AT402299B - Verfahren zur herstellung neuer cyclopeptidderivate - Google Patents

Description

AT 402 299 B

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung neuer Derivate cyclischer Peptide, die antibiotische Eigenschaften haben.

Wegen der beträchtlichen Möglichkeit und konstanten Bedrohung, daß sich antibiotikaspezifisch resistente Stämme pathogener Mikroorganismen entwickeln werden, besteht ein erhebliches Bedürfnis, neue Antibiotika zu entwickeln. Insbesondere sind Pathogene innerhalb der grampositiven Arten Staphylococcus und Streptococcus oft gegen häufig verwendete Antibiotika, wie Penicillin und Erythromycin, resistent; siehe zum Beispiel W. 0. Foye, Principles of Medicinal Chemistry, S. 684-686 (1974).

Die Erfindung ermöglicht die Herstellung neuer Derivate der A-2l978C-Cyclopeptide und der pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, die wirksame antibiotische Mittel sind.

Diese neuen Derivate können durch Umsetzung des A-21978C-Kernes, hergestellt durch Entacylierung eines aminogeschützten A-21978C-Komplexes oder irgendeines seiner aminogeschützten Einzelfaktoren Co, Ci, C2, C3, Ct oder Cs, mit dem gewünschten Acylierungsmittel oder einem aktivierten Derivat davon hergestellt werden.

Die erfindungsgemäß herstellbaren Derivate der A-21978C-Cyclopeptide der Formel 1:

worin R, R’ und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes C2-Ci9-Alkanoyl, Cs *Ci 3-AlkenoyI oder eine Aminoschutzgruppe sind, mit der Maßgabe, daß 1) wenigstens einer der Reste R, R1 oder R2 eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe haben muß, 2) wenigstens einer der Reste R1 oder R2 Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe sein muß, 3) die R-, R1-und R2-Gruppen zusammengenommen wenigstens 4 Kohlenstoffatome enthalten müssen, und 4) falls sowohl R1 als auch R2 Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, R nicht 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, die Cio-Alkanoylgruppe des A-21978C-Faktors Co oder die C12-Alkanoylgruppen der A-21978C-Faktoren C« und Cs sein kann, und die pharmazeutisch annehmbaren Salze dieser Peptide, sind als halbsynthetische antibakterielle Mittel oder als Zwischenprodukte für solche Mittel nützlich.

Im Rahmen der Erfindung werden die folgenden Abkürzungen, von denen die meisten auf dem Fachgebiet allgemein bekannt sind, verwendet:

Ala: Alanin

Asp: Asparaginsäure 2

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Asn: Asparagin Gly: Glycin Kyn: Kynurenin Om: Ornithin Ser: Serin Thr: Threonin Trp: Tryptophan t-BOC: tert.Butoxycarbonyl Cbz: Benzyloxycarbonyl DMF: Dimethylformamid THF: Tetrahydrofuran HPLC: Hochleistungsflüssigchromatographie NMR: ’H Kernmagnetische Resonanz TLC: Dünnschichtchromatographie UV: Ultraviolett

Die A-21978C-Antibiotika sind nahe verwandte saure Peptidantibiotika, die in der US-PS 4,208.403 beschrieben sind. Wie in der US-PS 4,208.403 beschrieben, enthält der A-21978-Antibiotikakomplex eine Hauptkomponente, Faktor C, die selbst ein Komplex nahe verwandter Faktoren ist. A-21978 Faktor C, der als der A-2l978C-Komplex bezeichnet wird, enthält Einzelfaktoren Co, Ci, Ci, C3, C« und Cs. Die Faktoren Ci, C2 und C3 sind Hauptfaktoren; die Faktoren Co, C* und Cs sind Nebenfaktoren. Die Struktur der A-21978C-Faktoren ist in Formel 2 dargestellt: L-*Sp / D-Ala Gl y 4r t D—Ser L-Asp ί t 3MG L-Orn Ψ \ L-Kyn Gly / 0 \ 1/ L-Thr t L-Asp t L-Asn t L-Trp

I

NH (2) in welcher 3MG L-threo-3-Methylglutaminsäure darstellt und RN einen spezifischen Fettsäurerest bedeutet. Die spezifischen RN-Gruppen der Faktoren sind wie folgt: 3

AT 402 299 B A-2l978C-Faktor RN-Rest Ci 8-Methyldecanoyl c2 10-Methy lundecanoy I c3 10-Methyldodecanoyl Co Cio-Alkanoyl* C4 Ct 2-Alkanoy Γ C5 Ci 2-Alkanoy Γ ' Identität noch nicht bestimmt

Wenn man mit dem Problem der Entacylierung eines Peptidantibiotikums konfrontiert ist, ist es außerordentlich schwierig zu wissen, ob ein Enzym existiert, das für diesen Zweck verwendet werden kann. Das Auffinden eines solchen Enzyms ist in noch höherem Maße schwierig, wenn das Substratantibiotikum einen cyclischen Peptidkern enthält. Da Enzyme einen hohen Spezifitätsgrad haben, werden Unterschiede im Peptidrest und in der Seitenkette des Substrats das Ergebnis des Entacylierungsversuches beeinflussen. Außerdem erzeugen viele Mikroorganismen eine große Zahl von Peptidasen, die verschiedene Teile des Peptidrestes angreifen. Dies führt häufig zu schwer handhabbaren Produktgemischen.

Das zur Erzielung der Entacylierung der Fettsäureseitenkette von der a-Aminogruppe des Tryptophans verwendete Enzym kann von einem Mikroorganismus der Familie Actinoplanaceae, vorzugsweise dem Mikroorganismus Actinoplanes utahensis NRRL 12052, oder einer Variante davon gebildet werden. Um die Entacylierung zu bewirken, wird ein Antibiotikum, nämlich A-21978C-Komplex, einzelne A-21978C-Faktoren Co, Ci, C2, C3, C* und Cs, aminogeschützter A-21978C-Komplex und aminogeschützte A-21978C-Faktoren Co, Ci, C2, C3, C* und Cs, der Kultur des Mikroorganismus zugesetzt. Der Ausdruck "A-2l978C-Komplex" bezieht sich auf Gemische einzelner A-2l978C-Faktoren. Die Aminogruppe des Ornithins und/oder Kynurenins ist mit einer Aminoschutzgruppe versehen. Vorzugsweise liegt die Aminoschutzgruppe an der S-Aminogruppe des Ornithins des einzelnen Faktors oder Gemisches von Faktoren vor. Die Kultur wird mit dem Substrat bebrütet, bis die Entacylierung im wesentlichen vollständig ist. Das entsprechende, dabei erhaltene A-21978C-Cyclopeptid wird von der Fermentationsbrühe durch auf dem Fachgebiet bekannte Methoden abgetrennt.

Die Cyclopeptide, die durch diese enzymatischen Entacylierungen erhalten werden, sind in Formel 3 dargestellt. 4

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HC)2(/ (3) worin R’ und R° unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeuten, und umfassen auch die Salze davon.

Die Entfernung des Acylrestes vom A-2l978C-Komplex oder einzelnen A-21978C-Faktoren Co, Ci, C2, C3, C* und Cs liefert die Verbindung der Formel 3, worin R° und R' je Wasserstoff bedeuten. Das entacylierte Molekül ist das gemeinsame Cyclopeptid, das in jedem der Antibiotikum A-21978C-Faktoren vorhanden ist. Aus Zwechmäßigkeitsgründen wird diese Verbindung als A-21978C-Kern bezeichnet. Diese Verbindung kann auch durch die Formel 4 repräsentiert werden: 5

AT 402 299 B L-Asp / \· D-Ala Gl y i f D—Ser L-Asp 4 t 3MG L—Orn \ L-Kyn Gly / 0 \ L-Thr t L-Asp t L-Asn t L-Trp

I NH2 W , worin 3MG die L-threo-3-Methylglutaminsäure darstellt.

Die Verbindungen der Formel 3, worin R° oder R’ von Wasserstoff verschieden sind, werden durch Entacylierung der aminogeschützten Antibiotikum A-21978C-Faktoren Co, Ci, C2, C3, C* und Cs hergestellt. Aus Zweckmäßigkeitsgründen werden im Rahmen der Erfindung diese Verbindungen A-21978C-Kerne genannt. Diese aminogeschützten Verbindungen sind nützliche Zwischenprodukte für bestimmte Peptide der Formel 1, d.h. solche Verbindungen, worin R1 eine Aminoschutzgruppe ist.

Wie für den Sachverständigen ersichtlich, können A-21978C-Kern und aminogeschützte A-*21978C-Kerne entweder in der Form der freien Amine oder der Säureadditionssalze erhalten werden. Obgleich beliebige geeignete Säureadditionssalze verwendet werden können, werden solche, die pharmazeutisch annehmbar sind, bevorzugt. "Pharmazeutisch annehmbare" Salze sind Salze, die für die Chemotherapie warmblütiger Tiere brauchbar sind.

