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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung eines der folgenden Nocardieine, nämlich Nocardicin C, Nocardicin D, Nocardicin E, Nocardicin F und Nocardicin G, wobei Nocardicin C der folgenden chemischen Struktur:
EMI1.1
Nocardicin D der folgenden chemischen Struktur:
EMI1.2
Nocardicin E der folgenden chemischen Struktur:
EMI1.3
Nocardicin F der folgenden chemischen Struktur:
EMI1.4
und Nocardicin G der folgenden chemischen Struktur:
EMI1.5
entsprechen, dadurch gekennzeichnet, dass man einen zur Gattung Nocardia gehörenden, Nocardicin C, D, E, F undloder G erzeugenden Stamm in einem wässrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen züchtet und das Nocardicin C, D, E, F oder G daraus gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Nocardicin C, D, E, F undloder G erzeugende Stamm ein Stamm von Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ist
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Stamm Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Nocardicin C aus der Kulturbrühe gewinnt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Nocardicin D aus der Kulturbrühe gewinnt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Nocardicin E aus der Kulturbrühe gewinnt
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Nocardicin F aus der Kulturbrühe gewinnt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Nocardicin G aus der Kulturbrühe gewinnt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen, nämlich Nocardicin C, D, E, F und G, durch Züchtung eines der Gattung Nocardia angehörenden, Nocardicin C, D, E, F undloder G erzeugenden Stammes in wässrigen einem Nährmedium unter aeroben Bedingungen und Isolierung der besagten Nocardicine.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Nocardicin C, D, E, F und G (nachstehend als Nocardicine bezeichnet) entsprechen den folgenden Formeln:
EMI2.1
EMI2.2
<tb>
Nocardicin <SEP> AR
<tb> <SEP> NH
<tb> <SEP> i2
<tb> <SEP> C <SEP> HOOC-CHCH <SEP> 2CH2- <SEP> -CII
<tb> <SEP> NH2
<tb> <SEP> 0
<tb> <SEP> D <SEP> " <SEP> -C
<tb> <SEP> N-OH
<tb> <SEP> 1
<tb> <SEP> E <SEP> II- <SEP> -C
<tb> <SEP> HO-N
<tb> <SEP> 1
<tb> <SEP> F
<tb> <SEP> NH
<tb> <SEP> G <SEP> " <SEP> 12
<tb> <SEP> -CII
Als erfindungsgemäss zur Anwendung gelangender Mikroorganismus ist ein Stamm vorgesehen, welcher der Gattung Nocardia angehört und befähigt ist, Nocardicin C, D, E, F und/oder G zu erzeugen.
Unter solchen Stämmen wird der Stamm Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis bevorzugt, welcher am 13. Juni 1972 bei American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville (Maryland 20852, USA) unter der Nummer ATCC 21806 hinterlegt worden ist. Dieser Stamm Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 und Ein zelheiten hierüber, z. B. die mikrobiologischen Eigenschaften usw., sind ausführlich publiziert und in der Literatur veröffentlicht worden, z. B. in der amerikanischen Patentschrift Nr.
3923977 und der deutschen Offenlegungsschrift 2 242699.
Dabei ist zu verstehen, dass für die Herstellung der erfindungsgemäss angestrebten Nocardicine die vorliegende Erfindung keineswegs auf die Verwendung des hier beschriebenen spezifischen Organismus eingeschränkt sein soll, da dieser Organismus lediglich zu Erläuterungszwecken angeführt ist.
Die Erfindung soll sich auch auf die Verwendung von natürlichen Mutanten sowie von künstlich geschaffenen Mutanten beziehen, welche sich von dem hier beschriebenen Mikroorganismus ableiten lassen, z. B. durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder Ultraviolettstrahlen, durch Behandlung mit N'-Nitro-N-nitrosoguanidin, 2-Aminopurin oder Stickstofflost oder dergleichen.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird mit Vorteil so ausgeführt, dass man einen der Gattung Nocardia, z. B. Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis, angehörenden, Nocardicin C, D, E, F und/oder G erzeugenden Stamm in einem Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter submersen, aeroben Bedingungen züchtet. Als Nährmedium kann man ein beliebiges verwenden, welches durch den besagten Mikroorganismus für die Herstellung der erfindungsgemäss gewünschten Nocardicine verwendet werden kann. Die bevorzugten Kohlenstoffquellen sind Kohlehydrate, wie Glucose, Saccharose, Maltose, Glycerin, Stärke usw.
Die bevorzugten Stickstoffquellen sind organische Stickstoffquellen, wie Hefeextrakte, Pepton, Glutenmehl, Baumwollsamenmehl, Sojabohnenmehl, Maisstärke, getrocknete Hefe, Rinderextrakte, Kaseinhydrolysat, Maisquellflüssigkeit, Harnstoff und dergleichen, sowie anorganische Stickstoffquellen, wie Ammoniumsalze, z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat usw.
Gewünschtenfalls kann man dem Medium Mineralsalze, z. B. Calciumcarbonat, Natrium- oder Kaliumphosphat, Magnesiumchlorid oder -sulfat usw. in kleineren Mengen zugeben.
