JPH0631234B2 - 新規生理活性物質ナグスタチン及びその製造法 - Google Patents
新規生理活性物質ナグスタチン及びその製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗N−アセチルグルコサミニダーゼ活性を有す
る新規生理活性物質ナグスタチン及びその製造法に関す
るものである。
る新規生理活性物質ナグスタチン及びその製造法に関す
るものである。
これまで微生物培養液中より多くの生理活性物質が発見
されてきている。なかでも細胞膜に存在する酵素や細胞
膜上に結合している糖鎖を切断する酵素の阻害物質は免
疫調節作用を有する可能性があることが認められてい
る。また、癌、老化等の状態に免疫増強剤の投与が有効
であることは周知の事実であり、強力かつ有効な免疫増
強剤を提供することは常に要望されている。
されてきている。なかでも細胞膜に存在する酵素や細胞
膜上に結合している糖鎖を切断する酵素の阻害物質は免
疫調節作用を有する可能性があることが認められてい
る。また、癌、老化等の状態に免疫増強剤の投与が有効
であることは周知の事実であり、強力かつ有効な免疫増
強剤を提供することは常に要望されている。
本発明者らはこれらの点に着目し、細胞膜上に結合して
いる糖鎖をN−アセチルグルコサミンの位置で切断する
酵素、N−アセチルグルコサミニダーゼの阻害物質とし
て作用する新規生理活性物質を提供することによつてこ
れを解決しようとするものである。
いる糖鎖をN−アセチルグルコサミンの位置で切断する
酵素、N−アセチルグルコサミニダーゼの阻害物質とし
て作用する新規生理活性物質を提供することによつてこ
れを解決しようとするものである。
本発明者らは上述の要望に応えるべくN−アセチルグル
コサミニダーゼに対する阻害活性を有する物質の探索を
続けていたところ、ストレプトミセス(Streptomyces)
属に属するある菌株の培養物中にN−アセチルグルコサ
ミニダーゼに対する強い阻害作用を有する物質が生産さ
れていることを見出し、有効物質ナグスタチンを単離し
てその理化学的性状及び生物学的特性を確定することに
より本発明を完成した。
コサミニダーゼに対する阻害活性を有する物質の探索を
続けていたところ、ストレプトミセス(Streptomyces)
属に属するある菌株の培養物中にN−アセチルグルコサ
ミニダーゼに対する強い阻害作用を有する物質が生産さ
れていることを見出し、有効物質ナグスタチンを単離し
てその理化学的性状及び生物学的特性を確定することに
より本発明を完成した。
したがつて第一の本発明は、下記の式を有する新規生理
活性物質ナグスタチンを提供するものである。
活性物質ナグスタチンを提供するものである。
さらに第二の本発明は、ストレプトミセス属に属するナ
グスタチン生産菌を培養し、その培養物からナグスタチ
ンを採取することを特徴とする生理活性物質ナグスタチ
ンの製造法を提供するものである。
グスタチン生産菌を培養し、その培養物からナグスタチ
ンを採取することを特徴とする生理活性物質ナグスタチ
ンの製造法を提供するものである。
本発明に使用されるナグスタチン生産菌の一例として
は、本発明者らにより微生物化学研究所構内の土壌より
新たに分離されたMG 846−fF3株がある。MG 846−fF3
株の菌学的性状はつぎのとおりである。
は、本発明者らにより微生物化学研究所構内の土壌より
新たに分離されたMG 846−fF3株がある。MG 846−fF3
株の菌学的性状はつぎのとおりである。
1.形態 MG 846−fF3株は、顕微鏡下で分枝した基中菌糸よりか
ぎ状あるいはらせん状の気菌糸を形成し、輪生糸はみと
められない。成熟した胞子鎖は20〜50個あるいはそ
れ以上の胞子の連鎖をみとめ、胞子の大きさは0.5〜0.6
×0.7〜0.8ミクロン程度で、胞子の表面は平滑である。
ぎ状あるいはらせん状の気菌糸を形成し、輪生糸はみと
められない。成熟した胞子鎖は20〜50個あるいはそ
れ以上の胞子の連鎖をみとめ、胞子の大きさは0.5〜0.6
×0.7〜0.8ミクロン程度で、胞子の表面は平滑である。
2.各種培地における生育状態 色の記載について〔 〕内に示す標準は、コンテイナー
・コーポレーシヨン・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニイ・マニユアル(Contaier Corporation of America
のColor harmony manual)を用いた。
・コーポレーシヨン・オブ・アメリカのカラー・ハーモ
ニイ・マニユアル(Contaier Corporation of America
のColor harmony manual)を用いた。
(1)シユクロース・硝酸塩寒天培地(27℃培養)無色の
発育上に、明るい灰〔3fe,Silver Gray〕〜明るいオリ
ーブ灰〔 Olive〕の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素はみ
とめられない。
発育上に、明るい灰〔3fe,Silver Gray〕〜明るいオリ
ーブ灰〔 Olive〕の気菌糸をうっすらと着生し、溶解性色素はみ
とめられない。
(2)グルコース・アスパラギン寒天培地(27℃培養) 発育は貧弱で、無色〜うす黄〔1ea,Canary Yellow〕を
