FI79118C - Foerfarande foer framstaellning av nya, terapeutiskt anvaendbara, cykliska a-21978c-peptidderivat. - Google Patents

Description

1 79118

Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten, syklisten A-21978C peptidijohdannaisten valmistamiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä uusien, terapeutti-5 sesti käyttökelpoisten, syklisten A-21978C-peptidijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava 1 ΪΝΗΙΐ1 l /\ /CH3 / \ / \

Hi U

/ \/\/\ .0 0=< T * CONH, „ “ "R' " "•O-^VSVy'^ n > -< μ 1ΐ-,-Λ ·> > u yv o=A \=o i 20 o V H_f\ K/k/VA/vv^ s Y i 3 HOaC ^ 2, 25 jossa R on C^-C^g-alkanoyyli, C-^-C^-alkenoyyli tai ami-noryhmää suojaava ryhmä; R·^ on vety tai C^-C^g-alkanoyyli; ja R^ on vety, C^-C^2_al^an°yyli# sukkinyyli tai aminoryhmää 30 suojaava ryhmä; sillä edellytyksellä, että 1 2 1) vähintään yksi ryhmistä R, R ja R on jokin muu kuin vety tai aminoryhmää suojaava ryhmä, 1 2 2) vähintään toinen ryhmistä R ja R on vety tai amino- 35 ryhmää suojaava ryhmä, 1 . 2 3) R, R ja R sisältävät yhteensä vähintään neljä hiili-atomia ja 2 79118 1 2 4) sekä R :n että R :n ollessa ;joko vety tai aminoryhmää suojaava ryhmä R ei ole 8-metyylidekanoyyli, 10-metyyli-undekanoyyli, A-21978C-tekijän Cq spesifinen C^Q-alkano-yyliryhmä tai A-21978C-tekijöiden C4 ja C5 spesifinen 5 C12-aHcan°yyliryhmä; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi. Näillä uusilla syklisten peptidien johdannaisilla on antibioottisia ominaisuuksia.

On olemassa suuri tarve kehittää uusia antibioot-10 teja sen suuren mahdollisuuden ja jatkuvan uhan vuoksi, että kehittyy määrättyjä antibiootteja kohtaan vastustuskykyisiä patogeenisten mikro-organismien kantoja. Erityisesti gram-positiivisten sukujen Staphylococcus ja Streptococcus patogeeniset lajit ovat usein vastustus-15 kykyisiä tavallisesti käytettyjä antibiootteja, kuten penisilliiniä ja erytromysiiniä, kohtaan; katso esimerkiksi W.O. Roye, Principles of Medicinal Chemistry 1974, s. 684 - 686.

Uudet kaavan (1) mukaiset sykliset A-21978C-pepti-20 dijohdannaiset ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat on todettu tehokkaiksi antibioottisiksi aineiksi.

Näitä uusia kaavan (1) mukaisia peptidijohdannaisia voidaan valmistaa saattamalla A-21978C-ydinpepti-di, joka on valmistettu deasyloimalla soveltuvalla taval-25 la suojattua A-21978C-yhdistelmä tai jokin sen soveltuvalla tavalla suojatuista yksittäisistä tekijöistä Cq, C^, C2, Cq, C4 tai Ccj, reagoimaan halutun sylointirea-genssina käytettävän hapon tai sen aktivoidun johdannaisen kanssa ja haluttaessa poistamalla mahdollisesti 30 läsnäolevat suojaryhmät ja/tai muuttamalla saatu tuote suolaksi.

Kaavan (1) mukaisten syklisten A-21978C-peptidi-johdannaisten ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen on todettu olevan käyttökelpoisia puolisynteet-35 tisiä antibakteerisia aineita tai sellaisiin aineisiin johtavia välituotteita.

3 79118 Tässä selitysosassa käytetään seuraavia lyhenteitä, joista useimmat ovat alalla yleisesti tunnettuja: Ala: alaniini Asp: asparagiinihappo 5 Gly: glysiini

Kyn: kynureniini Orn: ornitiini Ser: seriini Thr: treoniini 10 Trp: tryptofaani t-BOC: t-butoksikarbonyyli Cbz: bentsyloksikarbonyyli DMF: dimetyyliformamidi THF: tetrahydrofuraani 15 HPLC: korkean erotuskyvyn nestekromatografia NMR: 1H-ydinmagneettinen resonanssi TLC: ohutkerroskromatografia UV: ultravioletti A-21978C-antibiootit ovat läheistä sukua US-20 patenttijulkaisussa 4 208 403 kuvatuille happamille peptidiantibiooteille. Kuten US-patenttijulkaisussa 4 208 403 kuvataan, A-21978C-antibioottiyhdistelmä sisältää pääkomponentin, tekijän C, joka itsessään on läheisesti toisiaan muistuttavien tekijöiden yh-25 distelmä. A-21978C-tekijä C, jota kutsutaan A-21978C-yhdistelmäksi, käsittää yksittäiset tekijät Cq, C^, 0-2 ’ C3» C4 ja Cg. Tekijät C^, C2 ja Cg ovat päätekijöitä, ja tekijät Cq, ja Cg ovat sivutekijöitä. A-21978C-tekijöiden rakenne esitetään kaavassa 2.

ί 79118 L-Asp 'ϋ /

Gly 5 D~A,a 4/ f O-Ser L-Asp 4^

t 3MG

L-Orn 4/ \ L-Kyn 10 Gly q ^ \ t L-Thr t L-Asp t L-Asn 15 f L-Trp

NH

20 1

N

25 jossa 3MG on L-treo-3-metyyliglutamiinihappo ja R on

N

spesifinen rasvahappo-osa. Tekijöiden spesifiset R ryhmät ovat seuraavat: A-21978C -tekijä RN -ryhmä 30 8-metyylidekanoyyli C2 10-metyyliundekanoyyli C. 10-metyylidodekanoyyli jt CQ -alkanoyyli £ C^2 -alkanoyyli 35 C,. C-, „ -alkanoyyli* b 1 £ tarkemmin määrittämättä toistaiseksi 5 79118

Jouduttaessa vastakkain peptidiantibiootin deasy-lointiongelman kanssa, on erittäin vaikeata tietää, onko olemassa entsyymi, jota voidaan käyttää kyseiseen tarkoitukseen. Sellaisen entsyymin löytäminen on vielä 5 vaikeampaa silloin, kun substraattiantibiootti sisältää syklisen peptidirungon. Koska entsyymit ovat hyvin spesifisiä, peptidiosassa ja substraattiantibiootin sivuketjussa esiintyvät erot vaikuttavat deasylointiyri-tyksen onnistumiseen. Lisäksi monet mikro-organismit 10 tuottavat useita peptidaaseja, jotka vaikuttavat pepti-diosan eri kohtiin. Tämä johtaa usein vaikeasti käsiteltäviin tuoteseoksiin.

Entsyymiä, jota käytetään asyyliryhmän poistamiseksi rasvahapposivuketjun tryptofäänin o^-aminoryhmästä, 15 voidaan tuottaa Actinoplanaceae-heimoon kuuluvan mikro-organismin, edullisesti Actinoplanes utahensis NRRL 12052 -mikro-organismin, tai sen muunnoksen avulla. Asyyliryhmän poistamiseksi antibiootti, joka kuuluu A-21978C-yhdistelmän, A-21978C -tekijöiden CQ, C^/ C^, ja 20 Ci-, suojatun A-21978C -yhdistelmän ja suojattujen A21978C -tekijöiden CQ, C2, C3, C4 ja Cg muodostamaan ryhmään, lisätään mikro-organismiviljelmään. Ilmaisu "suojatut A-21978C -tekijät" ja "suojattu A-21978 -yhdistelmä" viittaa yksittäisiin A-21978C -teki-25 joihin tai tekijöiden seoksiin (yhdistelmään), joissa organitiinin ja/tai kynureiinin aminoryhmä on suojattu aminoryhmän suojausryhmällä. Edullisesti aminoryhmää suojaava ryhmä sijaitsee yksittäisen tekijän tai tekijöiden seoksen ornitiinin <£-aminoryhmässä. Viljelmän 30 annetaan inkuboitua substraatin kanssa, kunnes deasyloi-tuminen on jokseenkin täydellistä. Siten saatu vastaava A-21978 -syklinen peptidi erotetaan fermentointiliemestä alalla tunnetuin menetelmin.

Tällaisin entsymaattisin deasyloinnein saatavat 35 sykliset peptidit ja niiden suolat esitetään kaavassa 3, 6 79118 I NHR' \ cn, λ a 5 Ί Ye A if \/ /ΑαΛλ · °=·\ T Y / conh2 > H 6 A ϊ < ff /h2 ί» h<?/ A h^\a'\Α/γ*γ 7\ > A ?4 h h—I t V /H c°2H w

0=/ \=0 H

15 /—7* iH3 0 ¥ »Λ Ϊ „ hos/A ΑΛ A / w~* i ! μ H0a(/ 3 20 jossa R'ja R° ovat toisistaan riippumatta vety tai amino-ryhmää suojaava ryhmä.

Poistamalla asyyliryhmä A-21978C -yhdistelmästä 25 tai yksittäisistä A-21978C -tekijöistä CQ, C-^, , C^, C^ ja C,. saadaan kaavan 3 mukainen yhdiste, jossa sekä R' että R° on vety. Deasyloitu molekyyli on jokaisessa antibioottisessa A-21978C -tekijässä esiintyvä yhteinen syklinen peptidi. Yksinkertaisuuden vuoksi tätä yhdis-30 tettä kutsutaan tästä lähtien A-21978C -rungoksi. Tämä yhdiste voidaan myös esittää kaavan 4, 7 79118 L-Asp /

Gl y 5 D-Ala T D-Ser L-Asp j,

t 3MG

L-Orn I

\ L-Kyn 10 r. /

Gl y o \ </ L-Thr t L-Asp t 15 L'Jsn L-Trp NHs 4 20 jossa 3MG on L-treo-3-metyyliglutamiinihappo, avulla.

Kaavan 3 mukaiset yhdisteet, joissa R"tai R° on muu kuin vety, valmistetaan deasyloimalla soveltuvalla tavalla suojatut antibioottiset A-21978C -tekijät CQ, 25 Clt C2, c3, ja C^. yksinkertaisuuden vuoksi näitä yhdisteitä kutsutaan tässä hakemuksessa suojatuiksi A-21978C -rungoiksi. Nämä suojatut yhdisteet ovat käyttökelpoisia välituotteita valmistettaessa eräitä kaavan 1 mukaisia peptidejä, so. sellaisia yhdisteitä, joissa 1 2 30 vähintään toinen ryhmistä R ja R on aminoryhmää suo- jaava ryhmä.

Kuten alan asiantuntijoille on selvää, A-21978C-runko ja suojatut A-21978C -rungot voidaan saada joko vapaina emäksinä tai happoadditiosuoloina. Vaikka mitä 35 tahansa soveltuvaa happoadditiosuolaa voidaankin käyt tää, farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat ovat edulli- 8 79118 siä. "Farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat" ovat suoloja, joita voidaan käyttää tasalämpöisten eläinten ke-moterapiassa.

Menetelmä kaavan 3 mukaisen A-21978C -rungon 5 valmistamiseksi erilaisia mikro-organismeja käyttäen esitetään täydellisesti rinnakkaisessa patenttihakemuksessamme (831 748). Edullista asylointientsyymiä, A. utahensis NRRL 12052:a, on saatavissa

Agricultural Research Culture Collection 10 (NRRL):stä, Northern Regional Research Center, U.S.

Department of Agriculture, 1815 Northern University St., Peoria, Illinois 61604, Yhdysvallat, talletusnumerolla NRRL 12052. Tämän hakemuksen valmistusesimerkki 1 valaisee A-21978C -rungon valmistusta fermentoimalla käyttäen 15 substraattina A-21978C -yhdistelmää ja mikro-organismina Actinoplanes utahensis NRRL 12052 :a.

Muita Actinoplanaceae-viljelmiä, joita voidaan käyttää valmistettaessa kaavan 3 mukaisia A-21978C -runkoja, on saatavissa Northern Regional Research Labora-20 tory :sta seuraavilla talletusnumeroilla:

Actinoplanes utahensis NRRL 12052

Actinoplanes missouriensis NRRL 12053

Actinoplanes sp. NRRL 8122

Actinoplanes sp. NRRL 12065 25 Streptosporangium roseum var. hollandensis NRRL 12064

Actinoplanaceae-heimon mikro-organismin kunkin nimenomaisen kannan tehokkuus deasyloinnissa määritetään seuraavaa menettelytapaa käyttäen. Soveltuva kasvatus-30 väliaine inokuloidaan mikro-organismilla. Viljelmää in-kuboidaan noin 28° C:ssa kaksi tai kolme vuorokautta käyttäen pyöröravistinta. Sitten lisätään viljelmään jotakin substraattiantibioottia pitäen fermentointiväli-aineen pH suunnilleen arvossa 6,5. Viljelmän aktiivisuut-35 ta seurataan käyttäen Micrococcus luteus -koetta. Antibiootin aktiivisuuden väheneminen on merkki siitä, että 9 79118 mikro-organismi tuottaa deasylointiin tarvittavaa entsyymiä. Tämä täytyy kuitenkin varmistaa jollakin seuraavis-ta menetelmistä: 1) HPLC-analyysillä muuttumattomien runkojen toteamisek-5 si; tai 2) uudelleen asyloimalla soveltuvalla sivuketjulla (esim. lauryylillä, n-dekanoyylillä tai n-dedekanoyylillä) aktiivisuuden palauttamiseksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan (1) mu-10 kaisten syklisten A-21978C-peptidijohdannaisten valmistamiseksi on tunnusomaista, että kaavan (3) mukaista syklistä A-21978C-ydinpeptidiä, jossa R' ja R° ovat toisistaan riippumatta vety tai aminoryhmää suojaava ryhmä, käsitellään lämpötilassa noin 10 - 60°C 1-24 tuntia 15 hapolla, jolla on kaava 5 R6-COOH (5) g tai sen aktivoidulla johdannaisella, jolloin R on Cg-C^5-alkyyli tai C^Q-C^g-alkenyyli; ja 20 haluttaessa poistetaan mahdolliset suojausryhmät, joita saattaa olla läsnä tuotteessa, ja/tai haluttaessa saatu tuote muutetaan suolaksi.