Ferner kann man dem Medium auch eine oder mehrere organische Verbindungen, wie Tyrosin, Glycin, Serin, Homoserin, p-Hydroxyphenylglycin, a-Aminobuttersäure, a,p-Diaminopro- pionsäure, N-Acetyltyrosin, N-Acetyltyrosinamid, p-Hydroxy phenylbrenztraubensäure, p-Hydroxyphenylglycolsäure, p-Hydroxyphenylglyoxalsäure, Shikiminsäure, 2-Amino-3-(4- hydroxyphenyl)-propionohydroxaminsäure, 2-Acetamido-3-(4 hydroxyphenyl)-propionohydrazid und dergleichen, hinzugeben. Diese organischen Verbindungen können als eine Art Vor läufer wirken und können für die Steigerung der Ausbeute an Nocardicinen dienlich sein.
Für die Herstellung der erwünschten Nocardicine in grossen Mengen bedient man sich mit Vorteil des Fermentierverfahrens unter submersen aeroben Züchtungsbedingungen. Für die Herstellung von begrenzten Mengen kann man auch eine Schüttelkultur oder Oberflächenkultur in einem Kolben oder in einer Flasche anwenden. Erfolgt das Wachstum in grossen Behältern, so verwendet man vorzugsweise die vegetative Form des Organismus für die Impfung in den Produktionsbehältern, um eine Wachstumsverzögerung bei der Herstellungsmethode der Nocardicine zu verhindern. Damit ist es wünschenswert, zuerst ein vegetatives Inokulum des Organismus zu erzeugen, indem man eine relativ kleine Kulturmediummenge mit Sporen oder Mycelien des Organismus impft und hierauf die Züchtung vornimmt. Der Transfer des gezüchteten vegetativen Inokulums in die grossen Behälter erfolgt dann aseptisch.
Das Medium, in welchem das vegetative Inokulum erzeugt wird, kann praktisch das gleiche Medium sein wie jenes, welches für die Herstellung der Nocardicine verwendet wird, oder es kann auch ein davon verschiedenes Medium sein.
Das Rühren und Belüften des Züchtungsgemisches kann in verschiedener Weise bewirkt werden. Das Rühren kann beispielsweise mit einem Propeller oder mit einer ähnlichen, mechanischen Rührausrüstung geschehen, indem der Fermentierbehälter gedreht oder geschüttelt wird oder indem man sich verschiedenartiger Pumpsysteme bedient oder aber sterile Luft durch das Medium leitet. Die Belüftung kann durch Einleiten von steriler Luft in das Fermentiergemisch erfolgen. Im Verlaufe der Fermentierung kann man dem Medium insbesondere in jenen Fällen, in welchen das Kulturmedium in beachtenswer ter Weise schäumt, ein Entschäumungsmittel, z. B. Pflanzenöle, wie Sojabohnenöl usw., höhere Alkohole, wie Octadecanol,
Tetradecanol usw., Silikone usw., zugeben.
Die Fermentierung erfolgt gewöhnlich bei Temperaturen im Bereiche von ungefähr 20 bis 40 "C und vorzugsweise bei ungefähr 30 "C während einer Zeitdauer von 50 bis 100 Stunde den.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Nocardicine lassen sich in bekannter Weise aus der Kulturbrühe gewinnen. Sie sind in der Kulturbrühe in den Mycelien (intracellular) und/oder ausserhalb der Myceline (extracellular) vorhanden.
Als erste Stufe kann die Kulturbrühe in das Filtrat (überstehende Flüssigkeit) und einen Filterkuchen entweder durch Filtrieren oder durch Zentrifugieren getrennt werden.
Die Extraktion der Nocardicine aus dem Filterkuchen erfolgt durch Behandeln dieses Kuchens mit einem organischen Lösungsmittel, in welchem die Nocardicine löslich sind, wie z. B. Alkoholen, z. B. Methanol, usw., Ketonen, z. B. Aceton usw., wässrigen Alkoholen, Äthanol, z. B. wässrigem Methanol, wässrigem Äthanol usw.
Aus dem so erhaltenen Filtrat und/oder Extrakt lassen sich die Nocardicine isolieren und in bekannter Weise reinigen.
Zu diesem Zwecke kann man beispielsweise mit Adsorptionsmitteln, z. B. Aktivkohle, Kieselsäure, Kiesegel, Aluminiumoxyd usw., anionischen oder kationischen Austauschharzen oder makroporösen, nicht-ionischen Adsorptionsharzen [z. B. Amberlite XAD-2, XAD4, XAD-7 und XAD-8 (Warenzeichen der Firma Rohm & Haas Co.)J, behandeln. Man kann auch mit Lösungsmitteln extrahieren, unter vermindertem Druck einengen, lyophilisieren, den pH-Wert einstellen, eine Kristallisierung vornehmen, umkristallisieren und dergleichen. Alle diese Mittel kann man vorzugsweise unabhängig voneinander oder in Kombination miteinander in beliebiger und gewünschter Reihenfolge oder wiederholt anwenden.