呈し、白〜明るい灰〔15ba,Blue Yint〕の気菌糸をわず
かに着生する。溶解性色素はみとめられない。
呈し、白〜明るい灰〔15ba,Blue Yint〕の気菌糸をわず
かに着生する。溶解性色素はみとめられない。
(3)グリセリン・アスパラギン寒天培地(ISP−培地5,
27℃培養) うす黄〜うす茶〔 Antique Gold〕の発育上に、黄味灰〔2gc,Bamboo〕〜明
るい茶灰〔3fe,Silver Gray〕の気菌糸を着生し、溶解
性色素はわずかに茶色味をおびる程度である。
27℃培養) うす黄〜うす茶〔 Antique Gold〕の発育上に、黄味灰〔2gc,Bamboo〕〜明
るい茶灰〔3fe,Silver Gray〕の気菌糸を着生し、溶解
性色素はわずかに茶色味をおびる程度である。
(4)スターチ・無機塩寒天培地(ISP−培地4,27℃培
養) うす黄の発育上に白〜明るい灰〔2fe,Covert Gray〕の
気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに黄色味をおびる
程度である。
養) うす黄の発育上に白〜明るい灰〔2fe,Covert Gray〕の
気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに黄色味をおびる
程度である。
(5)チロシン寒天培地(ISP−培地7,27℃培養) うすオリーブ〔 Lt,Olive 〕〜うす茶の発育上に、明るいオリーブ灰〔 Putty〕の気菌糸を着生し、溶解生色素は黄色味をおび
る程度である。
る程度である。
(6)栄養寒天培地(27℃培養) うす茶の発育上に白の気菌糸をうっすらと着生し、溶解
生色素はみとめられない。
生色素はみとめられない。
(7)イースト・麦芽寒天培地(ISP−培地2,27℃培養) うす黄〜暗い茶〔3po,Ebony〕の発育上に、白〜明るい
茶灰〔2ig,Slate Tan〕の気菌糸を着生し、溶解性色素
は黄色味をおびる程度である。
茶灰〔2ig,Slate Tan〕の気菌糸を着生し、溶解性色素
は黄色味をおびる程度である。
(8)オートミール寒天培地(ISP−培地3,27℃培養) うす黄の発育上に白〜明るい茶灰〔3ih,Beige Gray〕の
気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素はほのかに黄色味
をおびる程度である。
気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素はほのかに黄色味
をおびる程度である。
(9)グリセリン・硝酸塩寒天培地(27゜培養) うす茶の発育上に白の気菌糸を着生し、溶解性色素はわ
ずかに茶色味をおびる程度である。
ずかに茶色味をおびる程度である。
(10)スターチ寒天培地(27゜培養) 無色〜うす黄の発育上に白〜明るい茶灰〔3fe,Silver G
ray〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに黄色味
をおびる程度である。
ray〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はわずかに黄色味
をおびる程度である。
(11)リンゴ酸石灰寒天培地(27゜培養) 無色〜うす黄の発育上に白〜明るい茶灰〔3fe,Silver G
ray〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はみとめられな
い。
ray〕の気菌糸を着生し、溶解性色素はみとめられな
い。
(12)セルロース(紙片添加合成液,27℃培養) 3週間観察したが、生育をみとめなかつた。
(13)ゼラチン穿刺培養 単純ゼラチン培地(20゜培養)では、発育はうす黄、気
菌糸は着生せず、溶解性色素もみとめられない。
菌糸は着生せず、溶解性色素もみとめられない。
グルコース・ペプトン・ゼラチン培地(27゜培養)で
は、発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素もみ
とめられない。
は、発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素もみ
とめられない。
(14)脱脂牛乳(37℃培養) 発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素もみとめ
られない。
られない。
3.生理的性質 (1)生育温度範囲 イースト・スターチ寒天(Soluble starch(小宗化学
製)1.0%,Yeast extract(大五栄養化学製)0.2%,
糸寒天3.0%,pH7.0)を用い、20℃,24℃,27℃,30
℃,37℃,50℃の各温度で試験の結果、50℃を除いてそ
のいずれの温度でも発育した。しかし、37℃での発育は
著しく強く、24°〜30℃付近が最適温度と考えられる。
製)1.0%,Yeast extract(大五栄養化学製)0.2%,
糸寒天3.0%,pH7.0)を用い、20℃,24℃,27℃,30
℃,37℃,50℃の各温度で試験の結果、50℃を除いてそ
のいずれの温度でも発育した。しかし、37℃での発育は
著しく強く、24°〜30℃付近が最適温度と考えられる。
(2)ゼラチンの液化(15%単純ゼラチン,20℃培養;
グルコース・ペプトン・ゼラチン,27℃培養) 単純ゼラチン培地では、培養後3日目頃から液化が始ま