Ilmaisut "C^-C^g-, Ci-cio~ -*a C^-C^-alkanoyyli" ja "C^-C^^-alkenoyyli" viittaavat vastaavasti 7-16, 1-10, 25 1-13 ja 11-17 hiiliatomia sisältävistä karboksyylihapois- ta johdettuihin asyyliryhmiin. R-ryhmän ollessa alkanoyyli alkyyliosa on tyydytetty, suoraketjuinen tai haaroittunut hiilivetymonoradikaali. R:n ollessa alkenoyyli alkenyyli-osa on tyydyttämätön, suoraketjuinen tai haaroittunut hii-30 livetymonoradikaali, joka sisältää korkeintaan kolme kak-soissidosta. Tyydyttämättömän hiilivetyketjun kaksoissi-doksen/kaksoissidosten konfiguraatio voi olla cis- tai trans-konfiguraatio.

Ilmaisu "aminoryhmää suojaava ryhmä" tarkoittaa 35 A-21978C-molekyylissä olevien muiden funktionaalisten ryhmien kanssa yhteensoveltuvia, tunnettuja aminoryhmän suo-· 10 791 1 8 jausryhmiä. Aminoryhmää suojaavat ryhmät ovat edullisesti sellaisia, jotka voidaan helposti poistaa suojattuna asy-loidusta yhdisteestä. Esimerkkejä soveltuvista suojaryhmis-tä löytyy teoksesta "Protective Croups in Organic Synthe-5 sis", Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, New York, 1981, luvusta 7. Erityisen edullisia aminoryhmää suojääviä ryhmiä ovat t-butoksikarbonyyli- ja bentsyloksikarbo-nyyliryhmä.

Erityisesti keksinnön piiriin kuuluvat seuraavat 10 edulliset kaavan 1 mukaiset yhdisteet: 0 a) Yhdisteet, joissa R on kaavan CH^Cl^) -di- mukainen

alkanoyyli ja n on kokonaisluku 5-14; CH0 O

1 3 il b) Yhdisteet, joissa R on kaavan CH0(CH~) CH(CH-J -C- j z n z m mukainen alkanoyyli ja n ja m merkitsevät toisistaan riip-15 pumatta kokonaislukua 0-12, sillä edellytyksellä, että

n + m on vähintään 3 ja korkeintaan 12 ja että n:n ollessa 0 m ei ole 8 ja n:n ollessa 1 m ei ole 6 eikä 8; O

c) Yhdisteet, joissa R on kaavan CH0(CH~) CH=CH(CH~) -C- 3 z n 2 m mukainen cis- tai trans-alkenoyyli ja n ja m merkitsevät 20 toisistaan riippumatta kokonaislukua 1-13 sillä edellytyksellä, että n + m on vähintään 7 3a korkeintaan 13;

O

d) Yhdisteet, joissa R on kaavan CH2=CH (CH2) -<ϋ- mukainen cis- tai trans-alkenoyyli ja n on kokonaisluku 8-14; 25 e' Yhdisteet, joissa R on:

O

CH3(ch2}5~C-0 ch3(ch2)6-c-

30 O

ch3 (ch2) ?-C-0 ch3(ch2)8-c- 0 35 ch3(ch2) 9-c- o CH3(CH 2)10-C- 11 79118

O

CH2=CH-(CH2)g-c-0 CH3(CH2)11-C- 5 2 ch3(ch2)12-c- o CH3-(CH2)3-CH=CH-(CH2)?-c-0 10 ch3(ch2)13-c- o CH3CH2CH(CH3)-(CH2)6-C-

Kaavan 1 mukaiset yhdisteet kykenevät muodosta-15 maan suoloja, jotka ovat myös osa tätä keksintöä. Sellaiset suolat ovat käyttökelpoisia esimerkiksi yhdisteiden erottamisessa ja puhdistamisessa. Erityisen käyttökelpoisia ovat farmaseuttisesti hyväksyttävät alkalime-talli-, maa-alkalimetalli-, amiini- ja happoadditiosuo-20 lat.

Kaavan 1 mukaisissa yhdisteissä on esimerkiksi neljä vapaata karboksyyliryhmää, jotka voivat muodostaa suoloja. Tästä syystä näiden karboksyyliryhmien muodostamat osittaiset suolat, sekasuolat ja täydelliset suolat 25 ovat osa tätä keksintöä. Näitä suoloja valmistettaessa tulisi välttää 10:ä suurempia pH-arvoja, koska yhdisteet ovat epästabiileja sellaisilla pH-alueilla.

Tyypillisiä ja soveltuvia, kaavan 1 mukaisten yhdisteiden alkali- metalli- ja maa-alkalimetallisuoloja 30 ovat natrium-, kalium-, litium-, cesium-, rubidium-, barium-, kalsium ja magnesiumsuolat. Soveltuvia kaavan 1 mukaisten yhdisteiden amiinisuoloja ovat ammonium-ja primaariset, sekundaariset ja tertiaariset alkyyliammonium- ja hydroksi-C2_^-alkyyliammoniumsuolat. 35 Esimerkkejä amiinisuoloista ovat suolat, jotka muodostu vat kaavan 1 mukaisen yhdisteen reagoidessa ammonium- i2 791 1 8 hydroksidin, metyyliamiinin, s-butyyliamiinin, isopro-pyyliamiinin, dietyyliamiinin, di-isopropyyliamiinin, sykloheksyyliamiinin, etanoliamiinin, trietyyliamiinin tai 3-amino-l-propanolin kanssa.

5 Kaavan 1 mukaisten yhdisteiden alkalimetalli- ja maa-alkalimetallikationisuolat valmistetaan menetelmin, joita tavallisesti käytetään kationisuolojen valmistuksessa. Esimerkiksi liuotetaan kaavan 1 mukainen yhdiste vapaana happona soveltuvaan liuottimeen, kuten 10 esimerkiksi lämpimään metanoliin tai etanoliin, ja lisätään siihen sitten liuos, joka sisältää stökiömetrisen määrän haluttua epäorgaanista emästä vesi-metanoli -seoksessa. Näin muodostunut suola voidaan eristää tavanomaisin menetelmin, kuten suodattamalla ja haihduttamalla 15 liuotin. Soveltuva menetelmä suolojen valmistamiseksi on ioninvaihtohartsien käyttö.

Orgaanisten amiinien kanssa muodostuvat suolat voidaan valmistaa samalla tavalla. Kaasumainen tai nestemäinen amiini voidaan esimerkiksi lisätä liuokseen, 20 jossa on kaavan 1 mukaista yhdistettä soveltuvassa liuot-timessa, kuten etanolissa; liuotin ja amiiniylimäärä voidaan poistaa hauduttamalla.

Tämän keksinnön mukaiset yhdisteet voidaan sisältää myös vapaita aminoryhmiä ja tästä syystä muodostaa 25 happoadditiosuoloja, jotka ovat myös osa tätä keksintöä.

Tyypillisiä ja soveltuvia kaavan 1 mukaisten yhdisteiden happoadditiosuoloja ovat sellaiset suolat, jotka muodostuvat tavanomaisella reaktiolla sekä orgaanisten että epäorgaanisten happojen kanssa, kuten esimerkiksi suo-30 la-, rikki-, fosfori-, etikka-, meripihka-, sitruuna-, maito-, maleiini-, fumaari-, palmitiini-, kooli-, pamo-iini-, lima-, D-glutamiini-, d-kamferi-, glutaari-, glykoli-, ftaali-, viini-, lauriini-, steariini-, salisyyli-, metaanisulfoni-, bentseenisulfoni-, sorbiini-, pikriini-, 35 bentsoe- tai kanelihapon kanssa.

13 791 1 8

Kaavan 1 mukaiset yhdisteet, joissa R, R1 tai 2 R on alkanoyyli- tai alkenoyyliryhma tai aminoryhmää suojaava ryhmä, valmistetaan asyloimalla kaavan 3 mukainen yhdiste halutulla alkanoyyli- tai alkenoyylisivu-5 ketjulla käyttäen amidisidoksen muodostuksessa tavanomaisia mentelmiä. Asylointi toteutetaan yleensä antamalla asyloitavan yhdisteen reagoida haluttua asyylisi-1 2 vuketjua (R, R tai R ) vastaavan aikaani- tai alkeeni-hapon aktivoidun johdannaisen kanssa. Ilmaisu "aktivoi-10 tu johdannainen" tarkoittaa johdannaista, joka tekee asylointiaineen funktionaalisen karboksyyliryhmän kyllin reaktiiviseksi liittymään primaariseen aminoryhmään, jolloin muodostuu amidisidos, joka yhdistää asyylisi-vuketjun runkoon. Soveltuvat aktivoidut johdannaiset, 15 niiden valmistusmenetelmät ja menetelmät niiden käyttämiseksi primaaristen amiinien asylointireagensseina ovat tuttuja alan asiantuntijoille. Edullisia aktivoituja johdannaisia ovat: a) happohalogenidi (esim. happok1 oridi) , 20 b) happoa nhydr.idi (esim. a Ikoksimuurahaishappoanhydridij tai c) aktivoitu esteri (esim. 2,4,5-trikloorifenyyliest.eri) . Muihin menetelmiin funktionaalisen karboksyyliryhmän aktivoimiseksi kuuluu karboksyylihapon reaktio karbonyy-25 lidi-imidi (esim. N,N'-disykloheksyyli-karbodi-imidin tai N,N'-di-isopropyylikarbodi-imidin) kanssa reaktiivisen välituotteen aikaansaamiseksi, jota välituotetta ei sen epästabiilisuuden vuoksi eristetä. Sellaisessa tapauksessa reaktio primaarisen amiinin kanssa tehdään 30 in situ.

Alan asiantuntijat tietävät, että kaavan 1 mukaiset yhdisteet valmistetaan käyttäen selektiivisiä asy-iointimenetelmiä sekä apuna aminoryhmää suojaavia ryhmiä.

i4 791 1 8

Esimerkiksi silloin, kun lähtöaineena on kaavan 3 mukainen yhdiste, jossa R'ja R° ovat vetyjä, sekä tryptofaa-nin -aminoryhmä että ornitiinin ^-aminoryhmä voi asyloitua, jolloin syntyy ^iprp,NQrn-diasyyli johdannaisia .

5 Monoasyloitujen johdannaisten, joissa tryptofaanin o(-ami noryhmä on asyloitunut, saamiseksi on edullista asyloida kaavan 3 mukainen yhdiste, jossa ornitiinin £-aminoryh-mä (R° -asema) on suojattu aminoryhmän suojausryhmällä. Sellaisia lähtöaineita saadaan edullisesti suojaamalla 10 A-21978C -tekijän mainittu asema, ennen kuin se deasyloi- daan. Kynureniinin aromaattinen aminoryhmä on vähiten reaktiivinen A-21978C -rungossa olevista kolmesta vapaasta aminoryhmästä. Kynureniinissa tapahtuva asyloitumi-nen edellyttää tryptofaanin ja ornitiinin aminoryhmien 15 soveltuvaa suojaamista, mutta R:n tai R :n asylointi ei tavallisesti sisällä kynureniinin aminoryhmän suojaamista .

Kaaviot I, II ja III esittävät pääpiirteittäin yleisiä menettelytapoja kaavan 1 mukaisten yhdisteiden, 1 2 20 joissa jokin ryhmistä R, R ja R on alkanoyyli, alkeno-yyli tai aminoryhmää suojaava ryhmä, valmistamiseksi. Näissä kaavioissa käytetään seuraavia symboleja: 1*7 = A-21978C :n loppuosa Ν,ρ = tryptofaanin c(-aminoryhmä 25 Nq = ornitiinin S-aminoryhmä N = kynureniinin aromaattinen aminoryhmä K 1 2 R, R , R = ilmoitettuja substituentteja Rn = luonnollisen tekijän asyyliryhmä B, B"*· = aminoryhmää suojaavia ryhmiä 30 Acyl = asylointivaihe

Deacyl = deasylointivaihe

Block = asylointi aminoryhmää suojaavaa ryhmää käyttäen Deblock = aminoryhmää suojaavan ryhmän poisto

Kaaviossa I yleiskaava 3 esittää A-21978C :n 35 N^p-monoasyylijohdannaisia ja yleiskaava 4 A-21978C :n is 79118

NTrp,NOrn"diasyyli:iohdannaisia· Niitä NTrp,NOrn"^ohdan· naisia, joissa N -asyyliryhmä on luonnollisen A-21978C

ir -tekijän asyyliryhmä, esittää yleiskaava 8.

i6 791 1 8 ω d

+J

tn Ή % s ^ £ f* X o 0) - X χ

G h- X

<D XX

-P \ / « ΪΓ , •H Μ·| <d § /\ (0 _ 'Ö >

Xl u 0 < n 03

Γ N -* X

1 x υ o

n X O N O X X N

v-> XXX — XX

00 h- T ^ ^ h - x

I" X X X X

Ch \ I / / Q \ / ι-t ί-1 col - 5Γ

7 2- \ -M

< •H / \ / \ t—{ _ >1 > > >i υ u en < < id

'O XN CD

1 o X_

OJ 2! N 01 O W

5 §-} ^ 5-T ^ a iL <nI ί- voi

M

B* / \ £ ^ id x x >-

•r-ι X X N U

X O X £ i CT/** Ϊ * Ή 1—> Itj _ >1 -K , CD _ “

>, >— 00 Q X X

m X O n

® X X X

id (— T x § \ I / 6 \ ΐ _ iL ^1 ' >> ° /1

Pj U — / H < CD / E-ι y' Z N / XX / .. X O n

" XXX

H h- X

X X

O \ A <H| Ή <—* > * id 1—' id 17 791 1 8

Kaaviossa II yleiskaava 10 esittää A-21978C :n ^Trp/^Kyndias^^^i^ohdannaisia' Niitä ΝΤΓρ'ΝκΥη~άΐ33^1:ί-johdannaisia, joissa NTrp-asyyliryhmä on luonnollisen A-21978C -tekijän asyyliryhmä, esittää yleiskaava 12.