Das Verfahren zur Herstellung des A-21978C-Kernes der Formel 3 unter Verwendung verschiedener Mikroorganismen ist vollständig in der US-PS 4,482.487 beschrieben. Das bevorzugte Entacylierungsenzym A. utahensis NRRL 12052 ist der Öffentlichkeit aus der Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, US-Department of Agriculture, 1815 North University St., Peoria, Illinois 61604, USA, unter der Sammlungsnummer NRRL 12052 zugänglich. Die Vorschrift 1 veranschaulicht hier die Herstellung des A-21978C-Kernes durch Fermentation unter Verwendung des A-21978C-Komplexes als Substrat und Actinopianes utahensis NRRL 12052 als Mikroorganismus.

Andere Actinoplanaceae-Kulturen, die zur Herstellung der A-21978C-Kerne der Formel 3 verwendet werden können, sind der Öffentlichkeit vom Northern Regional Research Laboratory unter den folgenden Sammlungsnummern zugänglich:

Actinopianes missouriensis NRRL 12053 Actinopianes sp. NRRL 8122 Actinopianes sp. NRRL 12065 Streptosporangium roseum var. hollandensis NRRL 12064

Die Wirksamkeit irgendeines gegebenen Stammes des Mikroorganismus innerhalb der Familie Actino-planaceae zur Ausführung der Entacylierung wird durch folgende Vorgangsweise bestimmt. Ein geeignetes Nährmedium wird mit dem Mikroorganismus beimpft. Die Kultur wird bei etwa 28° C zwei bis drei Tage auf 6

AT 402 299 B einer Rotationsschüttelmaschine bebrütet. Eines der Substratantibiotika wird dann der Kultur zugesetzt, wobei der pH des Fermentationsmediums bei etwa 6,5 gehalten wird. Die Kultur wird hinsichtlich ihrer Aktivität unter Anwendung eines Micrococcus luteus-Tests überwacht. Der Verlust an antibiotischer Aktivität ist ein Anzeichen dafür, daß der Mikroorganismus das für die Entacylierung erforderliche Enzym produziert, s Dies muß jedoch unter Anwendung einer der folgenden Methoden verifiziert werden: 1) Analyse mittels HPLC hinsichtlich Vorliegen des intakten Kernes; oder 2) Reacylierung unter Verwendung einer entsprechenden Seitenkette (z.B. Lauroyl, n-Decanoyl oder n-Dodecanoyl), um die Aktivität wieder herzustellen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung neuer Verbindungen, die durch Acylierung eines A-21978C-Kernes (Verbindung der Formel 3), eines A-21978C-Faktors oder eines aminogeschützten 70 A-21978C-Faktors hergestellt werden, und welche die in Formel 1 dargestellte chemische Struktur aufweisen:

worin R, R' und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes C2-Ci9-Alkanoyl, Cs-Ci9-Alkenoyl oder eine Aminoschutzgruppe sind mit der Maßgabe, daß 1) wenigstens einer der Reste R, R' oder R2 von Wasserstoff oder einer Aminoschutzgruppe verschieden sein muß, 2) wenigstens einer der 45 Reste R1 oder R2 Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe sein muß, 3) die R-, R1- und R2-Gruppen zusammengenommen wenigstens vier Kohlenstoffatome enthalten müssen, und 4) falls sowohl R1 als auch R2 Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, R nicht 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, die Ci ο-Alkanoylgruppe des A-21978C-Faktors Co oder die Ci 2-AlkanoyIgruppen der A-21978C-Faktoren C< und Cs sein kann, oder die Salze davon sind, so Die Ausdrücke "gegebenenfalls substituiertes C2-C19-AlkanoyΓ und "Cs-Ci 9-AlkenoyΓ beziehen sich auf Acylgruppen, die von 2 bis 19 bzw. 5 bis 19 Kohlenstoffatome enthaltenden Carbonsäuren abgeleitet sind. Falls die R-Gruppe Alkanoyl ist, ist der Alkylabschnitt ein einwertiger, gesättigter, geradkettiger oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest, der gegebenenfalls eine Hydroxy-, Carboxyl- oder Ci -C3-Alkoxygrup-pe oder einen bis drei aus Chlor, Brom und Fluor ausgewählte Halogensubstituenten tragen kann. Falls R 55 · Alkenoyl ist, ist der Alkenylabschnitt ein einwertiger, ungesättigter, geradkettiger oder verzweigtkettiger Kohlenwasserstoffrest, der nicht mehr als drei Doppelbindungen enthält. Der Doppelbindungsabschnitt bzw. die Doppelbindungsabschnitte der ungesättigten Kohlenwasserstoffkette können entweder in der cis- oder in der trans-Konfiguration vorliegen. 7

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Der Ausdruck "Aminoschutzgruppe" bezieht sich auf eine anerkannte Aminoschutzgruppe, die mit den anderen funktionellen Gruppen in dem A-21978C-Molekül verträglich ist. Vorzugsweise sind Aminoschutz-gruppen solche, die von der in der Folge acylierten Verbindung leicht entfernt werden können. Beispiele geeigneter Schutzgruppen finden sich in "Protective Groups in Organic Synthesis" von Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, New York, 1981, Kapitel 7. Besonders bevorzugte Aminoschutzgruppen sind die tert.Butoxycarbonyl- und Benzyloxycarbonylgruppen.

Im spezielleren sieht die vorliegende Erfindung die Herstellung folgender bevorzugter Verbindungen der Formel (1) vor: (a) Die Verbindungen, in welchen R Alkanoyl der Formel

C • i CH*(CHP).,-C- y C. Λ* ist und n eine ganze Zahl von 3 bis 17 bedeutet; (b) Die Verbindungen, in welchen R Alkanoyl der Formel 0

CHj(CE 2'n II-Ο ι st und n 5 bis 14 bedeutet; (c) Die Verbindungen, in welchen R Alkanoyl der Formel CH, 0 CHj(CH2)nCH(CH2)B-C- ist und n und m jeweils unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 0 bis 14 mit der Maßgabe bedeuten, daß n + m nicht kleiner als 1 und nicht größer als 15 sein darf; und mit der weiteren Maßgabe, daß, falls n 0 ist, m nicht 8 sein kann, und falls n 1 ist, m nicht 6 oder 8 sein kann; (d) Die Verbindungen, in welchen R cis- oder trans-Alkenoyl der Formel 0 CH5(CH2)nCH=CH(CH2)m-C- ist und n und m jeweils unabhängig voneinander eine ganze Zahl von 0 bis 14 bedeuten, mit der Maßgabe, daß n + m nicht kleiner als 1 und nicht größer als 15 sein darf; (e) Die Verbindungen, in welchen R cis- oder trans-Alkenoyl der Formel 0 CE2=CH(CH2)n-S- ist und n eine ganze Zahl von 4 bis 15 bedeutet; und

(f) Die Verbindungen, in welchen R 8 5 10 15 20 25 30 35

AT 402 299 B CHjiCHg^-C-0 ch3(ch2)6-c-0CH3(CH2)7-ä-oCH3(CH2>8-S- CH3 (ch2)g-c-

Cli^ tCK2' io""C~ ch2=ch-<ch2)g-c-o CK3(CH2)11-C-o CH3(CH2)12-C- CH3-(CK2)3-CH=CH-(CK2)?-C- CH3(CH2>13-C~ CH3CH2CH(CH.)-(CH2)g-C· 40 ist.

Die Verbindungen der Formel 1 sind zur Bildung von Salzen, deren Herstellung ebenfalls ein Teil dieser Erfindung ist, befähigt. Solche Salze sind beispielsweise zur Abtrennung und Reinigung der Verbindungen 45 nützlich. Pharmazeutisch annehmbare Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Amin- und Säureadditionssalze sind besonders brauchbar.

Die Verbindungen der Formel 1 haben zum Beispiel vier freie Carboxylgruppen, die Salze bilden können. Partial-, Misch- und vollständige Salze dieser Carboxylgruppen sind daher als Teil dieser Erfindung mit umfaßt. Bei der Herstellung dieser Salze sollen pH-Werte von mehr als 10 wegen der Instabilität der so Verbindungen bei solchen Werten vermieden werden.

Repräsentative und geeignete Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze der Verbindungen der Formel 1 umfassen die Natrium-, Kalium-, Lithium-, Cäsium-, Rubidium-, Barium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Geeignete Aminsalze der Verbindungen der Formel 1 umfassen die Ammonium- und die primären, sekundären und tertiären Ci-C*-Alkylammonium- und Hydroxy-C2-C*-alkylammoniumsalze. Veranschauli-55 chende Aminsalze umfassen solche, die durch Umsetzung einer Verbindung der Formel 1 mit Ammoniumhydroxid, Methylamin, sek.Butylamin, Isopropylamin, Diethylamin, Diisopropylamin, Cyclohexylamin, Ethanolamin, Triethylamin oder 3-Amino-1-propanol gebildet werden. 9

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Die kationischen Alkalimetall- und Erdalkalimetallsaize der Verbindungen der Formel 1 werden nach Verfahrensweisen hergestellt, die üblicherweise für die Herstellung der kationischen Salze angewendet werden. Beispielsweise wird die freie Säureform einer Verbindung der Formel 1 in einem geeigneten Lösungsmittel, wie warmen Methanol oder Ethanol, gelöst; eine Lösung, die die stöchiometrische Menge der gewünschten anorganischen Base in wässerigem Methanol enthält, wird dann zugegeben. Das so gebildete Salz kann durch Routinemethoden, wie Filtration oder Abdampfen des Lösungsmittels, isoliert werden. Eine geeignete Methode der Salzherstellung ist die Verwendung von lonenaustauscherharzen.