り、14〜21日目にほとんど完了した。その作用は強
い方である。
グルコース・ペプトン・ゼラチン,27℃培養) 単純ゼラチン培地では、培養後3日目頃から液化が始ま
り、14〜21日目にほとんど完了した。その作用は強
い方である。
グルコース・ペプトン・ゼラチン培地では、3週間観察
したが液化作用はみとめられなかつた。
したが液化作用はみとめられなかつた。
(3)スターチの加水分解(スターチ・無機塩寒天培地及
びスターチ寒天培地、いずれも27℃培養) スターチ・無機塩寒天培地,スターチ寒天培地ともに培
養後3日目頃から水解性がみられ、その作用は強い方で
ある。
びスターチ寒天培地、いずれも27℃培養) スターチ・無機塩寒天培地,スターチ寒天培地ともに培
養後3日目頃から水解性がみられ、その作用は強い方で
ある。
(4)脱脂牛乳の凝固、ペプトン化(脱脂牛乳,37℃培
養) 培養後10日目頃より凝固が始まり、直ちに完了し、ペ
プトン化が始まる。ペプトン化は培養後18日目頃に完
了する。この作用はともに中等度〜強い方である。
養) 培養後10日目頃より凝固が始まり、直ちに完了し、ペ
プトン化が始まる。ペプトン化は培養後18日目頃に完
了する。この作用はともに中等度〜強い方である。
(5)メラニン様色素の生成(トリプトン・イースト・ブ
ロス,ISP−培地1;ペプトン・イースト鉄寒天,ISP−
培地6;チロシン寒天,ISP−培地7;いずれも27℃培
養) トリプトン・イースト・ブロス培地,ペプトン・イース
ト・鉄寒天培地,チロシン寒天培地のいずれにおいて
も、はつきりしたメラニン様色素を観察できなかつた。
ロス,ISP−培地1;ペプトン・イースト鉄寒天,ISP−
培地6;チロシン寒天,ISP−培地7;いずれも27℃培
養) トリプトン・イースト・ブロス培地,ペプトン・イース
ト・鉄寒天培地,チロシン寒天培地のいずれにおいて
も、はつきりしたメラニン様色素を観察できなかつた。
(6)炭素源の利用(プリドハム・ゴトリーブ寒天培地,I
SP−培地9;27℃培養) D−グルコース,D−キシロース,イノシトールを利用
して発育し、L−アラビノース,D−フラクトース,シ
ユクロース,L−ラムノース,ラフイノース,D−マン
ニトールを利用しない。
SP−培地9;27℃培養) D−グルコース,D−キシロース,イノシトールを利用
して発育し、L−アラビノース,D−フラクトース,シ
ユクロース,L−ラムノース,ラフイノース,D−マン
ニトールを利用しない。
(7)リンゴ酸石灰の溶解(リンゴ酸石灰寒天,27℃培
養) 培養後9日目頃から発育周辺のリンゴ酸石灰を溶解し、
その作用は中等度〜強い方である。
養) 培養後9日目頃から発育周辺のリンゴ酸石灰を溶解し、
その作用は中等度〜強い方である。
(8)硝酸塩の還元反応(0.1%硝酸カリ含有ペプトン水,
ISP−培地8;27℃培養) 陰性である。
ISP−培地8;27℃培養) 陰性である。
以上の性状を要約すると、MG 846−fF3株は、胞子のう
を持たず、気菌糸はかぎ状あるいはらせん状で輪生枝は
認められない。胞子の表面は平滑である。種々の培地で
無色〜うす茶あるいはうすオリーブの発育上に、白〜明
るいオリーブ灰あるいは明るい茶灰の気菌糸を着生し、
溶解性色素はみとめられないか、わずかに黄色味をおび
るものがある。メラニン様色素は陰性、蛋白分解力は中
等度〜強い方、スターチの水解性は強い方である。
を持たず、気菌糸はかぎ状あるいはらせん状で輪生枝は
認められない。胞子の表面は平滑である。種々の培地で
無色〜うす茶あるいはうすオリーブの発育上に、白〜明
るいオリーブ灰あるいは明るい茶灰の気菌糸を着生し、
溶解性色素はみとめられないか、わずかに黄色味をおび
るものがある。メラニン様色素は陰性、蛋白分解力は中
等度〜強い方、スターチの水解性は強い方である。
なお、全菌体中に含まれる2,6−ジアミノピメリン酸
はLL−型であつた。これらの性状より、MG 846−fF3
株はストレプトミセス(Streptomyces)属に属する放線
菌と考えられる。さらに、MG 846−fF3株に近縁の既知
菌種を検索すると、つぎの種があげられる。すなわち、
ストレプトミセス・アマクサエンシス(Streptomyces a
makusaensis,文献1) “International Journal of Systematic Bacteriolog
y”18巻,290頁,1968;文献2) Nagatsu etal,Studies on a new antibiotic,tuberin,I
V Taxonomic studies on the tuberin producing organ
isms,Streptomyces amakusaensis,"Joural of Antibiot
ics"SeriesA16巻,207−210頁,1963)である。この種
のISP菌株(当研究所保存)とMG 846−fF3株とを比較
試験し、その成績の大要をつぎに示す。
はLL−型であつた。これらの性状より、MG 846−fF3
株はストレプトミセス(Streptomyces)属に属する放線
菌と考えられる。さらに、MG 846−fF3株に近縁の既知
菌種を検索すると、つぎの種があげられる。すなわち、
ストレプトミセス・アマクサエンシス(Streptomyces a