Erhält man ein Rohmaterial, z. B. das Kulturfiltrat und Extrakte aus dem Filterkuchen, welches sämtliche Nocardicine enthält, d. h. Nocardicin A, Nocardicin B, welches ein geometrisches Isomer von Nocardicin A an der Hydroxyiminogruppe darstellt, Nocardicin C, Nocardicin D, Nocardicin E, Nocardicin F und Nocardicin G, so kann man ein jedes dieser Nocardicine beispielsweise nach dem folgenden Schema isolieren:
EMI4.1
<tb> <SEP> Nocardicin <SEP> A,B,C,D,E,F <SEP> und <SEP> G
<tb> <SEP> enthaltendes <SEP> Rohmaterial
<tb> (Stufe <SEP> e) <SEP> makroporöses <SEP> nicht
<tb> <SEP> ionisches <SEP> Adsorptions
<tb> <SEP> harz
<tb> <SEP> (Stufe <SEP> a)
<tb> <SEP> t
<tb> <SEP> 7iltl:
<SEP> t <SEP> - <SEP> Adsorbat
<tb> <SEP> (Nocardicin <SEP> A,B,D,E <SEP> und <SEP> F)
<tb> <SEP> (Nocardicin <SEP> C <SEP> und <SEP> G)
<tb> <SEP> Cellulose-Säulen- <SEP> Eluierung
<tb> <SEP> chromatographie
<tb> <SEP> (Stufe <SEP> b)
<tb> <SEP> Eluat
<tb> <SEP> t <SEP> (Nocardicin <SEP> A,B,D,E <SEP> und <SEP> F)
<tb> <SEP> Fraktion <SEP> I <SEP> Fraktion <SEP> II
<tb> (Nocardicin <SEP> C) <SEP> (Nocardicin <SEP> G) <SEP> Cellulose-Säulen
<tb> <SEP> chromatographie
<tb> <SEP> (Stufe <SEP> c)
<tb> <SEP> -¹
<tb> <SEP> Fraktion <SEP> III <SEP> Fraktion <SEP> IV <SEP> Fraktion <SEP> V
<tb> <SEP> (Nocardicin <SEP> E <SEP> (Nocardicin <SEP> D) <SEP> (Nocardicin <SEP> A
<tb> <SEP> und <SEP> F) <SEP> und <SEP> B)
<tb> <SEP> Kieselsäure-Säulenchromatographie
<tb> <SEP> (Stufe <SEP> (Stunde <SEP> d)
<tb> <SEP> Fraktion <SEP> VI <SEP> Fraktion <SEP> VII
<tb> <SEP> (Nocardicin
<SEP> E) <SEP> (Nocardicin <SEP> F)
<tb> Stufe a)
Trennung von Nocardicin C und G von Nocardicin A, B, D, E und F:
Wird das besagte Rohmaterial unter Verwendung eines makroporösen, nicht-ionischen Adsorptionsharzes, z. B. Diaion HP 20, der Säulenchromatographie unterworfen, so werden Nocardicin A, B, D, E und F auf dem Harz adsorbiert. Andererseits gehen Nocardicin C und G durch die Säule hindurch.
Stufe b)
Trennung von Nocardicin C von Nocardicin G:
Die nach den obigen Angaben durch die Säule hindurchge- flossene Lösung wird hierauf fraktioniert, indem man sie einer Säulenchromatographie unterwirft, wobei man Cellulose mit einem geeigneten Entwicklerlösungsmittel, wie mit Wasser gesättigtem n-Butanol oder einem Gemisch von n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Mischungsverhältnis 20 : 1 : 6, verwendet, wodurch man zu der Fraktion I, welche Nocardicin C enthält, und zur Fraktion II, welche Nocardicin G enthält, gelangt.
Stufe c)
Trennung von Nocardicin D von Nocardicin A, B, E und F:
Das Adsorbat aus der vorangehenden Stufe a) wird mit einem hydrophilen Lösungsmittel, z B. wässrigem Methanol, aus dem Harz eluiert. Das Nocardicin A, B, D, E und F enthal tende Eluat wird hierauf in drei Fraktionen, d. h. Fraktion III, welche Nocardicin E und F enthält, Fraktion IV, welche Nocar- dicin D enthält, und Fraktion V, welche Nocardicin A und B enthält. durch Säulenchromatographie über Cellulose mit einem geeigneten Entwicklerlösungsmittel, wie mit Wasser gesättigtem n-Butanol oder einer oberen Schicht einer Mischung von Äthylacetat, n-Butanol und Wasser im Mischungsverhältnis von 5 :5 :2. fraktioniert.
Stufe d)
Trennung von Nocardicin E von Nocardicin F:
Die gemäss vorangehender Stufe c) erhaltene Fraktion III wird über Kieselsäure mit einem geeigneten Entwicklerlö- sungsmittel. z. B. einem Gemisch von Chloroform und Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 4:1 oder einem Gemisch von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 10 : 1 durch Säulenchromatographic einer weiteren Fraktionierung unterworfen, wobei man zur Fraktion VI, welche Nocardicin E enthält, und zur Fraktion VII. welche Nocardicin F enthält, gelangt.
Stufe e)
Alternatimethode für die Trennung von Nocardicin E und Nocardicin F:
Nocardicin E und F lassen sich aus dem Rohmaterial auch durch Säulenchromatographie über Kieselsäure mit dem gleichen geeigneten Entwicklerlösungsmittel, wie es oben bei spielsweise angegeben worden ist, trennen, da Nocardicin A, B,
C, D und G durch die Kieselsäure stark adsorbiert werden und sich mit dem besagten Lösungsmittel praktisch nicht eluieren lassen.
Jedes Nocardicin C, D, E, Fund G lässt sich aus den Fraktio nen, d. h. Fraktionen I, II, IV, VI und VII, in üblicher Weise reini gen.
Die in der Kulturbrühe erzeugten Nocardicine können in freier Form isoliert werden; sie können auch in Form ihrer Alkalimetallsalze erhalten werden, indem man das die Nocardicine enthaltende Rohmaterial mit einem Alkali, z. B. Natriumoder Kaliumhydroxyd. während der Isolierung oder der Reinigung behandelt.
Die in freier Form erhältlichen Nocardicine können auch mit einer anorganischen oder einer organischen Base, z. B.