Die Salze, die mit organischen Aminen gebildet werden, können in einer ähnlichen Weise hergestellt werden. Zum Beispiel kann das gasförmige oder flüssige Amin zu einer Lösung einer Verbindung der Formel 1 in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Ethanol, zugegeben werden; das Lösungsmittel und überschüssiges Amin können durch Eindampfen entfernt werden.

Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen haben auch freie Aminogruppen und können daher Säureadditionssalze bilden deren Herstellung, gleichfalls Teil dieser Erfindung ist. Repräsentative und geeignete Säureadditionssalze der Verbindungen der Formel 1 umfassen solche Salze, die durch Standardumsetzung sowohl mit organischen als auch anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Chlorwasserstoffsäu-re, Schwefelsäure,Phosphorsäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Palmitinsäure, Cholinsäure, Embonsäure, Mucinsäure, D-Qiutaminsäure, d-Camphersäure, Glutarsäure, Glycolsäure, Phthalsäure, Weinsäure, Laurinsäure, Stearinsäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Sorbinsäure, Picrinsäure, Benzoesäure oder Zimtsäure gebildet werden.

Die Verbindungen der Formel (1), worin R, R1 oder R2 Alkanoyl, Alkenoyl oder eine Aminoschutzgruppe sind, werden durch Acylierung eines A-21978C-Faktors, eines aminogeschützten A-21978C-Faktors oder einer Verbindung der Formel (3) oder einer entsprechenden Verbindung der Formel (3), die an der Aminogruppe des Tryptophans durch die gewünschte Alkanoyl- oder Alkenoylseitenkette geschützt ist, unter Anwendung von auf dem Fachgebiet zur Bildung einer Amidbindung üblichen Methoden hergestellt. Die Acylierung wird im allgemeinen durch Umsetzung der ausgewählten Verbindung mit einem aktivierten Derivat der Alkansäure oder Alkensäure, die der gewünschten Acylseitenkettengruppe (R, R1 oder R2) entspricht, bewirkt. Der Ausdruck "aktiviertes Derivat” bedeutet ein Derivat, das die Carboxylfunktion des Acylierungsmittels zur Kupplung mit der primären Aminogruppe unter Bildung der Amidbindung, welche die Acylseitenkette an den Kern bindet, reaktionsfähig macht. Geeignete aktivierte Derivate, deren Herstellungsmethoden und deren Anwendungsmethoden als Acylierungsmittel für ein primäres Amin sind dem Sachverständigen bekannt. Bevorzugte aktivierte Derivate sind: (a) ein Säurehalogenid {z.B. ein Säurechlorid), (b) ein Säureanhydrid (z.B. ein Alkoxyameisensäureanhydrid) oder (c) ein aktivierter Ester (z.B. ein 2,4,5-Trichlorphenylester). Andere Methoden zur Aktivierung der Carboxylfunktion umfassen die Umsetzung der Carbonsäure mit einem Carbonyldiimid (z.B. N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder N,N’-Diisopropylcarbodii-mid) unter Bildung eines reaktiven Zwischenproduktes, welches aus Gründen der Instabilität nicht isoliert wird. Eine solche Umsetzung mit dem primären Amin wird in situ ausgeführt. Für den Sachverständigen ist ersichtlich, daß die Verbindungen der Formel 1 unter Anwendung selektiver Acylierungsverfahrensweisen unter Zuhilfenahme von Aminoschutzgruppen hergestellt werden. Wenn zum Beispiel eine Verbindung der Formel 3, worin R’ und R° Wasserstoff sind, das Ausgangsmaterial ist, kann die Acylierung sowohl an der α-Aminogruppe des Tryptophans als auch der 5-Aminogruppe des Ornithins erfolgen, wobei Ντφ, N0m-Diacylderivate erhalten werden. Zur Gewinnung von Derivaten, die an der α-Aminogruppe des Tryptophans monoacyliert sind, wird es daher bevorzugt, eine Verbindung der Formel 3 zu acylieren, in welcher die 5-Aminogruppe des Ornithins (die R°-Steilung) durch eine Aminoschutzgruppe geschützt ist. Solche Ausgangsmaterialien werden vorzugsweise durch Schützen des A-21978C-Faktors an dieser Stellung, bevor er entacyliert wird, erhalten. Die aromatische Aminogruppe des Kynurenins ist die wenigst reaktive der drei freien Aminogruppen in dem A-21978C-Kern. Die Acylierung beim Kynurenin umfaßt eine entsprechende Blockierung der Aminogruppen des Tryptophans und Ornithins, aber die Acylierung in R oder R1 berührt somit üblicherweise das Schützen der Kynureninaminogruppe nicht.

Die Schemata I, II und III geben allgemeine Verfahrensweisen für die Herstellung der Verbindungen der Formel 1 an, worin einer der Reste R, R1 oder R2 Alkanoyl, Alkenoyl oder eine Aminoschutzgruppe ist. In diesen Schemata werden die folgenden Symbole verwendet:

[*] = Rest von A-21978C NT = α-Aminogruppe des Tryptophans N0 = 5-Aminogruppe des Ornithins NK = aromatische Aminogruppe des Kynurenins R, R\ R2 = Substituenten wie definiert

Rn = Acylgruppe des natürlichen Faktors 10 T5 20 25 30 35 40

4S 50

AT 402 299 B B = Aminoschutzgruppe Acyl = eine Acylierungsstufe Oeacyl = eins Entacylierungsstufe Block = Acylierung mit einer Aminoschutzgruppe Deblock = Entfernung einer Aminoschutzgruppe

In Schema I werden die NTrp-Monoacylderivate des A-21978C durch die allgemeine Formel 3 veranschaulicht, und die NTrp, N0,n-Diacylderivate des A-21978C werden durch die allgemeine Formel 4 veranschaulicht. Jene NTrp, N0rn.Diacylderivate, in welchen die NTrp-Acylgruppe eine solche eines natürlichen A-21978C-Faktors ist, werden durch die allgemeine Formel 8 veranschaulicht. 11 55 I Ö Φ +> Φ > •Η *4 Φ η ιο 00 θ' V“ CVJ <ί I <—Iο (0

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φ U η Cj φ ΑΤ 402 299 Β ΧΛ £Τ Ο « “ Χ* ! χΛκ 2L ^rt κ \ > υ < ο <IV / Γ «ί C ω α ο. σ' 3 C <4 3 σ -υ Ν rH U CD 3 α £ « ο ο in cc CQ “Ο α: 2 « xi- |\ ι κ κ \ κ \ υ < > υ < α _ο» Ο Μ ττ 00α ο « * <Ν ! <! κ2 2- vol κ \ κ \ α ζ χ α. ι β: χ ο χ^ I— 2 2 ΐ \ ι κ

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In Schema II werden die Νγφ, NKyn*Diacylderivate des A-21978C durch die allgemeine Formel 10 repräsentiert. Solche NTrp, NKyn-Diacylderivate, in welchen die NTrp-Acylgruppe jene eines natürlichen A-21978C-Faktors ist, werden durch die allgemeine Formel 12 veranschaulicht. Die Verbindungen, die die allgemeinen Formeln 5, 6 und 7 haben, sind auch in Schema I beschrieben. 12

5 AT 402 299 B 5 T\ < I s 10

( 4«^ <=^ 0) α α 3 (4 σ> N 15 20

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In Schema III werden die No,„-Monoacylderivate des A-21978C durch die allgemeine Formel 18 55 veranschaulicht, die NKyn-Monoacylderivate des A-21978C durch die allgemeine Formel 15 und die N0rn. NKyn-Diacylderivate des A-21978C durch die allgemeine Formel 20. Die Verbindungen der allgemeinen Formel 6 sind auch in den Schemata I und II beschrieben. 13

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Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel 1, worin einer der Reste R, R1 oder R2 Alkanoyl oder Alkenoyl ist, ist die Aktivestermethode. Die Verbindung der Formel 3, worin R' = H und R° = t-BOC, d.h. der A-21978C N0rr-t-BOC-Kern, sind, ist ein besonders bevorzugtes Ausgangsmaterial bei der Herstellung der Verbindungen der Formel 1_. Der 2,4,5-Trichlorphenylester der gewünschten Alkan- oder Alkensäure ist ein bevorzugtes Acylierungsmittel. Bei diesem Verfahren wird eine überschüssi- 14

AT 402 299 B ge Menge des Aktivesters mit dem t-BOC-Kern bei Zimmertemperatur in einem nicht-reaktionsfähigen organischen Lösungsmittel, wie DMF, THF, Diethylether oder Dichlormethan, umgesetzt. Die Reaktionszeit ist nicht kritisch, obgleich eine Zeit von 6 bis 20 Stunden bevorzugt wird. Nach Beendigung der Umsetzung wird das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand wird gereinigt. Eine besonders vorteilhafte Reinigungs-5 methode ist die Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von LP-1/Cie als stationäre Phase und einem Gemisch aus H2 0/CH30H/CH3CN/Pyridin/H0Ac als Lösungsmitteisystem. Die t-BOC-Gruppe wird durch Behandlung mit Trifluoressigsäure/Anisol/Triethylsilan oder vorzugsweise Trifluoressigsäure/1,2-Ethandithiol während 3 bis 5 Minuten bei Zimmertemperatur entfernt. Nachdem das Lösungsmittel entfernt ist, wird der Rückstand durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt. io Eine alternative Acylierungsmethode ist eine modifizierte Schotten-Baumann-Behandlung, bei der der ungeschützte Kern mit dem Säurechlorid der gewünschten Alkansäure oder Alkensäure in einem Pyri-din/Wasser-Gemisch behandelt wird. Bei dieser Verfahrensweise wird ein Überschuß des Säurechlorids in einem nicht-reaktionsfähigen organischen Lösungsmittel (wie Aceton) langsam zu einer Lösung des Kerns in 90 Vol-% Pyridin/10 Vol-/% Wasser zugesetzt. Das nicht umgesetzte Säurechlorid wird aus dem 15 Reaktionsprodukt durch Extraktion in ein unmischbares organisches Lösungsmittel (z.B. Diethylether) abgetrennt. Die Endreinigung erfolgt durch Umkehrphasen-HPLC, wie vorher beschrieben.