makusaensis,文献1) “International Journal of Systematic Bacteriolog
y”18巻,290頁,1968;文献2) Nagatsu etal,Studies on a new antibiotic,tuberin,I
V Taxonomic studies on the tuberin producing organ
isms,Streptomyces amakusaensis,"Joural of Antibiot
ics"SeriesA16巻,207−210頁,1963)である。この種
のISP菌株(当研究所保存)とMG 846−fF3株とを比較
試験し、その成績の大要をつぎに示す。
表から明らかなように、MG 846−fF3株とストレプトミ
セス・アマクサエンシスとは極めて近い性状を示してい
る。
セス・アマクサエンシスとは極めて近い性状を示してい
る。
アマクサエンシスの文献上の記載とは異なるが、実際に
比較してみて、両者が同じ結果を示したのが、ISP−培
地6でのメラニン様色素形成、単純ゼラチンの液化であ
る。比較試験で異なるのは、D−キシロースとイノシト
ールの利用であるが、文献の記載を照合して考慮すると
大きな相異点とは考えにくい。
比較してみて、両者が同じ結果を示したのが、ISP−培
地6でのメラニン様色素形成、単純ゼラチンの液化であ
る。比較試験で異なるのは、D−キシロースとイノシト
ールの利用であるが、文献の記載を照合して考慮すると
大きな相異点とは考えにくい。
これらのことから、MG 846−fF3株をストレプトミセス
・アマクサエンシス(Streptomyces amakusaensins)近
縁の種と同定した。
・アマクサエンシス(Streptomyces amakusaensins)近
縁の種と同定した。
なお、MG 846−fF3株を工業技術院微生物工業技術研究
所に寄託申請し、昭和60年2月15日微工研菌寄第80
95号として受託された。
所に寄託申請し、昭和60年2月15日微工研菌寄第80
95号として受託された。
MG 846−fF3株は他の放線菌の場合に見られるようにそ
の性状が変化しやすい。MG 846−fF3株又はこの株に由
来する突然変異体、形質接合体又は遺伝子組換え体であ
つても、ナグスタチンを生産するものはすべて本発明に
使用できる。
の性状が変化しやすい。MG 846−fF3株又はこの株に由
来する突然変異体、形質接合体又は遺伝子組換え体であ
つても、ナグスタチンを生産するものはすべて本発明に
使用できる。
本発明の方法では、前期の菌を通常の微生物が利用し得
る栄養物を含有する培地で培養する。栄養源としてはグ
ルコース、水あめ、デキストリン、シユクロース、でん
粉、糖みつ、動植物油等を使用できる。また窒素減とし
ては大豆粉、小麦はい芽、コーンステイープリカー、綿
実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモ
ニウム、硝酸ソーダ、尿素等を使用できる。その他必要
に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシ
ウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオン
を生成することができる無機塩類を添加することは有効
である。また菌の発育を助け、ナグスタチンの生産を促
進するような有機および無機物を適当に添加することが
できる。
る栄養物を含有する培地で培養する。栄養源としてはグ
ルコース、水あめ、デキストリン、シユクロース、でん
粉、糖みつ、動植物油等を使用できる。また窒素減とし
ては大豆粉、小麦はい芽、コーンステイープリカー、綿
実かす、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモ
ニウム、硝酸ソーダ、尿素等を使用できる。その他必要
に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシ
ウム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸及びその他のイオン
を生成することができる無機塩類を添加することは有効
である。また菌の発育を助け、ナグスタチンの生産を促
進するような有機および無機物を適当に添加することが
できる。
培養法としては好気的条件での培養法、特に深部培養法
が最も適している。培養に適当な温度は15−40℃で
あるが、多くの場合26〜30℃附近で培養する。ナグ
スタチンの生産は培地や培養条件によつて異なるが、振
とう培養、タンク培養とも通常2〜10日の間でその蓄
積が最高に達する。培養液中のナグスタチンの蓄積量が
最高になつた時に培養を停止し、培養液から目的物質を
単離、精製する。
が最も適している。培養に適当な温度は15−40℃で
あるが、多くの場合26〜30℃附近で培養する。ナグ
スタチンの生産は培地や培養条件によつて異なるが、振
とう培養、タンク培養とも通常2〜10日の間でその蓄
積が最高に達する。培養液中のナグスタチンの蓄積量が
最高になつた時に培養を停止し、培養液から目的物質を
単離、精製する。
かく生産されるナグスタチンは後述する理化学的性状を
有するので、その性状に従つて溶媒物から抽出、精製す
ることが可能であるが、特に以下の方法により効率的に
抽出、精製することができる。
