DK144180B - Fremgangsmaade til fremstilling af nocardicin c,d,e,f og g. - Google Patents

Description

(19) DANMARK (wJ

t \R^/

^ (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT (n) 1^T80B

DIREKTORATET FOR PATENT- QG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. 4453/76 (51) Int.CI.3 C 12 P 17/10 (22) Indleveringsdag 1. okt. 1976 G 07 D 205/08 (24) Løbedag 1 . okt. 1976 (41) Aim. tilgængelig 4. apr. 1977 (44) Fremlagt 4. jan. 1982 (86) International ansøgning nr. -1 (86) International indleveringsdag - (85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -

(30) Prioritet 3· o.kt, 1975* 120009/75* JP 3. okt. 1975* 120Gl 0/75, Jp 14. nov. 1975* 137391/75* JP 4. feb. 1976, 11673/76^ JP

(71) Ansøger FUJISAWA PHARMACEUTICAL CO. LTD.* Osaka-shi, JP.

(72) Opfinder Junji Hosoda, JP: Hat buo Aoki, JP: Hiroshi jCmanaka, JP.

(74) Fuldmægtig Plougmann & Vingtoft Patent bureau.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af Nocardicin C, D* E* F og G.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af nocardiciner, nemlig Nocardicin C, D, F, F og G,

Det er kendt, se f.eks. USA patentskrift nr. 3.923.977 og dansk fremlæggelsesskrift nr. 130.423, at fremstille et antibiotikum betegnet FR-1923 eller Nocardicin A ved dyrkning af en stamme af Nocardia uniformis, OQ En foretrukken stamme blandt disse stammer er Nocardia uniformis

subsp. tsuyamanensis, son blev deponeret 13. juni 1972 hos American DO

t— Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive Rockville,

Maryland 20852, USA, og som fik ATCC-nummeret 21806. Denne de-r- ponerede Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 er *

Q

2 144180 nu offentligt tilgængelig, og dens detaljer, dvs. mikrobiologiske egenskaber osv,, er beskrevet i litteraturen, f.eks. i USA patentskrift nr. 3.923.977 og i tysk offentliggørelsesskrift nr. 2,242.699.

Det har nu overraskende vist sig, at ovennævnte mikroorganismeart udover Nocardicin A danner yderligere nocardiciner, nemlig Nocardicin C, Dr E, F og G. Nocardicin E og F er hidtil ukendte forbindelser, medens Nocardicin C, D og G kendes fremstillet ved en kemisk fremgangsmåde, se beskrivelsen til dansk patentansøgning nr, 3023/75.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af nocardiciner ved dyrkning af en nocardicinproducerende stamme af arten Nocardia i et vandigt næringsmedium under aerobe betingelser er ejendommelig ved, at der fra dyrkningsblandingen udvindes Nocardicin C med formlen

NH0 O

f-\ i 11 HOOC-QH(CH2)2Q-f >—CH - C - HN- -i--1-

Jt— N-CH-/ /"OH

NH9 O I \=s

Å COOH

Nocardicin D med formlen

O O

/T~\ II I

hooc-ch(ch2) 2o~t y—c - c - hn-^—j

J_N-CH-V VoH

NH 1

wtl2 COOH

Nocardicin E med formlen

N-OH O

rf~\ Il II

HQ—C y “C - C - HN--—1

^,_N-CH-<^~^K)H

COOH

3 144180

Nocardicin F med formlen HO-N O

HO---C-C-HN-1-[

o —N-CH-^~^—OH COOH

og/eller Nocardicin G med formlen NH. 0

r\ I 2 H

KO—\ )—CH - C - HN —,f

_N-CH-//)-OH

o>~ |Λ=Λ"

COOH

De foretrukne carbonkilder i næringsmediet er carbonhydrater, f.eks. glu· cose, saccharose, maltose, glycerol, stivelse og lignende. De foretrukne kilder for nitrogen er organiske nitrogenkilder såsom gærekstrakter, pepton, glutenmel, bomuldsfrømel, sojabønnemel, majsmel, tørret gær, kødekstrakter, caseinhydrolysat, majsstøbevand, urea og lignende, og uorganiske nitrogenkilder såsom ammoniumsalte (f.eks. ammoniumnitrat, ammoniumsulfat og ammoniumphosphat etc.) og lignende.

Om ønsket, kan der til mediet sættes mineralsalte såsom calci-umcarbonat, natrium- eller kaliumphosphat, magnesiumchlorid eller -sulfat og lignende som en i mindre mængde tilstedeværende komponent. Endvidere kan der til mediet sættes én eller flere organiske forbindelser såsom tyrosin, glycin, serin, homoserin, p-hydroxy-phenylglycin, a-aminosmørsyre, α,β-diaminopropionsyre, N-acetyl-tyrosin, N-acetyltyrosinamid, p-hydroxyphenylpyrodruesyre, p-hydro-xyphenylglycolsyre, p-hydroxyphenylglyoxalsyre, shikiminsyre, 2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propionohydroxamsyre, 2-acetamido-3--(4-hydroxyphenyl)propionohydrazid og lignende. Disse organiske forbindelser kan virke som en slags precursor og kan være nytti- . ge til at forøge produktiviteten til dannelsen af disse omhandlede nocardiciner.

Ved fermentationsprocessen anvendes der fortrinsvis submerse aerobe dyrkningsbetingelser til dannelse af de her omhandlede nocar’diciner i væsentlige mængder. Det vil også forstås, at 4 144180 der til produktion i begrænsede mængder kan anvendes en rysteeller overfladekultur i en kolbe eller flaske. Når dyrkningen udføres i store tanke, foretrækkes det endvidere at anvende den vegetative form af organismen til podning i produktionstanke til undgåelse af vækstforsinkelse ved produktionen af de her omhandlede nocardiciner. Det er derfor ønskeligt først at producere et vegetativt podemateriale af organismen ved at pode en relativt lille mængde dyrkningsmedium med sporer eller mycelier af organismen og dyrke disse og overføre det dyrkede vegetative inokulum aseptisk til store beholdere. Det medium, hvori det vegetative , inokulum produceres, kan være i det væsentlige det samme som eller forskelligt fra det medium, der anvendes til fremstilling af de her omhandlede nocardiciner.

Omrøring og luftning af dyrkningsblandingen kan udføres på en række forskellige måder. Omrøringen kan tilvejebringes ved hjælp af en propel eller lignende omrøringsapparatur, ved at dreje eller ryste fermenteringsbeholderen, ved hjælp af forskellige pumpeapparater eller ved at føre steril luft gennem mediet. Luftningen kan udføres ved at føre steril luft gennem fermentationsblandingen. Under fermentationen, især når dyrkningsmediet skummer væsentligt op, kan der til mediet sættes et afskumningsmiddel, f.eks. planteolie, (f.eks. sojabønneolie), højere alkoholer (f.eks. octadecanol, tetradecanol, etc.), siliconer og lignende.

Fermentationen udføres sædvanligvis ved en temperatur mellem ca. 20°C og ca. 40°C, fortrinsvis ved en temperatur på ca. 30°C, i et tidsrum på 50 - 100 timer.