Die als Ausgangsmaterialien für die Acylierungsreaktion verwendeten Alkan- und Alkensäuren und die aktivierten Derivate davon (insbesondere die Säurechloride und die 2,4,5-Trichlorphenylester) sind bekannte Verbindungen oder können aus bekannten Verbindungen nach bekannten Methoden hergestellt werden. Die 20 2,4,5-Trichlorphenylester werden zweckmäßigerweise durch Behandlung des Säurechlorids der Alkan- oder Alkensäure mit 2,4,5-Trichlorphenol in Gegenwart von Pyridin oder durch Behandlung der freien Alkan- oder Alkensäure mit 2,4,5-Trichlorphenol in Gegenwart von Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid als Kupplungsmittel hergestellt. Das 2,4,5-Trichlorphenylesterderivat kann durch Säulenchromatographie über Silicagel gereinigt werden. 25 Wird ein erfindungsgemäß hergestelltes A-21978C-Cyclopeptid als ein antibakterielles Mittel verwendet, so kann es entweder oral oder parenteral verabreicht werden. Wie für den Sachverständigen ersichtlich, wird die A-21978C-Verbindung üblicherweise gemeinsam mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht.

Die Dosierung der A-21978C-Verbindung wird von verschiedenen Überlegungen abhängen, wie z.B. der 30 speziellen zu verwendenden Verbindung und die Art und die Schwere der besonderen zu behandelnden Infektion. Der Sachverständige wird erkennen, daß entsprechende Dosierungsbereiche oder Dosierungseinheiten für die Verabreichung unter Berücksichtigung der verfügbaren MIC- und EDso-Werte und Toxizitätsdaten zusammen mit Faktoren, wie pharmakokinetischen Wirkungen, Kennmerkmale des Patienten oder des Wirtes und des infizierenden Mikroorganismus bestimmt werden können. · 35 Zur näheren Veranschaulichung der Erfindung werden die folgenden nicht einschränkenden Beispiele gegeben.

Vorschrift 1 40 Herstellung des A-21978C-Kerns A. Fermentation von Actinoplanes utahensis

Es wird eine Vorratskultur von Actinoplanes utahensis NRRL 12052 zubereitet und auf einem Schräga-45 gar belassen. Das zur Herstellung des Schrägagars verwendete Medium wird aus einem der folgenden gewählt: 50 15 55

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Medium A

Menge 60.0 g 2,5 g Ί »0 S 5,0 ml 25.0 g Rest auf 1 1

Bestandteil

Vorgekochtes Hafermehl Ηβί e V ΤΓ'^'

Czapek*s Kineralvorrat^

Agar

Entionisiertes Wasser

Der pH beträgt vor dem Autoklavieren etwa 5,9; man stellt ihn unter Zugabe von NaOH auf pH 7,2 ein; nach dem Autoklavieren beträgt der pH etwa 6,7* & Czapek*s Mineralvorrat hat folgende Zusammensetzung: Bestandteil Menge

FeSO^^^O (gelöst in 2 ml konz.HCl) 2 g KCl 100 g

MgS04.7H20 100 g

Entionisiertes Wasser Rest auf 1 1

Medium B Bestandteil Menge Kartoffeldextrin 5,0 g Hefeextrakt 0,5 g Enzymatisches Caseinhydrolysaf 3,0 g Rindfleischextrakt 0,5 g Glucose 12,5 g Maisstärke 5,0 g Fleischpepton 5,0 g Portweinmelassen 2,5 g MgS0*.7H2O 0,25 g CaCOe 1,0 g Czapek's Mineralvorrat 2,0 ml Agar 20,0 g Entionisiertes Wasser Rest auf 1 I * N-Z-Amin A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ.

Der Schrägagar wird mit Actinoplanes utahensis NRRL 12052 beimpft und der beimpfte Schrägagar wird bei 30° C etwa 8 bis 10 Tage bebrütet. Etwa die Hälfte des Wuchses am Schrägagar wird verwendet, um 50 ml eines Vegetationsmediums der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen: 16

AT 402 299 B

Bestandteil Menge Vorgekochtes Hafermehl 20,0 g Saccharose 20,0 g Hefe 2,5 g Distiller's Dried Grain" 5,0 g K2HPOt 1,0 g Czapek's Mineralvorrat 5,0 ml Entionisiertes Wasser Rest auf 1 I Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,4 eingestellt; nach dem Autoklavieren beträgt der pH etwa 6,8. "National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, NY.

Das beimpfte vegetative Medium wird in einem 250 ml Weithals-Erlenmeyerkolben bei 30° C etwa 72 Stunden auf einer Schüttelmaschine, die über einen Bogen von etwa 5 cm (2 Zoll) Durchmesser bei 250 UpM rotiert, bebrütet.

Dieses bebrütete vegetative Medium kann unmittelbar verwendet werden, um ein vegetatives Medium der zweiten Stufe zu beimpfen. Alternativ und bevorzugterweise kann es zur späteren Verwendung gelagert werden, indem die Kultur in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff belassen wird. Die Kultur wird für eine solche Lagerung in kleinen Mehrfachfläschchen wie folgt zubereitet: In jedes Fläschchen werden 2 ml des bebrüteten vegetativen Mediums und 2 ml einer Glycerin-Lactose-Losung [bezüglich Einzelheiten siehe W.A. Dailey und C.E. Higgens, "Preservation and Storage of Microorganisms in the Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10, 364-367 (1973)] eingebracht Die hergestellten Suspensionen werden in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff gelagert.

Eine so hergestellte gelagerte Suspension (1 ml) wird zur Beimpfung von 50 ml eines vegetativen Mediums der ersten Stufe (mit der oben beschriebenen Zusammensetzung) verwendet. Das beimpfte vegetative Medium der ersten Stufe wird wie oben beschrieben bebrütet.

Um ein größeres Volumen von Impfmaterial zu schaffen, werden 10 ml des bebrüteten vegetativen Mediums der ersten Stufe zur Beimpfung von 400 ml eines vegetativen Mediums der zweiten Stufe verwendet, das dieselbe Zusammensetzung hat wie das vegetative Medium der ersten Stufe. Das Medium der zweiten Stufe wird in einem 2 I Weithals-Erlenmeyerkolben bei 30° C während etwa 48 Stunden auf einer Schütteleinrichtung bebrütet, die über einen Bogen mit etwa 5 cm Durchmesser bei 250 UpM rotiert.

Bebrütetes vegetatives Medium der zweiten Stufe (80 ml), das wie oben beschrieben hergestellt worden ist, wird zur Beimpfung von 10 I sterilem Produktionsmedium verwendet, das aus einem der folgenden gewählt ist:

MEDIUM 1 Bestandteil Menge (g/l) Erdnußmehl 10,0 Lösliches Fleischpepton 5,0 Saccharose 20,0 KH2PO* 0,5 I^HPO* 1,2 MgS0*.7H20 0,25 Leitungswasser Rest auf 1 I

Der pH des Mediums beträgt nach Sterilisierung unter Autoklavieren bei 121° C während 45 Minuten bei etwa 110-124 kPa etwa 6,9. 17 55

AT 402 299 B

MEDIUM II Bestandteil Menge (g/l) Saccharose 30,0 Pepton 5,0 K2HPO4 1,0 KCl 0,5 MgS0*.7H20 0,5 FeSO*.7H20 0,002 Entionisiertes Wasser Rest auf 1 I

Man stellt den pH-Wert mit HCl auf 7,0 ein; nach dem Autoklavieren beträgt der pH etwa 7,0.

MEDIUM III Bestandteil Menge (g/l) Glucose 20,0 NH* CI 3,0 Na2 SO« 2,0 ZnCI2 0,019 MgCI2.6H20 0,304 FeCb .6H20 0,062 MnCI2.4H20 0,035 CuCI2.2H20 0,005 CaCOa 6,0 KH2PO** 0,67 Leitungswasser Rest auf 1 I * Gesondert sterilisiert und aseptisch zugegeben. End-pH etwa 6,6.