5 Yhdisteet, joilla on yleiskaavat 5, 6 ja 7, esiintyvät myös kaaviossa I.

is 79118 « x o X r- cc a: x x

H- X

\ /= T oi iH| / \ υ o

_Q

Q)

Q

m

3 X ^cTcC

Γ1 XXX

-t-1 H I M

s \ I ^

-H ^ CM

rd > a <υ >

^ O

(0

C CD

rj X

£ X O w

rS, N XXX

^ X I— 1 x: x o- x x

0 xxx \ I

71 t- ^ Γ

zv 7= *- M

u \ /

00 IX" CVI I

I- 2L rnl /V

CT\ / x

rH

7 / \ > f £ 1 u

H O

r—{ CO

>1 -° X

ä? - •H ^ =\ I /= X) CD —, I X X *- -K .

V-· x o x >—. o 1 I M x* „ * >

p. 1—1 U

i, ra ,Η ,r oi

Eh l\ o X \ \ s

M U* X2 X° M

< X X

O h- X

ίο ϋ i9 791 1 8

Kaaviossa III yleiskaava 18 esittää A-21978C :n N -monoasyylijohdannaisia, yleiskaava 15 A-21978C :n NKyn-monoasyylijohdannaisia ja yleiskaava 20 A-21978C:n ISL· ,N -diasyyli johdannaisia . Yleiskaavan 6 esittämät 5 yhdisteet esiintyvät myös kaavioissa I ja II.

20 7911 8 m

•H

rt

G

G

rt « 'S x - w -g N O CC cc £ ^ «xo « ' 2\ /2 XH "f "Se 0 Γ OI X\ /= CO — cm| x Γ-. x f" . . * oo! 5 OJ -*· / \ 1 υ JL o -* <C — υ

1 -O O

h rt —

M Q -Q

sL a>

O

>t N

m cc rt «- x *- n

H CD O CC CC

rrt XXX «- X

? (— yc CD O N

x Z XXX

>1 X — ' ^ ^ Xw i* *. / \ / M o a 2 ~ E il M ^ ml S /N =^1/= ö sl e il 2 υ rt < / v *- X ^ S 8 £ 2\ I /z 1 ®

S r 51 Q

0

S rt / \ CD

f ·+Ι υ ""cd Χο cc U O tf Χν C ® ~ z z >1 φ (D \ /

CO CD .M

.-3 - ^1

CD _ ΉI

1 - X _ /1 1 m o « -v. /1 •H X Z X q* / .h i- z y/ >1 \ _ / / rt T / rt — / o G / \ nl O rM|

f· U

G - Μ ω

O

S w -5 g H en Cl O ci H h 3: z x H e z T - O rt x Λ κ > ·# co |

rt G rt rt i=C 4J

2i 79118

Edullinen menetelmä kaavan 1 mukaisten yhdisteiden, 1 2 joissa jokin ryhmistä R, R ja R on alkanoyyli tai alke-noyyli, valmistamiseksi on menetelmä, jossa käytetään aktivoitua esteriä. Kaavan 3 mukainen yhdiste, jossa R' = H 5 ja R° = t-BOC, so. A-21978C-NQi_n-t-BOC -runko eli "t-BOC-runko", on erityisen edullinen lähtöaine valmistettaessa kaavan 1 mukaisia yhdisteitä. Halutun aikaani- tai alkee-nihapon 2,4,5-trikloorifenyyliesteri on edullinen asyloin-tiaine. Tässä menetelmässä aktiivisen esterin, jota on 10 ylimäärin, annetaan reagoida t-BOC -rungon kanssa huoneen lämpötilassa inertissä orgaanisessa liuottimessa, kuten esimerkiksi DMF:ssa, THFrssa, dietyylieetterissä tai di-kloorimetaanissa. Reaktioaika ei ole ratkaiseva, vaikkakin edullinen aika on noin 6-20 tuntia. Reaktion ollessa 15 lopussa liuotin poistetaan ja jäännös puhdistetaan. Erityisen käyttökelpoinen puhdistusmenetelmä on käänteisfaa-si-HPLC stationäärifaasina LP-1/18 ja liuotinsysteeminä H20-CH20H-CH2CH-pyridiini-HOAc -seos. t-BOC-ryhmä poistetaan käsittelemällä noin 3-5 minuuttia huoneen lämpöti-20 lassa trifluorietikkahappo-anisolitrietyylisilaani- tai edullisesti, trifluorietikkahappo-1,2-etaaniditioli-seoksella. Liuottimen poiston jälkeen jäännös puhdistetaan käänteisfaasi-HPLC:llä.

Vaihtoehtoinen asylointimenetelmä on muunnettu 25 Schotten-Baumann-menetelmä, jossa suojaamatonta runkoa käsitellään happokloridilla tai alkeenihapolla pyridiini-vesi-seoksessa. Tässä menetelmässä lisätään ylimäärin hap-pokloridia inertissä orgaanisessa liuottimessa (kuten asetonissa) hitaasti liuokseen, jossa on runko seoksessa, jo-30 ka sisältää 90 tilavuusprosenttia pyridiiniä ja 10 tilavuusprosenttia vettä. Reagoimaton happokloridi erotetaan reaktiotuotteesta uuttamalla se reaktiotuotteeseen sekoit-tumattomaan liuottimeen (esim. dietyylieetteriin). Lopullinen puhdistus suoritetaan käänteisfaasi-HPLC:llä, kuten 35 edellä on kuvattu.

22 79118

Asylointireaktion lähtöaineina käytetyt alkaani-ja alkeenihapot ja niiden aktivoidut johdannaiset (erityisesti happokloridit ja 2,4,5-trikloorifenyyliesteri) ovat tunnettuja yhdisteitä, tai ne voidaan valmistaa tun-5 netuista yhdisteistä tunnetuin menetelmin. 2,4,5-trikloo-rifenyyliesteri valmistetaan helposti käsittelemällä aikaani- tai alkeenihappokloridia 2,4,5-trikloorifenolil-la pyridiinin läsnäollessa tai käsittelemällä vapaata aikaani- tai alkeenihappoa 2,4,5-trikloorifenolilla N,N'~ 10 disykloheksyylikarbodi-imidin ollessa läsnä liittävänä reagenssina. 2,4,5-trikloorifenyyliesterijohdannaiset voidaan puhdistaa pylväskromatografiällä.

Kaavan 1 mukaisten yhdisteiden antibakteerinen vaikutus voidaan osoittaa in vitro. Tulokset tyypillisten 15 kaavan 1 mukaisten yhdisteiden antibakteerisen vaikutuksen tutkimisesta käyttäen tavanomaista estovyöhykettä (sus-pentoituun yhdisteeseen kastettu kiekko asetetaan petri-maljaan agarin pinnalle, johon yhdiste sitten diffindoi-tuu) esitetään taulukossa I. Taulukossa I aktiivisuus 20 määritetään sen havaitun vyöhykkeen koon (halkaisijan mm:inä) perusteella, jossa mikro-organismien kasvu on estynyt tutkittavan yhdisteen vaikutuksesta.

79118

V) ,Ω •H CO

rH m

•H vO

u vo ^Or^o>iHrgcx\oo<r^v^o <r r-tCMCNCVCNCOiNCvJOJfv/iNrO Ή o o

to CJ

. H

iÖ - . <* i—I cq|

rH

<D

S g * S -4 O u « <r

Ai (Tl O P ΟΊ

(U ,—,οωσΝ iHrooocNinHcr.cr><-io>r^-oo O

\J> COU CSCSiHCSCSr-lr-ICSr-li-ICSrS CS

t? Supo Ϊ £. υ -· o XI Ή :θ Σ <

>, O

> Ai o o g .s s G H H Ό W Η Ή \0 ιΟΟΟνΟΟ<ΤνΟΓ^ι-ΐσΛΓ^Ι^.σ\ n Q) G ‘H 4J rH Γ-1 CS r—4 CS r-( CS r-l r—IrHrH r—\

QJ O XI O

(fl m Π3 P P

3 X « w te +J * « < 3 >s p

Ai xl υ (x, •H :0 =o (rt Sh O ω n

P ? U PN

^ ^ O « Ό r^mO-iCTiU-irHCSOOvr-ifS m _ Ur—lU r-CCSCSCSr-ICSCSCSCSrHCMCS r-| 3 -P >, p o

(1) m £ » U

G W £ H 2 < H Φ 10 O 0)

Ai -P

Ai Ai 3 3 es 3 Λ OiÄÄÄXÄKÄÄÄÄX® a 3 *·"»

3 -P

Es G

3

G rH

0) piaaaasaaaaaaa as "0 ω ¢1, w •H λ id

Ί3 es O

X * « I

s. i o a o ^ o ^ o o - o a es 3 i i i i i oo o » r-s

3 ^ IIIIIOOOOO^llUtN

m oiooooooouoocsaax m ooocjoor-icNoi<t;couu iXlvOt^OOCTlrHrHi—Ir-lr-IOr-lll'—' J"J ^ /‘"N /"“S «^N /*\ /“—N /*“>. ✓*“> 's-r' /^v ££ £

Π3 CNCNCMCNCN<NCNCMCN(N1 CNCJU

x xaxxaaxaaxaacsii 3 uuooouuuuuuoaa

g ^ ^ ' N—' 'w' «W 'w' Il -W ζ_) U

1=5 fOOromcoromrorororMrorOiN

xwaasaaaaaaaaa 1-1 ooooououoouuoo

G -P

3 to O __ j> -HP •-i csrio-msor'.coo'Or-fcsn

3 T) G H H H H

3 X

K X

24 79118 rd c H W *0 .b

Zj -h ro ‘2

<U Ή vO C -P

<U j-'orninr-'Or'icNm ·· -h

A! x> CM CM r-l CM i—I Cl CM SO

O 3 U S X

M « U ε Λ <U · < r- Ai

Ai «I C

£*i ·» -H

Γ—( :0 “ e *

> U H \ CU

P> fo U W <3· tr» fH

O ^ O 3 m g rH

-P g υωσ> 0cr\0<r or^. rrt (/) SOiJ C'JfHr-HrHIrH'H __If* 0 *5 V, 3 U c

^ U H u C

*H Η ·Η *H

W 0 £ <s r-H CU

3 * o

•P 0 [n -PC

r-J U t/) [ft Π , rf 3 ‘H m ^ Η Η a *H w ‘*J τ' rH t-< \D CO CO M CO P r-l O CO flj

'—' <0 (1)*H±J MrHiJrHUrHiH

g > ® S-§8 ® «

Sc S »” e dc p 2 >i to d m

c x: d w -P

•r- -H :0 o p_ -H +J

^ P ^ n rn S Ο Ή

ω > S 5 £ -p M

M OoajvDrHrH^ir-cMMrin n<-

_ -Jr P Ή U CM CM r—t r—t τ—I i—I r—t dlC

O Ai 10 ^ 3 U -H

Λί ιτί W £ n|u :td -rt λ; λ g-h -P -ρ

3 ·Η -P P

CC w I I I ® f{

3 5 O I 1 O O P

H3H) CJ O O O CJ ~ CU

H tNOOr-loCW

C rtM vo σι ,Η γΗ .Η ^ rrt K CM CM CM CM 2 „y ^ X I CJ X X ffi X C Ιί « •H O - cp CJ CP CJ CJ 'Π rl

CU rH

-P frtcjcnnncqn-imc-H

yj XOXXX|Xmn._,

H CJXCJCJOUCJ.g0P

Ό f—i CU -H Oi -C χχχχχχχχ > en td

> CO

_ Il . C CU -P

β O O —. Ή Q-ι Ci dj cp CJ □ -rl 10 rl P vo vo vo -P C J> W /-v /-v ^ -H U) flj

•H CM CM CM n G

(rt XX 35 jj rt -2 m 3 8 S c -h g

2 rtN I y-s 0) -H -H

S co n i i o co Oi-PC

35 35 O O CP X tn+J-H

iH X CJ CJ CJ CJ r-l CJ rt m e x X ^ En +5 -h 5 CP CP CM CM CM CJ )ί3 τίη! JP CM CM X X X CM -PC-PC1)

> X X CP CJ CJ x CU Λ! -P -H

td cj cj - v-' w u o CUCLi

td ^T1 ^ _Γ> N -P O -P

y. xxxxxffix m ij ii4 rt dj oauouuu ^^^.5 P t3 cu tn > en o xj -h td >i •Hp ντιηνΟΓ'-οοσιο >nvt«ii2

*—I '—( '—1 *—I i—H *—I CN

f! <ΰ X! O

25 79118

Tulokset tyypillisten kaavan 1 mukaisten yhdisteiden antibakteerisen vaikutuksen tutkimisesta tavanomaisin laimennuskokein esitetään yhteenvetona taulukossa II. Taulukossa II aktiivisuus määritetään pienimmän 5 estävän pitoisuuden (MIC) perusteella, so. määrittämällä yhdisteen alhaisin pitoisuus, jolla tutkittava yhdiste estää mikro-organismin kasvun.