De her omhandlede nocardiciner, fremstillet på den ovenfor beskrevne måde, kan udvindes fra dyrkningsvæsken på konventionel måde, som generelt anvendes til udvinding af fermentationsprodukter. De her omhandlede nocardiciner i dyrkningsvæsken er til stede i myceliet (intracellulært) og/eller uden for myceliet (ekstracellulært).

Som første trin inddeles dyrkningsvæsken i filtrat (supernatant) og filterkage ved filtrering eller centrifugering.

5 144180

Ekstraktionen af de her omhandlede nocardiciner fra filterkagen udføres ved at behandle filterkagen med et organisk opløsningsmiddel/ i hvilket de her omhandlede nocardiciner kan være opløselige, f.eks. alkoholer (f.eks. methanol og ethanol), ketoner (f.eks. acetone), vandige alkoholer (f.eks. vandig methanol og vandig ethanol) og lignende.

Fra det på denne måde vundne filtrat og/eller den på denne måde vundne ekstrakt kan de her omhandlede nocardiciner isoleres og renses på konventionel måde.

Som denne konventionelle måde kan nævnes behandling med adsorben-ter (f.eks. aktiveret kul, kiselsyre, silicagel, aluminiumoxid etc,), anioniske eller kationiske ionbytterharpikser eller makrør-porøse ikke-ionfske adsorptionsharpikser [f.eks. Amberlite XAD-2, XAD-4, XAD-7 øg XAD-8 (Amberlite er et varemærke, produkterne fremstilles af Rohm & Haas Co,), Diaion HP10, HP20, HP3Q, HP40 og HP50 (Diaion er et varemærke, produktet fremstilles af Mitsubishi Chemical Industries Ltd.)]; ekstraktion med opløsningsmiddel; koncentrering under reduceret tryk; lyofilisering; pH-indstilling, krystallisation; omkrystallisation; og lignende. Disse måder kan fortrinsvis anvendes uafhængigt eller i kombination i vilkårlig orden eller gentagne gange. 1 tilfælde af et råt materiale (f.eks· dyrkningsfiltrat, ekstrak’-ter fra filterkage) indeholdende alle nocardicinerne, dvs, Nocardicin A, Nocardicin B, som er en geometrisk isomer af NacardicinA ved hydroxyiminogrgppen, Nocardicin C, Nocardicin D, Ngcardfcin E, Nocardicin F og Nocardicin G, kan hver af de her omhandlede nocardiciner skilles derfra, f.eks. ved den separationsmetode, der er illustreret i nedenstående skema.

6 146180 Η m β -—- M fe O' . . O O' -P o to ^ ^ £ ri! fe fe o > M c

O' Oi il C H

O O O OU

(1) v Ή -H

fe fe Η r-> +1 Ό

-- i ·π X P

44 - ^ -Θ· β β U to Q Q ra P 0

•H O M-t O

θ' β * *.10 -—- S

o Oto m to pqoo -- h 44 c ^ ~ fe I -H * -ri » Ρ β

(I) - <U & 44 ri! P <SC ·—I -fH Q H

Ό * 44 ρ β tu η p > μ-i β fe 44 β Λ β 3 β <U 44 Η β β

tu -Η x p -Η Η -Η O — -Η P

Ό *· tQ O O <U -Ρ O β O O'

rt O '' W ΰ v tfl ·Η v tO-H s. O ·Η O

O ^ O ffO Ό " PTJ -'-'--*·Η Ό 4-) .£ * Η ·Η r*. β p HP 4-) Ρ 2 ο)οθ4-) (θ<ο a)td λ; to ε

TOOtOjO U tOOQ

β - O Ρ β O O p o p

•H fe P O -H S S 44 S x H

44 to ρ — — — o Hp <D *. (0 Ό 4-> <U > fe H <<, . S'tO'-* ^ ^ 1-1 _ -fO - C5 fe -π β β

-ri β & O -H

p -ri Η β O' to -Η ο αΓϋ · - η-η ο <υ -,-ρ-η 44 -Η I Ο Η Ρ — 1-^44 Ό to 03 -- O' tu β -Η Η Η >ιΌ Λ Ρ Ε ρ β - η -ρ ο Ό η ω Ρ(0 ‘ to Η ο -η <44 -HP β Η β fe Ο '4-1 Ο β ·& Λ Λ 4-) (0 β -Η (U ·Η Ο

ottJO ΙΟ θ' (0 Ρ ^ U OO tOP S

fe 3 Ό. O (U O' β Ο .Λ ·Η ·Η ·Η 4-1 - η too— PS ^ +)Ό 44 — -- D.U Ο 4-) 43 fe'- 44 Ρ --r--- i Ο Η β ttj (0 λ β 3 ε β ρ ο ^ I dj Ή Η Ο ·Ρ 44 Ο

iVO Ο Η Ρ Ρ S HH

β -Η <U -β -Ρ — > Φ Ό Ο Ο — ^ β Ρ Ρ___ Ο tu ίΟ ο ΙΟ Ο β -Η ·Η ΙΟ Ο Η -Η 44 Ό O S Ο X Ρ

Qj* C *rl ίο fo tu v O Ό Ρ o

“H-H ρ ή O

β 44 to S

•H X O —

Ρ β O

44 PS

— fe 7 U4180

Trin a) Adskillelse af Nocardicin C og G fra de andre nocardiciner A, B, D, E og F: Når det nævnte råmateriale underkastes en søjlechromatografi under anvendelse af en makroporøs ikke-ionisk adsorptionsharpiks (f.eks. Diaion HP 20), adsorberes Nocardicin A, B, D, E og F til harpiksen. Nocardicin C og G passerer derimod gennem søjlen.

Trin b) Adskillelse af Nocardicin C fra Nocardicin G:

Den opløsning, der har passeret, og som er vundet som beskrevet ovenfor, fraktioneres derefter ved, at den underkastes søjle' chromatografi under anvendelse af cellulose, med et egnet udviklings-opløsningsmiddel [f.eks. n-butanol mættet med vand, i en blanding af n-butanol, eddikesyre og vand (20:1:6)] til opnåelse af fraktion I indeholdende Nocardicin C og fraktion II indeholdende Nocardicin G.

Trin c) Adskillelse af Nocardicin D fra Nocardicin A, B, E og F:

Adsorbatet fra det ovennævte trin a) elueres fra harpiksen med et hydrofilt opløsningsmiddel, f.eks. vandig methanol. Eluatet, som indeholder Nocardicin A, B, D, E og f, fraktioneres derefter i i tre fraktioner, nemlig fraktion III indeholdende Nocardicin e og F, fraktion IV indeholdende Nocardicin D og fraktion V indeholdende Nocardicin A og B, ved en søjlechromatografi på cellulose med et egnet udviklings-opløsningsmiddel [f.eks. n-butanol mættet med vand, et øvre lag af en blanding af ethylacetat, n-butanol og vand (5:5:2)]·

Trin d) Adskillelse af Nocardicin E fra Nocardicin F:

Fraktion III, vundet i det ovennævnte trin c), fraktioneres yderligere ved en søjlechromatografi på kiselsyre med et egnet udviklings--opløsningsmiddel [f.eks. en blanding af chloroform og ethylacetat (4:1), en blanding af chloroform og methanol (10:1)] til opnåelse af fraktion VI indeholdende Nocardicin E og fraktion VII indeholdende Nocardicin F.