Kalium- oder Natriumhydroxyd, Äthanolamin, Dicyclohexyla min usw., in an sich bekannter Weise in ein Salz überführt wer den.
Andererseits lassen sich die unter Zuhilfenahme von anorganischen oder organischen Basen erhaltenen Salze der Nocardicine auch leicht ion die freie Form überführen, indem man solche Salze mit einer Säure, z. B. einer Mineralsäure, wie Salzsäure usw., in an sich bekannter Weise behandelt.
Die physikochemischen Eigenschaften der neuen Nocardicine finden sich nachstehend.
Tabelle 1
Physikochemische Eigenschaften von
Nocardicin C und d
Aussehen Weisse Kristalle, amphoter Weisse Kristalle, amphoter
Optische
Drehung [α]D24 = -95 (C = 0,6, H2O) [α]#D20 = -171 (C = 1,H2O)
Schmelzpunkt 220-225 C(Zers.) 230-235 C(Zers.) UV-Spektrum #max(E1 cm1 %) = 227 (434), 272(43), #max(E1 cm1 %) = 226(395), 298(313)
277 (sh,37)nm in H2O, 232(319), nm in C2H5OH-H2O(1 :
1), 246
243 (sh, 289), 280(54), 292 (sh, 44) (305), (300) nm in C2HsOH nm in 0,1n-NaOH-Lösung 0,1n-NaOH-Lösung(1 1)
IR-Spektrum #maxNujol = 3430, 2920, 2850, 1745, #maxNujol = 3430, 3210, 2900, 2850,
1670, 1610, 1580, 1560, 1515, 1465, 1735, 1670, 1655, 1610, 1600, 1570,
1375, 1340, 1310, 1255, 1180, 1170, 1510, 1465, 1455, 1420, 1408, 1375,
1110, 1040, 970, 940, 930, 890, 850, 1340, 1320, 1280, 1260, 1240, 1178,
820, 795, 760, 740, 680 cm-1 1140, 1120, 1080, 1050, 1030, 1010,
980, 930, 845 cm-1 Farb- Positiv auf Ninyhdrin und Positiv auf Ninhydrin und reaktion Ferrichloridreaktionen;
Ferrichloridreaktionen; negativ auf Ehrlich- und negativ auf Molischtest,
Molischtests, Reaktion mit - Reaktionen mit Tollensreagens
Tollensreagens. und Dragendorffreagens.
Löslichkeit Stark löslich in wässrigen Stark löslich in wässrigen alkalischen Lösungen, wie alkalischen Lösungen, wie wässrigem Ammoniak, wässrigem wässrigem Ammoniak, wässrigem
Natriumhydroxyd oder Natriumhydroxyd, sowie in
Dimethylsulfoxyd; spärlich löslich Pyridin; spärlich löslich in Wasser, in Wasser, CH3OH unlöslich in CHIOH, C2H5OH unlöslich in C2HsOH, CH3COCH3, CHCl3, CH3COOC2Hs, CHCb, CH3COOC2Hs. C2H5OC2Hs.
Tabelle 2
Physikochemische Eigenschaften von Nocardicin E und F
Nocardicin E Nocardicin F
Aussehen Weisse Kristalle, schwach sauer Weisse Kristalle, schwach sauer
Elementarana lyse C = 56,95; H = 4,20; N = 10,48. C = 56,84; H = 4,35; N = 10,21
Optische
Drehung [α]D24 = - 192 (C = 1, H2O) [α]D24 = - 181 (C = 1, H2O)
Schmelzpunkt 228-231 0C (Zers.) 230-231 0C (Zers.)
UV-Spektrum #max(E1 cm1 %) = 222 (sh,557), 272 #max(E1 cm1 %) = 224 (516), 270 (248) (396) nm in CH3O 248 (719), 298 nm in CH3OH, 247 (720), 295 (253) (324) nm in nm in CH3OH-1n-NaOH-Lösung
CH3OH-1n-NaOH-Lösung(9 : 1) (9 :
1)
IR-Spektrum #maxNujol = 3380, 3280, 2920, 2840, #maxNujol = 3420, 3300, 3280, 2950, 1745,1675,1645, 1610,1595,1540, 2920,1900,1745, 1680,1655,1610,
1515, 1510, 1460, 1435, 1375, 1360, 1595, 1550, 1515, 1465, 1450, 1410,
1325, 1310, 1275, 1380, 1360, 1310,
IR-Spektrum 1260, 1220, 1175, 1140, 1115, 1105, 1295, 1280, 1270, 1250, 1220, 1180,
1055, 1030, 1005, 945, 935, 910, 855, 1140, 1120, 1110, 1060, 1030, 1010,
845, 825, 755, 735, 730, 700, 685 980, 935, 900, 860, 840, 820, cm-1 780, 740, 720, 680 cm-1
Farbreaktion Positiv auf Positiv auf
Ferrichlorid-Kaliumferricyanidre- Ferrichlorid-Kaliumferricyanidre aktion; negativ auf Ehrlichtest und aktion; negativ auf Ehrlichtest und
Ninhydrinreaktion. Ninhydrinreaktion.
Löslichkeit Stark löslich in wässrigen Stark löslich in wässrigen alkalischen Lösungen, wie z. B. alkalischen Lösungen, Pyridin,
Ammoniak oder wässriger Dimethylsulfoxyd;
Natriumhydroxydlösung, Pyridin,
Dimethylsulfoxyd; spärlich löslich in CH3OH, spärlich löslich in CH3OH, CHsOH; unlöslich in CH3COCH3 C2HsOH; unlöslich in CH2COCH2 CH3COOC2H5, CHCh. CH3COOC2H5, CHCI3.