有するので、その性状に従つて溶媒物から抽出、精製す
ることが可能であるが、特に以下の方法により効率的に
抽出、精製することができる。
すなわち、有効成分を含む培養物から固形物を別した
液に活性炭もしくは合成吸着剤を加え、メタノール等
の水と自由に混和する溶媒を加えて攪拌し、有効成分を
抽出する。抽出液の溶媒を留去して得た油状物質を少量
の水に溶解し、イオン交換樹脂、セルロースパウダー、
ゲル過剤等の担体を使用したクロマトグラフイーを適
宜組み合わせてナグスタチンを単離する。ナグスタチンの理化学的性状 形状:無色の粉末 元素分析:炭素48.58%、水素5.80%、窒素13.96%、
酸素31.99% 分子量:299 分子式:C12H7N3O6 融点:190−195℃ 紫外部吸収:225nmに吸収極大 赤外部吸収スペクトル:第1図に示す。
液に活性炭もしくは合成吸着剤を加え、メタノール等
の水と自由に混和する溶媒を加えて攪拌し、有効成分を
抽出する。抽出液の溶媒を留去して得た油状物質を少量
の水に溶解し、イオン交換樹脂、セルロースパウダー、
ゲル過剤等の担体を使用したクロマトグラフイーを適
宜組み合わせてナグスタチンを単離する。ナグスタチンの理化学的性状 形状:無色の粉末 元素分析:炭素48.58%、水素5.80%、窒素13.96%、
酸素31.99% 分子量:299 分子式:C12H7N3O6 融点:190−195℃ 紫外部吸収:225nmに吸収極大 赤外部吸収スペクトル:第1図に示す。
核磁気共鳴スペクトル:重水中のプロトンNMR スペクトルを第1表に、13C−NMRスペクトルを第
2表に示す。
2表に示す。
ナグスタチンは各種スペクトルを検討した結果、前記の
式の構造を有することが決定された。この構造に一致す
る既知物質は報告されていないのでナグスタチンは新規
生理活性物質であると決定した。
式の構造を有することが決定された。この構造に一致す
る既知物質は報告されていないのでナグスタチンは新規
生理活性物質であると決定した。
ナグスタチンの生物学的性質 ナグスタチンのN−アセチル−β−D−グルコサミニダ
ーゼに対する阻害活性の測定は“Method in Enzymolog
y”,28,772-776(1952)記載のTarentinoらの方法に従
い、β−ニトロフエニル−N−アルチル−β−D−グル
コサミナイドから遊離されるP−ニトロフエノールの40
0nmにおける吸光度を測定して阻害物質を定量した。す
なわち、反応液の組成は0.1Mクエン酸緩衝駅(pH4.5)
0.5ml、0.025Mp−ニトロフエニル−N−アセチル−β
−D−グルコサミナイド0.05ml、蒸留水0.44mlであつ
て、0.01mlの酵素液の添加により反応を開始させ、37
℃において30分の反応の後、1m1の0.4Mグリシン−
苛性ソーダ緩衝液(pH10.5)を添加することにより反
応を停止させ、室温に10分間放置後、400nmにおける
吸光度(a)を測定した。
ーゼに対する阻害活性の測定は“Method in Enzymolog
y”,28,772-776(1952)記載のTarentinoらの方法に従
い、β−ニトロフエニル−N−アルチル−β−D−グル
コサミナイドから遊離されるP−ニトロフエノールの40
0nmにおける吸光度を測定して阻害物質を定量した。す
なわち、反応液の組成は0.1Mクエン酸緩衝駅(pH4.5)
0.5ml、0.025Mp−ニトロフエニル−N−アセチル−β
−D−グルコサミナイド0.05ml、蒸留水0.44mlであつ
て、0.01mlの酵素液の添加により反応を開始させ、37
℃において30分の反応の後、1m1の0.4Mグリシン−
苛性ソーダ緩衝液(pH10.5)を添加することにより反
応を停止させ、室温に10分間放置後、400nmにおける
吸光度(a)を測定した。
同時にナグスタチンを含まない緩衝液のみを用いた盲検
の吸光度(b)を測定し、N−アルチル−β−D−グルコ
サミニダーゼ阻害率を〔(b-a)/b〕×100の算式により
計算した。この定量方法でナグスタチンは0.0012μg/
m1の濃度でN−アセチル−β−D−グルコサミニダーゼ
を50%阻害(IC50)した。また、正常マウスにおける細
胞性免疫に及ぼす効果を、羊赤血球(SRBCと略称)を抗
原としてマウス足蹠に接種して得られる遅延型過敏症
(DD.T.Hと略)を指標(参考文献“J.Exp.Med.”139,1
529〜1539,1974)として検討した。
の吸光度(b)を測定し、N−アルチル−β−D−グルコ
サミニダーゼ阻害率を〔(b-a)/b〕×100の算式により
計算した。この定量方法でナグスタチンは0.0012μg/
m1の濃度でN−アセチル−β−D−グルコサミニダーゼ
を50%阻害(IC50)した。また、正常マウスにおける細
胞性免疫に及ぼす効果を、羊赤血球(SRBCと略称)を抗
原としてマウス足蹠に接種して得られる遅延型過敏症
(DD.T.Hと略)を指標(参考文献“J.Exp.Med.”139,1
529〜1539,1974)として検討した。
すなわち、SRBC 108個を0.05mlの生理食塩水に浮遊させ
た懸濁液をCDF1(雌性8週令)マウスの足蹠皮下に接種
し、これと同時に、ナグスタチン50mg/kg,5mg/k
g,0.5mg/kg又は0.05mg/kgを含有する水溶液を1回腹
腔内投与した。投与4日後、他の一方の足蹠に、SRBC10