3 144180

Trin e) Alternativ fremgangsmåde til adskillelse af Nocardicin E og Nocardicin F:

Nocardicin E og F kan også adskilles fra det rå materiale ved en søjlechromatografi på kiselsyre med samme hensigtsmæssige udviklings-opløsningsmiddel som eksemplificeret ovenfor, da Nocardicin A, B, C, D og G adsorberes stærkt til kiselsyren og næsten ikke kan elueres med det pågældende opløsningsmiddel.

Hver af Nocardicinerne C, D, E, F og G kan renses ud fra fraktioner, dvs. fraktionerne I, II, IV, VI og VII, på konventionel måde.

De her·omhandlede nocardiciner, fremstillet i dyrkningsvæsken, kan isoleres i fri form, og eventuelt i form af deres alkalimetalsalte, ved, at det rå materiale indeholdende de her omhandlede nocardiciner behandles med et alkalimetalmateriale (f.eks, natriumeller kaliumhydroxid) under isolering- eller rensningsprocesser.

De her omhandlede nocardiciner, vundet i deres frie form, kan også omdannes til saltet med en uorganisk eller organisk base (f.eks. natrium- eller kaliumhydroxid, ethanolamin og dicyclohexylamin) på kqnventionel måde.

Endvidere kan det uorganiske eller organiske basesalt af de her omhandlede nocardiciner let omdannes til deres frie form ved, at det pågældende salt behandles med en syre, f.eks. en mineralsyre (f.eks. saltsyre) på konventionel måde.

Fysisk-kemiske egenskaber af de her omhandlede nocardiciner er følgende:

Tabel I

____Fysisk-kemiske egenskaber af Nocardicin C og D_ , __Nocardicin C Nocardicin D_

Udseende Hvide krystaller Hvide krystaller amfotere amfotere

Optisk drejning [a]^4 = "95° = 0,δ) ^d° = -171° (c ~ H2°) h2o

Smeltepunkt 220-225°C(sønderdeling) 230-235°C (sønderdeling) UV-spektrum *max (E^m) = 227(434), Xmax (E^) ^ 226 (395) 272(43), 277(skulder, 298(313)nmi C2H5QH-H20 37)nm i H20, 232(319), 243 (1:1)' 246 (30^' 298 9 144180

Tabel I fortsat (skulder, 289), 289(54), |(300)nm i C^H^OH- 0,1N 292(skulder, 44)nm i vandig NaOH (1:1)

0,IN vandig NaOH

IR-spektrum vnbjol = 3430; 2920, 2850,vnu:io1 = 3430, 3210, 2900 md.x max 1745, 1670, 1610, 1580, 2850, 1735, 1670, 1655, 1560, 1515, 1465, 1375, 1610, 1600, 1570, 1510, 1340, 1310, 1255, 1180, 1465, 1455, 1420, 1408, 1170, 1110, 1040, 970, 1375, 1340, 1320, 1280, 940, 930, 890, 850, 820, 1260, 1240, 1178, 1140, 795, 760, 740, 680 cm"1 1120, 1080, 1050, 1030, 1010, 980, 930, 845 cm'1

Farvereaktion Positiv: ninhydrin- og Positiv: ninhydrin- og ferrichloridreaktion ferrichloridreaktion

Negativ: Ehrlich-test Negativ: Molisch-test, og Molisch-test, reak- reaktion med Tollens tion med Tollens rea- reagens og med Dragengens dorff's reagens

Opløselighed Let opløselig i: vandig Let opløselig i: vandig alkalisk opløsning (f.eks. alkalisk opløsning (f.eks vandig ammoniak, vandig vandig ammoniak, vandig natriumhydroxidopløsning), natriumhydroxidopløsning) dimethylsulfoxid pyridin

Spo Lidet opløselig i: H20, Lidet opløselig i: H2Q, ch3qh ch3oh, c2h5oh

Uopløselig i: C^H^OK, Uopløselig i: CH3COOC2H3, ch3coch3, chci3, chci3, c2r5oc2h5 ch3cooc2h5

Tabel II

Fysisk-kemiske egenskaber af Nocardicin E og F Nocardicin E Nocardicin F

Udseende Hvide krystaller Hvide krystaller svagt sure svagt sure

Elementaranalyse C 56,95: H 4,20: N 1Q,48 C 56,84: H 4,35: N 10,23

Optisk drejning ία]^4 ="192° = H20^ (α^4 = “181° (c = H20)

Smeltepunkt 228-231°C (sønderdeling) 230-231°C (sønderdeling) 10 144180 αν-spektrum W'^L1 ' 222 (skuld“' W^cm1 " 224(5161 ' 557) , 272 (396)ran i CH3OH 270(248)nm i CH3OH, 248 (719), 298(324)nm 247(720), 295 (253)nm i CH30H-1N vandig NaOH i CH30H-1N vandig NaOH (9:1) (9:1) IR-spektrum \>nuj°l = 338Ο, 3280, 2920^nu^01 = 3420, 3300, 3280 max max 2840, 1745, 1675, 1645, 2950, 2920, 1900, 1745, 1610, 1595, 1540, 1515, 1680, 1655, 1610, 1595, 1510, 1460, 1435, 1375, 1550, 1515, 1465, 1450, 1360, 1325, 1310, 1275, 1410, 1380, 1360, 1310, 1260, 1220, 1175, 1140, 1295, 1280, 1270, 1250, 1115, 1105, 1055, 1030, 1220, 1180, 1140, 1120, 1005, 945, 935, 910, 855,1110, 1060, 1030, 1010, 845, 825, 755, 735, 730, 980, 935, 900, 870, 860, 700, 685 cm"1 840, 820, 780, 740, 720, 680 cm

Farvereaktion Positiv: ferrichlorid- Positiv: ferrichlorid- -kalium-ferricyanidreak- -kalium-ferricyanidreak-tion tion

Negativ; Ehrlich-test, Negativ: Ehrlich-test, ninhydrinreaktion ninhydrinreaktion

Opløselighed Let opløselig i: vandig Let opløselig i: vandig alkalisk opløsning alkalisk opløsning, py- (f.eks. vandig ammoniak, ridin, dimethylsulfoxid, vandig natriumhydroxid- Lidet opløselig i: CH3OH, opløsning), pyridin, di- c2H,-OH, methylsylfoxid, Uopløselig i: CH3COCH3,

Lidet opløselig i: CH3OH, CH^OOC^, CHC13 c2h5oh,

Uopløselig i: CH3COCH3, ch3cooc2h5, chci3

Tabel III

Fysisk-kemiske egenskaber af Nocardicin G

Udseende Hvide krystaller, amfotere

Elementaranalyse C 57,62: H 5,14: N 10,39: H20 2,81

Optisk drejning [a]^ = ^05° (c = 1, 1% vandig NaHC03)

Smeltepunkt 227 - 233°C (sønderdeling) (Nocardicin G ændres gradvist til rød omkring 200°C og rødsort omkring 225°C) n 1U180 UV-spektrum λ naxfElcit^ = 228(454), 273(52), 278(skulder, 45)nra i O,IN vandig HC1, 248(562), 291(107)nm i O,IN vandig NaOH.