Tabelle 3
Physikochemische Eigenschaften von Nocardicin G
Nocardicin G Aussehen Weisse Kristalle, amphoter.
Elementaranalyse: C = 57,62; H = 5,14; N = 10,39; H20 = 2,81.
Optische Drehung: [α]D24 = - 205 C (C = 1,1%iges wässriges NaHCO3) Schmelzpunkt: 227-233 C (Zers.). (Das Nocardicin G geht allmählich bei ca.
200 C in rot und bei ca. 225 C in rötlich-schwarz über.) UV-Spektrum: #max(E1cm1 %) = 228 (454), 273 (52), 278 (sh, 45) nm in
0,1n-HCl-Lösung, 248 (562), 291 (107) nm in 0,1n-NaOH-Lösung.
IR-Spektrum: #maxNujol = 3250, 3150, 2900, 2850, 1745, 1690, 1610, 1590, 1560,
1510, 1460, 1375, 1340, 1295, 1270, 1255, 1185, 1170, 1135, 1100,
1050,1025, 940, 925, 880, 850, 830, 825, 815, 760, 750, 720, 680 cm-1.
Farbreaktion: Positiv auf Ninhydrin- und Ferrichloridreaktionen; negativ auf
Ehrlich- und Molischtests, Fehlingreaktion und Reaktion mit
Tollenreagens.
Löslichkeit: Stark löslich in Dimethylsulfoxyd und Wasser; spärlich löslich in CH2OH, C2HsOH; unlöslich in CH3COCH3, CH3COOC2H5, CHCl3.
Tabelle 4
Dünnschichtchromatographie von Nocardicinen C, D, E, F und G
Träger: Eastman-Chromagra-Sheet Cellulose Nr.6065 (ein fluoreszierendes Mittel enthaltend) (Warenzeichen Eastman Kodak Co.)
Nachweismethode: UV-Absorption Entwicklerlösungsmittel Rf-Wert
Nocardicin C Nocardicin D Nocardicin E Nocardicin F Nocardicin G n-Butanol-Essigsäure Wasser-Gemisch Mischungsverhältnis 4:1:2 0,38 0,57 0,84 0,89 0,62 mit Wasser gesättigtes n-Butanol 0,00 0,04 0,29 0,41 0,15 n-Propanol-Wasser-Gemisch Mischungsverhältnis 7:
:3 0,31 0,48 0,67 0,74 0,55
Tabelle 5
NMR-Spektrum von Nocardicin E, F und G Nocardicin E F G Lösungsmittel DMSO-d6 DMSO-d6 NaHCO3-D2O Sandard TMS TMS Natrium-2,2,3,3,-tetradeutero-3-(tri methylsilyl)-propionat oppm 3,12(1 H,m) 3,14(1 H,m) Ca. 3,00(1 H,m) 3,79(1 H,t,J=5Hz) 3,74(1 H,t,J=5Hz) 3,77 (1H,t,J=5Hz)
4,98(1 H,m) 4,94(1 H,m) 5,06(1 H,s)
5,33(1 H,s) 5,31 (1 H,s) 5,32(1 H,s)
6,78 (4H,d,J = 8Hz) 6,78 (4H,d,J=8Hz) 6,85 (2H,d,JAB=8)
7,16 (2H,d,J=8Hz) 7,17 (2H,d,J=8Hz) 6,89 (2H,d,JAB=8)
7,30 (2H,d,J=8Hz) 7,39 (2H,d,J = 8Hz) 7,25 (4H,d,JAB=8)
9,06 (1H,d,J=8Hz) 8,82 (1H,d,J=8Hz)
9,70 (3H, broad s) 11,60(1H,
broad s) 11,14(1 H,s) Aufgrund von weiteren Studien liessen sich die chemischen Strukturen der erfindungsgemäss erhältlichen Nocardicine, welche die obigen physikochemischen Eigenschaften aufweisen, identifizieren.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Nocardicine und deren Salze besitzen spezifische antibiotische Spektren, wobei sie eine Wirkung gegen pathogene Bakterien bei niedriger Toxizität besitzen. Daher sind die erfindungsgemäss erhältlichen Nocardicine und deren Salze für die Behandlung von Infektionskrankheiten, welche durch solche Bakterien bei Mensch und Tier verursacht werden, wertvoll.
Die pharmakologischen Teste einiger der erfindungsgemäss erhältlichen Nocardicine, d. h. antimikrobielle Teste und Toxizitätsteste, finden sich nachstehend.
Minimale Hemmkonzentration(M.I.C.)
Der M.l.C.-Test wurde durchgeführt unter Anwendung einer üblichen Agarverdünnungsmethode unter Verwendung von Herzinfusionsagar (oder Mueller Hinton-Agar), welches während 20 Stunden bei 37 C inkubiert wurde. M.I.C.-Wert wird als die minimale Konzentration von Nocardicin C, D, E oder F (mcglml) ausgedrückt, welche das Wachstum des Mikroorganismus verhindert. Die Resultate finden sich in der folgenden Tabelle 6.