26 791 1 8 m η r—I m in tn cnj m cm in f—I »-·*·*·* ·***· ·*

O O O O H rH O O H O

VO LO

o H p-I CH H CN CN rH O OH CN

r-l «· -

-p O O

tn > 3 is § a ^ I O' »—4 *H CN rH CM rH »v CM ·*

M rj O O

H

£ 2 h n rj ·μπ cn m co

£ ·* -λ fsj ¢-4 CM * * m (N · * CM CM

G O,) oo m in ·* ··· ** ·* m o <-h »n ·—\ ή

C h OO OOOOO

-H Q) *"4-· mmm mmm h

Jr en pHOHmeHmmeHonO j> o rrt «. -.OOOOO O oo •h S ° ° £ -Jj >1 m o ·» o •H - ». in ·« - >

-P Co) OHrHOrHrHcHmmm o H

d Q1 VO % r ' r λ f' * · pH Cv] O OH *vj" ‘ * (rt I m m r-( O r-( rrt *r r- — m '3 - - O O O O OH -

2 O O O OH

*r <d m tD +j in H4jT3min on m ^

Ti -H mononminminrH o on m £ ^ o* o” o o o" o" o' o o" tn 0-3 0 cu fn m m «n in · * m n vo M Q-ι 1) κνΗ s*H nI/1N k *—1 CM <-t H <r 0 0*»0-»0<NH0 -* ··* Z> Γ) .#1 .* CNJ „* CM *» v s. * * VO CM Zl

0 00 rH i-H *-1 rH O O rH »H H

^ H £ 3 h m on j, i—| (N moHOH-iOH-vfCNOH OH m 00 T"

Π I ». P

s < ° Ö •En e 3 3 1) T3 η .μ m -r <r co o- oo -r pH oo -j-vo *-· 2 ° M d «S id

'3 01 -P -P

H T3 d e >- oo oo oo oo m 5 2

rn r—i vo oo m oo co co P

UJ pH OH OI -P

rH rH ϋ) ·Η ·Η

P ·Η -P -P

OJ pH TS -P -p

m H Λ C d O

“ S m >i Q) 0) > '2 o n -P +J u S ρΗ,ΠθωίΛ0Ηθ.Πί --0101(¾

Λ rH O m -rl M OH MVO rl rl t| H

£3 f—! rH *O CH O Π3 vO O ö m m v* g X>*W.HW(n Oi * £ < $ « * _. oi MOidJQCTvCnPPQl 'P 3 0) e « 3 Λ!

_ CU Ό <U . ·Η CL \.0)<D

3 P= = = H= tCC3 rH pH £ 2 2 α°Ι2=:*^^ω

^ C. 3 O d-H-p|(D(C

2 H v) V) o :0dd^i-P

5 6 3 3 (Λ e λ; H -H o -P

x 0) O O 3 PH M -rl -H Φ

•H U ^ H H H H O

3 O OO ÖIHH,* 3 g O O Λ! H H d

tn ph::zph;o o :: >hU1U)QJH

Sh >. >. u h h 6 en O -e Ud-PH^i <1) 2- HQlQJOd

r^ CO CO CO

rO Χϊ O T3 0) 27 79118 P' 0 > μ (Ö o

H

a S ^ <N 00 00 i—I i—i ST esi sO esi es| I—| I/O (SJ CS1

•HCN CO r-( ,H

O) O O Λ

-P

(A

•H

T3 o oo so tsj co <si esi sj- ) oo <r

J^tN r-t ro ΓΟΠ ICNVO

>1 1-1 c

QJ

H 00 OO-TOOOOOOOOrHinoOOO

> Ή CSI cs| (SJ CSI »V esi esi itJ 4rH OrHi—t 4J Λ Λ Λ Λ Λ Λ J ‘Λ frt “1 ΕΝ

5 Λί ^ -H<r<TMCOOOCNrHOOOO

S % ~ ο* o' ϋ * . Γ™! 00

' · SO OOvOOOOO'XIvO'JsJ-rsIsT

*—* (H r~i ιΗ Η ΙΗ Λ Η

<Τ CN

„ <υ <rooooooooooiHstsorn O m — .. .«

X -! <raOsr<raooorHcsisrcN

X ο η 2 d esi H <u <Γ·ία3-ίοθ'}ΗΝποο 03 <ί ·Λ -Λ ·» to* ·. * i.0k ·Λ ·»>·» ·« ·* £η Ή<Τ<Τ00 00 00 00ρΗ(Ν'3·<Ν

<0 CO

οοαοοοοοοοοοοοοοαοοο C") ΝΝΝΙΝΝΝΝΝΝΝ

1-1IrHi-liHiHrHi-li-HrHrHi-H

ΛΛΛΛΛΛΛΛΑΛ ιΛ| m

esi i—i r-i CS| *—I esi Cs| . . m H

Ή O O

»H

M

CU

ω m O en H Λ OWWfMO^

• iH O eo *H M CN μ VO

f-l <T sf r-l X) P-, U W sO O

X > X t/1 -H W CL, X vO

Sm σ\ ra μ oi ra q σ» 3 ra e ra ra ό ra ·η o.

u : z z -h : cc e 3 - a o o o r ra ra x e μ „ asu

Hra tn a) e 3 3 tn e M u o 3 a -h υ o o e ° o o 5 υ a o ra o o υ CT» ήιϊΓιΗϊογι: μ X X 4-> n -3 X Cl m a aai X ra ra μ O »-> u u X oo en co 28 7 9 1 1 8

Kaavan 1 mukaisilla syklisillä A--21978C peptideillä on osoittautunut olevan antimikrobinen vaikutus in vivo kokeellisia bakteeri-infektioita vastaan. Annettaessa esimerkki-infektioissa hiirille ihonalaisesti tai 5 suun kautta kaksi annosta tutkittavaa yhdistettä todettu vaikutus määritettiin ED^-arvona /tehokas annos mg/kg:na, joka riittää suojaamaan 50 % koe-eläimistä: katso Warren Wick et ai, J. Bacteriol, 31 (1961) 233 - 235/. Tyypillisten kaavan 1 mukaisten A-21978C -yhdisteiden ED,_ ^ -arvot 10 esitetään taulukossa III.

29 7 911 8 01 φ S o o o . 5 ^ ° o

O I ^ rH V CM

>t C -P J O t-l "* O O 00 ΙΟ Λ o o &, 3 O H O «ΌΟΟΟΊΡΟΟΟΠί^ — O o 01 ^njZcSIC^^OmvOO-mcNCNr-l ΓΟ CM Cs|

3 01ϋ1ΛίΑσ' 1-1 VAA Ό A A

PO ^ 3 υ vr

Ai O *> UO

H O +> ο υ .*> o > O «.«ro «« 1 -P q tn o oo <r

Cl 1-tNOCN vDCMOOOOvOm ιΛ 0 G) G^-^vcommvrHfHfHOrHON^r oo ^ Cl flinOOOrHOOO #»

-i-lTt Jj I C\ 1Γ *Ä " * " _*>v •^"•'OOOOrHrH CN

P°.s 71 '~cncN<rooooco ^ ^ -P C/3 C ‘H «<j- *s c—i Q> iT) fs| o OfC-.eN.. vv v

C > ,C P P V O OO CN

P k H 1C v <C 01 «j 3 13 p Φ O ^

H O O O

Ό m o S

•H Q U x

P W O

di Pol C oo S

^ Φ >i 3 Φ <r o E

^ & pJOICm·. co <r «r noo »n λ 1-1 ft^ÖP^o-HincNn-j-mnnncricNrocN in o % 3 3 J§ 3 " £ ° ° o" ° cT ^ «Γ n o" n p“ «o ,2 * ” w HO ^ <*, ^ Ό

•q e* en n o CN

•3 P I <N X - h cn o i u n 3 . cn cj o <n

^ < ^ΧΧΧΧΧΧΧΧΧΚχχ x^ O 5 χ'Ίο P

U X ^ CJ o V

C p p 2 «ÄXXXXXXXXXXSCKX X 3 01 P ^ i fl) w £ Φ

•H

ό .** P I rt.

>i oil f3 o o o p e Γ-. O Ο φ Φ d, 'β o 3 X CN CN Ä

•H I CJ X X

(0 O —- CJ CJ P

Λί CJ X W 0) h i i i i I X CJ /. v § ΛΛΛ1100000'~'ΐι no i ^ E OOOOOOCJCJCJCJCNXXX o 5 cjcjocjcj opcnp<tx u o u o H uiOr^OTOPPPPPCJ p W o.

^ ^ ^ /*1 /-N y“N y*"N y—\ W g ^ ^ „Q

{-H CSJ CNCNCNCNCN<NCN<N<NI CN CJ CJ <S|

rtOiXFt?33333 33 33 33 333333*'^^ X

fOP CJCJUCJCJCJCJCJCJUUCJXX CJ OO

*·> / v—' S—^ 'p »p p 's—' P N_y II «W· ζ_) QJ v N

φ ο n n n ppppppcnppp ro 3 f3 33 33 33 ÄXXXXKXXKX χ x

X OCJCJCJCJCJCJCJCJCJCJCJCJCJ CJ

&1 I Ai Φ \ P O'

010r-lrs,nsrin\or^ooffiOPcN~cfu·! r-. E

Pd pppppp rö 3 3 Λ >h 30 791 1 8

Joidenkin kaavan 1 mukaisten syklisten A-21978C peptidien myrkyllisyyskokeiden tulokset esitetään yhteenvetona taulukossa IV.

3i 79118 :<d rH o -Q m in lo oo

S_| ΙΛ « H fN OO

W -H OOOOOOtN V --. OOOUJ

3 -d O O O O O (N fH ^voooin·'*' 10 -C vOVOvOMVO**r-ΙιΛιηι/ΙιΛ'ΤΟΟΟη· >. ο A A A A A Tf ». a| O U-l Ο σι >. LD tt (N t£> •«T u3

to Q I—I VO A A

iH

rH

λ* u

>- I

e oil u o o C I (N u o (1) (N O'-' o cn H « χχχχχχχχχχχχυ tN '—

Ό Γ0 X (N CM

H X U X X

P U U U

α o ^ <U U mm

0- O X X

% u 33 u u

O 00 rH

Ä £; « xxxxxxxxxxxxxxxx aj

3 1—1 -P

3 2 J

m Oil Ö

2 u o o ’S

ω « r- U U x , -P v0 :- H “j <n ~ Λ

3 -3 X AI (N

".·. > X! I O 33 X

02 >1 O ^ U U H

§ I I I I I cou - - $ fi I I I I IOOOOO-— II roni |

•H OOOOOUUUUU CNXXXOO -H

s UUUOU OrHtNm^TXOUUCJCJ :S

1¾ ιΠΟΜΟΟσι—Ir-HrHrHi—ICJ ΓΟ'-'—-voa\ _2 g '—' ^ ' -— '— -— X X '—' m ΝΝ(ΊΊ(Ί(ΊΙΝ(Ν(ΊΝΙ CN CJ (J (N (N β

-Η « XXXXXXXXXXXX tNCNXX Q

g UCJUUOUOUUUOCJXXUU .g S romromnmpomromfNinromnm § XXXXXXXXXXXXXXXX d UUUUOOUUOOUUUUOU ή 3

-P

mn rHfNm^rinvor^oocnoiHcN^invor^ 5

>rJ rH rH rH rH fH rH rH

r 32 791 1 8

Kun tämän keksinnön mukaista syklistä A-21978C peptidiä käytetään antibakteerisena aineena, se voidaan antaa joko suun kautta tai parenteraalisesti. Niin kuin alan asiantuntijat tietävät, A-2]978C-yhdiste annetaan 5 tavallisesti yhdessä farmaseuttisesti hyväksyttävän kantaja- tai laimennusaineen kanssa. A-21978C -yhdisteen annostus riippuu monenlaisista seikoista, kuten esimerkiksi kulloinkin hoidettavan infektion luonteesta ja vakavuudesta. Asiantuntijat tietävät, että annettavaksi 10 soveltuvat annostusrajät tai annostusyksiköt. voidaan määrittää ottamalla huomioon MIC- ja ED,.q -arvot ja käytettävissä olevat myrkyllisyystiedot sekä sellaiset tekijät kuten farmakokinetiikka, potilaan tai isännän ominaispiirteet ja infektion aiheuttanut mikro-organismi.

15 Seuraavat esimerkit annetaan keksinnön valaise miseksi perusteellisemmin.

Valmistusesimerkki 1 A-21978C -rungon valmistus A. Actinoplanes utahensis :n fermentointi 20 Valmistetaan Actinoplanes utahensis NRRL 12052- varastovil j elmä, ja se ylläpidetään agar-vinopinnalla . Vinopinnan valmistamiseen käytettävä väliaine on jokin seuraavista:

Väliaine A

25 Aineosa Määrä

Esikypsytetty kaurajauho 60,0 g

Hiiva 2,5 g K2HP04 1,0 g

Czapekin mineraalilähde* 5,0 ml 30 tc n

Agar 25,0 g

Deionisoitu vesi täytetään 1 litraksi

Ennen autoklavointia pH on noin 5,9; pH säädetään arvoon 7,2 lisäämällä NaOH:a; autoklavoinnin jälkeen 35 pH on noin 6,7.

* Czapekin mineraalilähteen koostumus on seuraava: 33 791 1 8

Aineosa Määrä

FeSC>4.7H20 (liuotettuna 2 mitään 2 g väkevää HClta) KC1 100 g 5 MgS04.7H20 100 g

Deionisoitu vesi täytetään 1 litraksi

Väliaine B

Aineosa Määrä 10 Perunadekstriini 5,0 g

Hiivauute 0,5 g

Kaseiinin entsymaattinen hydrolysaatti* 3,0 g

Lihauute 0,5 g 15 Glukoosi 12,5 g

Maissitärkkelys 5,0 g

Lihapeptoni 5,0 g

Sokeriruokomelassi 2,5 g

MgS04.7H20 0,25 g 20 CaC03 1,0 g

Czapekin mineraalilähde 2,0 ml

Agar 20,0 g

Deionisoitu vesi täytetään 1 litraksi t N-Z-Amine A, Humko Sheffield Chemical, Lyndhurst, NJ.

25

Vinopinta inokuloidaan Actinoplanes utahensis NRRL 12052 :11a, ja inokuloitua vinopintaa inkuboidaan 30°C:ssa noin 8-10 vuorokautta. Noin puolet vinopinta-kasvustosta käytetään kasvatusväliaineen (50 ml), jolla on seuraava koostumus, inokuloimiseen: 30 Aineosa Määrä

Esikypsytetty kaurajauho 20,0 g

Sakkaroosi 20,0 g

Hiiva 2,5 g

Distillers Dried Grain* 5,0 g 35 K2HP04 1,0 g

Czapekin mineraalilähde 5,0 ml

Deionisoitu vesi täytetään 1 litraksi 34 7 9 1 1 8 pH säädetään arvoon 7,4 NaOH:lla; autoklavoinnin jälkeen pH on noin 6,8.