IR-spektrum = 3250, 3150, 2900, 2850, 1745, 1690, 1610, 1590, 1560, 1510, 1460, 1375, 1340, 1295, 1270, 1255, 1185, 1170, 1135, 1100, 1050, 1025, 940, 925, 880, 850, 830, 825, 815, 760, 750, 720 og 680 cm

Farvereaktion Positiv: Ninhydrinreaktion og ferrichloridreak- tion

Negativ: Ehrlich-test og Molisch-test< Fehling--reaktion og reaktion med Tollens reagens.

Qpløselighed Let opløselig i: dimethylsulfoxid, H20

Lidet opløselig i: CH^OH, C2Hj.OH Uopløselig i: CH3COCH3, CH3COOC2H5, CHCl3· 12 ' . [ a) o i [ i Ή « . - :.2¾ U4180

fe fe : 0) C

tu o i +j g S fe ni LO LO I G fe aj ΐζ) LO fe in I . 0) ft C u * * - ti 0 O (8 0 0 0 (8 U N ^ ^ •H O tn U a K oo oo oo « fe O G -P ^ 0) CL, 2 fe 0) fe LO Jl* .II· Jl‘

O S-l C *P

H o — ---ro i Ή — II pq pq pq

H ro & ι^·Η S <l <! <C

h fe fe ^ ro b b >-0 bi fe ro 1¾ ft ^t1 ' m i O w "' " rjf C I «£ r 4J ro rofl fl fl D fe O --P - fe o NN O * - S K » » o) .. -η σι. h ^ q i g o k a k a sa κ

Air; .fe 00 fer·' ‘ I E *H O fe fe i—I £N Ol ^ r-O p - - ! o ro ^3 }-j *- -—- —' ^ — —

cn -rH (0 O O O ! O fe -P rO

4j O tOP'-'t^voojLDcnin g ^ O ’ κ+>Ι·γ~όποοοο£Ν (Od) 2 <0 ro ro (8 **·« * *· *· ^4j S 2 I 0 ro m m lo o r- t n d) —----------- ---- - --------

(0 P

Ξ 0 * W Λ ^ Λ Λ

J-1 » £$ i N M N N

d_j o -ι-f ^ σι r-· n K 2 GI bb Γ) O oo ni LO O ffi ;

£ .,-1 LO 00 00 00 CO

(8 A? >0000 !T> ε 7a u o ii il ii il ii ω -p X} (8 m o o fe b b b b hi! (8 X O ® . .

ta 2 - -- — - - - ' U

C _ (3 lo S-ftSMO Ό Ό ΌΛ ·« t8 ___G} UP C I 01

d) fe *h -H fe O S WffiWWWWqHffiW

Uro •tiQ o c/ι H i—t f^4 *—i *—ι cvj rvi «—11—ϊ ft) (8 U fe S ——

pq fe ft) C Ό Q

*> -H U ^^•^ι-Ηοοη-σιΜο

;> IU ro fer-.cnror~-feroooLD

H U d) mh fe t— ·# oo > O ^ ^ ' s

y P^jr^j tn O^* O fOfO^lilVD Is* Γ' COH

fe tn u u * *· *· fe 2 h ojoft) ro ooo o)_______ xj S o Λ u njfed) o roro — ^

Fn U 2 EH N N N N N

«. ro e inwwffiw

Η > G

---U in oo oo co oo ». fe ' ’ q _ Ai II II II II II ro fe d) . ____ ~d) CU t-D t-0 ϊ-ρ *PJ ^ O Ό O ro d) tJ 1 «. v .. > U ^ C-h C Pi E+'Eroti'ti'd'ro^ro •HE -η S Τ3 om o oo o ι i S i - ^ •HC *H ro o ro O W ΚΚΚϊιΙΚΚίιΙϊΡΚΚ d) · ·- ·- qd co SI *—i ·—i *—i ’—i ηί ni *—t ro i—i u o u ooo SH —— — — ——

ro ro ro Q

Od) U niooorooocoocoo'a· OU O tHn-oror^i-iroon'r-l 2 O 2__ - - ' ' ' 3 r-, roro^mvo η- n~ σισίιΗ μη H d) Ή ro μη ^ •H d) __!__ μη Ό ro ι Ό roe tn d) ω ro ud) e u E ·· tn Ό -η >1 n~ 0 fe G ro-P'-' -P O ro d) d) fe ro Λ Ό. Λ -p Ί3 d)

Ed)fe -Η-PC Ό Ό a ό —. ft) ro op UG 0 DN E > -fe J3 λ fe ι ο)··-ι S ro

o " ro i fe * fe GraG

w ir* r—i ·· fe o -ri d1 ro

tnm G 0-m>0 G OG-P

(β ίο -H g ^ G ro fe fe ro r—ι o i—i ro ro a ro g .pio Al +) Ό -P O urod)

ό -η pgGtiu ro -s u E

g· > xiroxica lofeta a >ι o ό i>iroi o a G a EH 2 I 2 c I C > G i 2 O H <o 13 UA180

De kemiske strukturer af de ker omhandlede nocardiciner med de ovennævnte fysisk-kemiske egenskaber er blevet identificeret og angivet som ovenfor.

De her omhandlede nocardiciner og deres salte har specifikke antibiotiske spektre, idet de viser aktivitet mod patogene bakterier og lav toxicitet. De her omhandlede nocardiciner og salte deraf kan derfor anvendes til behandling af infektionssygdomme forårsaget af sådanne bakterier i pattedyr.

De farmakologiske afprøvninger af nogle af de her omhandlede nocardiciner, dvs. antimikrobielle forsøg og toxicitetsforsøg, er som følger:

Mimimal inhiberende koncentration (M.X.C.) Μ.I.c.-test udføres efter den sædvanlige agarseriefortyndingsme-tode, idet der anvendes hjerteinfusionsagar (eller Mueller-Hinton--agar), som inkuberes ved 37 C i 20 timer. M.X.C.-værdien udtrykkes som den minimale koncentration af Nocardicin C» D, E eller F (y,ug/ml) , der inhiberer væksten af mikroorganismen. Resultaterne fremgår af nedenstående tabel VI.

* . Η 144180 * 1¾ c •d

O

•ri T3 o o o o

M O o O I 1 I o J

td ^ ^ h O ^ ^ ^ s « tt tt

H

d -H ' ^ o

•d O O O <M

TJ O O O I I I Ή I

μ d* -3* d< g Λ.

0 5 s

t—I

g tt \ tt &> Q υ , g c d — -d m o o

•H · -d OOOOCNJOOO

4J u d OOLflOHiriOLn id . l-ι co cm H oo d H id

4J · O

C S o 0) 2 o h d > 0 _ _ _ rd M i—I 1—f —f <u ο» ε s ε Λ Ό * > > >

4ι (U Ο CU 0J

5-id —1 —I ι—I

(D-d Η Η i—I

η ο ω ω ω -Η ·ΗΟΟΟ Ο Ο Ο Ο Ο ,£ Ό ο ο ο ι ο ι m ι C 54 co ΓΊ ·5Τ -d· νοοονο •Η ίΰ ν\ ° ° ° Ο Η Η Η ι-Η Ο ' ^ 'w* **"'* id 53 ,

g r~s U U U

-η ° ta ta ta C 5 tn tn Cn

-r-l 00 o (0 Id nJ

2 t-t h tn to i rH u d d d

ft η N O ctiEh OOO

cn (O i E-ι oo U -Η -d -P

oioucjtni-tSH wind n « b g « i d d -d u owtdrt! mmaa wuhjtUH-Hw dd dEHffitdS'doa) ·η·ημ OJrijH-rH^-Hdtd tutuo) 0 54 2 d H 4-> -d -d jJjJi-l g d w o -d Cn 54 5-i 5-i i t tn td -d -d g w 54 d tu <d<i)<d -d r-i r-i d -d O) M -P -1-1 -Π d

d w-doo)5H-dti)d ,d Λ S

td d-Podflcma) tj> O Λ ft td 0) w oid oid oid M odd η w>i ft ft ft

o ow-diddnStdO

Ο o dH>Hd tt tt tt M otnord i-tonJ tt tt ^ Hd-da)wa)gH tt •d >1 r-l id -d d d Old g dHOWfliOOC) 4) ft-ddX)4JgdtJ> m idootuordtu-d tu +)nJwrdMnjtnd B tniQpii^fttnPitn 15 144180

Akut toxicitet.