Tabelle 6
Minimale Hemmkonzentration Testmikroorganismus M.l.C. (mcg/ml)
Nocardicin C* Nocardicin D** Nocardicin E*** Nocardicin F*** Staphylococcus aureus 209P > 800 > 800 > 400 > 400 Bacillus subtilis ATCC 6633 200 200 > 400 > 400 Escherichia coli NIHJ JC-2 400 50 > 400 > 400 Klebsiella pneumoniae NCTC 418 - 100 Proteus vulgaris IAM 1025 400 12,5 Salmonella enteritidis 1891 ¯ 50 Pseudomonas aeruginosa NCTC 1049 50 800 12,5 100 Shigella dysenteriae A-l ¯ 50 Bei Herzinfusionsagar(106 Zellen/ml) ** mit Herzinfusionsagar (108 Zellen/ml) mit mit Mueller Hinton-Agar (106 Zellen/ml) Akute Toxizität
Eine wässrige Natriumhydroxydlösung von Nocardicin C mit einem pH-Wert von 7,4 wurde intravenös
in jeweils fünf männlichen Mäusen vom ICR-Stamm und einem Gewicht von 18 bis 22 g (Dosis: 1 g/kg) injiziert, worauf man während 1 Woche nach der Verabreichung die Tiere beobachtete. Es ergab sich dabei, dass sämtliche getesteten Mäuse sich wäh- rend dieser Periode normal verhielten.
Ferner wurden jeweils wässrige Natriumhydroxydlösungen von Nocardicin D, E, F und G mit einem pH-Wert von 7,4 jeweils fünf Mäusen vom ICR-Stamm mit einem Gewicht von 18 bis 22 g (Dosis: 500 mg/kg) subkutan injiziert, und dann nach Ablauf von einer Woche nach Verabreichung wurden die Tiere beobachtet. Es ergab sich dabei, dass sich sämtliche getesteten Tiere während der ganzen Dauer normal verhielten.
Die neuen Nocardicine und die pharmazeutisch zulässigen Salze derselben lassen sich für die Verabreichung in beliebiger Weise formulieren, und zwar wie dies normalerweise bei bekannten Antibiotika der Fall ist, indem man ihnen einen pharmazeutischen Träger beimischt.
Pharmazeutisch zulässige Salze der erfindungsgemäss erhältlichen Nocardicine umfassen Salze mit anorganischen oder organischen Basen, z. B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Calciumhydroxyd, Ammoniak, Äthanolamin, Triäthylamin, Dicyclohexylamin und dergleichen.
Somit lassen sich die antimikrobiellen Präparate in Form von pharmazeutischen Formen, z. B. in fester, halbfester oder flüssiger Form, verwenden, wobei die Wirksubstanz mit einem pharmazeutischen, organischen oder anorganischen Trägermittel oder Füllstoff, welcher für die äussere, enterale oder parenterale Verabreichung geeignet ist, vermischt wird. Die Wirksubstanz kann beispielsweise mit üblichen Trägermitteln, wie sie für Tabletten, Kügelchen, Kapseln, Suppositorien, Lösungen, Emulsionen, Suspensionen usw. verwendet werden, compoundiert werden. Auch andere Formen mögen sich eig nen.
Als verwendbare Trägermittel kommen Wasser, Glucose
Lactose, Akaziengummi, Gelatine, Mannitol, Stärkepaste,
Magnesiumtrisilikat, Kalk, Maisstärke, Keratin, kolloidales Ki selgel, Kartoffelstärke, Harnstoff und andere Trägermittel, welche sich für die Herstellung solcher Präparate in fester, halbfester oder flüssiger Form eignen, in Frage. Solche Präparate können überdies Hilfsstoffe, Stabilisiermittel, Verdünnungsmittel und Färbemittel sowie Riechstoffe enthalten. Die antimikrobiellen Präparate können auch Schutzmittel oder bakteriostatische Mittel enthalten, um auf diese Weise die Wirksubstanz in den gewünschten Präparaten aktiv zu halten.
Die erfindungsgemäss erhältlichen Nocardicine oder deren Salze werden in einer solchen Menge in die antimikrobiellen Präparate eingearbeitet, welche ausreicht, um die gewünschte therapeutische Wirkung auf den bakteriell infizierten Prozess oder Zustand zu gewährleisten.
Will man die in Frage kommenden antimikrobiellen Präpa rate am Menschen anwenden, so wird man dies vorzugsweise in Form von intravenösen oder intramuskulären Injektionen tun. Dabei schwankt die Dosierung oder die therapeutisch wirksame Menge der neuen Nocardicine und deren Salze je nach Alter und Bedingung des einzelnen, zu behandelnden Patienten. Tägliche Dosierungen von ungefähr 2 bis 50 mg Wirksubstanz/kg Körpergewicht bei Mensch oder Tier werde allgemein für die Behandlung von Erkrankungen verwendet.
Die Nocardicine können auch als Zwischenprodukte für di Herstellung der anderen 3-Acylamino-1 < a-carboxy-t-hydroxy benzyl > 2-azetidinone mit besserer antimikrobieller Wirkung gegen pathogene, grampositive Bakterien verwendet werden.
Unter Bezugnahme auf einige der erfindungsgemäss erhältlichen Nocardicine sei die Herstellung von 3-Acylamino-lXa-ca boxy-4-hydroxybenzylS2-azetidionen aus den erfindungsgemä sen Nocardicinen mit dem folgenden Schema erläutert.
EMI8.1
EMI9.1
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung.
Beispiel 1 Herstellung von Nocardicin C
Ein wässriges Medium (100 ml), welches 2% Saccarose, 2% Baumwollsamenmehl, 1% getrocknete Hefe,2,18% KH2PO4 und 1,43% Na2HPO4.12H20 enthält, wurde jeweils in 20 500-ml Schüttelkolben gegossen und während 20 Minuten bei 120 "C sterilisiert. Dann wurde jedes Medium mit einer Öse voll Schrägkultur von Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 geimpft und hierauf während 48 Stunden bei 30 "C gezüchtet.
