CS257766B2 - Method of cyclic peptide's a-21978c derivative preparation - Google Patents

Description

Předložený vynález se týká nových derivátů A-21978C cyklických peptidů a jejich farmaceuticky vhodných solí, které jsou účinnými antibiotiky. Nové deriváty podle vynálezu se připravují reakcí A-21978C jádra připraveného deacylací příslušně chráněného A-21978C komplexu nebo jeho kteréhokoli chráněného faktoru Co, Cl, C2, Сз, C4 nebo Cs požadovaným acylačním činidlem nebo jeho aktivovaným derivátem, nebo v případě alkylovaných derivátů, vytvořením příslušné Schiffovy báze a následující redukcí iminové vazby báze.

Předložený vynález se týká A-21978C cyklických peptidů obecného vzorce I

kde

R, R¹ a R² jsou na sobě nezávisle atom vodíku, alikanoyl s 2 až 19 atomy uhlíku, případně substituovaný karboxylem, alkenoyl s 5 až 19 atomy uhlíku nebo skupina chránící aminoskupinu vybraná z ikarbobenzyloxyskupiny nebo terc.butoxykarbonylskupiny,

R³, R⁴ a R⁵ jsou atomy vodíku, přičemž il. alespoň jedna ze skupin R, R¹ nebo R² musí mít jiný význam než atom vodíku nebo skupina chránící aminoskupinu definovaná výše,

2. alestpoň jedna ze skupin R¹ mebo R² musí být atom vodíku nebo skupina chránící aminoskupinu definovaná výše,

3. R, R¹ a R² skupiny musí dohromady obsahovat alespoň čtyři atomy uhlíku a

4. jestliže oba substituenty R¹ a R² jsou atomy vodíku nebo skupiny chránící aminoskupimu definované výše, R nemůže být 8-methyldekanoyl, 10-methylundekanoyl, 10-methyldodekanoyl, specifická alkanoylskupina s 10 atomy uhlíku A-21978C faktoru Co nebo specifické alkanoylskupiny s 12 atomy uhlíku A-21978C faktorů C4 a Cs, a farmaceuticky vhodných solí těchto peptidů použitelných jako polosyntetická antibakteriální činidla nebo jako meziprodukty pro přípravu těchto činidel.

V ipopisu jsou použity následující zkratky, běžně používané v odborné literatuře:

Ala: alanin

Asp: asparagová kyselina .

Asn: asparaigin Gly: glycin Kyn: kynurenin Orn: ornithin Ser: serin Thr: threonin Trp: tryptofan t-BOC: terc.-butoxyikarbonyl Cbz: benzyloxykarbonyl DMF: dimethylformamid THF: tetrahydrofuran NMR: nukleární magnetická resonance

UV: ultrafialové záření.

A-21978C antibiotika jsou si blízce příbuzná kyselá peptidická antibiotika, popsaná v USA patentu č. 4 208 403, který je zde uveden jako odkaz, jak je popsáno v USA patentu č. 4 208 403 A-21978 antibiotický komplex obsahuje hlavní složku, faktor C, který je sám komplexem blízce příbuzných faktorů. A-21978 faktor C, který je nazýván A-21978C komplexem, obsahuje individuální faktory Co, Cl, C2, Сз, C4 a Cs. Faktory Ci, C2 а Сз jsou hlavními faktory a faktory Co, Ci a Cs jsou minoritními faktory. Struktura A-21978C faktorů je patrná ze vzorce II

257768

NH

I

RN (II) kde

3MG je L-threo-3-methylglutamová kyselina, a

R^N je část molekuly specifické mastné kyseliny.

Specifické R^N skupiny faktorii jsou násls-

dující:
A-21978C faktor	RN část molekuly
Cl	8-methyldekanoyl
C2 Сз	10-metbylundekanoyl 10-methyldodekanoyl
Co	Cto-alkanoyl*
C4	Ci2-alkanoyl*
C5	Ci2-alkanoyl*

Identita ještě nebyla stanovena.

Při provádění deacylace peptidických antibiotik je velmi obtížné rozhodnutí, který enzym je použitelný pro tento účel. Nalezení takového enzymu je ještě obtížnější, jestliže substrát obsahuje cyklické peptidické jádro. Vzhledem к tomu, že enzymy mají vysoký stupeň ^pecifity, rozdíl v peptidické části a v postranním řetězci substrátu ovlivňují výtěžek deacylace. Navíc mnohé mikroorganismy produkují velké množství peptidas, které napadají různé části peptidické části molekuly. To často vede к nezpracovatelné směsi produktů.

Enzym používaný pro provádění deacylace postranního řetězce mastné kyseliny a-aminoskupiny tryptofanu je produkován mikroorganismem rodu Actinoplanaceae, s výhodou mikroorganismu Actinoplanes utahensis NRRL 12052 nebo jeho variety. Při provádění deacylace se antibiotikum vybrané ze skupiny zahrnující A-21978C komplex, A-21978C faktory Co, Cl, C2, Сз, Cí a Cs blokované A-21978C komplex a blokované A-21978C faktory Co, Ci, Сг, Сз, Cí a Cs, přidá ke kultuře mikroorganismu.

Výraz „blokované A-21978C faktory“ a „blokovaný A-21978C komplex“ se vztahuje na individuální A-21978C faktory nebo směsi faktorů (komplex), kde aminosikuipina ornithinu a/nebo kynureninu je chráněna skupinou chránicí aminoskupinu.

S výhodou skupina chránicí aminoskupinu je umístěna 11a δ-aminoskupině ornithinu jednotlivých faktorů nebo· směsí faktorů. Kultura se nechá inkubovat se substrátem až do úplného průběhu deacylace. Takto získaný odpovídající A-21978C cyklický peptid se oddělí z fermentačního média metodami běžně známými z literatury.

Cyklické peptidy získané těmito enzymatickými deacylacemi jsou znázorněné vzorcem III

R‘ a R° jsou na sobě nezávisle atom vodíku nebo skupina chránící aminoskupinu a jejich soli.

Odstranění acylové Části molekuly z A-21978C individuálních faktorů Co, Ci, C2, Сз, C4 а C5 posíkytuje sloučeninu vzorce III, kde R‘ a R° jsou atomy vodíku. Deacylovaná molekula je běžným cyklickým peptidem přítomným v každém z A-21978C faktorů. Pro jednoduchost tato sloučenina se nazývá A-21978C jádro. Tato sloučenina' může být reprezentována vzorcem IV

o-Ata f	Gly 1
L-Áp	D-Ser
T L—Qru	3MG 1
ΐ
1 Gíy □	/
z
Wh-r
1 ’ L—Ast>
r
L “ASii

t

L —Trp

3MG je L-threo-3-methylglutamová kyselina.

Sloučeniny vzorce III, kde R‘ nebo R° mají jiný význam než atom vodíku, se připravují deacylací příslušných blokovaných antibiotických A-21978C faktorů Co, Ci, C2, Сз, C4 a C5. Pro jednoduchost se tyto sloučeniny nazývají blokovaná A-21978C jádra. Tyto blokované sloučeniny jsou použitelné jalko meziprodukty pro přípravu určitých peptidů vzorce I, to je sloučenin, kde alespoň jeden ze substituentů R¹ a R² je skupina chránící aminoskupinu.

Odborníkům je známo, že A-21978C jádro a blokované A-21978C jádro se může připravit buď ve formě volných aminů, nebo solí s kyselinami. I když se může připravit jakákoli vhodná sůl s kyselinou, výhodné jsou farmaceuticky vhodné soli. Farmaceuticky vhodné soli jsou solí, které jsou použitelné v chemoterapii teplokrevných živočichů.

NRRL 12052 je veřejnosti dostupný z Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Norhern Regional Research Center, US, Department of Agriculture, 1815 North University St., Peoria, Illinoifs 61604, USA, pod Číslem NRRL 12052.

Příprava 1 zde popisuje přípravu A-21978C jádra fermentací za použití A-'21978C (komplexu jako substrátu a Actinoplanes utahensis NRRL 12052 jako mikroorganismu.

Jiné Actinoplanaceae kultury, použitelné pro přípravu A-21978C jádra vzorce III jsou dostupné veřejnosti z Northern Regional Research Laboratory pod čísly:

257769

Actinoplanes utahensis

Actinoplanes missouriensis

Actinoplanes sp.

Actinoplanes sp.

Streiptosporangium roseumj var. hollandensis

NRRL 12052

NRRL 12053

NRRL 8122

NRRL 12065

NRRL 12064

Účinnost kteréhokoli uvedeného kmene mikroorganismu z Čeledí Actinoplanaceae pro provádění deacylace .podle vynálezu se stanovuje následujícím postupem. Vhodné růstové médium se naočkuje mikroorganismem. Kultura se inkubuje asi při 28 ^aC dva dny nebo tři dny na rotační třepačce. Ke kultuře se pak přidá jedno z antibiotik jako substrát a kultura se udržuje talk, aby pH fermentačního média bylo asi 6,5. Kultura se hodnotí podle aktivity za použití Micrococcus Juteus. Ztráta antibiotické aktivity je indikátorem, že mikroorganismus produkuje požadovaný enzym pro deacylaci. To se musí však ověřit použitím jedné z následujících metod:

1. analýzou vysokotlakou kapalinovou chromatografií na přítomnost antibiotického jádra nebb

2. reacylací příslušným postranním řetězcem (např. lauroyl, n- dekanoyl nebo n-doje umístěna na í-aminoskupině ornithinu dekanoyl), aby se obnovila aktivita.

Předmětem předloženého vynálezu je způsob přípravy sloučenin obecného vzorce I

(!)