En vandig natriumhydroxidopløsning (pH-værdi 7,4) af Nocardicin C injiceres intravenøst i hver af fem hanmus af iCR-stammen med vægt 18 - 22 g (dosis: 1 g/kg), og observationen fortsættes i 1 uge efter administrationen; alle de afprøvede mus var normale i den nævnte periode.

Endvidere injiceres vandig natriumhydroxidopløsning (pH-værdi 7,4) af hver af Nocardicinerne D, E, F og G subcutant i hver af fem mus af ICR-stamme med vægt 18 - 22 g (dosis 500 mg/kg), og observationen fortsættes i 1 uge efter administrationen. Alle de afprøvede mus var normale i nævnte periode.

De her omhandlede nocardiciner og farmaceutisk acceptable salte deraf kan formuleres til administration på en hvilken som helst hensigtsmæssig måde, i analogi med kendte antibiotika, ved at de blandes med en farmaceutisk bærer.

Et farmaceutisk acceptabelt salt af de her omhandlede nocardiciner kan være et salt med en uorganisk eller organisk base såsom natriumhydroxid, kaliumhydroxid, calciumhydroxid, ammoniak, ethanol-amin, triethylamin, dicyclohexylamin og lignende.

Det antimikrobielle middel kan således anvendes i form af farmaceutiske præparater, f.eks. i fast, halvfast eller flydende form, hvilke præparater indeholder den pågældende aktive forbindelse i blanding med en farmaceutisk organisk eller uorganisk bærer eller excipiens, der egner sig til ekstern, enteral eller parenteral applikation. Den aktive bestanddel kan f.eks. sammensættes med sædvanlige bærere for tabletter, piller, kapsler, suppositorier, opløsninger, emulsioner, suspensioner og andre former, der egner sig til anvendelsen. De bærere, som kan anvendes, er vand, glucose, lactose, gummi acacia, gelatine, mannitol, stivelsespasta, magne-siumtrisilicat, talkum, majsstivelse, keratin, kolloidt silicium-dioxid, kartoffelstivelse, urea og andre bærere, der egner sig til anvendelse ved fremstillingen af præparater i fast, halvfast eller flydende form, samt hjælpemidler såsom stabiliserings-, fortykkelses- og farvemidler samt parfumer. De antimikrobielle præparater kan også indeholde konserveringsmidler eller bakterio-statiske midler, således at den aktive bestanddel i de ønskede 16 144180 præparater holdes med stabil aktivitet. De her omhandlede nocar-diciner eller salte deraf inkorporeres i de antimikrobielle midler i en sådan mængde, som er tilstrækkelig til opnåelse af den ønskede terapeutiske effekt på den bakterialt inficerede tilstand.

Til applikation af det her omhandlede antimikrobielle middel til mennesker foretrækkes intravenøs eller intramuskulær injektion.

Selv om doseringen eller den terapeutisk effektive mængde af de her omhandlede nocardiciner eller et salt deraf varierer efter og Også afhænger af alder og tilstand' af hver enkelt patient, der skal behandles, indgives der almindeligvis til behandling < af sygdomme en daglig dosis på ca. 2-50 mg af den aktive be-standdel/kg legemsvægt af det pågældende menneske eller det pågældende dyr.

De her omhandlede nocardiciner kan også anvendes som mellemprodukter til fremstilling af andre 3-acylamino-l-(a-carboxy-4-hydro-xybenzyl)-2-azetidinoner, som har forbedret antimikrobiel virkning mod patogene grampositive bakterier. For nogle af de her omhandlede nocardiciner vises fremstillingen af 3-acylamino-l-- (a-carboxy-4-hydroxybenzyl)-2-azetidinon ud fra de her omhandlede nocardiciner efter følgende skema: 17 144180 /—λ nh2? HOOC-CH (CH,) ,0-/ 'S—CH-C-HN-- 1 \=/ i /ΓΛ ς/ I Y=/

u COOH

(Nocardicin C) C^-n=c=s 0 HOOC-CH (CH2) 20-^ V-CH — C-HN--j

I n~Λ ^ J N-CH-/^ OH

NHCSNH-(/ ') Λ I \—/

\ —/ COOH

NHCSNH—/ Λ , hydrolyse £

H2N_! I

N-CH-/~\-OH acylering _HN - ° iw 1

COOH J?—n-ch-(/ y OH

O' ^ '—

COOH

hydrolyse [3-acylamino-l-(a-carboxy--4-hydroxybenzyl)-2-azeti-dinon]

O

HO— V )—CH-C------HN—1-1

NHCSNH·-/ \ yt N-CH-—OH

o COOH

/N

o HO-V y—CH-C -HN -r ”2 0Λ"7Η—

/m .. . ~\ COOH

(Nocardicin G) 18 144180

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved følgende eksempler:

Eksempel 1. (Fremstilling af Nocardicin C).

Et vandigt medium (100 ml) indeholdende 2% saccharose, 2% bomuldsfrømel, 1% tørret gær, 2,18% KH2P04 og 1,43% Na2HPC>4.121^0 hældes ud i hver af 20 500 ml's rystekolber og steriliseres ved 120°C i 20 minutter. En trådøjefuld af en skråkultur af Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 podes i hver af medierne og dyrkes , derefter ved 30°C i 48 timer.

Et andet vandigt medium (100 liter) indeholdende 2% opløselig stivelse, 1% pepton, 0,4% gærekstrakter, 1% KH2P04, 1% Na2HP04.12H20, 0,5% MgS04.7H20, 0,1% L-tyrosin og 0,1% glycin indstilles til pH--værdi 6,0 med 6N vandig natriumhydroxidopløsning. 20 liter af mediet hældes ud i hver af fem 30-liter's karfermentorer og steriliseres ved 120°C i minutter.

Til hver af medierne sættes den på den ovenfor beskrevne måde fremstillede podekultur i en mængde på 2 rumfangsprocent beregnet på mediet. Organismen dyrkes ved 30°C i 96 timer. Under vækstperioden omrøres væsken ved 250 omdrejninger pr. minut, og der blæses steril luft gennem væsken i en mængde på 20 liter pr. minut.

Den resulterende dyrkningsvæske (80 liter) filtreres ved hjælp af 8 kg diatoméjord, hvorved fås en filterkage og et filtrat. Til filterkagen sættes 70% vandig ethanol (20 liter), og derefter omrøres blandingen i 1 time, hvorefter den filtreres. Denne ekstraktionsoperation gentages to gange. De forenede ekstrakter (40 liter) koncentreres til et rumfang på 2 liter under reduceret tryk.

