合物K284-3046结构如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化合物K284-3046与VSIG3蛋白结合，进而可促进IFN-γ、IL-17A炎症因子的释放，作为VSIG3抑制剂在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述化合物K284-3046可作为药用盐使用，所述盐为化合物与金属离子或药学上可接受的胺或铵离子形成的盐。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述金属离子为钠、钾或钙离子，所述胺为乙二胺或氨丁三醇。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肿瘤疾病为血液癌症、神经系统癌症、胃肠癌、食道癌、泌尿系统癌症、肺癌、肝癌、皮肤癌、肠癌、胰腺癌、胆囊癌、血管瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、脑癌、黑色素瘤或者鳞癌。

6.一种含有权利要求1所述化合物K284-3046的预防或治疗肿瘤疾病的药物组合物作为VSIG3抑制剂在制备预防或治疗肿瘤药物中的应用，所述组合物其含有化合物K284-3046或其药学上可接受的盐药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、霜剂、软膏剂、栓剂或贴剂。

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