Andererseits wurde ein anderes wässriges Medium (100 Liter), welches 2% lösliche Stärke, 1% Pepton, 0,4% Hefeex trakte, 1% KH2PO4,1% Na2HPO4- 12H20,0,5% MgSO- 7H20, 0.1% L-Tyrosin und 0,1% Glycin enthält, durch Zugabe einer wässrigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt. 20 Liter des Mediums wurden in jeweils fünf 30-Liter-Fermentierbehälter gegossen und während 20 Minuten sterilisiert.
Jedes dieser Medien wurde mit der nach den obigen Angaben erhaltenen Samenkultur versetzt, und zwar in einer Menge von 2 Volumen-% Medium. Der Organismus wurde während 96 Stunden bei 30 "C wachsen gelassen. Während dieser Wachstumsperiode wurde die Brühe mit 250 Umdrehungen pro Minute gerührt und durch Einblasen von steriler Luft in einer Menge von 20 Litern pro Minute behandelt.
Die so erhaltene Kulturbrühe (80 Liter) wurde mit Hilfe von Diatomeenerde (8 kg) filtriert, wobei man einen Filterkuchen und ein Filtrat erhielt. Der Filterkuchen wurde mit 70%igem wässrigem Äthanol (20 Liter) versetzt und das Gemisch hierauf während 1 Stunde gerührt und filtriert. Diese Extraktion wurde zweimal wiederholt. Die vereinigten Extrakte (40 Liter) wurden auf ein Volumen von 2 Litern unter vermindertem Druck eingeengt.
Andererseits wurde das nach den obigen Angaben erhaltene Kulturfiltrat auf ein Volumen von 10 Litern eingeengt.
Dieses Konzentrat wurde hierauf mit 50 Liter Methanol unter Rühren versetzt, worauf man das Gemisch während 1 Stunde stehen liess und anschliessend filtrierte. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 2 Litern eingeengt.
Die vereinigten Konzentrate wurden durch Zugabe von 6n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und zweimal mit Äthylacetat (4 Liter) extrahiert. Die wässrige Schicht wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 1,8 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde mittels wässriger 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und hierauf durch eine mit Diaion HP20 (4 Liter) beschickte Säule hindurchgeleitet, um auf diese Weise eine ausfliessende Lösung zu erhalten. Anschliessend wurde die Säule mit Wasser gewaschen, wobei man Waschflüssigkeiten erhielt Die durch die Säule geflossene Lösung und die Waschflüssigkeiten wurden vereinigt und die wässrige Lösung (6 Liter) durch Zugabe einer wässrigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt.
Dann wurde diese Lösung mit 120 g Aktivkohle versetzt, worauf man das Gemisch während 10 Minuten rührte und hierauf filtrierte. Die Aktivkohle wurde mit 1 Liter Wasser ausgewaschen, worauf man 80%iges Methanol (1 Liter) hinzugab.
Das Gemisch wurde während 10 Minuten gerührt und filtriert. Der Eluierungsvorgang wurde einmal mehr wiederholt.
Die vereinigten Eluate (2 Liter) wurden auf ein Volumen von 10 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wurde hierauf mit 200 ml Methanol unter Rühren versetzt, worauf die unlöslichen Bestandteile aus dem Gemisch abfiltriert wurden. Das Filtrat wurde auf ein Volumen von 10 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde dann einer Säulenchromatographie über Cellulose (Ent wicklerlösungsmittel: obere Schicht einer Mischung von n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Mischungsverhältnis von 100 :5 :30) unterworfen. Das Eluat (500 ml), welches die gewünschte Verbindung enthielt, wurde gesammelt. Das Eluat wurde hierauf mit 500 ml n-Hexan versetzt und das Gemisch gerührt und hierauf die wässrige Schicht abgetrennt. Zu dieser wässrigen Schicht gab man 100 ml Äthylacetat und rührte dann das Gemisch. Die wässrige Schicht wurde hierauf abgetrennt und auf ein Volumen von 20 ml eingeengt.
Dieses Konzentrat wurde mit 40 ml Aceton versetzt und das Gemisch in einem Kühlschrank (5 "C) stehen gelassen, wobei sich Kristalle bildeten. Das Gemisch wurde filtriert, und die erhaltenen Kristalle wurden getrocknet, wobei man 26 mg Nocardicin C in Form von rohen Kristallen erhielt. Diese rohen Kristalle wurden in 4 ml Wasser gelöst und die Lösung mit 8 ml Aceton versetzt.
Das Gemisch wurde dann stehen gelassen, wobei sich Kristalle ausschieden. Diese wurden abgetrennt und getrocknet, wobei man Nocardicin C (15 mg) in Form von weissen Kristallen erhielt.
Beispiel 2 Herstellung von Nocardicin D
Ein wässriges Medium (100 ml), welches 2% Saccharose, 2% Baumwollsamenmehl, 1% getrocknete Hefe, 2,18% KH2PO4 ond 1 > 43% Na2HPO4- 12H20 enthielt, wurde in jeweils 20 500-ml-Schüttelkolben eingetragen und während 20 Minuten bei 120 "C sterilisiert. Dann wurde eine Öse voll Schrägkultur von Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 zwecks Impfung in jedes dieser Medien eingetragen, worauf die Züchtung während 48 Stunden bei 30 "C durchgeführt wurde.