* National Distillers Products Co., 99 Park Ave., New York, NY.

5 Inokuloitua kasvatus väliainetta inkuboidaan laa- jasuisessa 250 ml:n erlenmeyer-pullossa 30°C:ssa noin 72 tuntia käyttäen halkaisijaltaan noin kahden tuuman kaaressa, nopeudella 250 kierrosta minuutissa pyörivää ravistinta.

10 Tämä inkuboitu kasvatusväliaine voidaan käyttää suoraan toisen vaiheen kasvatusväliaineen inokuloimiseen. Vaihtoehtoisesti ja edullisesti se voidaan varastoida myöhempää käyttöä varten ylläpitämällä viljelmää nestemäisen typen muodostamassa höyryfaasissa. Sellaista va-15 rastointia varten viljelmä preparoidaan suureen määrään pieniä pulloja seuraavasti. Kuhunkin pulloon laitetaan 2 ml inkuboitua kasvatusväliainetta ja 2 ml glyseroli-laktoosi -liuosta /katso W.A. Dailey ja C.E. Higgens, "preservation and Storage of Micro-organisms in the Gas 20 Phase of Liquid Nitrogen", Gryobiol 10 (1973) 364 - 367 yksityiskohtien toteamiseksi/. Valmistetut suspensiot säilytetään nestetypen muodostamassa höyryfaasissa.

Näin valmistettu varastoitu suspensio (1 ml) käytetään ensimmäisen vaiheen kasvatusväliaineen (50 ml; 25 koostumus edellä kuvattu) inokuloimiseen. Inokuloitu ensimmäisen vaiheen kasvatusväliaine inkuboidaan edellä esitetyllä tavalla.

Suuremman inokulaattimäärän aikaansaamiseksi käytetään 10 ml inkuboitua ensimmäisen vaiheen kasvatusvä-30 liainetta toisen vaiheen kasvatusväliaineen, jonka määrä on 400 ml ja koostumus sama kuin ensimmäisen vaiheen kasvatusväliaineella, inokuloimiseen. Toisen vaiheen kas-vatusväliainetta inkuboidaan 2 l:n laajasuisessa erlenmeyer-pullossa 30° C:ssa noin 48 tuntia käyttäen halkai-35 sijaltaan kahden tuuman kaaressa, nopeudella 250 kierrosta minuutissa pyörivää ravistinta.

35 79 1 1 8

Edellä esitetyllä tavalla preparoitu, inkuboitu toisen vaiheen kasvatusväliaine (80 ml) käytetään steriilin tuotantoväliaineen (10 1), joka on jokin seuraavista, inokuloimiseen:

5 Väliaine I

Aineosa Määrä (g/1)

Maapähkinäjauho 10,0

Liukoinen lihapeptoni 5,0

Sakkaroosi 20,0 10 KH2P04 0,5 K2HP04 1,2

MgS04‘7H20 0,25

Vesijohtovesi täytetään 1 litraksi Väliaineen pH on noin 6,9 121° C:ssa ja noin 1,1 - 1,2 atm:n paineella suoritetun, 45 minuuttia kestäneen autoklaavisteriloinnin jälkeen.

Väliaine II

Aineosa Määrä (g/1)

Sakkaroosi 30,0 20 Peptoni 5,0 k2hpo4 1,0 KC1 0,5

MgS04.7H20 0,5

FeSO..7H~0 0,002 4 2 25 Deionisoitu vesi täytetään 1 litraksi pH säädetään arvoon 7,0 HCl:lla; autoklavoinnin jälkeen pH on noin 7,0.

Väliaine III

30 Aineosa Määrä (g/1)

Glukoosi 20,0 NH4C1 3,0

Na2S04 2,0

ZnCl2 0,019 35 MgCl2.6H20 0,304 36 79 1 1 8 Väliaine III jatkuu

Aineosa Määrä (g/1)

FeCl3.6H20 0,062 5 MnCl2.4H20 0,035

CuC12.2H20 0,005

CaC03 6,0 KH2P04* 0,67

Vesijohtovesi täytetään 1 litraksi 10 * Steriloitu erikseen ja lisätty aseptisesti.

Loppu-pH noin 6,6.

Inkuboidun tuotantoväliaineen annetaan fermen-toitua 14 l:n fermentointiastiassa noin 30° C:n lämpötilassa noin 66 tuntia. Fermentaatioväliainetta sekoite-15 taan tavanomaisilla sekoittamilla nopeuden ollessa noin 600 kierrosta minuutissa ja ilmastetaan steriilillä ilmalla liuenneen hapen pitoisuuden pitämiseksi suurempana kuin 30 % ilmalla kyllästysarvosta normaali-ilmanpaineessa .

20 B. A-21978 ;n deasylointi A. utahensis :n fermentaatio suoritetaan osassa A kuvatulla tavalla käyttäen vinopintaväliainetta A ja tuotantoväliainetta I ja inkuboimalla tuotantoväliainet-ta noin 67 tuntia. US-patenttijulkaisussa 4 208 403 kuva-25 tulla tavalla valmistettu epäpuhdas A-21978C -yhdistelmä (100 g) lisätään fermentaatioväliaineeseen.

A-21978C -yhdistelmän deasyloitumista seurataan Micrococcus luteus -kokeella. Fermentaation annetaan jatkua, kunnes deasyloituminen on täydellistä, mikä käy 30 ilmi vaikutuksen M. luteus :a vastaan häviämisestä, eli noin 24 tuntia.

C. A-21978C -rungon eristäminen

Koko fermentaatioliemi (20 1), joka saatiin osassa B kuvatulla tavalla, suodatettiin käyttäen suodatuk-35 sen apuainetta (Hyflo Super-Cel, Johns Manville Corp.) 37 79118

Myseelikakku heitettiin pois. Näin saatu suodos laskettiin pylvään läpi, joka sisälsi 1,5 1 HP-20-hartsia (DIAION High Porous Polymer, HP-Series, Mitsubishi Chemical Industries Limited, Tokio, Japani). Näin saatu efflu-5 entti heitettiin pois. Pylväs pestiin sen jälkeen deioni-soidulla vedellä (10 1) suodatetun liemen jäännösten poistamiseksi. Pesuvesi heitettiin pois. Sitten pylväs elu-oitiin vesi-asetonitriili -seoksilla (kutakin seosta käytettiin 10 1 ja suhde niissä oli 95:5, 9:1 ja 4:1) ja 10 kerättiin 1 l:n jakeita.

Eluointia seurattiin paperikromatografiällä käyttäen liuotinsysteeminä n-butanoli-pyridiini-etikkahappo-vesi -seosta (15:10:3:12) ja yhdisteiden havaitsemisessa käytettiin hyväksi UV-fluoresenssia. Tällä liuotinsystee-15 millä A-21978C -tekijöiden R^-arvo on noin 0,56 ja A- 21978C -rungon R^-arvo noin 0,32. Tuote tutkittiin myös analyyttisellä HPLC:llä käyttäen silikageeliä/C^g ja liuotinsysteeminä vesi-metanoli -seosta (3:1), joka sisälsi 0,1 % ammoniumasetaattia; runko havaittiin UV-valon 20 aallonpituudella 254 nm.

Runkoa sisältävät jakeet yhdistettiin, väkevöi-tiin alipaineessa asetonitriilin poistamiseksi ja kylmä-kuivattiin, jolloin saatiin 40,6 g osittain puhdistettua A-21978C -runkoa.

25 D. A-21978C -rungon puhdistus

Osassa C kuvatulla tavalla saatu, osittain puhdistettu A-21978C -runko (15 g) liuotettiin 75 ml:aan vesi-metanoli-asetonitriili -seosta (82:10:8), joka sisälsi 0,2 % etikkahappoa ja 0,8 % pyridiiniä. Tämä liuos pum-30 pattiin 4,7 x 192 cm:n pylvään päälle, joka sisälsi 3,33 1 silikageeliä/C-^g (Quantum LP-1, Quantum Industries, 341 Kaplan Drive, Fairfield, NJ 07006). Pylväs kehitettiin samalla liuotinsysteeminä. Kerättiin tilavuudeltaan 350 ml:n jakeita. Erottumista seurattiin UV-valon aallonpituu-35 della 280 nm. Runkoa sisältävät jakeet yhdistettiin, vä- 38 791 1 8 kevöitiin alipaineessa liuottimien poistamiseksi ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 5,2 g puhdistettua A-21978C -runkoa.

E. A-21978C -rungon karakteristiset tiedot 5 A-21978C -rungolla on seuraavat karakteristiset ominaisuudet: a) Muoto: valkoinen amorfinen aine, joka fluoresoi lyhytaaltoisessa UV-valossa.

b) Empiirinen kaava: cg2H83N17°25 10 c) Molekyylipaino: 1465 d) Liukoisuus: liukenee veteen e) Infrapuna-absorptiospektrissä (KBr) esiintyy absorp-tiohuiput seuraavilla taajuuksilla (cm : 3300 (leveä), 3042 (heikko), 1655 (voimakas), 15 1530 (voimakas), 1451 (heikko), 1399 (keskinkertainen), 1222 (keskinkertainen), 1165 (heikko), 1063 (heikko) ja 758 (keskinkertaisen ja heikon välillä).

f) UV-absorptiospektrissä metanolissa esiintyy huiput aallonpituuksilla 223 nm (6*41 482) ja 260 (¢ 8 687).

20 g) Potentiometrinen titraus 66 %:isessa dimetyyliforma- midin vesiliuoksessa osoittaa läsnä olevan neljä titrautu-vaa ryhmää, joiden pK -arvot ovat noin 5,2, 6,7, 8,5 ja cl 11,1 (alku-pH 6,12)

Valmistusesimerkki 2 25 A-21978C -rungon vaihtoehtoinen valmistus A-21978C -runko valmistettiin valmistusesimerkin 1 mukaisella menetelmällä lukuunottamatta joitakin muutoksia osassa B. A. utahensis -viljelmää inkuboitiin aluksi noin 48 tuntia, substraattina oli osittain puhdistettu 30 A-21978C -yhdistelmä (50 g), ja inkubointi substraatin lisäyksen jälkeen kesti noin 16 tuntia. Liemisuodos laskettiin 3,1 1 HP-20 -hartsia sisältävän pylvään läpi. Pylväs pestiin 10-kertaisella tilavuudella vettä ja elu-oitiin sitten vesiasetonitriili -seoksella (95:5). Elu-35 ointia seurattiin samoin kuin valmistusesimerkissä 1.

39 79118

Kun oli kerätty 24 litraa, vaihdettiin eluointiliuotti-meksi vesi-asetonitriiliseos (9:1) .. Runkoa sisältävät jakeet eluoitiin tällä liuottimena. Nämä jakeet yhdistettiin, väkevöitiin alipaineessa asetonitriilin poista-5 miseksi ja kulmäkuivattiin, jolloin saatiin 24,3 g osittain puhdistettua A-21978C -runkoa.

Tämä osittain puhdistettu A-21978C -runko (24,3 g) liuotettiin veteen (400 ml). Liuos pumpattiin 4,7 x 192 cm:n teräspylvään päälle, joka sisälsi 3,33 1 silikageeliä 10 (Quantum LP-l/C^) ja oli valmistettu vesimetanoli-ase- tonitriiliseoksessa (8:1:1), joka sisälsi 0,2 % etikka-happoa ja 0,8 % pyridiiniä. Pylväs kehitettiin samalla liuottimella noin 140 atm:n paineella ja kerättiin 350 ml:n jakeita. Eluointia seurattiin UV-aallonpituudella 15 280 nm. Runkoa sisältävät jakeet yhdistettiin, väkevöi tiin alipaineessa liuottimien poistamiseksi ja kylmäkui-vattiin, jolloin 14 g erittäin puhdasta A-21978C -runkoa.

Valmistusesimerkki 3

Nom~t-BOC-A-21978C “tekijöiden C2 ja valmistus 20 US-patenttijulkaisussa 4 208 403 kuvatulla taval la valmistettujen A-21978C -tekijöiden C2 ja seos (10 g) liuotettiin veteen (50 ml) käyttäen ääniaaltokäsittelyä (pitoisuudeksi tuli 200 mg/ml). Liuoksen pH säädettiin arvosta 4,05 arvoon 9,5 5N NaOHrlla (3,6 ml). Lisättiin 25 di-t-butyylidikarbonaattia (3,0 ml), ja reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 2 tuntia. Reaktioseoksen pH pidettiin 9,5 :ssä lisäämällä käsin 5N NaOH:a (6,5 ml 2 tunnin aikana).

Reaktiota seurattiin määräajoin TLC:llä silika-30 geelilevyjä käyttäen ja käyttäen liuotinsysteemeinä CH^ CN-H2O -seoksia (7:3 ja 8:2) ja havaitsemisessa UV-valoa.

Noin 10 minuutin kuluttua reaktioliuos muuttui äkkiä sameaksi ja emäksen kulutus kasvoi. 30 minuutin kuluttua sameuden lisääntymisnopeus ja emäksen kulumis-35 nopeus laski, mikä osoitti reaktion olevan lopussa. Siitä huolimatta reaktion annettiin jatkua vielä 90 minuuttia 4o 79118 loppuun menon varmistamiseksi. Kaksituntisen reaktion lopuksi reaktiomateriaali kylmäkuivattiin välittömästi, jolloin saatiin 12,7 g N0rn~t-BoC-A-21978 -tekijöitä C2 ja · 5 Samanlaisia menettelytapoja käyttäen tehtiin kak si reaktiota, joissa käytettiin lähtöainetta 10 g, ja reaktio, jossa käytettiin 30 g lähtöainetta. 10 g:11a tehdyissä kokeissa saatiin 11,9 g ja 12,1 g tuotetta, vastaavasti. 30 g:lla tehty reaktio antoi 35,4 g tuotetta. j-0 Valmistusesimerkki 4 A-21978C-NQrn~t-BOC -rungon valmistus A. A. utahensis :n fermentointi A. utahensis :n fermentointi suoritettiin valmis-tusesimerkin 1 osassa A kuvatulla tavalla käyttäen vino- 15 pintaväliainetta A ja tuotantoväliainetta I ja inkuboimal-la tuotantoväliainetta noin 66 tuntia.