Kde

R, R¹ a R² jsou na sobě nezávisle atom vodítku, alkanoyl s 2 až 19 atomy uhlíku, případně substituovaný karboxylem, alkenoyl s 5 až 19 atomy uhlíku nebo skupina chránící aminoskupinu vybraná z karbobenzyloxyskupiny nebo terc.butoxykarbonylskupiny, přičemž

1. alespoň jedna ze skupin R, R¹ nebo R² musí mít jiný význam, než atom vodíku nebo skupina chránící aminoskupinu definovaná výše,

2. alespoň jedna ze skupin R^] nebo R² musí být atoim vodíku nebo skupina chránící amlnoslkupinu definovaná výše,

3. R, R¹ a R² skupiny musí dohromady obsahovat alespoň čtyři atomy uhlíku a

4. jestliže oba substituenty R¹ a R² jsou atomy vodíku .nebo skupiny chránící aminoskupinu definované výše, R nemůže být 8-methyldekanoyl, 10-methylundekanoyl, 10-meťhyldodekanoyl, specifická alkanoylskupina s 10 atomy uhlíku A-21978C faktoru Co nebo specifické alkanoylskupiny s 12 atomy uhlíku A-21978C faktorů Cd a Cs a farmaceuticky vhodných solí těchto peptidů, který se vyznačuje tím, že se jádro cyklického peptidů A-21978C, obecného vzorce III

nebo jeho příslušně chráněný derivát, kde R‘ a R° jsou na sobě nezávisle atom vodíku nebo skupina chránící aminoskupinu definovaná výše, nebo odpovídající farmaceuticky vhodná sůl, nechá reagovat s acylačním činidlem obecného vzorce V

R⁶—COCH (V) nebo jeho aktivovaným derivátem, kde R^B je alkyl s 1 až 18 atomy uhlíku, popřípadě substituovaný karboxylem, nebo alkenyl s 4 až 18 atomy uhlíku, a případně se odstraní jakákoli chránící skupina, která může být přítomná v produktu výše uvedené reakce.

Výraz „alkyl s 4 až 14 atomy uhlíku“ se týká jednovazných nasycených, nerozvětvených nebo rozvětvených alkylových skupin obsahujících 4 až 14 atomů uhlíku. Tyto sloučeniny, kde jeden ze substituentu R, R¹ nebo R² jsou alkyly s 4 až 14 atomy uhlíku se připravují redukcí odpovídajících sloučenin, kde R, R¹ nebo R² je alkylidenyl s 4 až 14 atomy uhlíku a jsou zde uváděny jako „redukované Schiffovy base“.

Výraz „případně substituovaný alkanoyl s 2 až 19 atomy uhlíku“ a „alkenoyl s 5 až 19 atomy uhlíku“ se týká acylových skupin odvozených z karboxylových kyselin s 2 až 19 a 5 až 19 atomy uhlíku. Jestliže skupina R je alkanoyl, je alkylová část jednovazný nasycený, nerozvětveiný nebo rozvětvený uhlovodíkový zbytek, který případně může nést jako substituent hydroxyl, Ikarboxyl, alkoxyl s 1 až 3 atomy uhlíku nebo jeden až 3 atomy halogenu vybraný ze skupiny zahrnující atom chloru, bromu nebo fluoru.

Jestliže R je alkenyl, pak alkenylová část molekuly je jednovazný nenasycený, nerozvětvený nebo rozvětvený uhlovodíkový zbytek obsahující ne více než tři dvojné vazby. Dvojné vazby nenasycených uhlovodíkových řetězců mohou být bud v konfiguraci cis, nebo trans.

Výraz „skupina chrániči aminoskupinu“ se týká takové skupiny chránící aminoslkupinu, která je snášenlivá s ostatními funkčními skupinami v A-21978C molekule. Výhodné skupiny chránící aminoskupinu jsou ty, které se snadno odštěpují z následných acylovaných sloučenin.

Příklady vhodných chránících skupin je možno nalézt v· „Protective Groups in Organic Synthesis“ Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, New York, 1981, kapitola 7. Zejména výhodnými skupinami chránícími aminoskupinu jsou terc.butoxylkarbonyl a benzyloxykarbonyl.

Předložený vynález se ve svých výhodných provedeních týká následujících sloučenin obecného vzorce I:

a) Sloučeniny, kde R je alkanoyl obecného vzorce

O

II

CH5(CH2)„—c-a n je celé číslo od 3 do 17, .

<b) Sloučeniny, kde R je alkanoyl obecného vzorce

О

СНз(СН2)„—С— а

n je celé číslo od 5 do 14,

c) Sloučeniny, kde R je alkanoyl obecného vzorce

CHs( CHž )_nCH(CH2 )_m—C—

I II

СНз o a

mam jsou na sobě nezávisle celá čísla od 0 do 14, přičemž n + m inesmí být me-nší než 1 a ne větší než 15 a dále jestliže n je 0, m nesmí být 8 .a jestliže n je 1, m nesmí být 6 nebo 8,

d) Sloučeniny, kde R je cis nebo trans •alkenyl obecného vzorce

O

II

CH3( CH2 JnCH = CH (CH2) c— a

n a m jsou ina sobě nezávisle celá čísla od 0 do 14, přičemž n + m nesmí být imenší než 1 a ne větší než 15,

e) Sloučeniny, ;kde R je cis nebo trans alkenyl obecného vzorce

O

II .

СП2^СИ(СН2)„—c a

n. je celé číslo od 4 do 15,

f) Sloučeniny, kde R je alkyl obecmého vzorce СНз(СН2)_п— a n je celé číslo od 5 do 12 a

g) Sloučeniny, kde R je

O

II

СИз(СН2)5—C— o

II

CH3(CH2)6—c— o

II

CH3(CH2)7—C— o

II

CH3(CH2)8—C— o

CH3(CH2)9—C— o

II

СНз(СН2)10—C— o

II

CH2 = CH-(CH2)8-Co

II

СНз(СН2)11—C— o

II

CH5(CH2)12—C— o

II

СНз—(CH2)3—CH = CH—(CH2}7—c— o

II

CH3(CH2)13—C— o

II

CH3CH2CH (СНз ] — (CH2 )6—c—

Cil5(Cil2)U— Cll3(CHz)10CH = CH3(CH2)6— CH3(CH2]5CH = СНЗ(СН2)9— СНз(СН2)8СН =

Sloučeniny vzorce I jsou schopné tvorby solí, které jsou také zahrnuté v. předloženém vynálezu. Tyto soli jsou použitelné například pro dělení a čištění sloučenin. Farmaceuticky vhodné soli s alkalickými kovy, kovy alkalických zemin, aminy a adiční soli s kyselinami, jsou zejména použitelné.

Například sloučeniny vzorce I mají čtyři volné karboxylové skupiny, Ikteré mohou tvořit soli. Parciální, smíšené nebo úplné soli těchto karboxylových skupin jsou zahrnuté v předloženém vynálezu. Při přípravě těchto solí je nutno se vyvarovat pH většímu než 10, vzhledem к nestabilitě sloučenin při uvedených hodnotách.

Reprezentativní a vhodné soli alkalických kovů a soli kovů alkalických zemin sloučenin vzorce I zahrnují:

sodné, draselné, lithné, česné, rubidlové, barnaté, vápenaté a hořečnaté soli.

Vhodnými amoniovými solemi sloučenin vzorce I jsou amonné a primární, sekundární .a terciární alkylamoniové soli s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylu a hydroxyalkylamoniové soli s 2 až 4 atomy uhlíku. Příklady amoniových solí zahrnují mezi jiným ty, které vznikají reakcí sloučeniny vzorce I s hydroxidem amonným, methylaminem, sek.butyl-aminem, isopropylaminem, diethylaminem, di-isopropylamiinem, cyklohexylaminem, ethanolaminem, triethylaminem a 3-amino-l-propanolem.

Soli kationtů alkalických kovů a kovů alkalických zemin sloučenin vzorce I se připravují postupy běžně používanými pro přípravu kationtových solí. Například forma volné kyseliny sloučeniny vzorce I se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, jaíko je horký methanol nebo eth-anol, načež se přidá roztok obsahující §techiometrické množství požadované anorganické báze ve vodném methanolu. Takto vzniklá sůl se může izolovat běžnými metodami, jako je filtrace nebo odpaření rozpouštědla. Vhodnou metodou přípravy solí je použití iontoměničových pryskyřic.

Soli vzniklé s organickými aminy se mohou připravit obdobným způsobem. Například plynné nebo kapalné aminy se mohou přidat к roztoku sloučeniny vzorce I ve vhodném rozpouštědle, jako je ethanol, rozpouštědlo a přebytek aminů se paik odstraní odpařením.

Sloučeniny podle vynálezu mají také volné aiminoskupiny a mohou proto také tvořit adiční soli s kyselinami, které také tvoří součást předloženého vynálezu. Reprezentativní a vhodné adiční soli sloučenin vzorce I zahrnují mezi jiným ty soli, které vznikají běžnou reakcí jak s organickými, tak anorganickými kyselinami, jaíko jsou například kyselina chlorovodíková, kyselina sírová, kyselnna fosforečná, kyselina octová, kyselina jantarová, kyselina citrónová, kyselina mléčná, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina palmitová, kyselina cholová, kyselina pamoová, kyselina muková, kyselina D-glutamová, kyselina D-kafrová, kyselina glutarová, kyselina glykolová, kyselina ftalová, kyselina vinná, kyselina laurová, kyselina stearová, kyselina salicylová, kyselina methansulfonová, kyselina benzensulfonová, kyselina sorbová, kyselina pikrová, kyselina benzoová a kyselina cinamová.