Das beimpfte Produktionsmedium wird in einem 14 I-Fermentationskessel bei einer Temperatur von etwa 30° C etwa 66 Stunden fermentiert. Das Fermentationsmedium wird mit üblichen Rührern bei etwa 600 UpM gerührt und mit steriler Luft belüftet, um den Spiegel an gelöstem Sauerstoff oberhalb 30 % der Luftsättigung bei Atmosphärendruck zu halten.

B. Entacylierung von A-21978C

Eine Fermentation von A. utahensis wird wie in Abschnitt A beschrieben ausgeführt, wobei Schrägagarmedium A und Produktionsmedium I verwendet werden und die Bebrütung des Produktionsmediums etwa 67 Stunden durchgeführt wird. Roher A-21978C-Komplex (100 g), der wie in der US-PS 4,208.403 beschrieben hergestellt worden ist, wird dem Fermentationsmedium zugegeben.

Die Entacylierung des A-21978C-Komplexes wird mittels Test gegen Micrococcus luteus überwacht. Die Fermentation läßt man fortschreiten, bis die Entacylierung vollständig ist, was sich durch Verschwinden der Aktivität gegen M. luteus zeigt und einen Zeitraum von etwa 24 Stunden in Anspruch nimmt. C. Isolierung des A-21978C-Kerns

Die gesamte Fermentationsbrühe (20 I), die wie in Abschnitt B beschrieben erhalten worden ist, wurde mit einem Filtrierhilfsmittel (Diatomeenerde, Johns Manville Corp.) filtriert. Der mycelhaltige Kuchen wurde verworfen. Das so erhaltene Filtrat wurde durch eine Säule geführt, welche 1,5 I Copolymer-Harz aus Styrol und Divinylbenzol in (Form von Kügelchen, unpolar, HP-20, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan) enthält. Das so erhaltene ausfließende Material wurde verworfen. Die Säule wurde dann mit entionisiertem Wasser (10 I) gewaschen, um restliche filtrierte Brühe zu entfernen. Dieses Waschwasser wurde verworfen. Die Säule wurde dann mit Wasser : Acetonitrilgemischen (jeweils 10 I 95 : 5, 9 : 1 und 4 : 1) eluiert, wobei 1 I-Fraktionen gesammelt wurden. 18

AT 402 299 B

Die Eluierung wurde durch Papierchromatographie überwacht, wobei ein n-Butanol : Pyridin : Essigsäure : Wasser (15:10:3: 12)-Lösungsmittelsystem verwendet wurde und die Feststellung der Verbindungen durch UV-Fluoreszenz erfolgte. In diesem System haben die A-21978C-Faktoren einen Rf-Wert von etwa 0,56 und der A-21978C-Kern hat einen Rf-Wert von etwa 0,32. Das Produkt kann auch durch analytische 5 HPLC unter Verwendung von Silicagel/Ci 8 und einem Lösungsmittelsystem aus Wasser : Methanol (3:1), enthaltend 0,1 % Ammoniumacetat, unter Feststellung des Kerns mit einen UV-Monitor bei 254 nm geprüft werden.

Fraktionen, die den Kern enthalten, wurden vereinigt, im Vakuum eingeengt, um das Acetonitril zu entfernen, und gefriergetrocknet, wobei 40,6 g halbgereinigter A-21978C-Kern erhalten wurden. 10 D. Reinigung des A-21978C-Kerns

Halbgereinigter A-21978C-Kern (15 g), erhalten wie in Abschnitt C beschrieben, wurde in 75 ml eines Gemisches aus Wasser : Methanol : Acetonitril (82 : 10 : 8), das 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin 75 enthielt, gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Säule mit den Abmessungen 4,7 x 192 cm gepumpt, die 3,33 I Silicagel/Cis (Quantum LP-1, Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield, N.J. 07006) enthielt. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittelsystem entwickelt. Es wurden Fraktionen gesammelt, die ein Volumen von 350 ml haben. Die Separation wurde mit einem UV-Monitor bei 280 nm überwacht. Fraktionen, welche den Kern enthielten, wurden vereinigt, unter Vakuum eingeengt, um Lösungsmittel zu 20 entfernen, und gefriergetrocknet, wobei 5,2 g gereinigter A-21978C-Kern erhalten wurden. E. Kennmerkmale des A-21978C-Kerns A-21978C-Kern hat die folgenden Kennmerkmale: 25 a) Form: Weißer amorpher Feststoff, der unter kurzwelligem UV fluoresziert; b) Empirische Formel: C62H83N17O25 c) Molekulargewicht: 1465 d) Löslichkeit: in Wasser löslich e) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) zeigt Absorptionsmaxima bei: 3300 (breit), 3042 (schwach), 2909 30 (schwach), 1655 (stark), 1530 (stark), 1451 (schwach), 1399 (mittel), 1222 (mittel), 1165 (schwach), 1063 (schwach) und 758 (mittel bis schwach) cm'1. f) Das UV-Absorptionsspektrum in Methanol zeigt Maxima bei 223 nm (f 41,482) und 260 nm (« 8,687). g) Die elektrometrische Titration in 66 %igem wässerigem Dimethylformamid zeigt das Vorliegen von vier titrierbaren Gruppen mit pKa-Werten von etwa 5,2, 6,7, 8,5 und 11,1 (Anfangs-pH 6,12). 3 5

Vorschrift 2:

Alternative Herstellung des A-21978C-Kerns 40 A-21978C-Kern wurde nach der in Vorschrift 1 angegebenen Methode mit gerissen Änderungen in

Abschnitt B hergestellt. Die A. utahensis-Kultur wurde anfangs etwa 48 Stunden bebrütet; das Substrat war halbgereinigter A-21978C-Komplex (50 g) und die Bebrütung nach Zugabe des Substrates erfolgte während etwa 16 Stunden. Das Kulturfiltrat wurde über eine Säule geführt, die 3,1 I HP-20-Harz enthielt. Die Säule wurde mit 10 Vol-Teilen Wasser gewaschen und dann mit Wasser: Acetonitril (95 : 5) eluiert. Die Eluierung 45 wurde wie in Vorschrift 1 abgegeben überwacht. Nach Sammlung von 24 I wurde das Eluierungslösungsmittel gegen Wasser : Acetonitril (9:1) ausgetauscht. Fraktionen, die den Kern enthielten, wurden mit diesem Lösungsmittel eluiert. Diese Fraktionen wurden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung von Acetonitril eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 24,3 g halbgereinigter A-21978C-Kern erhalten wurden. Dieser halbgereinigte A-21978C-Kern (24,3 g) wurde in Wasser (400 ml) gelöst. Die Lösung wurde auf so eine 4,7 x 192 cm-Stahlsäule gepumpt, die 3,33 I Silicagel (Quantum LP-1 /Ci s), hergestellt in Wasser : Methanol : Acetonitril (8:1 : 1), enthaltend 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin, enthielt. Die Säule wurde mit dem gleichen Lösungsmittel bei einem Druck von etwa 137 kPa (2000 psi) entwickelt, wobei 350 ml Fraktionen gesammelt wurden. Die Eluierung wurde mittels UV bei 280 nm überwacht. Fraktionen, die den Kern enthielten, wurden vereinigt, im Vakuum zur Entfernung der Lösungsmittel eingeengt und gefrierge-55 trocknet,wobei 14 g hochgereinigter A-21978C-Kern erhalten wurden. 19

AT 402 299 B

Vorschrift 3:

Herstellung der No,n-t-BOC A-21978C-Faktoren C2 und C3

Ein Gemisch der A-2l978C-Faktoren C2 und C3 (10 g), hergestellt wie in der US-PS 4.208.403 beschrieben, wurde in Wasser (50 ml) unter Beschallen (200 mg/ml) gelöst. Der pH der Lösung wurde mit 5N NaOH (3,6 ml) von 4,05 auf 9,5 gebracht. Es wurde Di-tert.butyldicarbonat (3,0 ml) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde durch manuelle Zugabe von 5N NaOH (6,5 ml innerhalb von 2 Stunden zugesetzt) auf 9,5 gehalten.

Die Reaktion wurde periodisch mittels Dünnschichtchromatographie an Silicagel überwacht, wobei CH3CN : H2O (7 : 3 und 8 : 2)-Lösungsmittelsysteme verwendet wurden und die Feststellung mittels UV erfolgte.

Nach etwa 10 Minuten wurde die Reaktionslösung rasch trüb und der Verbrauch an Base stieg an. Nach 30 Minuten nahm die Zunahmegeschwindigkeit der Trübung und die Geschwindigkeit des Basenverbrauches ab, was anzeigte, daß die Reaktion beendet war. Trotzdem wurde die Reaktion weitere 90 Minuten fortgesetzt, um vollständige Umsetzung zu gewährleisten. An Ende der zweistündigen Umsetzung wurde das umgesetzte Material sofort lyophilisiert, wobei 12,7 g N0rn-t-BOC-A-21978C-Faktoren C2 und C3 erhalten wurden.

Unter Anwendung ähnlicher Verfahrensweisen wurden zwei 10 g-Reaktionen und eine 30 g-Reaktion durchgeführt. Bei jedem dieser Ansätze betrug die Reaktionszeit nur 40 Minuten. Die zwei 10 g-Versuche ergaben 11,9 g bzw. 12,1 g an Produkt. Die 30 g-Reaktion ergab 35,4 g Produkt.