B. NQrn“t-BOC-yhdistelmän deasylointi A-21978C-NQrn-t-BOC-yhdistelmä (1185 g raakasubst- raattia, joka sisälsi noin 176 g A-21978C -yhdistelmää) 20 lisättiin fermentaatioväliaineeseen. Deasylointi tehtiin valmistusesimerkin 1 osassa B kuvatulla tavalla. Deasy-loituminen oli HPLCtn mukaan lopussa noin 24 tunnin kukuttua .

C. A-21978C-N0rn-t-BOC-rungon eristäminen 25 Osassa B kuvatulla tavalla saatu fermentaatiolie- mi (100 1) suodatettiin käyttäen suodatuksen apuainetta (Hyflo Super-cel). Suodos laskettiin 7,5 1 HP-20 -hartsia (DIAION) sisältävän pylvään läpi, ja pylväs pestiin vedellä (38 1). Eluointia seurattiin silikageeli/C^g-HPLC:llä 30 ja käyttäen havaitsemisessa UV-valon aallonpituutta 254 nm. Osa rungosta eluoitui pesuliuoksessa. Seurannut rungon eluointi tehtiin seuraavia vesi-asetonitriiliseoksia käyttäen: (9:5) - 40 1; (9:1) - 40 1? ja (35:15) - 100 1.

Runkoa sisältävät jakeet yhdistettiin, väkevöitiin alipai- 4i 79118 neessa liuottimen poistamiseksi ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 298,5 g osittain puhdistettua A-21978C-N^

Orn t-BOC-runkoa.

D. A-21978C-N0rn~t-BOC-rungon puhdistus 5 Osassa C kuvatulla tavalla saatu, osittain puh distettu A-21978C-N0rn“t-BOC-runko (30 g) liuotettiin vesi-asetonitriiliseokseen (9:1), joka sisälsi 0,2 % etik-kahappoa ja 0,8 % pyridiiniä ja jonka määrä oli 75 ml.

Tämä liuos pantiin 4,7 x 192 cm:n teräspylvääseen, joka 10 sisälsi 3,33 1 silikageeliä (Quantum LP-1/C1Q), joka oli saatettu tasapainotilaan samaan liuotinsysteemiin sekoitettuna. Pylväs kehitettiin painetta käyttäen vesi-asetoni-triili-metanoliseoksella (80:15:5), joka sisälsi 0,2 % etikkahappoa ja 0,8 % pyridiiniä, kerättiin 350 ml:n ja-15 keitä ja havaitsemisessa käytettiin UV-valoa aallonpituudella 280 nm. Tuotetta sisältävät jakeet yhdistettiin, väkevöitiin alipaineessa liuottimen poistamiseksi ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 18,4 g puhdistettua A- 21978C-1SL· -t-BOC-runkoa.

Orn 20 A-21978C-t-BOC-rungon karakteristiset tiedot ovat seuraavat: a) Muoto: Valkoinen amorfinen aine, joka fluoresoi lyhytaaltoisessa UV-valossa.

b) Empiirinen kaava N-, 0~ c 67 91 I7 27 25 c) Molekyylipaino: 1565 d) Liukoisuus: liukenee veteen e) Infrapuna-absorptiospektrissä (KBr) esiintyy absorp-tiohuiput seuraavilla taajuuksilla (cm ^): 3345 (leveä), 3065 (heikko), 2975 (heikko), 2936 30 (heikko), n. 1710 (olkapää), 1660 (voimakas), 1530 (voimakas, 1452 (heikko), 1395 (keskinkertainen), 1368 (heikko) , 1341 (heikko), 1250 (keskinkertainen), 1228 (keskinkertainen) , 1166 (keskinkertaisen ja heikon välillä) ja 1063 (heikko).

42 791 1 8 f) UV-absorptiospektrissä 99 %:isessa etanolissa esiintyy huiput aallonpituuksilla 220 nm (£ 42 000) ja 260 nm (6 10 600) .

g) HPLC-retentioaika = 6 minuuttia 4,6 x 300 mm:n silika-5 geeli/Cj, g-pylvästä käytettäessä ja käytettäessä liuottimena I^O-CH^CN-CH^OH-seosta (80:15:5), joka sisälsi 0,2 % NH^OAc:a, virtausnopeuden ollessa 2 ml/min ja käytettäessä havaitsemisessa UV-valoa.

Valmistusesimerkki 5 10 A-21978C-N0rn-t-BOC-rungon vaihtoehtoinen puhdistus

Valmistusesimerkin 4 osassa C kuvatulla tavalla saatu, osittain puhdistettu A-21978C-N0rn-t-BOC-runko (10,8 g) liuotettiin veteen ja pantiin pylvääseen, joka sisälsi 80 ml Amberlite IRA-68 :a (Rohm and Haas, Phila-15 delphia, PA, asetaattisykli). Pylväs pestiin vedellä ja eluoitiin perätysten, virtausnopeuden ollessa 5 ml/ min, 0,05 N etikkahapolla (1080 ml), 0,IN etikkahapolla (840 ml) ja 0,2N etikkahapolla (3120 ml) ja kerättiin 120 ml:n jakeita. Pylvästä seurattiin analyyttisellä silikageeli/ 20 C^g-HPLC :llä käyttäen liuotinsysteeminä vesi-asetonit-riili-metanoliseosta (85:15:5), joka sisälsi 0,2 % am-moniumasetaattia, ja havaitsemisessa UV-valoa aallonpituudella 254 nm. Tuotetta sisältävät jakeet yhdistettiin, liuoksen pH säädettiin pyridiinillä arvoon 5,8, ja muo-25 dostunut liuos väkevöitiin alipaineessa noin 200 ml:n tilavuuteen. Väkevoityyn liuokseen lisättiin vettä, ja saatu liuos väkevöitiin uudelleen pyridiinin poistamiseksi. Tämä konsentraatti kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 3,46 g puhdistettua A-21978C-NQrn-t-BOC-runkoa.

30 Esimerkit 1-16

Erilaisten alkanoyyli- ja alkenoyylijohdannaisten valmistus asyloimalla kaavan 3 mukaisia yhdisteitä, mikä on tyypillinen kaavan 1 mukainen valmistustapa, esitetään jäljempänä olevassa taulukossa V. Taulukossa V ole-35 vat johdannaiset valmistetaan joko muunnetulla Schotten-Baumanreaktiolla käyttäen happokloridia asylointireagens-sina (menetelmä A) tai aktiivisen esterin menetelmällä 43 791 1 8 käyttäen 2, 4, 5-trikloorifenyyliesteriä asylointirea-genssina (menetelmä B). Yleiset menettelytavat asylointi-reaktioiden tekemiseksi menetelmällä A tai menetelmällä B esitetään seuraavassa: 5 Menetelmä A (Muunnettu Schotten-Baumanreaktio) Tämä menetelmä sisältää kaavan 3 mukaisen rungon reaktion aikaani- tai alkeenihappokloridin kanssa, joka vastaa haluttua asyylisivuketjua.

Kaavan 3 mukainen yhdiste (1,95 - 2,16 g, 1,33 -10 1,47 mmol) tai kaavan 2 mukainen yhdiste (409 mg, 0,25 mmol) liuotetaan 200 ml:aan pyridiini-vesiseosta (9:1). Asylointireagenssi (18 - 20 mmol ylimäärin asyyli-kloridia liuotettuna 15 ml:aan asetonia) lisätään pisaroi ttain 1-3 tunnin kuluessa, ja reaktioseosta sekoi-15 tetaan ympäristön lämpötilassa lisäksi 2-3 tuntia. Reak-tioseos väkevöidään asetonin poistamiseksi. Jäljelle jäävä vesikerros laimennetaan vedellä noin 200 ml:ksi. Tämän liuoksen pH säädetään jääetikalla arvoon 3,0 - 3,5. Tämä liuos pestään 8 kertaa samansuureisella tilavuudella di-20 etyylieetteriä ja sen jälkeen kylmäkuivataan.

Epäpuhdas asyloitu johdannainen puhdistetaan kään-teisfaasi-HPLC :llä seuraavasti: Veteen tai eluenttisystee-miin (noin 4-6,5 ml) liuotettu näyte ruiskutetaan ruostumattomasta teräksestä valmistetun, 84 x 1,6 cm:n pyl-25 vään päälle, joka on täytetty LP-l/C^g adsorbentilla. Pylväs eluoidaan H20-MeOH-CHgCN-pyridiini-HOAc -liuotinsys-teemillä. Eluointi suoritetaan noin 100 - 140 atm:n paineella ja noin 10 - 12 ml/min:n virtausnopeudella käyttäen LDC-dupleksipumppua (Milton-Roy). Effluenttia seura-30 taan UV-valossa käyttäen ISCO-UA-5 -detektoria aallonpituudella 280 nm. Halutut jakeet yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa, jolloin saadaan haluttu alkanoyyli-johdannainen. Puhdistettu tuote analysoidaan TLC:llä käyttäen käänteisfaasilevyjä (Whatman KC^g) ja liuotinsystee-35 minä H^-MeOH-CHgCN-pyridiini HOAc -seosta (45:15:40:2:2).

44 791 1 8

Levyjä tarkastellaan UV-valossa tuotteen havaitsemiseksi. Tuotteet analysoidaan myös UV:llä (ekstinktiokertoimet aallonpituuksilla 220 nm ja 260 nm), ja niille tehdään aminohappoanalyysi. Puhtaus määritetään analyyttisellä 5 käänteisfaasi-HPLC :llä (C-^Microbondapak, Waters Co.) käyttäen I^O-MeOH-CH^CN-pyridiini-HOAc -liuotinsysteemiä ja seuraten eluenttia UV-valossa aallonpituudella 280 nm.

Menetelmä B {aktiivisen 2,4,5-trikloorifenyyli-esterin menetelmä) 10 Liuos, jossa on N0rn~t-BOC-A-21978C -runkoa (1,0 g, 0,64 mmol), A-21978C -runkoa (0,5 - 1,0 g, 0,34 - 0,68 mmol) tai A-21978C :ä (946 mg, 0,58 mmol), ja aktiivinen trikloorifenyyliasyyliesteri, jota on 3,5 moolia ylimäärin, liuotetaan DMF:iin (100 ml), ja liuosta sekoitetaan 15 lämpötilassa, joka on huoneen lämpötilan ja noin 50° C:n välillä, noin 6-20 tuntia. Reaktioseos väkevöidään öljyksi alipaineessa. Öljy trituroidaan käyttäen 50 ml Et20-tolueeniseosta (1:1) ja pestään Etoilla. Monoasyloitu ja diasyloitu A-21978C -rungon johdannainen, asyloitu A-20 21978C^ ja asyloitu t-BOC-A-21978c-runko puhdistetaan me netelmässä A-kuvatulla tavalla.

Asyloitu t-BOC-A-21978C -runko suojataan käyttäen 50 mg/ml trifluorietikkahappo-anisoli-trietyylisilaani-seosta (10:1:1) lämpötilan ollessa noin -10 - 0°C ja kä-25 sittelyajan 3-5 minuuttia. Tämä reaktioseos väkevöidään alipaineessa öljyksi, joka trituroidaan käyttäen kahta 20 ml:n erää dietyylieetteriä. Epäpuhdas asyloitu tuote puhdistetaan käänteisfaasi-HPLC:llä ja analysoidaan menetelmässä A kuvatulla tavalla.

30 Kaikki esimerkkien yksittäiset yhdisteet, jotka esitetään yhteenvetona seuraavissa taulukoissa V - X, ovat rakenteeltaan kaavan 1 mukaisia: 45 79118 :rd

•H

•H

00 v *'

01/1-0-040-3-0400-11-100--0.01/1 ro -HU DinvD.-t^rocNrs.rHkO.Hmu-iO'r-i oo M <C

110104 04 04 01 00 00 00 04 04 01 04 04 04 S >lO

n, ΓΠ U ^ T-t di TJoo.3-mmooom mm om o <*> ö*3 m mmo) <r -3 m cnoj a m “ ~ p Μ3-μ^?| ^ ηηοηηοηη _< oo ** &'fll2ininoc,ir'ir'ir'C>^om<Nmö m -h ^aJom^Hmm<r<r^vr m oo -? -3 m «

i—I

:« 3 3 3 333 tn o m m ί> $ 4J iCSm+j-P^+J m ’tn ^

a Λ |;ϋ» JJ S s " ÄS

4J | <» | fS 3 -4 ,H 0} M m r4 ,—I .-4 0} tn rH CD _| ^ C

m -H4Jua)"^;"dzj a ...... h -h ·. -h ·· ^ n •d rfilfel 3 ί ° ° Ώ 'S Ώ OOO-d^oO m o 5

g ^ ^ w & * dP

i *H -H *H *Η ·Η ·Η ^ΊΓ' i

Cik (1)0)0) Q) Q) <1) >fH

Il „ H A

ίφ ,V £j S^^^^mr-JCN -d- . 04 O CM "°oo O oo CO w :3

dj *H ^ ^ ^ CN fSC^CNcNr-HCN-^r iNS2 *H

h h s" g o -d L ‘H - in n Q S S ? o^orviomoovoo(NO-i<rr^o o o & °ti2caot,'®00rHOr1-irio o n IS gSsSffi n <rm ^ S c^ > S ö -< Q o-i , δ δ ·η ^ tn -¾ 9 II ‘S- COOOOOOOOOOOOOOO OU ^ •SF hl· -nte O4>oooovoooooooooo o »0 3 1 n 3 0 :n$s o^ooo-ioooooooOo o w 1 £ , 1 c I <D ^ 5 H Sffi MCcQ<;c3<ca<caoaoqEapqpa30 e 'cm