Sloučeniny vzorce I, kde R, R¹ nebo R² jsou alkanoyl, alkenoyl /nebo skupina chránící aminoskupinu se připraví acylací A-21978C faktoru, blokovaného A-21978C faktoru, sloučeniny vzorce III nebo příslušné sloučeniny vzorce III, která je blokovaná na a-aminoskupině tryptofanu, požadovaným alkanoyl nebo alkenoyl postranním řetězcem za použití metod běžných v oboru pro tvorbu amidické vazby. Acylace se provádí běžně reakcí selektivní sloučeniny aktivovaným derivátem alkanové kyseliny nebo alkenové kyseliny odpovídající požadované acylové skupině postranního řetězce (R, R¹ nebo R²). Výraz „aktivovaný derivát“ znamená derivát, který způsobuje, že karboxylová funkční skupina acylačního činidla je reaktivní pro kopulaci primární aminoskupiny na amidickou vazbu, která připojuje acylový postranní řetězec na jádro. Vhodné aktivované deriváty, metody jejich přípravy a metody použití acylačních činidel pro primární amin jsou odborníkům známé. Výhodné aktivované deriváty jsou a) halogenid kyseliny (např. chlorid kyseliny), b) anhydrid kyseliny ( např. anhydrid alkoxymravenčí kyseliny], nebo c) aktivován/ ester (např. 2,4,5-trichlorfenylester). Jiné metody pro .aktivaci karboxylové funkční skupiny zahrnují reakci karboxylové kyseliny s karbonyldiimidem (např. N,N‘-<dicyklohexylkarbodiimidem nebo N,N‘-diisopropylkarbonyldiimidem) za vzniku reaktivního meziproduktu, který vzhledem к (nestabilitě se neisoluje. Reakce s primárním aminem se v takovém případě provádí in sítu.

Odborníkům je známo, že sloučeniny vzorce I se připravují selektivními acylačními postupy, za asistence skupin chránících aminoskupiny. Například jestliže sloučenina vzorce III, kde R‘ a R° jsou atomy vodíku, se použije jako výchozí materiál, acylace může proběhnout na a-aminoskupině tryptofanu a í-aminoskupině ornithinu za vzniku Nr_rp, N_Orn-diacylderivátů. Pro přípravu monoacylovaných derivátů na a-aminoskupině tryptofanu se s výhodou acyluje sloučenina obecného vzorce III, kde č-aiminoskupina ornithinu (R° poloha) je blokována skupinou chránící aminoskupinu. Tyto výchozí materiály se s výhodou připraví blokováním A-21978C faktoru v této poloze před deacylací. Aromatická -aminoskuipina kynureinu je reaktivní nejméně ve třech

2577G6 volných aminoskupinách A-21978C jádra. Acylace kynureninu zahrnuje vhodně blokovat aminoskuipiny tryptofanu a ornithinu, ale acylace v polohách R a R¹ běžně nezahrnuje blokování aminoskupiny kynureninu.

Schéma I, II а III ukazují obecné postupy pro přípravu sloučenin obecného vzorce I, kde jedno z R, R¹ nebo R² je alkanoyl, alkenoyl nebo skupinu chránící aminoskupinu. V schématech jsou použity následující zkratky:

(x] = zbytek A-2197BC

N_r = α-aminoslkupina tryptofanu

N_o = á-aminoskuipina ornithinu N_K = aromatická aminoskupina kynureninu

R, R¹, R² = substituenty jak byly definovány

R_n acylskupina přírodního faktoru

В, B¹ = amino-chránicí skupiny Acyl = acylační stupeň

Deacyl ~ deacylační stupeň Block = acylace skupinou chránící aminoskupinu

Deblock = odstranění skupiny chránící aminoskupinu.

V schématu I Ντιρ-monoacylderiváty A-21978C jsou reprezentovány obecným vzorcem III a Nt_1p, Norn-diacylderiváty A-21978C jsou reprezentovány obecným vzorcem IV. N-i-rp, Νο,η-diacylderiváty, kde N_Trp-acylová skupina je skupina přírodního A-21978C faktoru je reprezentována obecným vzorcem VIII.

Schéma I: Příprava N_rrp-monoacyl a Nrr_P,

Nom-diacyl-A21978C derivátů

Ve schématu II Ντ,ρ, N_Kyn-diacylderiváty A-21978C jsou reprezentovány obecným vzorcem X. Ty N_Trp, N_Kyn-diacylderiváty, Ikde N_Trp-acyIskuipiina je skupina přírodního A-21978C faktoru jsou reprezentovány obecným vzorcem XII. Sloučeniny obecných vzorců V, VI а VII jsou také popsány ve schématu I.

Schéma II: Příprava N_Irp) N_Kyi,-diacyl-A-21978C derivátů

X

Ve schématu III Nou-rnanoacylderiváty A-21978C jsou reprezentovány obecným vzorcem XVIII, NK_yll-monoacylderiváty A-21978C jsou reprezentovány obecným vzorcem XV a N_Om, N_Ky_H-di®cylderlváty A-21978C jsou reprezentovány obecným vzorcem XX. Slou čeniny obecného vzorce VI jsou také popsané ve schématech I а II.

Schéma III: Příprava N_0rn-monoacyl, N_Kyil-monoacyl a N_Om, N^n-diacyl A-21978C derivátů

> X v.-

Sloučeniny vzorce I, kde jedna nebo více aminoskupin je substituována alkylidenylskupinou (Schiffovy báze] nebo alkylskupinou (redukované Schiffovy báze] se mohou připravit známými metodami používanými pro přípravu Schiflových bází a redukcí těchto bází. Tak Schiffovy báze se připravují reakcí (kondenzací) primární aminoslkupiny tryptofanu, or.nithinu nebo kynureninu A-21978C příslušným aldehydem nebo ketonem ve vhodném rozpouštědle. Redukce iminové vazby Schiffovy báze za vzniku odpovídající sloučeniny vzorce I, kde R, R¹ nebo R² je alkyl, se může provádět známými selektivními redukčními postupy. Výhodným redukčním činidlem pro tuto reakci je kyanoborohydrid sodný.

Za podmínek testů in vitro, Schiffovy báze nevykazují antibakteriální aktivitu pravděpodobně vzhledem к nestabilitě v testovacím médiu. Jsou však použitelné jako meziprodukty pro přípravu redukovaných Schiffových bází. Jestliže se Schiffovy báze používají jako meziprodukty, nemusí se izolovat před redukcí na redukované Schiffovy báze.

Výhodnou metodou pro přípravu sloučenin obecného vzorce I, kde jedno R, R^l nebo R² je alkanoyl nebo alkenoyl je aktivní esterová metoda. Sloučenina vzorce III, kde R‘ H a R° = t-BOC, to je A-21978C N_Ollr -t-BOC jádro nebo ,,t BOC jádro“ je zejména výhodným výchozím materiálem v přípravě sloučenin vzorce I. 2,4,5-trichlorfenylester požadované alkanové nebo alikenové kyseliny je výhodným acylačním činidlem. Při této metodě se přebytečné množství aktivního esteru nechá reagovat s t-BOC jádrem při teplotě místnosti v nereaktivním organickém rozpouštědle, jako je dimethylformamid, tetrahydrofuran, dieťhylether nebo dichlormethan. Reakční doba není rozhodující, i když doba od 6 do asi 20 hodin je výhodná. Ke konci reakce se rozpouštědlo odstraní a zbytek se čistí. Zejména výhodnou čisticí metodou je vysokotlaká kapalinová chromatografie na reverzní fázi používající LP-1/C18 jako stacionární fází a směs vody, methanolu, acetonitrilu, pyridinu a kyseliny octové jalko systému rozpouštědel. t-BOC skupina se odstraní reakcí se směsí trifluoroctové kyseliny, anisolu a triethylsilanu nebo s výhodou směsí trifluoroctové kyseliny a 1,2-ethandithiolu po dobu 3 až 5 minut při teplotě místnosti. Po odstranění rozpouštědla se odparek čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografii na reverzní fázi.

Alternativní acylační metodou je modifikovaná Schotten-Baumannova metoda, ve které se nechráněné jádro nechá reagovat s chloridem kyseliny požadované alkanové kyseliny nebo alkenové kyseliny ve směsi pyridinu a vody. Při této metodě se přebytek chloridu kyseliny v nereaktivním organickém rozpouštědle (jako je aceton) pomalu přidává к roztoku jádra ve směsi 90 % pyridinu a 10% vody (objemově). Nezrea govaný chlorid kyseliny se oddělí od reakčního produktu extrací do organického rozpouštědla nemísitelného s vodou (např. diethyletheru). Konečné čištění se s výhodou provádí vysokotlakou kapalinovou chromatografií, postupem popsaným výše.

Alkanové a alkenové kyseliny použité jako výchozí materiály pro acylace a jejich aktivované deriváty (zejména chloridy kyselin а 2,4,54ггс111о^епу1е81егу) jsou známé sloučeniny nebo se mohou připravit známými metodami ze známých sloučenin. 2,4,5-trichlorfenylestery se výhodně připraví reakcí chloridu kyseliny alkanové nebo alkenové kyseliny s 2,4,5-trichlorfenolem v přítomnosti pyridinu nebo reakcí volné alkanové nebo alkenové kyseliny s 2,4,5-trichlorfenolem v přítomnosti N.bT-dicyklohexylkarbodiimidu jako kopulačního činidla.

2,4,5-trichlorfe.nylesterový derivát se může čistit chromatografii na koloně silikagelu.

Jestliže A-21978C cyklický peptid podle vynálezu je používán jako antibakteriální činidlo, může se aplikovat buď orálně nebo parenterálně. Jak je odborníkům známé, A-21978C sloučenina se běžně aplikuje spolu s farmaceuticky vhodným nosičem nebo ředidlem. Dávky A-21878C sloučeniny závisí na různých faktorech, například na typu a vážnosti příslušné infekce, která se má léčit. Odborníkům jo také známo, že příslušné dávkové rozmezí a/nebo jednotky pro dávkování se mohou aplikovat s ohledem na МТС a EDso hodnoty a podle údajů toxicit a s ohledem na faktory, jako· je farmakokinelika, charakteristiky pacienta nebo hostitele a mikroorganismus, který způsobil infekci.

;?’() plné objasnění vynálezu jsou uvedeny následující příklady, které jej však žádný·; ^! způsobem neomezují.

Příprava 1

Příprava A-21978C jádra

A. Fermentace Actinoplanes utahensis

Zásobní kultura Actinoplanes utahensis NRRL 12052 se připraví a udržuje na šikmém agaru. Médium používané pro přípravu šikmé kultury se vybírá z následujících médií:.