Vorschrift 4:

Herstellung von A-21978C N0rn-t-BOC-Kern A. Fermentation von A. utahensis

Es wurde eine Fermentation von A. utahensis, wie in Vorschrift 1, Abschnitt A beschrieben, unter Verwendung von Schrägagarmedium A und Produktionsmedium I sowie Bebrüten des Produktionsmediums während etwa 66 Stunden ausgeführt. B. Entacylierung von N0m-t-BOC-Komplex

Der A-21978C N0m-t-BOC-Komplex (1185 g rohes Substrat, das etwa 176 g A-21978C-Komplex enthielt) wurde dem Fermentationsmedium zugegeben. Die Entacylierung wurde wie in Vorschrift 1, Abschnitt B, beschrieben ausgeführt. Die Entacylierung war, wie durch HPLC festgestellt wurde, nach etwa 24 Stunden beendet. C. Isolierung von A-21978C Nom-t-BOC-Kern

Fermentationsbrühe (100 I), erhalten wie in Abschnitt B beschrieben, wurde mit einem Filtrierhilfsmittel (Diatomeenerde) filtriert. Das Filtrat wurde über eine Säule geführt, die 7,5 I Copolymer-Harz (gemäß Vorschrift 1C.) enthielt; die Säule wurde mit Wasser (38 I) gewaschen. Die Eluierung wurde mittels Silicagel/Ci s HPLC unter Ermittlung mittels UV bei 254 nm überwacht. Etwas an Kern wurde in der Waschflüssigkeit eluiert. Die nachfolgende Eluierung des Kerns wurde mit Wasser : Acetonitril-Gemischen wie folgt ausgeführt: (95:5)-40 I; (9:1)-40 I und (85:15)-100 I. Die den Kern enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, im Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 298,5 g halbgereinigter A-21978C N0m-t-BOC-Kern erhalten wurden. D. Reinigung des A-21978C Nom't-BOC-Kerns

Halbgereinigter A-21978C Νο,η-t-BOC-Kern (30 g), erhalten wie in Abschnitt C beschrieben, wurde in Wasser : Acetonitril (9:1), enthaltend 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin (75 ml) gelöst. Diese Lösung wurde auf eine 4,7 x 192 cm-Stahlsäule aufgebracht, die 3,33 I Silicagel (Quantum LP-1 /Cis) enthielt, das in dem gleichen Lösungsmittelsystem ins Gleichgewicht gebracht wurde. Die Säule wurde unter Druck mit Wasser: Acetonitril: Methanol (80 :15 : 5), das 0,2 % Essigsäure und 0,8 % Pyridin enthielt, entwickelt, es wurden 350 ml-Fraktionen ges mmelt und die Feststellung des Produktes erfolgte mittels UV bei 280 nm. 20 ΑΤ 402 299 Β

Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden vereinigt, unter Vakuum zur Entfernung des Lösungsmittels eingeengt und gefriergetrocknet, wobei 18,4 g gereinigter A-21978C Νο,,,-t-BOC-Kem erhalten wurden. A-21978C N0rn-t-BOC-Kem hat die folgenden Kennmerkmale: a) Form: Weißer amorpher Feststoff, der unter kurzwelligem UV fluoresziert; b) Empirische Formel: C67H91N17O27 c) Molekulargewicht: 1565 d) Löslichkeit: Löslich in Wasser e) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) zeigt folgende Absorptionsmaxima: 3345 (breit), 3065 (schwach), 2975 (schwach), 2936 (schwach), -1710 (Schulter), 1660 (stark), 1530 (stark), 1452 (schwach), 1395 (mittel), 1368 (schwach), 1341 (schwach), 1250 (mittel), 1228 (mittel), 1166 (mittel bis schwach) und 1063 (schwach) cm-1. f) Das UV-Absorptionsspektrum in 90 %igem Ethanol zeigt Maxima bei: 220 nm (« 42,000) und 260 nm (« 10,600). g) HPLC-Retentionszeit = 6 Minuten an einer 4,6 x 300 mm-Silicagel/Ci s-Säule unter Verwendung von FhO/CHsCN/CFhOH (80 : 15 : 5)-Lösungsmittel, enthaltend 0,2 % NH*OAc, bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min und UV-Ermittlung.

Vorschrift 5:

Alternative Reinigung von A-21978C Nom-t-BOC-Kern

Halbgereinigter A-21978C N0rn-t-BOC-Kem (10,8 g), erhalten wie in Vorschrift 4, Abschnitt C beschrieben, wurde in Wasser gelöst und auf eine Säule aufgebracht, die 80 ml schwach basisches Polystyrol-Polyamin-Anionenaustauscherharz (Amberlite IRA-68; Rohm und Haas, Philadelphia, PA; Acetatcyclus) enthielt. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und bei einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min erfolgte die Eluierung aufeinanderfolgend mit 0.05N Essigsäure (1080 ml), 0,1 N Essigsäure (840 ml) und 0,2N Essigsäure (3120 ml), wobei 120 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Die Säule wurde mittels analytischer HPLC über Silicagel/Ci s unter Verwendung eines Systems aus Wasser: Acetonitril : Methanol (80 : 15 : 5), das 0,2 % Ammoniumacetat enthielt, überwacht, wobei die Feststellung des Produkts mittels UV bei 254 nm erfolgte. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, wurden vereinigt; der pH der Lösung wurde mit Pyridin auf 5,8 eingestellt. Die entstehende Lösung wurde unter Vakuum auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Dem Konzentrat wurde Wasser zugesetzt und die entstehende Lösung wurde erneut zur Entfernung von Pyridin eingeengt. Dieses Konzentrat wurde gefriergetrocknet und lieferte 3,46 g gereinigten A-21978C Nom-t-BOC-Kern.

Beispiele 1 · 26:

Die Herstellung verschiedener Alkanoyl- und Alkenoylderivate durch Acylierung der Verbindungen der Formel 3, welche repräsentativ für die Herstellung der Verbindungen der Formel 1 ist, ist in der folgenden Tabelle I dargestellt. Die in Tabelle I angegebenen Derivate werden entweder nach der modifizierten Schotten-Bauman-Reaktion unter Verwendung eines Säuarechlorids als Acylierungsmittel (Methode A) oder nach der Aktivestermethode unter Verwendung des 2,4,5-Trichlorphenylesters als Acylierungsmittel (Methode B) hergestellt. Die allgemeinen Verfahrensweisen für die Ausführung der Acylierungsreaktionen nach Methode A oder Methode B sind nachstehend angegeben:

Methode A (modifizierte Schotten-Bauman-Reaktion)

Diese Methode umfaßt die Umsetzung eines Kerns der Formel 3 mit dem Alkan- oder Alkensäurechlorid, das der gewünschten Acylseitenkette entspricht.

Eine Verbindung der Formel 3 (1,95 - 2,1 g, 1,33 - 1,47 mMol) oder eine Verbindung der Formel 2 (409 mg, 0,25 mMol) wird in 200 ml Pyridin/HiO (9:1) gelöst. Das Acylierungsmittel (18 - 20 mMol überschüssiges Acylchlorid, gelöst in 15 ml Aceton) wird tropfenweise innerhalb von 1 - 3 Stunden zugegeben und das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur weitere 2-3 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wird eingeengt, um das Aceton zu entfernen. Die verbleibende wässerige Phase wird auf ein Volumen von etwa 200 ml mit Wasser verdünnt. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit Eisessig auf pH 3,0 bis 3,5 eingestellt. Diese Lösung wird achtmal mit gleichen Volumina Diethylether gewaschen und wird dann lyophilisiert. 21

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Das rohe acylierte Derivat wird durch Umkehrphasen-HPLC wie folgt gereinigt: Die Probe, gelöst in Wasser oder des Eluierungssystem (etwa 4 - 6,5 ml), wird auf eine Edelstahlsäule mit den Abmessungen 838 mm x 15,9 mm gespritzt, die mit LPi/Cis-Kieselsäureträger gepackt ist. Die Säule wird mit einem Lösungsmittelsystem eluiert, das aus H20:Me0H:CH3CN:Pyridin:H0Ac besteht. Die Eluierung wird bei einem Druck von etwa 103 bis 137 bar bei einer Fließgeschwindigkeit von etwa 10-12 ml/min unter Verwendung einer LDC Duplexpumpe (Milton-Roy) ausgeführt. Das ausfließende Material wird mittels UV-Überprüfung überwacht, wobei ein ISCO-UA-5-Detektor bei 280 nm verwendet wird. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei das gewünschte AlkanoyIderi-vat erhalten wird. Das gereinigte Produkt wird mittels TLC unter Anwendung von Umkehrphasenplatten (Whatman KCis) und einem H2Ö:MeOH:CH3CN:Pyridin:HOAc (45:15:40:2:2)-Lösungsmittelsystem analysiert. Die Platten werden unter UV-Licht beobachtet, um das Produkt festzustellen. Die Produkte werden auch mittels UV analysiert (Extinktionskoeffizienten bei 220 nm und 260 nm) und durch Aminosäureanalyse. Die Reinheit wird mittels analytischer Umkehrphasen-HPLC (Ci s Microböndapak-Säule, Waters Co.) mit einem H20:Me0H:CH3CN:Pyridin:H0Ac-Lösungsmittelsystem bestimmt, wobei das ausfließende Material mittels UV bei 280 nm überwacht wird.