8個を0.05mlの生理食塩に浮遊させた懸濁液を皮下投与
して二次感作させた。その24時間後、その足蹠にみら
れる腫脹度(足蹠の厚さの増加)をキヤリパスで測定し
た。供試化合物を投与しないでSRBC及び生理食塩水の皮
下注射を受けた対照動物の足蹠肥厚度を100%と評価
し、これと処理した供試動物の足蹠肥厚度を比較するこ
とにより供試化合物の細胞性免疫増強効果を判定した。
試験結果を第3表に示す。
た懸濁液をCDF1(雌性8週令)マウスの足蹠皮下に接種
し、これと同時に、ナグスタチン50mg/kg,5mg/k
g,0.5mg/kg又は0.05mg/kgを含有する水溶液を1回腹
腔内投与した。投与4日後、他の一方の足蹠に、SRBC10
8個を0.05mlの生理食塩に浮遊させた懸濁液を皮下投与
して二次感作させた。その24時間後、その足蹠にみら
れる腫脹度(足蹠の厚さの増加)をキヤリパスで測定し
た。供試化合物を投与しないでSRBC及び生理食塩水の皮
下注射を受けた対照動物の足蹠肥厚度を100%と評価
し、これと処理した供試動物の足蹠肥厚度を比較するこ
とにより供試化合物の細胞性免疫増強効果を判定した。
試験結果を第3表に示す。
さらに、担癌マウスにおける細胞性免疫に及ぼすナグス
タチンの影響についてつぎのとおり検討した。
タチンの影響についてつぎのとおり検討した。
すなわち、腹水性ザルコーマ180腫瘍の担癌マウスにお
ける塩化ピクリルを抗原としたD.T.H反応による細胞性
免疫に及ぼすナグスタチンの効果を下記の試験法で検討
した。
ける塩化ピクリルを抗原としたD.T.H反応による細胞性
免疫に及ぼすナグスタチンの効果を下記の試験法で検討
した。
腹水性ザルコーマ180腫瘍の細胞の104個をCDF1(雌性1
2週令)マウス(6匹/群)の腹腔内に移植(0日)
し、1日後に25mm×15mmに剃毛した腹部に6%塩化
ピクリルエタノール液を20mm×20mm×2mmのカツト
脱脂綿に0.6ml含ませて感作する。8日後に両耳をダイ
アル式厚さ計で測定し、その値を前値(a)とする。その
後10mm×4mm×1mmのカツト脱脂綿に1%塩化ピクリ
ルオリーブ液を含ませて両耳を感作し、9日後にその両
耳の腫脹度をダイヤル式厚さ計で測定し、この測定値
(b)から前値(a)を差し引いてこの耳厚増加度(b−a)
を算定して、これを対照群(c)とする。他方、生理食塩
水にとかしたナグスタチンを50mg/kg,5mg/kg,0.
5mg/kg又は0.05mg/kgの量で、ザルコーマ180接種の1
日後から8日後までに連日6回/日腹腔内投与しかつ対
照群と同様に塩化ピクリルで感作をして耳厚増加度
(b′−a′)を測定して、これを処理群(T)とする。
対照に対する耳厚増加率(T/C×100)を算出し、細
胞免疫賦活性の程度とした。試験結果を第4表に示す。
2週令)マウス(6匹/群)の腹腔内に移植(0日)
し、1日後に25mm×15mmに剃毛した腹部に6%塩化
ピクリルエタノール液を20mm×20mm×2mmのカツト
脱脂綿に0.6ml含ませて感作する。8日後に両耳をダイ
アル式厚さ計で測定し、その値を前値(a)とする。その
後10mm×4mm×1mmのカツト脱脂綿に1%塩化ピクリ
ルオリーブ液を含ませて両耳を感作し、9日後にその両
耳の腫脹度をダイヤル式厚さ計で測定し、この測定値
(b)から前値(a)を差し引いてこの耳厚増加度(b−a)
を算定して、これを対照群(c)とする。他方、生理食塩
水にとかしたナグスタチンを50mg/kg,5mg/kg,0.
5mg/kg又は0.05mg/kgの量で、ザルコーマ180接種の1
日後から8日後までに連日6回/日腹腔内投与しかつ対
照群と同様に塩化ピクリルで感作をして耳厚増加度
(b′−a′)を測定して、これを処理群(T)とする。
対照に対する耳厚増加率(T/C×100)を算出し、細
胞免疫賦活性の程度とした。試験結果を第4表に示す。
以上の結果より、ナグスタチンは正常動物の細胞性免疫
能を増強しかつ担癌により低下した細胞性免疫を賦活す
る物質であることが認められ、その効力は免疫増強剤と
して知られているベスタチンに匹敵するものである。
能を増強しかつ担癌により低下した細胞性免疫を賦活す
る物質であることが認められ、その効力は免疫増強剤と
して知られているベスタチンに匹敵するものである。
つぎに本発明を実施例により説明するが、本発明はこれ
に限定されるものではない。
に限定されるものではない。
実施例1 ストレプトミセス・アマクサエンシスに近縁の種MG 846
-fF3株(微工研菌寄第8095号)の1白金耳ずつを2本
の500m1の回転培養用フラスコ中のS培地110m1に
植菌し、27℃において2日間培養し、種培養液とし
た。S培地の組成はガラクトース2%、デキストリン2
%、パクトソイトン(米国DIFCO社)1%、コーン・ス
テイープ・リカー(味の素社)0.5%、硫酸アンモニウ
ム0.2%、炭酸カルシウム0.2%、消泡剤1滴(pH7.4)
である。種培養液1m1ずつを同じくS培地110m1ずつ
を分注した500m1の回転培養用フラスコ136本(培
地15分)に植菌し、27℃において4日間、毎分1
80回転の回転振盪培養を行つた。培養液を過するこ
とにより14.5の培養液を得た(IC50=0.02μ/
m1)。
-fF3株(微工研菌寄第8095号)の1白金耳ずつを2本
の500m1の回転培養用フラスコ中のS培地110m1に