Médium A

Složka Množství předvařená ovesná mouka 60,0g kvasnice 2,5g

K2HPO4 1,0g

Czapekův minerální roztok* 5,0g agar 25,0g deionizovaná voda do 1 litru pH před sterilizací v autoklávu je asi 5,9, upraví se 11a pH 7,2, přidáním NaOH, po sterilizaci v autoklávu je pH asi 6,7.

* Czapekův minerální roztok imá následující složení:

Složka Množství

FeSOí. 7 H2O (rozpuštěný
v 2 ml konc. HClj	2 g
KC1	100 g
MgSOd . 7 H2O	100 g
deionizovaná voda	do .1 litru
Médium В
Složka	Množství
bramborový dextrin	5,0 g
extrakt z droždí	0,5 g
enzymatický hydrolyzát
z ka-seinu*	3,0 g
hovězí extrakt	0,5 g
glukóza	12,5 g
kukuřičný škrob	5,0 g
pepton z masa	5,0 g
konečná melasa	2.5 g
MgSOi. 7 H2O	0,25 g
СаСОз	1,0 g
Czapekův minerální roztok	2,0 ml
agar	20,0 g
deionizovaná voda	do 1 litru
’ N-Z-amine A. Humko Sheffield Chemical,
Lyndhurst, N. J.
Šikmá kultura se .naočkuje	Actinoplanes
utahensis NRRL 12052 a naočkovaná kultura
se inkubuje při 30 °C asi 8 až	10 dnů. Asi
polovina vyrostlé kultury se použije pro na-
očkování 50 ml vegetativního média násle-
dujícího· složení:
Složka	Množství
předvařená ovesná mouka	20,0 g
sacharóza	20,0 g
kvasnice	2,5 g
sušené granule destilačních
zbytků*	5,0 g
K2I-IPO4	1,0 g
Czapekův minerální roztok	5,0 ml
deionizovaná voda	do 1 litru

pH se upraví NaOH na pH 7,4, po sterilizaci v autoklávu je pH asi 6,8.

* National Destillers Products Co., 99 Park Ave., New York, Ν. Y.

Naočkované vegetativní médium se inkubuje ve 250 ml širokohrdlé Erlenmeyerově baňce při 30 °C po dobu asi 72 hodin na rotační třepačce s posunem 5 cm a 250 otáčkami za minutu.

Toto inkubované vegetativní médium se může použít přímo pro naočkování vegetativního média druhého stupně. Alternativně a s výhodou se může skladovat pro další použití tím, že se kultura udržuje v plynné fázi kapalného dusíku. Kultura se připraví pro takovéto skladování ve větším počtu malých lékovek následujícím způsobem.

Do každé lékovky se umístí 2 ml inkubovaného vegetativního média a 2 ml roztoku glycerollaktózy (viz W. A. Dailey а С. E. Higgens, „Preservation and Storage of MH croorganismus in the Gas Phase of Liquid Nitrogen, Cryobiol 10, 364 až 367 /1973/). Připravené suspenze se skladují v plynné fázi kapalného dusíku.

Skladovaná suspenze (1 ml) se použije pro naočkování 50 ml prvého stadia vegetativního média (výše uvedeného složení). Toto médium se inkubuje výše popsaným způsobem.

Pro přípravu většího objemu očka se 10 mililitrů mkubovaného vegetativního média z prvního stupně použije pro naočkování 400 ml druhého stadia vegetativního média stejného složení jaké mělo vegetativní médium prvého stadia. Médium druhého stadia se inkubuje v dvoulitrové širokohrdlé Erlenmeyerově baňce při 30 °C po dobu asi 48 hodin na rotační třepačce s posunem 5 cm a 250 otáčkami za minutu.

Naočkované vegetativní médium druhého stupně (80 ml) připravené výše popsaným způsobem se použije pro naočkování 10 litrů sterilního produkčního média vybraného z následujících médií:

Médium I

Složka	Množství (g/1)
arašídová mouka rozpustný pepton z masa sacharóza KH2PO4 K2HPO4 MgSCh.7 H2O pitná voda	10,0 5,0 20,0 0,5 1,2 0,25 doplnit do 1 litru
Hodnota pH média po sterilizaci v .autoklávu při 121 °C a 0,11 až 0,12 MPa po dobu 45 minut je asi 6,9.
Médium II
Složka	Množství (g/l)
sacharóza pepton K2HPO4 KC1 MgSCH . 7 H2O FeSOl.7 H2O deionizovaná voda	30,0 5,0 1,0 0,5 0,5 0,002 doplnit do 1 litru

přidáním HC1 se upraví pH na 7,0 a po sterilizaci v autoklávu je pH asi 7,0.

5 7 7 6 S

Médium III

Složka	Množství (g/1)
glukóza	20,0
NH4C1	3,0
NazSCM	2,0
ZnC12	0,019
MgC12. 6 H2O	0,304
FeC13.6 H2O	0,062
MnC12.4 H2O	0,035
CuC12.2 H2O	0,005
СаСОз	6,0
KH2PO4*	0,67
pitná voda	doplnit do 1 litru

* sterilizace se provádí odděleně a přidává se asepticky, konečné pH asi 6,6.

Naočkované produkční médium se ferunentuje ve 14 litrovém fer menta čním tanku při teplotě asi 30 Ί2 po dobu asi 66 hodin. Fermentační médium se míchá běžným míchadlem s otáčkami asi 600 otáček za minutu a provzdušňuje se sterilním vzduchem tak, aby se udržovala rozpuštěná kyslík o vři hladina nad 30 % nasycení vzduchem při atmosférickém tlaku.

B. Deacylace A-21978C

Fermentace A. utahensis se provádí postupem popsaným v odstavci A za použití šikmého média A a produkčního média I a inkubace produkčního média po dobu asi 67 hodin. К fermentačnímu médiu se přidá surový A-21978C komplex (100 g).

Deacylace A-21978C komplexu se monitoruje testem na Micrococcus luteus. Fermentace se provádí až do skončení deacylace, která se indikuje vymizením aktivity na M. luteus, doba asi 24 hodin.

C. Izolace A-21978C jádra

Celé fermentační médium (20 litrů) získané postupem popsaným v odstavci В se přefiltruje za pomoci filtračního materiálu (Hyflo Super-Cel, Johns Manville Corp.). Filtrační koláč mycelia se vyhodí. Takto získaný filtrát se přeleje pres kolonu obsahující 1,5 litru HP-20 pryskyřice (DIAION High Porous Polymer, HP-Series. Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokyo, Japan). Eluát získaný tímto způsobem se vyleje.

Kolona se pak promyje deionizovanou vodou (10 1) a odstraní se zbylé médium. Tato voda se ta'ké vyleje. Kolona se pak eluuje směsí voda-acetonitril (10 litrů směsi 95 : 5, 9:1 a 4:1) a jímají se llitrové frakce.

Eluce se monitoruje papírovou chromatografií za použití rozpouštědlového systému n-butanol : pyridin : kyselina octová : voda (15 : 10 : 3 : 12) a detekcí sloučenin fluorescencí UV zářením. V tomto systému mají

A-21978C faktory hodnotu Rf asi 0_?56 a

A-21978C jádro má hodnotu Rf asi 0,32. Produkt se také sleduje analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií za použití silikagelu Cib a směsí rozpouštědel voda : : methanol (3:1) obsahující 0,1 % octan amonný při použití detekce jádra UV zářením při 254 mm.

Frakce obsahující jádro, se spojí, zahustí ve v-akuu pro odstranění acetonitrilu a mrazovou sublimací se pak získá 40,6 g poločistélio A-21978C jádra.

D. Čištění A-21978C jádra

Poločisté A-21978C jádro (15 g) získané postupem popsaným v odstavci C se rozpustí v 75 ml směsi voda : methanol : acetonitril (82:10:8) obsahující 0,2 % kyseliny octové a 0,8 % pyridinu. Tento roztok se pumpuje na 4,7 X 192 cm kolonu obsahující 3,33 litrů silikagelu (Quantum LP-l/Cie). Kolona se vyvíjí stejným rozpouštědlovým systémem.

Jímají se frakce objemu 350 ml. Dělení se sleduje při 280 nm a UV detektoru. Fra'kce obsahující jádro se spojí, zahustí ve vakuu a mrazovou sublimací se získá 5,2 g čistého A-21978C jádra.

E. Charakteristika A-21978C jádra

A-2197BC jádro má následující charakteristiky:

a) Forma:

bílá amorfní pevná látka fluoreskující v krátkovlnné UV oblasti

b) Empirický vzorec:

C62H83N17O25

c) Molekulární hmotnost:

465

d) Rozpustnost: rozpustný ve vodě

e) Infračervené spektrum (KBr) vykazuje absorpční maxima při následujících délkách [om^-1]:

300 (široký),

042 (slabý),

909 (slabý),

655 (silný),

530 (silný),

1451 (slabý),

399 (středuí),

222 (střední),

165 (slabý),

063 (slabý) a

758 (střední až slabý).

f) UV absorpční spektrum v methanolu vykazuje maxima při:

223 nm (ε 41,482) a

260 nm (ε 8,687).

g) Elektrometrická titrace v 66% vodném dimethylformamidu ukazuje na přítomnost čtyř titroivatelných skupin pK_a hodnoty asi 5,2, 6,7, 8,5 a 11,1 (původní pH 6,12).