Methode B (2,4,5-Trichlorphenylaktivestermethode)

Eine Lösung von N0m-t-BOC-A-2l978C-Kern (1,0 g, 0,64 mMol), A-21978C-Kern (0,5 - 1,0 g, 0,34 - 0,68 mMol) oder A-21978C (946 mg, 0,58 mMol) und ein 3,5 molarer Überschuß des Trichlorphenyl-acylaktivesters werden in DMF (100 ml) gelöst und bei etwa Zimmertemperatur bis etwa 50° C während etwa 6 bis etwa 20 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum zu einem Öl eingeengt. Das Öl wird mit 50 ml EfcO.Toluol (1 : 1) verrieben und mit Et2Ö gewaschen. Die monoacylierten und diacylierten A-21978C-Kernderivate, acyliertes A-21978Ci und acylierter t-BOC-A-21978C-Kem werden wie bei Methode A beschrieben gereinigt.

Der acylierte t-BOC-A-21978C-Kern wird unter Verwendung von 50 mg/ml Trifluoressigsäu-re:Aniso!:Triethyisilan (10:1:1) bei etwa -10° C bis etwa 0° C während 3 - 5 Minuten entblockiert. Dieses Reaktionsgemisch wird im Vakuum zu einem Öl eingeengt, das mit zwei 20 ml-Volumsmengen Ethylether verrieben wird. Das rohe Acylprodukt wird durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt und wie bei Methode A beschrieben analysiert.

Die speziellen Verbindungen in den Beispielen, die in den folgenden Tabellen I bis X zusammengefaßt werden, sind Verbindungen der Formel 1: 22

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23 5 10 P M 3 X) O 3 P. b0 a 3 o ÜJ I 3 I O r-H CQ W W)rH i a « Q 3 P M 3 P λ ffi-Hk-h a 15 20 25 30 35 40

41 Μ3 •η ra ow r-t bCP · hS p 3 Ü 3 ·Η 0) <: ρ ao ß · /—» 3 3 fcö ο) © a I n U) 3 a» I 3 Ό hH O (J :—; .Cj ' P5 Ο P 4-5 Q> <n a I r-t φ © Ι.Ω ·ι-ί P <*< << n *-» I— " © P ~t -3 Jdü« S Ü 3 I CO o-dO S •h osi a 3 3P« 3 b3 P.« 3 45 50 c o ffi > bO 3 b0 3 3 —-1 3 3 « r-i -rC i—( P ü> 3 P <0 CO > 3 0) rH K ID •H P. · co 3 •h a D ffl

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Reaktionstemperatur auf 5 C eingestellt; enthaltend 1 % Pyridin und 1 % HOAc 24 55

AT 402,299 B

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Beispiel 27: NTrP-(n-Decanoyl)-A-21978C-Kern (Verbindung 4)

Die folgende Verfahrensweise veranschaulicht die Herstellung der Verbindungen nach der Aktivestermethode in großem Maßstab. A. Herstellung von 2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat

Eine Lösung von Decanoylchlorid (Pfaltz und Bauer, 5,6 ml) und 2,4,5-Trichlorphenol (5,6 g) in Diethylether (1 I) und Pyridin (120 ml) wird 4 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert und im Vakuum getrocknet. Das 2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat wird an einer Silicagelsäule (Woelm) gereinigt, wobei Toluol als Eluierungsmittel verwendet wird. Die Fraktionen werden durch TLC überwacht, wobei kurzwelliges UV zur Ermittlung dient. Entsprechende Fraktionen werden gesammelt und im Vakuum getrocknet, wobei 10,4 g 2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat erhalten werden. B. Acylierung von Nom-t-BOC-A-21978C-Kern mit 2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat

Eine Lösung von Nom-t-BOC-A-21978C-Kern (15,0 g) und 2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat (15,0 g) in trockenem DMF (500 ml) wird unter N2 bei Zimmertemperatur 25 Stunden gerührt. Das Gemisch wird dann 5 Stunden bei 60° C, oder bis mittels TLC vollständige Reaktion festgestellt wird, gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum auf etwa 200 ml eingeengt und wird mit 1,2 I Diethylether/Toluol (5:1) gerührt. Das Produkt wird durch Filtration abgetrennt, mit Diethylether gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wobei 15,05 g des NTrp-(n-Decanoyl)-Norn-t-BOC-A-21978C-Kernzwischenproduktes (Formel 1; R = n-Decanoyl, R1 = H, R2 = t-BOC) erhalten werden. C. Reinigung von NTrp-(n-Decanoyl)-Norn't-BOC-A-2l978C-Kern

Des NTrp-(n-Decanoyl)-N0rr-t-BOC-A-21978C-Kernzwischenprodukt wird in der folgenden Weise gereinigt: Die rohe Zubereitung wird in etwa 50 ml des Eluierungslösungsmittelsystems aufgelöst und dann mittels HPLC gereinigt, wobei das Waters Prep/500-System, welches eine mit Umkehrphasen-Ci8-Silicagel-Adsorptionsmittel gepackte Patrone enthält, verwendet wird. Das System wird mit H20:Me0:CH3CN (50:15:35), das 0,2 % Pyridin und 0,2 % HOAc enthält, eluiert. Die Fraktionen werden mittels UV bei 280 nm überwacht. Entsprechende Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum getrocknet, wobei 8,56 g gereinigter NTrp-(n-Decanoyl)-Norri-t-BOC-A-21978C-Kem erhalten werden. D. Entfernung der Norn-t-BOC-Gruppe

Die t-BOC-Gruppe wird durch Rühren des NTrp-(n-Decanoyl)-No,n-t-BOC-A-2l978C-Kerns (1,47 g) in 15 ml Trifluoressigsäure/1,2-Ethandithiol (10:1) bei Zimmertemperatur während 3 Minuten entfernt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum getrocknet und der Rückstand wird mit Diethylether (50 ml) verrieben. Nach einer Wäsche mit 20 ml Diethylether wird das beim Verreiben entstehende Produkt im Vakuum getrocknet, wobei 2,59 g des rohen NTrp-(n-Decanoyl)-A-2l978C-Kerns (Formel 1: R = n-Decanoyl: R1 und R2 = H) erhalten werden. E. Reinigung des NTrp-(n-Decanoyl)-A-2l978C-Kerns

Der rohe NTrp-(n-Decanoyl)-A-21978C-Kem wird durch Umkehrphasen-HPLC in folgender Weise gereinigt: Die Probe (2,59 g) wird, gelöst in 4,0 ml H20:Me0H:CH3CN:Pyridin:H0Ac (50:15:35:2:2), auf eine Edelstahlsäule mit den Abmessungen 838 mm x 25,4 mm, die mit LP-1/C18-Adsorptionsmittel (siehe oben) gepackt ist, aufgespritzt. Die Säule wird mit diesem gleichen Lösungsmittelsystem eluiert. Die Eluierung wird bei einem Druck von 82,8 - 117,2 mbar (1200 - 1700 psi) bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 - 12 ml/Minute unter Verwendung einer LDC Duplexpumpe (Milton-Roy) ausgeführt. Das ausfließende Material wird mittels eines UV-Detektors (Isco Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Avenue, Lincoln, NB 68504) bei 280 nm überwacht. Alle zwei Minuten werden Fraktionen (20 - 24 ml) gesammelt. Die gewünschten Fraktionen, ermittelt anhand mikrobieller Aktivität, werden vereinigt und im Vakuum getrocknet und liefern 1,05 g Produkt. 30

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Diese Reinigungsverfahrensweise wurde mit 4,35 g, 4,25 g, 2,14 g, 2,00 g und 1,75 g rohem Ausgangsderivat wiederholt, wobei insgesamt 5,58 g gereinigter NTrp-(n-Decanoyl)-A-21978C-Kern erhalten wurden. 5 Beispiel 28: NTrp-(n-Decanoyl)-NKyn-(n-decanoyl)-A-21978C (Verbindung 21) NTrp-(n-Decanoyl)-NKyn-(n-decanoyl)-A-21978C-Kern (Formel 1: R und R1 = n-Decanoyl; R2 = H) ist ein 70 kleineres Reaktionsprodukt bei der Herstellung des NT,p-(n-Decanoyl)-derivats des Beispiels 27. Es wird während der Umkehrphasen-HPLC-Reinigung, die in Abschnitt E beschrieben ist, isoliert. Gewünschte Fraktionen werden vereinigt und im Vakuum getrocknet, wobei 211 mg Rohprodukt erhalten werden. Die Verbindung wird durch analytische HPLC (Cts Microbondapak, Waters Co.) unter Verwendung von H20:MeOH:CH3CN:NH*OH:HOAc (6:23:15:0,5:0.5) als Eluierungssystem (32 Wiederholungen, 500 ug je 75 eingespritzte Probe) gereinigt, wobei 4,4 mg NTrP-(n-Decanoyl)-NKyir(n-decanoyl)-A-21978C-Kern (durch 360 MHz Protonen-KMR identifiziert) erhalten werden.