植菌し、27℃において2日間培養し、種培養液とし
た。S培地の組成はガラクトース2%、デキストリン2
%、パクトソイトン(米国DIFCO社)1%、コーン・ス
テイープ・リカー(味の素社)0.5%、硫酸アンモニウ
ム0.2%、炭酸カルシウム0.2%、消泡剤1滴(pH7.4)
である。種培養液1m1ずつを同じくS培地110m1ずつ
を分注した500m1の回転培養用フラスコ136本(培
地15分)に植菌し、27℃において4日間、毎分1
80回転の回転振盪培養を行つた。培養液を過するこ
とにより14.5の培養液を得た(IC50=0.02μ/
m1)。
培養液14.5に活性炭粉末(和光純薬工業)29
0gを添加し、室温で時々攪拌しながら30分間放置
し、過を行つた。5の脱イオン水で活性炭を洗浄
後、活性炭を容器にあけ、5のメタノールを添加し、
2規定塩酸を持ち手pHを2.0としたのち、過によりメ
タノール液を得た。さらに4のメタノールで洗浄
し、合わせて9のメタノール溶出液を得た。メタノー
ル液を減圧下に濃縮乾固することにより139gの阻害
活性を有する物質を粗物質として得た(IC50=0.2μg
/m1)。
0gを添加し、室温で時々攪拌しながら30分間放置
し、過を行つた。5の脱イオン水で活性炭を洗浄
後、活性炭を容器にあけ、5のメタノールを添加し、
2規定塩酸を持ち手pHを2.0としたのち、過によりメ
タノール液を得た。さらに4のメタノールで洗浄
し、合わせて9のメタノール溶出液を得た。メタノー
ル液を減圧下に濃縮乾固することにより139gの阻害
活性を有する物質を粗物質として得た(IC50=0.2μg
/m1)。
この粗物質138gを脱イオン水1.5に溶解して、ダ
ウエツクス(米国ダウケミカル社)50−100メツシ
ユ(H+型)のカラム(6×35cm)にかけ、2の脱
イオン水で洗浄液、0.5Mピリジン−酢酸緩衝液(pH4.7
5)を用いて阻害活性を示す物質の溶出を行つた。1フ
ラクシヨン15gで分画溶出すると、フラクシヨン16
1番から350番にかけて阻害活性のピークが見られた
もので、この分画を合わせて減圧下に濃縮乾固し、37.
8gの粗物質を得た(IC50=0.12μg/m1)。
ウエツクス(米国ダウケミカル社)50−100メツシ
ユ(H+型)のカラム(6×35cm)にかけ、2の脱
イオン水で洗浄液、0.5Mピリジン−酢酸緩衝液(pH4.7
5)を用いて阻害活性を示す物質の溶出を行つた。1フ
ラクシヨン15gで分画溶出すると、フラクシヨン16
1番から350番にかけて阻害活性のピークが見られた
もので、この分画を合わせて減圧下に濃縮乾固し、37.
8gの粗物質を得た(IC50=0.12μg/m1)。
これを1.89の0.02Mピリジン−酢酸緩衝液(pH3.1
0)に溶解し、酢酸でpHを3.10に修正した後、あらか
じめ0.02Mピリジン−酢酸緩衝液(pH3.10)にて平衡
化しておいたダウエツクス50のカラム(3×43cm)
にかけ、活性物質を吸着させ、0.02Mピリジン−酢酸
緩衝液(pH3.10)1と0.5Mピリジン−酢酸緩衝液
(pH4.72)1とを用いて直線的濃度勾配溶出方によ
り活性物質を溶出した。1フラクシヨン15gで分画す
ることによりフラクシヨン43番から65番にかけて阻
害活性を示すピークが得られたので、この分画を減圧下
に濃縮乾固し、4.06gの粗物質を得た(IC50=0.014μ
g/m1)。
0)に溶解し、酢酸でpHを3.10に修正した後、あらか
じめ0.02Mピリジン−酢酸緩衝液(pH3.10)にて平衡
化しておいたダウエツクス50のカラム(3×43cm)
にかけ、活性物質を吸着させ、0.02Mピリジン−酢酸
緩衝液(pH3.10)1と0.5Mピリジン−酢酸緩衝液
(pH4.72)1とを用いて直線的濃度勾配溶出方によ
り活性物質を溶出した。1フラクシヨン15gで分画す
ることによりフラクシヨン43番から65番にかけて阻
害活性を示すピークが得られたので、この分画を減圧下
に濃縮乾固し、4.06gの粗物質を得た(IC50=0.014μ
g/m1)。
ついでアビセル(フナコシ薬品)のカラム(3×43c
m)にかけ、酢酸n−ブチル−ブタノール−酢酸−水
(3:4:1:1)の混合溶媒にて溶出し、1フラクシ
ヨン15gで分画するとフラクシヨン151番より39
6番にかけて阻害物質のピークが得られたのでこの分画
を減圧下に濃縮乾固することにより480m1の粉末を得
た(IC50=0.0018μg/m1)。
m)にかけ、酢酸n−ブチル−ブタノール−酢酸−水
(3:4:1:1)の混合溶媒にて溶出し、1フラクシ
ヨン15gで分画するとフラクシヨン151番より39
6番にかけて阻害物質のピークが得られたのでこの分画
を減圧下に濃縮乾固することにより480m1の粉末を得
た(IC50=0.0018μg/m1)。
この粉末を1.5mlのメタノールに溶解し、セフアデツク
スLH−20(フアルマシア社)のカラム(1.6×150cm
にかけメタノール−水(8:2)で溶出し、1フラクシ
ヨン5gで分画するとフラクシヨン33番から35番に
かけて活性物質が溶出されたので、この分画を減圧下に
濃縮乾固することにより、ナグスタチンの白色粉末20
7mgを得た(IC50=0.0012μg/m1)。
スLH−20(フアルマシア社)のカラム(1.6×150cm
にかけメタノール−水(8:2)で溶出し、1フラクシ
ヨン5gで分画するとフラクシヨン33番から35番に