2577В6

Příprava 2

Alternativní příprava A-21978C jádra

A-21978C jádro se připraví postupem podle metody příkladu 1, s výjimkou určitých změn v odstavci B. Kultura A. utahensis se inkubuje nejprve asi 48 hodin, substrátem je polovyčištěný A-21978C kolmplex (50 g) a doba inkubace po přidání substrátu je asi 16 hodin. Filtrát se proleje kolonou obsahující 3,1 litru pryskyřice HP-20. Kolona se promyje 10 objemy vody a pak se eluuje směsí vody a acetonitrilu (95 :5). Eluce se sleduje postupem popsaným v přípravě 1. Po jímání 24 litrů se eluované rozpouštědlo zamění za směs vody a acetonitrilu (9:1). Tímto rozpouštědlem se eluují frakce obsahující jádro. Tyto frakce se spojí, zahustí ve vakuu tak, aby se odstranil acetonitril a mrazovou sublimací se pak získá 24,3 g poločistého A-21978C jádra.

Polovyčištěné A-21978C jádro (24,3 g) se rozpustí ve vodě (400 ml). Roztok se pumpuje do nerezové kolony (4,7 X 192 cm) obsahující 3,33 litru silikagelu (Quantum LP-1/С1») připravené ve směsi voda-methanol-acetonitril (8:1:1), obsahující 0,2 % kyseliny octové a 0,8 % pyridinu. Kolona se vyvíjí stejným rozpouštědlem za tlaku kolem 14 MPa. Jímají se frakce obsahující 350 mililitrů. Eluce se monitoru je UV zářením při 280 nm. Frakce obsahující jádro so spojí, zahustí ve vakuu a rozpouštědlo se odstraní. Mrazovou sublimací se získá 14 g vysoce čistého A-21978C jádra.

P ř í p r a v a 3

Příprava N.,-,-t-BOC A-21978C faktorů C2 а Сз

Směs A-21978C faktorů C2 а Сз (10 g), připravených postupem podle USA patentu č. 4 208 403 se rozpustí ve vodě (50 ml) za sonikace (200 mg/ml). Hodnota pH roztoku se upraví z 4,05 na 9,5 přidáním 5N roztoku NaOH (3,6 ml). Přidá se di-terc.butyldikarbonát (3,0 iml) a reakční směs se .míchá 2 hodiny při teplotě místnosti. Přidáním 5N roztoku NaOI-I se pH reakční směsi udržuje na 9,5 (6,5 ml přidaných v průběhu 2 hodin).

Reakce se periodicky sleduje chromatografií na tenké vrstvě silikagelu za použití směsi CH3CN : H2O (7:3 a 8:2) a detekce ultrafialovým světlem.

Asi po 10 minutách se reakční roztok zakalí a spotřeba báze se zvětší. Po 30 minutách se rychlost zvýší, což se projeví v zákalu a rychlosti spotřeby báze a indikuje to, že reakce je úplná. Přesto reakce pokračuje dalších 90 minut, aby se zajistil úplný průběh. Ke konci dvouhodinové reakce se reakční materiál ihned lyofilizuje a získá se 12,7 g Νο,,,-t-BOC A-21978 faktorů C2 а Сз.

Použitím obdobných postupů se provedou dvě lOg reakce a 30g reakce. Při každé z těchto reakcí byla reakční doba pouze 40 minut. Dva lOg experimenty poskytnou 11,9 a 12,1 g produktu. Reakcí 30 g se získalo 35,4 g produktu.

Příprava 4

Příprava A-21978C Norn-t-BOC jádra

A. Fermentace A. utahensis

Fermentace A. utahensis se provádí postupem popsaným v přípravě 1, sekcí A za použití šikmého média A a produkčního média I. Inkubace produkčního média byla asi 66 hodin.

B. Deacylace Norn-t-BOC komplexu

Nom-t-BOC komplex (1185 g surového substrátu obsahujícího asi 176 g A-21978C komplexu) se přidá к fermentačnímu médiu. Deacylace se provádí postupem popsaným v přípravě 1. odstavci B. Deacylace je úplná podle vysokotlaké kapalinové chromatografie po asi 24 hodinách.

C. Izolace A-21978C Nom-t-BOC jádra

Fermentační médium (100 1) získané postupem podle odstavce В se filtruje za použití filtrační hlinky (Hyflo Super-Cel). Filtrát se proleje kolonou obsahující 7,5 1 HP-20 pryskyřice (DIAION), kolona se promyje vodou (38 1). Eluce se sleduje vysokotlakovou kapalinovou chromatografií na silikagelu Cie za detekce ultrafialovým zářením při 254 nm. Část jádra se eluuje při promývání. Následující eluce jádra se provádí směsí vody a acetonitrilu (95:5), 40 litry, (9:1) 40 litry a (85 : 15) 100 litry. Frakce obsahující jádro se spojí, zahustí ve vakuu, aby se odstranilo rozpouštědlo, mrazově sublimuje a získá se 298,5· g poločistého A-21978'C N_Oin-t-BOC jádra.

D. Čištění A-21978C N_O1n-t-B0C jádra

Polovyčištěné A-21978C N₀,._n-t-BOC jádro, (30 g) získané postupem podle odstavce C se rozpustí ve směsi vody a acetonitrilu (9:1) obsahující 0,2 % kyseliny octové a 0,8 % pyridinu (75 ml). Tento roztok se nanese na nerezovou kolonu· 4,7 X 192 cm obsahující 3,33 1 silikagelu Quantum LP-l/Cis ekvilibrované ve stejném rozpouštědlovém systému. Kolona se vyvíjí za tlaku směsí vody, acetonitrilu a methanolu (80:15:5) obsahující 0,2 % kyseliny octové a 0,8 % pyridinu. Jímají se 350 ml frakce a produkt se deteguje UV světlem při 280 nm. Frakce obsahující produkt se spojí, zahustí ve vakuu, aby se odstranilo rozpouštědlo a mrazovou sublimací se získá 18,4 g vyčištěného A-21978C Nom-t-BOC jádra.

A-21978C t-BOC jádro má následující charakteristiky:

a) Forma:

bílá amorfní pevná látka fluoreskující v krátkovlnné UV oblasti

b) Empirický vzorec:

C7SH91N97O27

c) Molekulární hmotnost:

1565

d) Rozpustnost: rozpustný ve vodě

e) Infračervené absorpční spektrum (KBr) vykazuje absorpční maxima při následujících délkách (cm'¹):

345 (široký),

065 (slabý),

975 (slabý),

936 (slabý), ~ 1 710 (inflex),

660 (silný),

530 (silný),

452 (slabý),

395 (střední),

368 (slabý),

341 (slabý),

250 (střední),

228 (střední),

1166 (střední až slabý) a

063 (slabý).

f) UV absorpční spektrum v 90% et/hanolu vykazuje maxima při:

220 nm (s 42,000) a

260 nm (ε 10,600)

g) Vysokotlaká kapalinová chromatografie retenční čas = 6 min na 4,6 X 330 mm koloně silikagelu C18 za použití: H2O/CH3CN/CH3OH (80:15:5) rozpouštědel obsahujících 0,2 % NHíOAc rychlostí 2 ml/min a UV detekce.

P ř í ip r a v a 5

Alternativní čištění A-21978C N_O111-t-BOC jádra

Polovyčištěné A-21978C N_Om-t-B0C jádro (10,8 g) připravené postupem podle přípravy 4, odstavec C se rozpustí ve vodě a nanese na kolonu obsahující 80 ml Amberlitu IRA-68 (v acetátovém cyklu). Kolona se promyje vodou a rychlostí 5 ml/mln se pak eluuje 0,05N kyselinou octovou (1080 ml), 0,lN kyselinou octovou (840 ml) a 0,2N kyselinou octovou (3 120 ml) a jímají se 120mililitrově frakce.

Eluát se sleduje analytickou vysokotlakovou kapalinovou chromatografii na silikagelu/Cie za použití směsi voda-acetonitril-tnethanol (80:15:5) obsahující 0,2 % octan amonný a detekce se provádí ultrafialovým zářením při 254 nm. Frakce obsahující produkt se spojí, ,pH roztoku se upraví na 5,8 pyridinem, vzniklý roztok se zahustí ve vakuu na objem asi 200 ml. Ke koncentrátu se přidá voda a vzniklý roztok se zno vu zahustí a pyridin se odstraní. Tento .koncentrát se mrazově sublimuje a získá se 3,46 g čistého A-21978C N_0lll-t-BOC jádra.

Příklady 1 až 16

Příprava různých alkanoyl- a alkenoylderivátů acylací sloučenin vzorce III, reprezentativní příprava sloučenin vzorce I, je shrnuta v tabulce I níže. Deriváty v tabulce I se připravují buď modifikovanou Schotten-Baumanovou reakcí za použití chloridu kyseliny jaiko acylačního činidla (metoda A) nebo metodou aktivního esteru použitím 2,4,5-trichlorfenylesteru jako acylačního či- nidla (metoda B). Obecné postupy pro provedení acylačních reakcí metodou A nebo metodou В jsou uvedeny níže.

Metoda A (Modifikovaná Schotten-Baumanova reakce)

Tato metoda zahrnuje reakci jádra vzorce III s chloridem alkanové nebo alkenové kyseliny, která odpovídá požadovanému postrannímu řetězci acylu.

Sloučenina vzorce III (1,95 až 2,16 g, 1,33 až 1,47 mmolu) nebo sloučenina vzorce II (409 mg, 0,25 mmolu) se rozpustí v 200 ml směsi pyridinu a vody (9:1). Acylační činidlo (.18- až 20mmolový přebytek acylchloridu rozpuštěný v 15 ml acetonu) se přikape během 1 až 3 ihodin a reakční směs se míchá při teplotě místnosti další 2 až 3 hodiny. Reakční směs se odpařením zbaví acetonu a zbylá vodná fáze se zředí vodou na objem asi 200 ml. Hodnota pH tohoto roztoku se upraví na pH 3,0 až 3,5 ledovou kyselinou octovou. Tento roztok se osmkrát promyje stejnými objemy dlethyletheru a pak se lyofílízuje. .