Det som ovenfor angivet fremstillede dyrkningsfiltrat koncentreres til et rumfang på 10 liter. 50 liter methanol sættes under omrøring til koncentratet, hvorefter blandingen får lov at henstå i 1 time, hvorefter den filtreres. Filtratet koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 2 liter.

Det kombinerede koncentrat indstilles til pH-værdi 3,0 med 6N saltsyre og ekstraheres to gange med ethylacetat (4 liter). Den vandige fase koncentreres til et rumfang på 1,8 liter under redu- 19

U/4 ISO

ceret tryk. Koncentratet indstilles til pH-værdi 4,0 med IN vandig natriumhydroxidopløsning og føres derefter gennem en søjle, som er pakket med Diaion HP20 (4 liter), hvorved fås en behandlet op-' løsning. Derefter vaskes søjlen med vand, hvorved fås vaskevæsker.

Den behandlede opløsning og vaskevæskerne kombineres, og den vandige opløsning (6 liter) indstilles på pH-værdi 8,0 med 6N vandig natriumhydroxidopløsning. Til opløsningen sættes 120 g aktivt kul, hvorefter blandingen omrøres i 10 minutter og derpå filtreres. Det aktive kul vaskes med 1 liter vand, og derefter tilsættes 80% methanol (1 liter). Blandingen omrøres i 10 minutter, hvorpå den filtreres. Elueringsoperationen gentages yderligere en gang. Det kombinerede eluat (2 liter) koncentreres til et rumfang på 10 ml. Til koncentratet sættes 200 ml methanol under omrøring,og uopløselige materialer filtreres fra blandingen. Filtratet koncentreres til et rumfang på 10 ml. Koncentratet underkastes søjlechromatografi på cellulose [udviklings-opløsningsmiddel: øvre lag af en blanding af n-butanol eddikesyre: vand (100:5:30) ] .Eluatet (500 ml) indeholdende den omhandlede forbindelse opsamles, Til eluatet sættes 500 ml n-hexan, og blandingen omrøres, hvorpå den vandige fase fraskilles. Til den vandige fase sættes 100 ml ethylacetat, og blandingen omrøres.

Den vandige fase fraskilles og koncentreres til et rumfang på 20 ml,

Til koncentratet sættes 40 ml acetone, og blandingen lades henstå i køleskab (5°c), hvorved fås krystaller. Blandingen filtreres, og de vundne krystaller tørres, hvorved fås 26 mg Nocardicin C i form af rå krystaller. Disse rå krystaller opløses i 4 ml vand, og til opløsningen sættes 8 ml acetone. Blandingen lades henstå, hvorved fås krystaller, som fraskilles og tørres, hvorved fås 15 mg Nocardicin C i form af hvide krystaller.

Eksempel 2. (Fremstilling af Nocardicin D).

Et vandigt medium (100 ml) indeholdende 2% saccharose, 2% bomuld-frømel, 1% tørret gær, 2,18% KH2P04 og 1,43% Na2HP04.12H20 hældes ud i hver af 20 500 ml's rystekolber og steriliseres i 20 minutter ved 120°C. En trådøjefuld af en skråkultur af Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 podes til hver af medierne og dyrkes ved 30°C i 48 timer.

Et vandigt medium (100 liter) indeholdende 2% opløselig stivelse, 1% pepton, 0,4% gærekstrakter, 1% KH2P04, 1% Na2HP04.12H20, 0,5% MgS04.7H20, 0,1% L-tyrosin og 0,1% glycin indstilles på pH-værdi 20 144180 6.0 med 6N vandig natriumhydroxidopløsning, og 20 ml af mediet hældes ud i hver af 5 30 liters karfermentorer og steriliseres ved 120°C i 20 minutter.

Til hver af medierne sættes podekulturen fremstillet på den ovenfor beskrevne måde i en mængde på 2 rumfangsprocent, beregnet på mediet. Organismen dyrkes ved 30°C i 96 timer. Under vækstperioden omrøres væsken ved 250 omdrejninger pr. minut, og steril luft føres til væsken i en mængde på 20 liter pr. minut.

Til den resulterende dyrkede væske (80 liter) sættes 8 kg diatoméjord, i hvorefter blandingen filtreres, hvorved fås et filtrat og en filter-· kage. Filtratet (70 liter) koncentreres under reduceret tryk til > et rumfang på 7 liter. Til koncentratet sættes methanol (90 liter) under omrøring, hvorpå blandingen lades henstå i 1 time og filtre res til fjernelse af bundfald. Filtratet (80 liter) koncentreres til et rumfang på 5 liter. Til koncentratet sættes 15 liter vand og 1 kg aktivt kul. Blandingen omrøres i 10 minutter og filtreres, hvorved det aktive kul isoleres. Til det aktive kul sættes 80% vandig methanol (10 liter), hvorefter blandingen indstilles på pH-værdi 8.0 med 5% vandig ammoniak, omrøres i 10 minutter og derefter filtreres. Denne eluering gentages yderligere én gang. De kombinerede filtrater koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 2 liter. Koncentratet indstilles på pH-værdi 4,0 med 6N saltsyre og føres gennem en søjle, som er pakket med Diaion HP 20 (4 liter).

Denne søjle vaskes med vand (4 liter), hvorefter den omhandlede forbindelse elueres med 50% vandig ethanol. Eluatet (1,5 liter) indeholdende den omhandlede forbindelse opsamles og koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 100 ml. Koncentratet underkastes søjlechromatografi på cellulose (udviklings-opløsningsmiddel: n-butanol mættet med vand). Eluatet (200 ml) indeholdende den omhandlede forbindelse opsamles og koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 10 ml. Koncentratet underkastes yderligere søjlechromatogra-fi på cellulose (udviklings-opløsningsmiddel: øvre lag af en blanding af ethylacetat:n-butanol:vand (5:5:2)). Eluatet (100 ml) indeholdende den omhandlede forbindelse koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 10 ml til opnåelse af et bundfald, som fraskilles ved filtrering og derefter tørres. Bundfaldet suspenderes i 5 ml vand, hvorefter suspensionen indstilles på pH-værdi 8,0 med IN vandig na 2i 144180 triumhydroxidopløsning til opløsning af bundfaldet. Opløsningen indstilles på pH-værdi 3,0 med IN saltsyre og lades henstå natten over i et køleskab (5°C) til opnåelse af krystaller, som fraskilles ved filtrering, hvorved der tørres til dannelse af Nocardicin D (50 mg) 1 form af hvide krystaller.

Den på den ovenfor beskrevne måde vundne filterkage indeholdende mycelierne ekstraheres to gange med 70% vandig ethanol (20 liter).