かけて活性物質が溶出されたので、この分画を減圧下に
濃縮乾固することにより、ナグスタチンの白色粉末20
7mgを得た(IC50=0.0012μg/m1)。
実施例2 実施例1に述べた菌株、培地を用い、600容のタン
クで培養を行つた。培養液を過助剤を用いて過し、
液300を得た。この液を強酸性イオン交換樹脂
SK−104S(H型)(三菱化成工業製)45を充填し
たカラムに通し、活性成分を吸着させた。カラムを水洗
液、1規定のアンモニア水で溶離して活性画分58を
得た。これを濃縮後、ダイヤイオンHP−20(三菱化成工
業製)15のカラムにかけ、水で溶離した。活性画分
43をダウエツクス50W×2(H型)(ダウケミカ
ル社製)5に吸着させた。水洗後、0.04規定塩酸で
溶離した活性画分20を濃縮乾固し、アビセル(フナ
コシ薬品)1100mlを充填したカラムにかけた。酢酸ブチ
ル−ブタノール−酢酸−水(3:4:1:1)で、次い
で同様の混合溶媒系(1:4:1:1)で展開した。活
性画分を濃縮乾固して粗粉末26gを得た。これをつい
でトヨパールHW−40(東ソー製)2.4にかけ、メタノ
ールで展開した。活性画分を濃縮乾固して粗粉末14g
(IC50=0.004μg/m1)を得た。最後にCM−セフアデ
ツクスC−25(フアルマシア社製)370m1のカラム
にかけ、水で展開し、活性画分を濃縮することによりナ
グスタチンの白色粉末5.4gを得た。
クで培養を行つた。培養液を過助剤を用いて過し、
液300を得た。この液を強酸性イオン交換樹脂
SK−104S(H型)(三菱化成工業製)45を充填し
たカラムに通し、活性成分を吸着させた。カラムを水洗
液、1規定のアンモニア水で溶離して活性画分58を
得た。これを濃縮後、ダイヤイオンHP−20(三菱化成工
業製)15のカラムにかけ、水で溶離した。活性画分
43をダウエツクス50W×2(H型)(ダウケミカ
ル社製)5に吸着させた。水洗後、0.04規定塩酸で
溶離した活性画分20を濃縮乾固し、アビセル(フナ
コシ薬品)1100mlを充填したカラムにかけた。酢酸ブチ
ル−ブタノール−酢酸−水(3:4:1:1)で、次い
で同様の混合溶媒系(1:4:1:1)で展開した。活
性画分を濃縮乾固して粗粉末26gを得た。これをつい
でトヨパールHW−40(東ソー製)2.4にかけ、メタノ
ールで展開した。活性画分を濃縮乾固して粗粉末14g
(IC50=0.004μg/m1)を得た。最後にCM−セフアデ
ツクスC−25(フアルマシア社製)370m1のカラム
にかけ、水で展開し、活性画分を濃縮することによりナ
グスタチンの白色粉末5.4gを得た。
第3表及び第4表の試験結果から明らかなとおり、新規
生理活性物質ナグスタチンは免疫増強作用を示し、制癌
効果を有する。
生理活性物質ナグスタチンは免疫増強作用を示し、制癌
効果を有する。
第1図はナグスタチンの赤外吸収スペクトル図(KBr
錠)である。
錠)である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 C12R 1:465) (72)発明者 魚谷 和道 神奈川県鎌倉市笛田483―7
Claims (2)
- 【請求項1】次式: で表わされる抗N−アセチルグルコサミニダーゼ活性を
有する新規生理活性物質ナグスタチン。 - 【請求項2】ストレプトミセス属に属するナグスタチン
生産菌を培養し、その培養物から生理活性物質ナグスタ
チンを採取することを特徴とする生理活性物質ナグスタ
チンの製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63119257A JPH0631234B2 (ja) | 1988-05-18 | 1988-05-18 | 新規生理活性物質ナグスタチン及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63119257A JPH0631234B2 (ja) | 1988-05-18 | 1988-05-18 | 新規生理活性物質ナグスタチン及びその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01290675A JPH01290675A (ja) | 1989-11-22 |
JPH0631234B2 true JPH0631234B2 (ja) | 1994-04-27 |
Family
ID=14756853
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63119257A Expired - Fee Related JPH0631234B2 (ja) | 1988-05-18 | 1988-05-18 | 新規生理活性物質ナグスタチン及びその製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0631234B2 (ja) |
-
1988
- 1988-05-18 JP JP63119257A patent/JPH0631234B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH01290675A (ja) | 1989-11-22 |
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