Surový acylovaný derivát se čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografii na reverzní fázi následujícím způsobem:

Vzorek, rozpuštěný ve vodě nebo ve směsi elučních rozpouštědel (asi 4 až 6,5 ml) se nanese na nerezovou .kolonu 74 X 1,6 cm naplněnou nosičem LPi/Cie. Kolona se eluuje směsí sestávající z vody, methanolu, acetonitrilu, pyridinu a kyseliny octové. F.luce se provádí za tlaku asi 10,3 až 13,8 MPa rychlostí asi 10 až 12 ml/min, použitím LDC duplex pumpy (Mllton-Royj. Eluát se sleduje UV detektorem, použití ISCO-UA-5 detektoru při 280 nm.

Požadované frakce se spojí a odpaří ve vakuu к suchu a získá se požadovaný alkanoylderivát. Vyčištěný produkt se analyzuje použitím chromatografie na tenké vrstvě na deskách s obrácenou fází (Whatman KCie) a směsí voda, metfhanol, acetonitril, pyridin, kyselina octová (45 : 15 : 40 : 2 : 2). Desky se pro detekci pozorují v UV záření. Produkt se analyzuje také UV absorpcí (extiňkční koeficienty při 220 nm a 260 nm) a analýzou aminokyselin. Čistota se stanoví analy257786 ticky vysokotlakou kapalinovou chromatografií na reverzních fázích (Cis Microbondapack, Waters Co.) směsí rozpouštědel voda, methanol, acetonitril, pyridin, kyselina octová a monitorací UV zářením při 280 nm.

Metoda В (aktivní 2,4,5-trichlorfenylester)

Roztok Norn-t-BOC A-21978C jádra (1,0 g, 0,64 mmolu), A-21978C jádra (0,5 až 1,0 g, 0,34 až 0,6'8 mmolu) nebo A-21978C, (946 mg, 0,58 mmolu) a 3,5 molární přebytek trichlorfenylacyl aktivního· esteru se rozpustí v dimethylformamidu (100 ml) a míchá se při teplotě místnosti až 50 °C ipo dobu 6 až 20 hodin. Reakční směs se zahustí ve vakuu. Získaný olej se rozmělní s 50 ml směsi ethe ru a toluenu (1:1) a promyje se etherem. Monoacylované a diacylované deriváty A-21978C jádra, acylovaný A-21978C1 a acylované t-BOC A-21978C jádro se čistí postupem popsaným v metodě A.

Acylované t-BOC-A-21978C jádro se deblokuje použitím 50 mg/ml směsi trifluoroctové kyseliny, anisolu a triethylsilanu (10 :1:1) při teplotě od asi —10 do asi 0 °C po dobu 3 až 5 minut. Reakční směs se zahustí ve vakuu a získaný olej se rozmělní s dvěma 20 ml objemy etheru. Surový acylovaný produkt se čistí vysokotlakou kapalinovou chro•matografií na reverzní fázi a analyzuje se postupem popsaným v metodě A.

Specifické sloučeniny v příkladech jsou shrnuty v· tabulkách I až X a jsou to sloučeniny vzorce I.

(I)

Příprava N_Trp-monoacyl derivátů A-21978C cyklických peptidů

00

CM

o

CM

o

on

tD

(<

Γ-Ν

o

in

co

CD

on

CD

v4

co

14

on

Ю

O}

i-4

co

CM

CM

63

on

on

on

00

CM

CM

on

CM

CM

CM

CM

o in ’ф	o LÍD
Ю ΙΩ	LÍD
, 1-4 i-4	1-4
m O	in
sr	CO
LÍD	o
• cd a	LO
> . . )CD 1
> in >co	un
! x3	14
i ’· ω	• ·
ί о Д	m
CM	on

Charakteristiky N_Trp-monoacyl derivátů A-21978C cyklických peptidů

Slouče- R R¹ R² Rf^a Analýza HPLC UV nina č. eluát^b s_;._max 220 nm 260 nm

Q

ο

Ο

ο

ο

ο

ο

СМ

Q

α

Q

ο

Ο

ο

Ο

ο

ο

ο

ο

φ

ο

ο

ο

ο

ο

τ—1

Ο)

Ο

LO

СМ

ο

Ю

φ

Τ—<

ο

ο

ο

ο

СО

СО

со

со

со

φ

со

00

ο

φ

φ

ιη

ο

Φ

Φ

φ

φ

φ

φ

φ

φ

ΙΟ

LO

φ

φ

Ш

Ю

ιη

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ο

ω Q

<Ν

φ

φ

φ

φ

φ

Ο) φ

ο τΗ

ο со

φ

φ

φ

1Л 1Γ) ю Ю ιπ ιη

ιη

• ·

* ·

’ ·

1П

ιη

ιη τΗ

τΗ

гЧ

φ

τ-Η

гЧ

τΗ

τ—1

ο

ο

ο

τ—1

гЧ

ο

ο

ιη

1П

Ш

ιη

ιη

ο

rH

Ο)

ιη

ιη

ιη φ

со

со

φ

φ

φ

φ

φ

ιη.

СП

φ

φ

°°. °R 4 in ^ю

Q* θ' θ' θ' θ' θ' θ' qf θ' θ' Q* θ' θ'

СП

X) U

2S7766

Příprava N_Trp'N_Orn‘diacyl A-21978C derivátů

Příklad R R¹ R² Metoda Výchozí Acylační Reakční HPLC Produkt

č. přípravy materiál činidlo doba eluce² (mg)

						co
00	Ю	r—4	O	00	CO	HO	CD
l>	CO	CD	CO	ID	co		LÍD
CN	00	CN		T—1	oo	CN	in

N
ДО	л ί>> CL
O	OjS <D CB
	О д Д
	.. —· >CJ
LO
CN	О Λ n лч

i

Р4 o o o σι o o o o o o o o o o α cm

CO b Ю 0Э χφ χφ хф о

о о

н н ΖΖ

Ю ю 1Л Ю LO % £

LO

Charakteristiky N_Trp, N_Om-diacyl A-21978C derivátů >У

ю (ti tí <rH

CM

Tabulka V

Ctí o

in

LQ r—i

O

IQ

LQ

CO

Ю r-í

O

Ю o

LQ

Ctí Ό o -Ь-Í ω 2

CM > Ctí Fh Λ E a<

T3

Ctí

CQ

'O

S' Λ ctí ω

X) О

2S7766

S д o CM OJ сч &

í-4

CA

O O co

CO CO

O

Tabulka VI

I <D >G) ca o co

Ю ctf tí ··*<

Ol

Příklad 27

Ν_Γιρ-( n-dekanoyl) A-21978C jádro (sloučenina 4]

Následující postup objasňuje přípravu sloučenin ve velkém metodou aktivního esteru.

A. Příprava 2,4,5-trichlorfenyl n-dekanoátu

Roztok dekanoylchloridu (Pfaltz a Bauer, 5.6 ml) a 2,4,5-trichlorfenolu (5,6 g) v diethyletheru (1 litr) a pyridinu (120 ml) se míchá 4 hodiny. Reakční směs se filtruje a suší ve vakuu. 2,4,5-trichlorfenyl n-dekanoát se čistí na koloně silikagelu (Woelm) použitím toluenu jako elučního činidla. Frakce se sledují chromatografií na tenké vrstvě za použití krátkovlnné UV detekce. Příslušné frakce se spojí a suší ve vakuu. Získá se 10,4 g 2,4,5-trichlorfenyl n-dekanoátu.

B. Acylace N_í)rn-t-BOC-A-21978C jádra '2,4,5-trichlorfenyl n-dekanvátem

Roztok Norn-t-BOC A-21978C jádra (15,0 g) a 2,4,5-trichlorfenyl n-dekanoátu (15,0 g) v bezvodém diimethylformamidu (500 ml) se míchá 25 hodin při teplotě místnosti v atmosféře dusíku. Směs se pak míchá 5 hodin při 60 C až je reakce podle chro-matografie na tenké vrstvě ukončena. Reakční směs se zahustí ve vakuu na objem asi 200 ml -a míchá se s 1,2 litry směsi Et20 a toluenu (5 : :1). Produkt se odfiltruje, promyje etherem, vysuší ve vakuu a získá se 15,05 g N_Trp- (n-kanoyl) -N_Orn-t-B0C A-21978C jádra, meziproduktu (vzorec I; R = n — dekanoyl, R¹ = H, R² = t-BOC).

C. Čištění N_Trp-( n-dekanoyl)-N_Olll-t-B0C A-21978C jádra

N_Ttp-( n-dekanoyl )-N_Orn-t-BOC-A-21978C jádro se čistí následujícím způsobem: Surový produkt se rozpustí v 50 ml směsi rozpouštědel používaných pro eluci а рок se čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií použitím Waters/Prep 500 systému s náplní reverzní fáze C18 silikagelu jako adsorbentu. Systém se eluuje směsí voda, methanol, acetonitril (50:15:35) obsahující 0,2 % pyridinu a 0,2 % kyseliny octové. Frakce se sledují v UV záření při 280 nm. Příslušné frakce se spojí a suší ve vakuu. Získá se 8,56 g vyčištěného N_Trp-( n-dekanoyl )-N_Orir t-BOC А 21978C jádra.

D. Odstranění N_Orn-t-B0C skupiny t-BOC skupina se odstraní mícháním N_rrp- (n-dekanoyl) -Nom-t-BOC A-21978C jádra (1,47 g) v 15 ml směsi trifluoroctové kyseliny a 1,2-ethandithiolu (10:1) 3 hodiny při teplotě místnosti. Reakční směs se suší ve vakuu a zbytek se rozmělní s etherem (50 mililitrů). Po promytí 20 ml etheru se produkt suší ve vakuu a získá se 2,59 g surového N_T1p-(n-dekanoyl)-A-21978C jádra (vzorec I: R = in-dekanoyl; R¹ a R² = Н].