De kombinerede ekstrakter koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 2 liter. Koncentratet indstilles på pH-værdi 3,0 roed 6N saltsyre og ekstraheres tre gange med 2 liter ethylacetat til fjernelse af urenheder. Den vandige fase fraskilles og koncentreres under reduceret tryk. Koncentratet indstilles på pH-værdi 4,0 roed 6N vandig natriumhydroxidopløsning og føres gennem en søjle, soro er pakket med Diaion HP20 (2 liter). Søjlen vaskes med vand, hvorefter den omhandlede forbindelse elueres med 50% ethanol (1,5 liter) . Eluatet (1,5 liter) koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 100 ml. Den vundne remanens underkastes søjlechromatografi på cellulose (udviklings-opløsningsmiddel: n-butanol mættet med vand). Eluatet indeholdende den omhandlede forbindelse opsamles og koncentreres under reduceret tryk. Den vundne remanens underkastes søjle-chromatografi på cellulose (udviklings-opløsningsmiddel: øvre'lag af en blanding af ethylacetat:n-butanol:vand (5:5:2)). Eluatet indeholdende den omhandlede forbindelse koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 10 ml til opnåelse af bundfald, som fraskilles ved filtrering og derefter tørres. Bundfaldene suspenderes i 2 ml vand og indstilles på pH-værdi 8,0 med IN vandig natriumhydroxidopløsning til opløsning af bundfaldet. Derefter indstilles opløsningen på pH-værdi 3,0 med IN saltsyre og lades stå natten over i køleskab (5°C) til opnåelse af krystaller, som fraskilles ved filtrering og tørres, hvorved fås Nocardicin D (10 mg) i form af hvide krystaller.

Eksempel 3. (Fremstilling af Nocardicin E).

Et vandigt medium (300 ml) indeholdende 2% saccharose, 2% bomuldsfrømel, 1% tørret gær, 2,18% KH2PO4 og 1,43% Na2HPO^. 12^0 hældes ud i 22 144180 en X liters Erlenmeyer-kolbe og steriliseres ved 120°C i 20 minut ter. En trådøjefuld af en skråkultur af Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis &TCC 21806 podes til mediet og dyrkes ved 30°C i 54 timer.

I en 500 liters fermentor anbringes samme medium som beskrevet ovenfor (150 liter). Fermentationsmediet steriliseres ved 120°C i 20 minutter og podes derefter med det samlede rumfang af det på den ovenfor beskrevne måde fremstillede vegetative podemateriale, hvorefter der dyrkes ved 30°C i 42 timer.

Et vandigt medium (300Q liter) indeholdende 2% opløselig stivelse, 1% pepton, 0,4% gærekstrakter, 1% KH2P04, 1% Na2HP04.12H2Q, 0,5% .

MgSQ4.7H2Q, 0,1% L-tyrosin og 0,1% glycin hældes ud i en 4000 liters fermentor og steriliseres ved 120°C i 20 minutter. Det samlede rumfang af den på den ovenfor beskrevne måde fremstillede dyrkningsvæske podes til mediet.

Organismen dyrkes i fermentationsmediet ved 30°C i 119 timer. Under vækstperioden omrøres dyrkningsvæsken ved 230 omdrejninger pr. minut, og steril luft føres gennem væsken i en mængde på 3000 liter pr, minut..Når dyrkningen er tilendebragt, filtreres dyrkningsvæsken ved hjælp af diatoméjord (180 kg). Til en del af filtratet (1500 liter) sættes aktivt kul (45 kg), hvorefter blandingen omrøres i 30 minutter og filtreres til isolering af det aktive kul. Til det aktive kul sættes en blanding af acetone og vand (7:3) (200 liter), hvorefter den. resulterende blanding indstilles til pH-værdi 8,0 med vandig ammoniak og omrøres i 60 minutter. Det på denne måde vundne eluat (50.0 liter) koncentreres til et rumfang på 50 liter. Koncentratet indstilles på pH-værdi 4,0 med 6N saltsyre. Derefter sættes der til koncentratet 60 liter n-butanol, hvorefter blandingen omrøres i 30 minutter. n-Butanolfasen (50 liter) fraskilles og koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 10 liter. Koncentratet indstilles til pH-værdi 8,0 med 5%'s vandig ammoniakopløsning og omrøres i 30 minutter. Den vandige fase (15 liter) fraskilles og koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 1,3 liter. Koncentratet indstilles på pH-værdi 4,0 med 6N saltsyre, blandes med 1,3 kg diatoméjord og tørres derefter. Pulveret vaskes med 3 liter chloroform, og den omhandlede forbindelse elueres med ethylacetat.

23 U4180

Eluatet (5 liter) koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 50 ml. Koncentratet blandes med 50 g diatomejord og tørres. Pulveret underkastes søjlechromatografi på kiselsyre (udviklings-opløsningsmiddel: ethylacetat). Eluatet (600 ml) koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 10 ml. Koncentratet blandes med 10 g diatoméjord og tørres. Pulveret underkastes søjlechromatografi på kiselsyre (udviklings-opløsningsmiddel: en blanding af chloroform: methanol (100:7)). Eluatet (200 ml) koncentreres under reduceret tryk til ét rumfang på 3 ml. Derefter blandes koncentratet med 3 g diatomljord og tørres. Pulveret underkastes søjlechromatografi på kiselsyre (udviklings-opløsningsmiddel: en blanding af chloroform: ethylacetat (1:4)). Eluatet (50 ml) inddampes til tørhed under " reduceret tryk. Den på denne måde vundne remanens opløses i 1 ml methanol. Til opløsningen sættes 5 ml chloroform, og opløsningen henstår natten over ved 4°C, hvorved fås 230 mg krystaller, som omkrystalliseres af en blanding af methanol og chloroform (1:5) (12 ml), hvorved fås 190 mg Nocardicin E i form af hvide krystaller.

Eksempel 4. (Fremstilling af Nocardicin F).

100 ml af et vandigt medium indeholdende 2% saccharose, 2% bomuldsfrømel, 1% tørret gær, 2,18% KH2P04 og 1,43% Na2HP04.12H20 hældes ud i hver af 24 500 ml's Sakaguchi-kolber og steriliseres ved 120c i 20 minutter. En trådøjefuld af en skråkultur af Noeardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 podes til, og organismen dyrkes ved 30°C i 48 timer.

Et vandigt medium (20 liter) indeholdende 2% opløselig stivelse, 1% pepton, 0,4% gærekstrakter, 1% KH2P04, 1% Na^PO^. 12H20, 0,5% MgS04.7H20, 0,1% L-tyrosin og 0,1% glycin hældes ud i hver af 6 30 liters karfermentorer og steriliseres ved 12Q°C i 20 minutter. Derefter podes den på den ovenfor beskrevne måde vundne dyrkningsvæske til hver af medierne i en mængde på 2%, beregnet på mediets rumfang. Organismen dyrkes i mediet ved 30°C i 96 timer. Under vækstperioden omrøres dyrkningsvæsken ved 260 omdrejninger pr. minut, og steril luft føres gennem væsken i en mængde på 20 liter pr. minut. Når dyrkningen er tilendebragt,filtreres dyrkningsvæsken (100 liter) ved hjælp af 10 kg diatoméjord. Til filtratet (90 liter) sættes 1,5 kg 24 146180 aktivt kul, hvorefter hlandingen omrøres i 10 minutter og derefter filtreres. Det aktive kul vaskes to gange med vand (10 liter), og den omhandlede forbindelse elueres to gange med 80% vandig methanol (30 liter og 20 liter). Eluatet (50 liter) koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 6 liter. Koncentratet indstilles på pH-værdi 4,0 med 6N saltsyre og føres gennem en søjle, som er pakket med Diaion HP2Q (3 liter). Søjlen vaskes med 1 liter vand, hvorefter den omhandlede forbindelse eiueres med 40% ethanol (8 liter). De fraktioner (4 liter), som indeholder den omhandlede forbindelse, opsamles og koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 100 ml. Koncentratet blandes med 300 g pulveriseret cellulose, hvorefter blån- % dingen tørres under reduceret tryk. Det tørrede pulver pakkes i en søjle, og der udføres eluering fra søjlen med acetone (6 liter).