"§ ,5 1 Jj ^ G

S gal ΐ 0ΰ a i ϊ. ^

O u C

I < -S

CJ c-v x a -H

00 θ'1 <-> H -P

- K II I H 4-1 ^ I O X o 2 0) σι o u u Ό I—I O Ä CN Γ·"* X) CM .......· I I I I I 00 O X ^ Qj I A /X ,-L -L JL A X ö o o o o o /^s n cj t*\i L οοοοοοουυουυυ cmx·^- — m

^ ^ O O'UtJCJ O >H 04 04 OO .3 χ cj (j o - iH

Λ® vOr'^r^00CJ'''H'-lf-lr-lr-lr-IO Γ3 || >—’ X -H

a) a) ^T4 -T* ^T4 J4 04 .04 04 04 04 04 04 04 04 | OJ U (_) || \Q

M Μ§3σΰδδοουδ555υδχ^χο4 l* 3 SSSSsSSSSSSSSSSSSö^- 5 >1 ai. Ή W , -¾ ^ •Ho4(3vj-m^oo-m(y,OrHo4oi^imvo 10 Φ I g Ό tn -h w λ; 46 791 1 8 <0 C τη > :cö o'd tn -h ai -h

s O -H

O ^ U

^ OOOOOOOOrHOOO O Ή& . . ΟΟΟΟΟΟΟΓ^ίΛΟΟΟ O Μ-ΐϋ P >^ί <T ur> O O <J" tn 00 i—< r^. o c-J ρθ νο O ^ *****>*·*·.**.,*♦. „ .‘fy d£> ΤΪ E ^OMOOC^CTvc^C^rsJC^C^ r-i :fÖ

φ ^rHrH-HrHrH _4 Ij-PCN

•H OJ r—1 *·

-P :03 O

-P > 5 -¾ tn

Φ 3 o tn .H

tn cm ooooooor^cMooo o _:(ö •rj ΟΟΟΟΟΟΟμΤΓ^ΟΟΟ o β ^ tn ύ -'ONO^rMOin^MOOO o -* ‘d •d EcovovOMDvovrcoooo<r-<rin o 'c-1 _ d gj ^ 'Τ-Τ'ΤΜΓο-ΜΤΜί'^τιηιη-Μ--^· in ” Ή n. 0OO <£

i4 Φ Hm O

{3 -g Uffi H Q Uh - S 2 u r* Λ «*° -* ** n ^^οοοσου υ o o o S 2 ro

C I -H m ^ ^ ^ 11 u o <t -T <r S

S 9 2 COU-lU-lLOLOU-lU-l'f. 7! 'ft §!£} ° M £q c r. 2 2. 2. ?.?.?.?. ° ° 2 2 2 3» m ‘d 'd S M 9i oommininino—iosinin in Il 2 1-1 ä ö.hSh ^Μ3<ΤΜΤ<ίΜΤΜΤιη o <r <r <r 3 I^^Sw 3 g ;d H ft3 m m -h

> Λ Φ tq -H

O ·π - ^nomomtT.ncMMTinoMr ö ST 7. !3 i> -r^ c3 cocor^r-^iijiniA-<frn(Nir^Ln m ^ χ ρ g 'j* aT o o' o' o" o' o' o" o' o"1 o’' o' o' o-' 2 °η-) ffi ^ tn tn S de ^ S %=: X X X X X X χ χ χ χ χ χ X S°N ^ : Q -j x o nj f 1-1„ +J :td -H ϋ

a x ^“χχχχχχχχχχ x q c tnC

β 15 Sj S

SI Q <D -H df> o jn -P tn o ό tn i—i •H r-~- | <0 >1 10 _ x _ tn x to

•H cm o -ftJ H O "O

tl , S ΐ Λ 3ΐ Ί 5 R 8 £ ^ϋ„ U § > 'i * I I I I I co Ο X H ·· 'η η Λ'11'0°ΟΟΟ^.ΐΓυΓ.|^Ή > id “ OOOOOOOOUCJCMXXX I _ ·· Ό

u <j o o cj o^mcno-txcjcju ·η to t>-H

n· X iniOr^COO\i-lf-H.-li-lr-ICJcnIl'-^ t/J ‘OI -p Οι H—H H-N -V , V y ^ ^^ ^ X X tu Ϊ3 rH C'J _fM CM ΓΜ CM ΓΜ n| CM CM CM | ΓΜ U !J ,<0 -O JP ^

nj =ÄX3Xxxxxxx = %j|f tw q J K

I UUOUOOOCJOUOOXX tn-HtOUclP

--------- W ------ ' V-»· >_' ----- II PP···· «< η ο o m m m ο ο ο o n mm^i S Q tj S •t 3X XXXXXXXXxxxx -ΗΉ» Ö .

g uouuooooooouuo I ^ S aT «

<u :q (0 O H

P 4J ϋ q do ·· :tu

•H WO^cMo^mor.xcno-HCMo ^cn°cn-H

2 £ *0 -HO X} O

>1 ^ cn 47 791 1 8 § i,r Φ ·<0 ro m r-c o co vo m o •PM ιο o vo in vo <r in 2 :2 cm cn cm >h cn cm m

H E

o m o o o (o <j- r>. <r vj <r xi tj "Π ..........cn cn . -H m o m m m

rjn .h cn —i cm ,η o O

μΦ m m m in m <n cm & R ί οι <· n >j a :

W A

p L I yr m 3 Λ JS - „0 υυ

Vi? iH.p:5 rHr^ooo<roooo 0

Gj (¾ £3 |jj -”l CM i—I CM ι—1 t—I CM

m I Is co <n cm 0 cm on vo" m J! H t^-5 πΓ C o cn vo cn on ^-1 vo cm n 3 «ο 8 ·Λβ £ ^ m cm μ o h # g < r-t H U)M rJ ^ r-i 3 H 1 ttJ *

ΰ 0 :t Φ :(0 CM

*r~i 4J φ G «, •H e· g :3 on vo 0 0 0 0 0 0 0 O H 53-3:(3 0 <r 0 0 0 0 0 0 Λί J Λ B -vr on in m 0 0 0 0 nj 3 >n iH r-ι γη γη -n H S ω :¾ :id rd ^ P Jj 'ä

H Γ H Φ -H

H -P . -O 0) H

p g| CnunnuidiQ

: 2Γ > I 1 1 1 o 1 1 1 o o Dj _ · V 000000 :id Q-I cm U U U rH O dP ·Η

i-l 33vOO\<yirHr-i_, P

. | EM CM O ,—v /-—\ v ,—v CM -r-f

Z oi CM CM CM CM CM CM *· H

---- I I K K S3 33 a XOTj cd

C OOOOOOOOO -H

·· O O O —- i— O 3—, Ή tl '2

vj cncnumcncocneacnq<i!5lS

°2 xxosaaaia d ^ ^ 2 & 00330000^0·$^”«

H r-c -H O dP

^ oiaaaacaaxaa <n o m ^ < q q iti -¾ ,ρ- ·ρ <d O O O o o -5 -H -n CJ O O O -ΓΊ d Ή VO 30 VO VO P Vl ‘5 '"v ,-v 'Τ' tn -n

CM CM CM CM

x ä a a ^ x, d yj

O O O CJ

3-- V_, V-, N-* £* >S _ T?

-—v ,—s 1 ,—s .-y q q ‘H

ai m m m 1 1 10 en c? S j d.

333333000033 en R jJ K

o o o o o o h υ R ·η a o s ~ ~ ö q 'R i*> cm

«-M r—I /“N M «· p C2 M

CJ O O CM CM CM CM U Τ' n? -fi —I

CMCM<N33=S33 33 CM O Λ* d ?M

333333000033 en 2 n ·η ' te 5 .2 m Π cnmcncncncncncnN nQjjJdo xxxaaBffisjo 's ij1 y a «

1 000000000 OPrawT

M n IN a ID -H +J

H o a S k w —

SC r3-ooovOr-icMcn<rin rdjauO

•H '—1'—li—lCMCMCMCMCMCM

M -H W ^ I

48 791 1 8

:td -H

:td tn

-P

I-I (¾

E X

c tn o O -M -n Ό O O O O O rl) <N OOOO O ' 4J X -<Τ O O O O ^ Λ Cfl * * M m * ^ lU ' x, e o ή σ' oo <j\ z ‘z. x o

^ -< -η ,η O

QJ ω ·η » ιί

Tj tn ·· T. s o oo m o S M oooo o rH H· k tn cm o ο o o o O'- H X Ο O O cn O K? ^0 -M , a> 2 " ' ‘ ^ ~ * m 4J c= oi-'-inco O' H H ^ fi

j n r< mt -x <r <r <τ z Z CU <N

Τ’ 2 ω rtj n S S 5 g °

iin <0 ·· ttJ

m .i, e fL. o o u X K -n 2 μΗμΟΟΟι/ιοο £ O td £ Γ, fT £ -J -a- <r m <r <r — ro :td ·· to -P EH -P ............ n,-, _j r»

Ai >i CC G o m o o u-ι o -HU CrtC

- γη .. -ho

ni (H ip * Jj mmmomoHH 0)0 -H CC

xj 5 r n <r<r-3-m-3-<rz2: 1) (N Tl CP CG -H <#>

2 cd P

X :td >1 rH

S -H G O, i_) b cdO'inr'.rHnco'—l-H (d I· S ^-ιΟΓ'ΟΟ ο τ) o -H £ dP -r~t rj iS 06 - - ^ - -.h tn® h -O ooooozo Sojrtd

n n (d -P - -H

9 .° I I I C « · O C

τ$ [? O I I O O -P >i <C -P

•3 "p u o o u o -P tn ·· -p -h h >, 3 » = 1 m ή ή "i * ; o S » S i2 i u x x x z .Q 0 CC tn >i Η 5 Ο'-'οο οου p q -H pj 7j o q ^ ^ w o o -rl # to Ό o u o o opamrn^j m I Z O X K X I X rrt CM m CJXUCJUiJCJb™2_,

^ td ·* - M rH

J- Ή —^ o O

H X X X X X XXXI tide τι rd U rH -H (d -r-> ^ , , . tH p T-l o o o ·· O sd

n o u o U -P :<d > -H

*7 o o \o q 4-> -p ·· G

rj ^ T-N EH td c > -H

-Γ4 -Γ* ™ I (d -H ·. -H

5 5 5 , * ^ ^ _* w w *H ·Η ό Ή

G ^r-v i tn Td -P 2 P

, Oi cn n i I oo rd G P U >i « SSSS ^5 ^ a Sm ft 5 £ x x ^x M g 5 ^ _, O O cn CM O O -H ffl c»P ·· (d 7; CM CM X X X (M CLI>W>H£

v XXUO OX -P -H CM O -H

l CJ CJ ^ ·*—c' CJ C ö ^ ΓΟ Ή Λ! ^ S' S' S S' S' ij ;td tn o ® tn -p

G G 5 O Guu :5 ? _i υ 'h "I

X P H ·· :td -P

Q) O tn O tn -P U-t 3 rH CM -H Eh

« -ΤΟΌΓ. OOcrtO

ij _ r-t iH *H »H rHrHr·) Oj ^ “ Λ ϋ t3

Ό O JC P

ΪΗ C5 49 7 9 1 1 8

rH

f—i p g, £ £ Ϊ (ti 10 δ ssll a |äI? s qh cy T.

Φ ^ S g o +J to Ό ä 1/1 (ti *· g

s Z

M M I <0 ™

-P I ij 3 O O

tn « +» (ti _ •H fö P *Γ"> I tp g .s, 5“ a O <b ω :rt c - s ilii 2 i

H -H < 4-i cn g -H

I 1 ® 'ä "6 +3 1 '2 *Λ ΓΜ dj ·η jC G :(g > Ή *

Eh -h :73 -H :rg tJi O

r—I J (¾ £ '—^ Ή S, I :$ to rti -H lb ^ ^ ^ Ip -3

& I

^ as Μ & s ^ S s i 2 ^ - > .00 ^

i " S

S tJ aT

« g h --· ^ Ώ " 02 _r* nj Jr; OS 3 Sv, > s s u . o ii. -" 5° 79118 :rö I g -ä

o > -H

\0 Ή Ή ft O O Ό

X O W -H

Π3 iT) 01 H

e u >i ft ft Q ft li) ft d ft (Λ0

£ B

o $ o CN 4-) 4-) <nj f—v r-t Ή 0 x § 3 to 1 l « S ä

Tj ft rH M 2

^ ω 'T 5 « S

Ώ n ° iS ^

•H £2 O O

+J _ -H , - -Γ-l K

ra d +J ^ co

•H 0) +) 11 i—l * d*P

h Se Γ) U — ω -h 3 ^ 2 o cm +)+)3 rr -

M +J H 1/1 C ·· O

p ?tW ^ ra Ln 1 fa ; IS * g *a i s 1 x en z -ra O '3 * 3 3 li α - ^ s 0 -d

3 ra as o » SL

'd ό ra s ft 3 -s i x o ra O ! -h ro <*o

E-ι -n i ft E

H i -HU (N

ft ft | S in · · " >i oi) O o

ra (N

ra e k -ra ra -h _ in

^ i +j 'S

r o S -d in - υ Φ g -h & ^°° fi i ω 2* μ aT 8 | | 05 3 i fr & -3° :ra -h zP σ ft -8 £

••3 O

I U -H

Uco ^ ra I

0:1 ^ft S ra S

~c ra o m g ra d o e -, ή a s s S 3 § 5 I 3 CN s i ' * I ° ^ 1 - .s .* « a p «Γ ja e a 51 79118

Esimerkki 27 NTrp~ (n-dekan°yy1:i-) -A-21978C -runko (yhdiste 4)

Seuraava reaktiosarja valaisee yhdisteiden laajamittaista valmistamista aktiivisen esterin menetelmällä.

A. 2,4,5-trikloorifenyyli-n-dekanoaatin valmistus

Liuosta, jossa on dekanoyylikloridia (Pfaltz and Bauer, 5, 6 ml) ja 2,4,5-trikloorifenolia dietyylieet-terin (1 1) ja pyridiinin (120 ml) seoksessa, sekoitetaan 4 tuntia, Reaktioseos suodatetaan ja kuivataan alipaineessa. 2,4,5-trikloorifenyyli-n-dekanoaatti puhdistetaan silikageelipylväässä (Woelm) käyttäen eluenttina tolueenia. Jakelta seurataan TLC:llä käyttäen havaitsemisessa lyhytaaltoista UV-säteilyä. Sopivat jakeet yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa, jolloin saadaan 10,4 g 15 2,4,5-trikloorifenyyli-n-dekanoaattia.