E. Čištění N_Tip-(n-dekanoyl)-A-21978C jádra

Surové N_Trp-(n-dekanoyl)-A-21978C jádra

Surové N_Tlp- (n-dekanoyl) -A-21978C jádro se čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi následujícím způsobem: Vzorek (2,59 g) se rozpustí v 4,0 mililitru směsi vody, methanolu, acetonitrilu, pyridinu a kyseliny octové (50 : 15 : 35 : :2:2), nanese se na ocelovou kolonu 74 X X 2,54 cm naplněnou adsorbentem LP-l/Cie. Kolona se eluuje stejným systémem rozpouštědel. Eluce se provádí za tlaku 8,3 až 11,8 MPa rychlostí 10 až 12 ml/min použitím LDC duplex pumpy (Milton-Royl). Eluát se sleduje UV detektorem (Isco Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Avenue, Lincoln, NB 68504) při 280 nm. Frakce (20 až 24 ml) se jímají každé dvě minuty. Požadované frakce podle antimikrobiální aktivity se spojí a suší ve vakuu a získá se 1,05 g produktu.

Tento čisticí postup se opakuje s 4,35 g,

4,25 g, 2,14 g, 2,00 g a 1,75 g surového výchozího derivátu a celkem se získá 5,58 g čistého N_Tip-(n-dekanoylJ-A-21978C jádra.

P ř í klad 28

N_TrP- (n-dekanoyl) -N_Kyll- (n-dekanoyl) -A-21970C (sloučenina 21)

N _Trp- (n-dekanoyl) -N_Kyn- (n-dekanoyl) -A-21978C jádro (vzorec I: R a R¹ = n-dekanoyl; R² = H) je minoritním reakčním produktem při přípravě N_Trp-(n-dekanoyl )derivátu podle příkladu 27. Izoluje se během čištění vysokotlakou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi popsanou v odstavci É. Požadované frakce se spojí a suší se ve vakuu. Získá se 211 mg surového produktu. Sloučenina se čistí analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií (C18 Microbondapak Waters Co.) použitím vody, methanolu, acetonitrilu, amoniaku a kyseliny octové [6 : 23 : 15 : 0,5 : 0,5) jako elučního činidla (32 opakování pro 500 /zg v každém injikovaném vzorku). Získá se 4,4 mg N_Trp-(n-dekanoyl )-N!;_yn-(ⁿ‘dekanoyl)-A-21978C jádra, identifikované NMR spektrem změřeném na 360 MHz.

Příklad 29

N_T1P-Cbz-Noin-lauroyI A-21978C jádra (sloučenina 20)

Tato metoda zahrnuje chránění «-amino257766 skupiny tryptofanu N_Onrt-BOC-A-21978C jádra Cbz skupinou a pak odstraněním t-BOC skupiny a acylací (na a-aminoskupině ornithinu ) trichlorfenyl-lauroyl esterem.

A. Příprava N_np-Cbz-N_Ol(1-t-BOC-A-21978C jádra

N_Orll-t-BOC-A-21978C jádro (1,0 g) se rozpustí v dimethylformamidu (150 mlj a ohřeje se na 60 °C. Přidá se N,O-bis-trimethylsilylaceta-mid (0,55 ml) a pak se přidá benzyl ipentachlorfenylkarboinát (257 mg). Po 20 hodinách míchání se reakční směs zahustí na objem asi 20 až 25 ml. Přidá se voda (100 ml) a pH tohoto roztoku se upraví IN NaOH na 6,0. Směs se promyje ethyletherem (6 X 200 ml objemu) a pak se lyofilizuje.

Surový derivát se čistí vysokotlakou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi následujícím způsobem:

Vzorek se rozpustí asi v 6 ml vody, methanolu, -acetonitrilu, pyridinu a kyseliny octové (55:15:30:2:2) a injikuje se na 74 X 1,25 cm nerezovou kolonu naplněnou LP-1/C18 nosičem. Požadované frakce se sledují UV absorpcí (280 nm) a antimikrobiální aktivitou. Tyto frakce se pak spojí a lyofilizují. Získá se 951 mg derivátu N_Trp-Cbz-Nom-t-BOC A-21978C jádra.

B. Odstranění t-BOC skupiny t-BOC skupina se odstraní rozpuštěním meziproduktu v množství 50 mg/ml směsi trifluoroctové kyseliny, anisolu a triethylsilanu (10 : 1 : 1) při —10 ^aC po dobu 3 minut. Reakční směs se zahustí na olej, který se rozmělní 12 X 25 -ml ethyletheru. Získá se 520 mg surového N_(l|1-Cbz-A-21978C jádra,

C. Acylace N_]ip-Cbz-A-21978C jádra

N7_ip-Cbz-A-21978C jádro se acyluje acyl-ační metodou aktivovaného trichlorfenylesteru. Přidá se N_Tip-Cbz-A-21978C (520 mg) к roztoku 1-hydroxybenzotriazolu (7 mg) a -aktivního lauroyltríchlorfenylesteru (123 miligramů) v pyridinu, (150 iml). Po 20hodinovém míchání při 60 °C se reakční směs zahustí na odparek, který se rozmělní ethyletherem (3krát po 25 ml objemech). Získá se NTrp-Cbz-N_0nrlauroyl-A-21978C jádro (550 miligramů).

Příklad 30

Příprava Schiffových bází a redukovaných Schiffových bází

Některé reakce se provádějí následujícím způsobem: A-21978C jádro (40 mg) se rozpustí ve vodě (2 .ml). Hodnota pH se upraví na 4 až 9 přidáním IN NaOH. Alikvotní podíly (0,5 ml) tohoto roztoku se pak smísí s každým z následujících aldehydů (5 μΐ):

1. heptaldehyd

2. oktylaldehyd

3. de-cylaldehyd

4. undecylaldehyd v methanolu (4 ml). Reakce se míchají při teplotě místnosti přes noc. Vzniklé Schiffovy báze se redukují N-aBHsCN (2,5 mg na reakci) po dobu 5 minut při teplotě místnosti.

Reakční směs se hodnotí chromatografií na tenké vrstvě silikagelu použitím směsi acetonitrilu a vody (7:3) a testem na Staphylococcus aureus. Schiffovy báze nejsou na

S. aureus při tomto testu aktivní vzhledem к jejich nestabilitě za podmínek testu. Při každé redukční reakci vznikají dva fa.ktory. Tyto sloučeniny jsou aktivní na S. aureus a mají obdobnou pohyblivost v systému používaném při chromatografií na tenké vrstvě. Bylo tak zjištěno, že vznikají následující sloučeniny vzorce 1 (v každém případě R¹ je atom vodíku).

Tabulka
Příprava Schiffových bází a redukovaných	Schiffových bází
Reakce A-21978C s	Produkt
R	R2	Aktivita >na S. aureus9

heptaldehydem	СНз[СН2)5СН =	Н	пе
	СНз(СН2)б—	Н	апо
	СЫз(СН2)5СН =	СНз(СН2)5СН =	пе
	СНз[С№]б—	СНз(СН2]б—	апо
oktylaldehydem	СНз(СН2 JgCH -	н	пе
	СНЗ(СН2)7—	н	апо
	СНз[СН2)вСН =	СНз(СН2)бСП =	пе
	СНз(СН2)7—	СНз(СН2]7—	апо
decylaldehydem	СНз(СН2)8СН =	н	пе
	СНз[СН2)9—	н	апо
	СНз(СН2)8СН =	СНЗ(СН2)8СН =	пе
	СНз(СН2)9—	СНз(СН2)9—	апо
undecylaldehydem	СНз[СН2)9СН =	н	пе
	СНз(СН2)ю—	н	апо
	СНз[СН2]9СН =	СНз(СН2)9СН =	пе
	СНз[СН2)ю—	СНз(СН2]10—	апо

^a Neaktivita Schiffových bází při tomto testu může být způsobena nestabilitou za podmínek testu.

Příklad 31

Příprava Nr_lT-laurylaldehydových Schiffových bází a N_Trp, N_Onrdllaurylaldehydových Schiffových bází a jejich redukovaných Schiffových bází (sloučeniny 22 a 23]

A-21978C jádro (1 g) se rozpustí vc vodě (50 ml) a přidá se dodecylaldehyd [588^1] v methanolu (200 ml). Reakční směs se míchá ipři teplotě místnosti přes noc. Reakční směs se pak redukuje 50 minut přidáním NaBHsCN (291 ing). Reakční směs se filtruje ve vakuu použitím papíru Whatman č. 1. Supernatant se zahustí, vodný roztok se pak lyofilizuje a získá se 1,256 g produktu. Tento produkt se hodnotí analytickou vysokotlakou kapalinovou chromatografií a čistí po částech preparativní vysokotlakou kapalinovou chromatografií na reverzní fázi.

Každá část (350 mg) se rozpustí v 50 % vodného methanolu (6 ml) somkuje a zahřátím se materiál rozpustí. Roztok se pak naleje na kolonu 80 cm X 1,5 cm s LPi-Cis nosičem a eluce se provádí směsí methanolu, acetonitrilu, vody [25 : 40 : 35) obsahující 0,2 '% pyridinu a 0,2 % kyseliny octové rychlostí 7,5 ml/min. Eluce se sleduje UV detektorem při 280 nm. Frakce obsahující požadované produkty se spojí a získá se celkem 104 mg N_Tr_P-(n-dodecyl)-A-21978C jádra [sloučenina 22) a 19,2 mg N_Trp-(n-dodecyl)-N_Oin-(ⁿ’dQdecyl)-A-21978C jádra (sloučenina 23).

Příklad 32

Antibakteriální účinnost sloučenin obecného vzorce I je možno prokázat testy in vitro. Výsledky antibakteriálních testů reprezentativních sloučenin vzorce I použitím standardních difúzních testů na agarových deskách jsou uvedeny v tabulce VII. V tabulce VII se aktivita měří velikostí zóny (průměr v mm), ve které růst mikroorganismu je inhibován testovanou sloučeninou.