Eluatet koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 50 ml.

Koncentratet blandes med 50 g diatoméjord, og blandingen tørres. Den tørrede blanding behandles i en søjle, som er pakket med kiselsyre (udviklings-opløsningsmiddel: en blanding af chloroform og methanol (10:1)). De fraktioner, som indeholder den omhandlede forbindelse, opsamles og inddampes til tørhed under reduceret tryk. Den på denne måde vundne remanens opløses i 20 ml methanol. Til opløsningen sættes 40 ml vand, hvorefter blandingen lades henstå natten over ved 4°C til opnåelse af et bundfald (560 mg), som fraskilles ved filtrering og opløses i IQ ml methanol. Til opløsningen sættes 20 ml vand, hvorefter blandingen lades henstå natten over ved 4°C til opnåelse af krystaller, som fraskilles og tørres, hvorved fås Nocardicin F (300 mg)-i form af hvide krystaller.

Eksempel 5(Fremstilling af Nocardicin G).

Et vandigt medium (100 ml) indeholdende 2% saccharose, 2% bomuldsfrømel, 1% tøjret gær, 2,18% K^PO^ og 1,43% Na2HPO^. 121^0 hældes ud i hver af 8 500 ml's rystekolber og steriliseres ved 120°C i 20 minutter. En trådøjefuld af en skråkultur af Nocardia uniformis subsp, tsuyamanensis ATCC 21806 podes til hver af medierne, og organismen dyrkes ved 30°C i 48 timer.

25 1Α Λ1 80

Et andet vandigt medium (40 liter) indeholdende 2% opløselig stivelse, 2% bomuldsfrømel, 2% tørret gær, 2,18% K^PO^, 1,43% . 12^0, 0,5% MgS04.7H20, 0,1% L-tyrosin og 0,1% glycin indstilles på pH--værdi 6,0 med 6N vandigt natriumhydroxidopløsning, hvorefter 20 liter af mediet hældes ud i 2 30 liters karfermentorer og steriliseres ved 120°C i 20 minutter. Til hvert af medierne sættes den på den ovenfor beskrevne måde fremstillede podekultur i en mængde på 2 rumfangsprocent, beregnet på mediet. Organismen dyrkes i mediet ved 30°C i 96 timer. Under vækstperioden omrøres dyrkningsvæsken ved 300 omdrejninger pr. minut, og steril luft føres gennem væsken i en i. mængde på 20 liter pr. minut. Derefter filtreres den dyrkede væske (35 liter) ved hjælp af 3,5 kg diatomejord. Filtratet (30 liter) " koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 3 liter. Til kondentratet sættes under omrøring 15 liter methanol, hvorefter blandingen lades henstå i 1 time til dannelse af bundfald, som fjernes ved filtrering. Filtratet (17 liter) koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 1 liter.

(Alle de nedenfor nævnte operationer udføres i et lavtemperaturrum (4°C) ) .

Koncentratet indstilles til pH-værdi 2,0 med 6N saltsyre. Til koncentratet sættes 2 liter ethylacetat, hvorefter blandingen omrøres i 10 minutter, og den vandige fase fraskilles. Til den vandige fase sættes 1,5 liter n-butanol og 250 g natriumchlorid, hvorefter blandingen omrøres i 10 minutter, og n-butanollaget fraskilles. Denne ekstraktion gentages yderligere 1 gang. Til de kombinerede n-butanol-lag (3 liter) sættes 3 liter n-hexan, hvorefter blandingen omrøres i 10 minutter, og den vandige fase (400 ml) fraskilles. Den vandige fase indstilles på pH-værdi 7,0 med IN vandig natriumhydroxidopløsning og koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 300 ml.

Til koncentratet sættes 5 liter vand og 50 g natriumchlorid, hvorefter blandingen indstilles på pH-værdi 4,0 med IN saltsyre. Blandingen føres gennem en søjle, som er pakket med Diaion HP20 (2 liter). Derefter elueres den omhandlede forbindelse fra søjlen med 20 liter vand. Eluatet indeholdende den omhandlede forbindelse opsamles. Til eluatet sættes 60 g Na2HP04.12H20, hvorefter blandingen indstilles på pH-værdi 9,0 med IN vandig natriumhydroxidopløsning og føres gennem en søjle, som er pakket med 700 ml Diaion HP20. Søjlen vaskes med 1 liter 1%1 s vandig opløsning af sekundært natriumphosphat.

Derefter elueres den omhandlede forbindelse med 3 liter vand. Eluatet 26 144180 (2 liter) indeholdende den omhandlede forbindelse opsamles, indstilles på pH-værdi 8,0 med IN saltsyre og føres derefter gennem en søjle, som er pakket med 300 g aktivt kul. Søjlen vaskes med 1 liter vand. Derefter elueres den omhandlede forbindelse med 2 liter 80%'s vandig methanol. Eluatet koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 50 ml. Koncentratet lyofiliseres, blandes med en ringe mængde cellulose og underkastes derefter søjlechromatografi på cellulose. Søjlen udvikles med n-butanol, som er mættet med vand. Eluatet (400 ml) indeholdende den omhandlede forbindelse opsamles. Til eluatet sættes 400 ml n-hexan, hvorefter blandingen omrøres i 10 minutter, og den vandige fase (60 ml) fraskilles. Den vandige fase * indstilles på pH-værdi 5,0 med IN vandig natriumhydroxidopløsning og koncentreres under reduceret tryk til et rumfang på 30 ml. Koncen- s tratet lades henstå natten over, hvorved fås krystaller, som fraskilles, vaskes med et ringe rumfang vand, og derefter omkrystalliseres, hvorved fås 150 mg Nocardicin G i form af hvide krystaller.

Claims (2)

27 144180 Patentkrav.

1. Fremgangsmåde til fremstilling af nocardiciner ved dyrkning af en nocardicinproducerende stamme af arten Nocardia i et vandigt næringsraedium under aerobe betingelser, kendetegnet ved, at der fra dyrkningsblandingen udvindes Nocardicin C med formlen NH„ 0 r\J 11 HOOC-CH(CH2) 20-t V—CH - C - HN—-r \=S ' —N-CH-C Voh nh„ o i \=y COOH Nocardicin D med formlen

0 O Γ\ P II HOOC-CH (CH0) 00—(' ')-C - C - HH—,-, W TLh^\oH nh2 ο/ I '-'

2 COOH Nocardicin E med formlen N-OH O /T\J 11 HO—( 7——C - C - HN——-1 \-=/ ' jT\ J?—N-CH-0 O-OH COOH Nocardicin F med formlen HO-N 0 HO C-C-HN -1 —N-CH-^~^)—OH COOH og/eller Nocardicin G med formlen NH„ O r~\ I 2 II HO—C )—CH - C - HN —--1 ?_N-CH-^ \-OH O I COOH