B. N0rn“t-BOC-A-21978C -rungon asylointi 2,4,5-trikloo-rifenyyli-n-dekanoaatilla

Liuosta, jossa on N_ -t-BOC-A-21978C -runkoa (15,9 g) ja 2,4,5-trikloorifenyyli-n-dekanoaattia (15,0 g) vedettömässä DMF:ssa, sekoitetaan 25 tuntia ympäristön lämpötilassa käyttäen typpeä suojakaasuna. Sen jälkeen seosta sekoitetaan 60°C:ssa 5 tuntia tai kunnes TLC osoittaa reaktion menneen loppuun. Reaktioseos väke-vöidään alipaineessa noin 200 mlrksi ja sekoitetaan 1,2 25 litraan Et20_tolueeniseosta (5:1). Tuote erotetaan suo dattamalla, pestään dietyylieetterillä ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa, jolloin saadaan 15,05 g N«prp“ (n_ dekanoyyli)-Nn -t-BOC-A-21978C -runkovälituotetta (kaa-urn 2 va 1; R = n-dekanoyyli, R = H, R = t-BOC).

30 C. NTrp-(n-dekanoyyli)-NORn-t-BOC-A-21978C -rungon puh distus Välituotteena saatu NTrp“ (n-c*ekanoyyli)-NQrn-t-BOC-A-21978C-runko puhdistetaan seuraavalla tavalla: Epäpuhdas tuote liuotetaan noin 50 ml:aan eluoinnissa käytet-35 tävää liuotinsysteemiä ja puhdistetaan sitten HPLC:llä käyttäen Waters Prep/500 -systeemiä, johon kuuluu kään-teisfaasi-C-^g-silikageeliadsorbentilla täytetty patruuna.

b2 79118

Systeemi eluoidaan H20-Me0H-CH3CN -seoksella (50:15:35), joka sisältää 0,2 % pyridiiniä ja 0,2 % HOAc:a. Jakeita seurataan UV-valon aallonpituudella 280 nm. Sopivat ja-keet yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa, 5 jolloin saadaan 8,56 g puhdasta - (n-dekanoyyli) -ΝφΓη- t-BOC-A-21978c runkoa.

D. NQrn-t-BOC-ryhmän poistaminen t-BOC-ryhmä poistetaan sekoittamalla NTrp-(n_ dekanoyyli)-N0rn~t-BOC-A-21978C -runkoa (1,47 g) 15 ml:ssa 10 trifluorietikkahappo-1,2-etaaniditioliseosta (10:1) ym päristön lämpötilassa 3 minuuttia. Reaktioseos haihdutetaan kuiviin alipaineessa, ja jäännös trituroidaan käyttäen Et20:a (50 ml). Pesun (20 ml Et20:a) jälkeen tritu-raatti haihdutetaan kuiviin alipaineessa, jolloin saa- 15 daan 2,59 g epäpuhdasta N -(n-dekanoyyli)-A-21978C -

Trp ^ 2 runkoa (kaava 1;R = n-dekanoyyli, R ja R = H) .

E. N -(n-dekanoyyli)-A-21978C -rungon puhdistus —_-* P — _ __

Epäpuhdas NTrp-(n-dekanoyyli)-A-21978C -runko puhdistetaan käänteisfaasi-HPlC :llä seuraavalla tavalla: 20 4,0 ml:aan H^-MeOH-CH^CN-pyridiini-HOAc -seosta (50:15:35:2:2) liuotettu näyte (2,59 g) ruiskutetaan ruostumattomasta teräksestä valmistetun, 84 x 2,5 cm:n pylvään päälle, joka on täytetty LP-l/C^g -adsorbentilla. Pylväs eluoidaan samaa liuotinsysteemiä käyttäen. Elu-25 ointi suoritetaan 80 - 115 atm:n paineella ja 10 - 12 ml/min virtausnopeudella käyttäen LDC-dupleksipumppua (Milton-Roy). Effluenttia seurataan UV-detektorilla (Isco Model UA-5, Instrument Specialist Co., 4700 Superior Avenue, Lincoln, NB 68504) käyttäen aallonpituutta 30 280 nm. Jakeita (20 - 24 ml) kerätään kahden minuutin jaksoissa. Halutut jakeet, mikä todetaan antimikrobisen vaikutuksen perusteella, yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin alipaineessa, jolloin saadaan 1,05 g tuotetta.

Tämä puhdistustoimenpide toistettiin 4,35 g:n, 35 4,25 g:n 2,14 g:n, 2,00 g:n ja 1,75 g:n erillä epäpuh dasta lähtöainetta, jolloin saatiin yhteensä 5,58 g puhdistettua NTrp-(n-dekanoyyli)-A-21978C -runkoa.

53 791 1 8

Esimerkki 28 NTrp~ (n-dekanoYYli) ~NKyn~ (n-dekanoyyli) -A-219 78C (yhdiste 21) N_„~(n-dekanoyyli)-N„ -(n-dekanoyyli)-A-21978C- iirp 2 5 runko (kaava 1:R ja R = n-dekanoyyli, R = H) on reaktion sivutuote valmistettaessa esimerkin 27 mukaista NTrp“^“dekanoyyli)-johdannaista. Se eristetään osassa E kuvatun käänteisfaasi-HPLC -puhdistuksen aikana. Halutut jakeet yhdistetään ja haihdutetaan kuiviin alipai-10 neessa, jolloin saadaan 211 mg epäpuhdasta tuotetta.

Yhdiste puhdistetaan analyyttisellä HPLC:llä (C^g Micro-bondapak, Waters Co.) käyttäen eluointisysteeminä H^O-MeOH-CH3CN-NH4OH-HOAc -seosta (6:23:15:0,5:0,5) toistetaan 32 kertaa, kukin ruiskutettu näyte 500 ^ug) , jolloin 15 saadaan 4,4 g NTrp“(n-dekanoyyli)-NKyn-(n-dekanoyyli)-A- 21978C -runkoa, joka indentifioidaan 360 MHz:n protoni-NMR:llä.

Esimerkki 29 NTrp“Cbz-Norn“-*-aurYyH-A-21978C -runko (yhdiste 20) 20 Tämä menetelmä käsittää NQrn-t-BOC-A-21978C -run gon tryptofäänino^-aminoryhmän suojauksen Cbz-ryhmällä, sitä seuraavan t-BOC-ryhmän poistamisen ja (ornitiinin ö^-aminoryhmän) asyloinnin trikloorifenyylilauryylieste-rillä.

25 A. NTrp-Cbz-N0rn-t-BOC-A-21978 -rungon valmistus

Nom-1:'-B®<-“'^-21978C -runko (l,0g) liuotetaan DMF:iin (150 ml), ja liuos lämmitetään 60 C:een. Lisätään N,0-bis-trimetyylisilyyliasetamidia (0,55 ml) ja sen jälkeen bentsyylipentakloorifenyylikarbonaattia (257 mg). 20 tun-30 nin sekoittamisen jälkeen reaktioseos väkevöidään noin 20 - 25 ml:n tilavuuteen. Lisätään vettä (100 ml), ja säädetään liuoksen pH arvoon 6,0 IN NaOH:lla. Seos pestään ET20:lla (kuudella 200 ml:n erällä) ja sen jälkeen kylmäkuivataan.

35 Epäpuhdas johdannainen puhdistetaan käänteisfaasi- HPLC: llä seuraavasti: Noin 6 ml:aan H20-MeOH-CH3CN- 54 791 1 8 pyridiini-HOAc -seosta (55:15:30:2:2· liuotettu näyte ruiskutetaan ruostumattomasta teräksestä valmistetun, 84 x 1,3 cm:n pylvään päälle, joka on täytetty LP-l/C^g-adsorbentilla. Halutut jakeet havaittiin UV-absorption 5 (280 nm) ja antimikrobisen vaikutuksen avulla. Sitten nämä jakeet yhdistetään ja kylmäkuivataan, jolloin saadaan 951 mg Nm -Cbz-N^ -t-BOC-A-21978C -runkoa.

Trp Orn B. t-BOC-ryhmän poistaminen t-BOC-ryhmä poistetaan liuottamalla välituotetta 10 50 mg/ml trifluorietikkahappo-anisoli-trietyylisilaani- seokseen (10:1:1) lämpötilan ollessa -10°C ja liuotusajan 3 minuuttia. Reaktioseos väkevöidään öljyksi, joka tritu-roidaan käyttäen kahta 25 ml:n erää Et20:a, jolloin saadaan 520 mg epäpuhdasta NTrp-Cbz-A-21978C -runkoa.

15 C. NTrp-Cbz-Ap21978C -rungon asylointi N,rrp-Cbz-A-21978C -runko asyloidaan käyttäen aktiiviseen trikloorifenyyliesteriin perustuvaa asylointime-netelmää. NTrp“ckz-A-21978C (520 mg) lisätään liuokseen, jossa on 1-hydroksibentsotriatsolia (7 mg) ja aktiivista 20 lauryylitrikloorifenyyliesteriä (123 mg) pyridiinissä (150 ml). Sen jälkeen, kun reaktioseosta on sekoitettu 20 tuntia 60°C:ssa, se väkevöidään, ja syntyvä jäännös trituroidaan käyttäen Et2<0:a (kolme 25 ml:n erää), jolloin saadaan 550 mg NTrp-Cbz-N0rn-lauryyli-A-21978c -run-25 koa.

Claims (7)

55 791 1 8

1. Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten, syklisten A-21978C-peptidijohdannaisten valmis-5 tamiseksi, joilla on kaava 1 | p1 /\ /Hs / \ / \ “ϊΥ, I !

10 A Ϊ S/ / \ · · ^ '"'γ? conh9 h Y ‘ Yaa, "> h) “ rn ) V. / Y V ο=γ \=o i ·—-t· CHa H H-< *1 » <Ay\A./VV“ i Y j * HOaC (1) 25 jossa R on C7-Clg-alkanoyyli, C1 ^(γ-alkenoyyli tai ami-noryhmää suojaava ryhmä; R^ on vety tai C^-C^Q-alkanoyyli; ja R2 on vety, C1~C13-alkanoyyli, sukkinyyli tai aminoryhmää suojaava ryhmä; 30 sillä edellytyksellä, että 1 2 1. vähintään yksi ryhmistä R, R ja R on jokin muu kuin vety tai aminoryhmää suojaava ryhmä, 1 2 2. vähintään toinen ryhmistä R ja R on vety tai aminoryhmää suojaava ryhmä, 1 2 35 3) R, R ja R sisältävät yhteensä vähintään neljä hiili- atomia ja 56 791 1 8 1 2 4. seka R :n että R :n ollessa joko vety tai aminoryhmää suojaava ryhmä R ei ole 8-metyylidekanoyyli, 10-metyyli-undekanoyyli, A-21978C-tekijän Cg spesifinen C^g-alkano-yyliryhmä tai A-21978C-tekijoiden ja spesifinen

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-5 n e t t u siitä, että valmistetaan kaavan (1) mukainen peptidi johdannainen, jossa R on alkanoyyli, jolla on kaava 0 CH,(CH,) -d- j z n jossa n on kokonaisluku 5-14.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että valmistetaan kaavan (1) mukainen peptidi johdannainen, jossa R on alkanoyyli, jolla on kaava CH0 O T 3 II CH,(CH~) -CH(CH,) -C-ό Z n Z m 15 jossa n ja m merkitsevät toisistaan riippumatta kokonaislukua 0-12 sillä edellytyksellä, että n + m on vähintään 3 ja korkeintaan 12 ja että lisäksi n:n ollessa 0 m ei ole 8 ja n:n ollessa 1 m ei ole 6 eikä 8.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n- 20. e t t u siitä, että valmistetaan kaavan (1) mukainen peptidi johdannainen, jossa R on cis- tai trans-alkenoyyli, jolla on kaava 0 CH, (CH,) CH=CH (CH,) -1^-3 Z n 2 m 25 jossa n ja m merkitsevät toisistaan riippumatta kokonaislukua 1-13 sillä edellytyksellä, että n + m on vähintään 7 ja korkeintaan 13.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan (1) mukainen pep- 30 tidijohdannainen, jossa R on cis- tai trans-alkenoyyli, jolla on kaava O il ch2=ch(ch2) -C-jossa n on kokonaisluku 8-14. 58 791 1 8

5. I 8

25 H · HOsC (3) jossa R1 ja R° ovat toisistaan riippumatta vety tai aminoryhmää suojaava ryhmä, käsitellään lämpötilassa noin 30 10 - 60°C 1-24 tuntia hapolla, jolla on kaava 5 R6-COOH (5) tai sen aktivoidulla johdannaisella, jolloin R^ on Cg-C^-alkyyli tai C10-C16-alkenyyli; ja 57 7 9118 haluttaessa poistetaan mahdolliset suojausryhmät, joita saattaa olla läsnä tuotteessa, ja/tai haluttaessa saatu tuote muutetaan suolaksi.

5 C^2-al^an°yyliryhmä; ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että syklistä Ä-21978C-ydinpeptidiä, jolla on kaava 3

0 NHR' /\ /*> /\ / \ YYo [ N λ ! . v rv- ' ^ ^ A CONH 15 ,I\ » H J K 9 NHs h/hV h Y Yy V y Y x > Y <MA VYN < > VU 20 Υ-Π *v y * 0=/ γ=0 H yrz r d Ϊ H< . JL- ho^ Ύ /\ /\ /\ / v \/

6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan (1) mukainen peptidijohdannainen, jossa R on n-dekanoyyli.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, t u n- 5. e t t u siitä, että valmistetaan kaavan (1) mukainen pep- • ... 12 tidijohdannainen, jossa R on n-dekanoyyli ja R ja R ovat vetyjä. 59 791 1 8