Antibakteriální aktivita sloučenin vzorce I stanovená difúzním testem na agarové desce

vrch; inkubace: 24 až 48 hodin při 25 až 37 °C. Růst na minimálně výživném agaru tr = stopy

I

Výsledky antibakteriálních testů reprezentativních sloučenin vzorce I standardním zřectovacím testem na agaru jsou shrnuté v tabulce VIII. V tabulce VIII uvedená aktivita se měří jako minimální inhibiční koncentrace sloučeniny, při které je mikroorganismus inhibován testovanou sloučeninou.

гн th <N rH CM rH

со	ио
со	см	см^
О		о

σ) oo

гН	гН	см	гН	см
гН	см	см	СМ		СМ
• -	•	< ~	• г*		. -
ио	U0	гН	т-Ч	гН	см
θ'	θ' ·

ио	ио		ио
см	см
гН	гН	ио	°ч
θ'	сэ	θ'	θ'

LO O uo~ ^ю~

O rH rH O rH in Ú? rH ir? гН σ' со σ co UO

Q см 4 o o

см ио	ОЙ	см 1Л	ю во см r-H гН
θ'	О о	σ	сэ	л

UO

U0~ CM θ' θ' uo co

CM CO CO σ'

gS	ir? ю СМ см
5-	Q О'	см

U0^ σ' иэ σ'

ио см	ио см	ιη	LO	UO	ιη	UO CM rH	UO cm
σ	σ'	σ'	θ'	сэ	CD	θ'	cd

in σ'	in σ	rH	0,5	rH	ιο CD	Ю £	uo^ σ'
rH	rH	CM	rH	CM	rH	° CD	rH

см СМ СМ

см

см

LO

СМ СЭ

см см см со

Antibiotická aktivita A-21978C cyklických peptidů см

СО 00 ⁰⁰ со

СО СМ

со <£>

со ^м со см

Q0 см ω

.2 ’S о ω д

CU

си д о t-ч о си д о t-ч е сл д о ω о

СП

CO	oo	co	CD	00	00	00	N1	oo	CN	00
CM			т-Ч						CO

CN

CN

ČÍ

1O o

in θ' r4

O CN

00	CO	CM	oo	CN	CN	Ν’	1 00	тМ
	r4	oo		00	CO		1 CN	CD
						r4

pokračování tabulky VIII

Testovaný organismus MIC hodnoty testovaných sloučenin¹

o LO

CO т-Ч

00	Ν’	oo	00	00	00	гЧ	Ю	00	oo
	CD	CM	CM	CN	Ol			CM	CM
		y-H	т-Ч	т-Ч	r4		cd	t—1	r4
		A	A	A	A			A	A

00

CN

N*

CO

Ni	co	CO	00	σ.)	QJ	yH	N	64	CM 00
	00	TM	Ν’	co	00	гЧ	CM	64;	óT oo
TM	N1	O0	N	00	Ni	гЧ	CM	32	co
	Ni	00	00	co	co	гН	CM	Ni CO	CN CO

00 CM т-Ч	00 CN гЧ	00 CM r4	00 CM rH	00 CM гЧ	co CN rH	00 CN т-Ч	co CN r-4	00 CN r4	00 CN γ-Ч
A	A	A	A	A	A	A	A	A	A

v4 CM

in

CD θ'

CM

44

А-21978С cyklické peptldy vzorce I vykazují in vivo antlbakteriální účinnost na dvě experimentálně vyvolané bakteriální infekce. Jestliže se dvě dávky testované sloučeniny aplikují podkožně nebo orálně myším s vyvolanou infekcí, pak získaná aktivita se měří jako EDso hodnoty (účinná dávka v mg/kg, která chrání 50 °/o testovaných živočichů, viz Warren Wick aj. J. Bacteriol. 81, 233 až 235 (1961]]. Pozorované EDso hodnoty reprezentitivních A-21978C sloučenin vzorce I jsou uvedené v tabulce IX.

- 5 7 7 6 6 >ω rS *3 o

Tabulka IX

In vivo aktivita A-21978C cyklických peptidů

Slouče- Sloučenina vzorce I R¹ R² EDso hodnoty³ nina č. R Staphylococcus Streptococcus pyogenes >CD

O

o

bx

o o CM

o

o

00

LQ

o o CM

O

O

O

CJ

o

CD

00

cn

Ю

v

o

o

oo

bs

O

O

O

H

CM

CD

CO

co

CM

CM

Т-Ч

A

CM

CM

CM

Z

A

cvT

т“Ч

o

A

A

• *· 00

A

A

A

O)

LQ

CD

v

υ-1

LQ QO

Ю 00 θ' co co £ in

CO CM 00 C\l^ CM~

CQ r-Γ θ' CO r-Γ CD л Г-Г

Λ

ТЭ

Výsledky testů toxicity některých A-21978C cyklických peptidů vzorce I jsou shrnuté v tabulce X.

Tabuilka X

Toxicita A-21978C cyklických peptidů

Sloučenina C.	Sloučenina vzorce I R	R1	R2	LDso (mg/kg] u myší3
1	СНз(СН2)5СО—	н	н	> 600
2	СНз(СН2)бСО—	н	н	> 600
3	СНЗ(СН2)7СО—	н	н	> 600
4	СНз(СН2)8СО—	н	н	> 300
5	СНз(СН2]9СО—	н	н	> 600
6	СНз(СН2)10СО—	н	н	144; 265b
7	СНз(СН2)11СО—	н	н	112,5
8	СНз(СН2)12СО—	н	н	62,5; < 150
9	СНЗ(СН2)13СО—	н	н	56, 25
10	СН5(СН2)14СО—	н	н	50
11	СН2 = СН— (СН2)8СО—	н	н	L- 500
12	С Нз (СН2 ]зСН = CH (СН2) 7СО-	н	н	450
14	СНзСНгСН (СНз и СН2) 6С О—	н	СНзСО—	> 600; 600
15	СНзСНгСН (СНз ] (СНг )бСО—	н	НОСО(СН2)2СО—	450; 600
16	СНз(СН2)бСО—	н	СНз(СН2)бСО—	> 600
17	СНз(СН2)9СО—	н	СНз(СН2)9СО—	94
22	СНз(СН2)11СО—	н	н	'> 300

³ intravenosní aplikace, ^b dva pokusy

Claims (7)

1. PŘEDMĚT vynalezu

   1. Způsob přípravy derivátu

   A-21978C cyklického peptidů obecného vzorce I kde

   R, R¹ a R² jsou na sobě nezávisle’ vodíku, alkanoyl s 2 až 19 atomy чϊιΙίΚυ, případně substituovaný karboxylem, alkonoyl s 5 až 19 atomy uhlíku nebo skupina chrániči aminoskupinu vybrané z karbobeinzyloxyskupiny nebo terc.butoxykarbonylskupiny,

   R³, R⁴ a R⁵ jsou atomy vodíku, přičemž

   1. alespoň jedna ze skupin R, R¹ nebo R² musí mít jiný význam než atom vodíku nebo skupina chránící aminoskupinu, definovaná výše,
2. 2. alespoň jedna ze skupin R¹ nebo R² musí být atom vodíku nebo skupina chránící aminoskupinu definovaná výše,
3. 3. R, R¹ a R² skupiny musí dohromady obsahovat alespoň čtyři atomy uhlíku a
4. 4. jestliže oba substituenty R¹ a R² jsou atomy vodíku nebo skupiny chránící aminoskupinu definované výše, R nemůže být 8-methyldekanoyl, 10-methylundekanoyl, 10-methyldodekanoyl, specifická alkanoylskupina s 10 atomy uhlíku A-21978C faktoru Co nebo specifické alkanoylskupiny s 12 atomy uhlíku A-21978C faktorů C4 а C5 a farmaceuticky vhodných solí těchto peptidů, vyznačující se tím, že se A-21978C cyklické peptidické jádro obecného vzorce III

   4В nebo jeho příslušně chráněný derivát, kde R‘ a R° jsou na sobě nezávisle atom vodíku nebo skupina chrániči aminoskupinu definovaná výše nebo odpovídající farmaceuticky vhodná sůl, nechá reagovat s acylačním činidlem obecného vzorce V

   R^tí—COOH (V) nebo jeho aktivovaným derivátem, kde R⁶ je alkyl s 1 až 18 atomy uhlíku, případně substituovaný karboxylem, nebo alkenyl s 4 až 18 atomy uhlíku, a případně se odstraní jakákoliv chránící skupina, která může být přítomná v produktu výše uvedené reakce.

   2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se nechají reagovat výše uvedené výchozí sloučeniny za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, kde R je alkanoyl obecného vzorce

   C

   II

   CH5(CH2)„-On je celé číslo od 3 do 17.

   3. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se nechají reagovat výše uvedené výchozí sloučeniny za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, kde R je alkanoyl obecného vzorce

   СНз O

   I ΊΙ

   СНз (CH2)CH— (CH2 j c— a n a m jsou na sobě nezávisle celá čísla od

   0 do 14, přičemž -n + m nesmí být menší než 1 a větší než 15 a dále jestliže n je 0, m nesmí být 8 a jestliže n je 1, m nesmí být 6 nebo 8.

   4. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se nechají reagovat výše uvedené výchozí sloučeniny za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, kde R je cis nebo trans-alkenoyl obecného vzorce

   O

   I!

   СНз(СН2)„—CH--CH— (СНг)·.—c— kde n a m jsou na sobě nezávisle celá čísla od 0 do 14, přičemž n 4- m nesmí být menší než 1 a větší než 15.
5. 5. Způsob ipodle bodu 1, vyznačený tím, že se nechají reagovat výše uvedené výchozí sloučeniny za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, kde R je cis nebo trans-alkenoyl obecného vzorce

   O

   II

   CH2=CH(CH2)n—c— kde n je celé číslo od 12 do 16.
6. 6. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se nechají reagovat výše uvedené výchozí sloučeniny za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, kde R je n-dekanoyl.
7. 7. Způsob podle bodu 6, vyznačený tím, že se nechají reagovat výše uvedené výchozí sloučeniny za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, kde SR je n-dekanoyl a R¹, R², R³, R⁴ a R⁵ jsou atomy vodíku.