Beispiel 29: 20 NTrp-Cbz-Norn-Lauroyl-A-21978C-Kem (Verbindung 20)

Diese Verfahrensweise umfaßt den Schutz des Tryptophan-a-NH2 des Nom‘t'BOC-A-21978C-Kerns mit einer Cbz-Gruppe, dann Entfernung der t-BOC-Gruppe und Acylierung (an dem Omithin-a-NH2) mit dem Trichlorphenyl-Iauroylester. 25 A. Herstellung von NTrp-Cbz-Nom-t-BOC*A-21978C-Kem

Nom-t-BOC-A-21978C-Kern (1,0 g) wird in DMF (150 ml) gelöst und auf 60° C erwärmt. Es wird Ν,Ο-Bistrimethylsilylacetamid (0,55 ml) zugegeben und dann wird Benzylpentachlorphenylcarbonat (257 mg) 30 zugefügt. Nach Rühren während 20 Stunden wird das Reaktionsgemisch auf ein Volumen von etwa 20 - 25 ml eingeengt. Es wird Wasser (100 ml) zugesetzt und der pH dieser Lösung wird mit 1N NaOH auf 6,0 eingestellt. Das Gemisch wird mit Diethylether (sechsmal, 200 ml Volumina) gewaschen und dann lyophilisiert.

Das rohe Derivat wird durch Umkehrphasen-HPLC wie folgt gereinigt: Die Probe wird, gelöst in etwa 6 35 ml H20:Me0H:CH3CN: Pyridin:HOAc (55:15:30:2:2), auf eine 833 mm x 17,7 mm Edelstahlsäule, die mit LP-1/Cis-Träger (siehe oben) gepackt ist, eingespritzt.

Die gewünschten Fraktionen werden mittels UV-Absorption (280 nm) geortet und aufgrund antimikrobieller Aktivität. Diese Fraktionen werden dann vereinigt und lyophilisiert, wobei 951 mg des NT,p-Cbz-N0,n-t-BOC-A-21978C-Kernderivats erhalten werden. 40 B. Entfernung der t-BOC-Gruppe

Die t-BOC-Gruppe wird durch Auflösen des Zwischenproduktes bei 50 mg/ml in Trifluoressigsäu-re:Anisol:Triethylsilan (10:1:1) bei -10° C während 3 Minuten entfernt. Das Reaktionsgemisch wird zu einem 45 Öl eingeengt, das mit zwei 25 ml-Volumina Diethylether verrieben wird und 520 mg rohen NTrp-Cbz-A-21978C-Kern liefert. C. Acylierung des NTrp-Cbz-A-21978C-Kerns so Der NTrp-Cbz-A-21978C-Kern wird nach der Trichlorphenylaktivester-Acylierungsmethode acyliert. NTrp-Cbz-A-21978C (520 mg) wird zu einer Lösung von 1-Hydroxybenzotriazol (7 mg) und Lauroyltrichlorphenol-aktivester (123 mg) in Pyridin (150 ml) gegeben. Nach Rühren während 20 Stunden bei 60° C wird das Reaktionsgemisch zu einem Rückstand eingeengt, der mit Diethylether (dreimal, 25 ml-Volumina) verrieben wird, und NTrp-Cbz-N0rn-Lauroyl-A-21978C-Kern (550 mg) liefert. 55 Die antibakterielle Aktivität der Verbindungen der Formel 1 kann in vitro gezeigt werden. Die Ergebnisse der antibakteriellen Prüfung repräsentativer Verbindungen der Formel 1 unter Anwendung von Standard-Agarplatten-Scheibendiffusionstests sind in Tabelle VII angegeben. In Tabelle VII ist die Aktivität durch die Größe (Durchmesser in mm) der beobachteten Zone, in welcher das Wachstum des Mikroorganismus durch 31

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Die Ergebnisse der antibakteriellen Prüfung repräsentativer Verbindungen der Formel 1 nach Standardagar-Verdünnungstests sind in Tabelle VIII zusammengefaßt. In Tabelle VIII wird die Aktivität anhand der minimalen Hemmkonzentration (MIC) gemessen, d.h. die niedrigste Konzentration der Verbindung, bei welcher das Wachstum des Mikroorganismus durch die Testverbindung gehemmt wird. 33 5 10 15 20 25

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Die A-21978C-Cyclopeptide der Formel 1 haben in vivo antimikrobielle Aktivität gegen experimentelle bakterielle Infektionen gezeigt. Wenn zwei Dosen der Testverbindung subkutan oder oral an Mäuse mit veranschaulichenden Infektionen verabreicht wurden, wurde die beobachtete Aktivität als EDso-Wert gemessen [wirksame Dosis in mg/kg, um 50 % der Testtiere zu schützen: Siehe Warren Wiek und Mitarbeiter, J. Bacteriol. 81, 233-235 (1961)]. Die EDso-Werte, die für repräsentative A-21978C-Verbindungen der Formel 35

AT 402 299 B 1 beobachtet wurden, sind in Tabelle IX angegeben. X H Q) 0> <0 E-< V "d •H -P P4 Oi

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Die Ergebnisse von Toxizitätstests mit einigen A-21978C-Cyclopeptiden der Formel 1 sind in Tabelle X zusammengefaßt. 36

AT 402 299 B

Tabelle X

Toxizität der A-21978C-Cyclopeptide Verbindg. Nr. Verbindung der Formel 1 R1 R2 LDso (mg/kg) in Mäusen a R 1 CH3(CH2)sCO- H H >600 2 CH3(CH2)6CO- H H >600 3 CH3(CH2)7CO- H H >600 4 CH3(CH2)sCO- H H >300 5 CH3(CH2)9CO- H H >600 6 CH3(CH2)ioCO- H H 144;265b 7 CH3(CH2)i i CO- H H 112,5 8 CH3(CH2)12CO- H H 62,5;<150 9 CH3(CH2),3CO- H H 56,25 10 CH3(CH2)hCO- H H 50 11 CH2 = CH-(CH2)8CO- H H £500 12 CH3(CH2)3CH = CH(CH2)7CO- H H 450 14 CH3CH2 CH(CH3 )(CH2 )s CO- H CH3CO- >600:600 15 CH3CH2CH(CH3)(CH2)6CO- H HOCO(CH2)2CO- 450:600 16 CH3(CH2)6CO- H CH3(CH2)6CO- >600 17 CH3(CH2)9CO- H CH3(CH2)9CO- 94 22 CH3(CH2)i 1- H H >300 a intravenös verabreicht b zwei Versuche 37

Claims (4)

1. AT 402 299 B Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung von neuen Cyclopeptidderivaten der Formel:

   worin R, R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, gegebenenfalls substituiertes C2-C19-Alkanoyl, Cs-Cig-Alkenoyl oder eine Aminoschutzgruppe sind, mit der Maßgabe, daß 1) wenigstens einer der Reste R, R1 oder R2 eine andere Bedeutung als Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe haben muß, 2) wenigstens einer der Reste R1 oder R2 Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe sein muß, 3) die R-, R1- und R2-Gruppen zusammengenommen wenigstens 4 Kohlenstoffatome enthalten müssen, und 4) falls sowohl R1 als auch R2 Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe bedeutet, R nicht 8-Methyldecanoyl, 10-Methylundecanoyl, 10-Methyldodecanoyl, die C10-AlkanoyIgruppe des A-2l978C*Faktors Co oder die Ci2-Alkanoylgruppen der A-21978C-Faktoren C4 und Cs sein kann, oder von pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon, dadurch gekennzeichnet, daß man einen A-21978C-Cyclopeptidkern der Formel 38 ΑΤ 402 299 Β

   HÖzd' (3) oder ein entsprechend geschütztes Derivat davon, worin R' und R° unabhängig voneinander Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe sind, oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon (a) mit einem Acylierungsmittel der Formel (5): R6-COOH (5) oder einem aktivierten Derivat davon, worin R6 ein gegebenenfalls substituiertes Ci-Cis-Alkyl oder C*-Ci8-Alkenyl ist, umsetzt, und (b) gewünschtenfalls irgendeine Schutzgruppe, die in dem Produkt der Reaktion (a) oben vorhanden sein kann, entfernt und erforderlichenfalls ein erhaltenes A-21978C-Cyclopeptidderivat in eines seiner pharmazeutisch annehmbaren Salze bzw. ein erhaltenes Salz in das A-2l978C-Cyclopeptidderivat überführt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung eines A-21978C-Cyclopeptidderivats der Formel (1) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon, worin R n-Decanoyl ist und R1 und R2 jeweils Wasserstoff bedeuten, den A-21978C-Cyclopeptidkern der Formel (3), oder ein aminogeschütztes Derivat davon, mit n-Decansäure, oder einem aktivierten Derivat davon, umsetzt, anschließend irgendwelche in dem Produkt vorliegende Schutzgruppen entfernt und erforderlichenfalls das erhaltene Produkt in ein Salz überführt.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von NTrp-(n-Decanoyl)-A-21978C-Kern als aktiviertes Derivat von n-Decansäure 2,4,5-Trichlorphenyl-n-decanoat verwendet.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Herstellung von NTrp-(n-Decanoyl)-A-21978C-Kern als aminogeschützten A-21978C-Kern der Formel (3) No,„-t-BOC-A-2l978C-Kern einsetzt. 39