Andererseits wurde ein wässriges Medium (100 Liter), welches 2% lösliche Stärke, 1% Pepton, 0,4% Hefeextrakte, 1% KH2PO4,1 1% Na2HPO4 - 12H20,0,5% MgSO - 7H2O, 0,1% L-Tyrosin und 0,1% Glycin enthielt, durch Zugabe von wässriger 6n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, worauf 20 Liter dieses Mediums in jeweils fünf Fermentierbehälter mit einem Fassungsvermögen von jeweils 30 Litern gegossen und während 20 Minuten bei 120 "C sterilisiert
Ein jedes dieser Medien wurde mit der Samenkultur, wie sie oben erhalten worden war, in einer Menge von 2 Volumen-% des Mediums versetzt. Der Organismus wurde während 96 Stunden bei 30 C wachsen gelassen.
Während der Wachstumsperiode wurde die Kulturbrühe mit 250 Umdrehungen pro Minute gerührt, wobei man gleichzeitig sterile Luft in einer Menge von 20 Litern pro Minute durchleitete.
80 Liter der so erhaltenen Kulturbrühe wurden dann mit 8 kg Diatomeenerde versetzt und das Gemisch anschliessend filtriert, wobei man zu einem Filtrat und einem Filterkuchen gelangte. Das Filtrat (70 Liter) wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 7 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde dann unter Rühren mit 90 Liter Methanol versetzt und das Gemisch anschliessend während 1 Stunde stehen gelassen und filtriert, um den Niederschlag zu entfernen. Das Filtrat (80 Liter) wurde auf ein Volumen von 5 Liter eingeengt. Dann wurde das Konzentrat mit 15 Litern Wasser und 1 kg Aktivkohle versetzt.
Das Gemisch wurde während 10 Minuten gerührt und filtriert, um die Aktivkohle zu gewinnen. Diese Aktivkohle wurde hierauf mit 10 Litern einer 80%igen wässrigen Methanollösung versetzt, worauf man den pH-Wert des Gemisches durch Zugabe von 5%iger wässriger Ammoniaklösung auf einen pH-Wert von 8,0 einstellte und das Gemisch während 10 Minuten rührte und hierauf filtrierte. Diese Eluierung wurde ein zweites Mal durchgeführt. Die vereinigten Filtrate wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 2 Litern eingeengt.
Das Konzentrat wurde durch Zugabe von 6n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und dann durch eine mit Diaion HP20 (4 Liter) beschickten Säule geleitet. Diese Säule wurde mit 4 Litern Wasser gewaschen, worauf man die gewünschte Verbindung mit 50%igem wässrigem Äthanol eluierte. Das Eluat (1,5 Liter), welches die gewünschte Verbindung enthielt, wurde gesammelt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 100 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde dann über Cellulose (Entwicklerlösungsmittel: mit Wasser gesättigtes n-Butanol) der Säulenchromatographie unterworfen. Das die gewünschte Verbindung enthaltende Eluat (200 ml) wurde gesammelt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 10 ml eingeengt.
Das Konzentrat wurde hierauf über Cellulose (Entwicklerlösungsmittel: obere Schicht einer Mischung von Äthylacetat, n-Butanol und Wasser im Mischungsverhältnis von 5 :5 :2) der Säulenchromatographie unterworfen. Das Eluat (100 ml), welches die gewünschte Verbindung enthielt, wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 10 ml eingeengt, wobei ein Niederschlag gebildet wurde, welcher durch Filtrieren und anschliessendes Trocknen gewonnen wurde. Der Niederschlag wurde in 5 ml Wasser suspendiert, worauf man die Suspension durch Zugabe einer wässrigen In-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,0 einstellte, um den Niederschlag zu lösen.
Die Lösung wurde durch Zugabe von 1 n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 angesäuert und dann über Nacht in einem Kühlschrank (5 "C) stehen gelassen, wobei sich Kristalle bildeten, die man hierauf durch Filtrieren isolierte. Diese Kristalle wurden hierauf getrocknet, wobei man 50 mg Nocardicin D in Form von weissen Kristallen erhielt
Der nach den obigen Angaben erhaltene, die Mycelien enthaltende Filterkuchen wurde zweimal mit 70%igem wässrigem Äthanol (20 Liter) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 2 Litern eingeengt. Das Konzentrat wurde durch Zugabe von 6n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und dreimal mit Äthylacetat (2 Liter) extrahiert, um die Verunreinigungen zu entfernen. Die wässrige Schicht wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck eingeengt.
Das Konzentrat wurde mittels wässriger 6n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und dann durch eine mit Diaion HP20 (2 Liter) beschickten Säule geleitet. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen, worauf die gewünschte Verbindung mit 50%igem Äthanol (1,5 Liter) eluiert wurde. Das Eluat (1,5 Liter) wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 100 ml eingeengt.
Der so erhaltene Rückstand wurde über Cellulose (Entwicklerlösungsmittel: mit Wasser gesättigtes n-Butanol) der Säulenchromatographie unterworfen. Das die gewünschte Verbindung enthaltende Eluat wurde gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde erneut über Cellulose (Entwicklerlösungsmittel: obere Schicht einer Mischung von Äthylacetat, n-Butanol und Wasser im Mischungsverhältnis von 5 :5 :2) der Säulenchromatographie unterworfen. Das die gewünschte Verbindung enthaltende Eluat wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 10 ml eingeengt, wobei man zu einem Niederschlag gelangte, welcher durch Filtrieren abgetrennt und hierauf getrocknet wurde.
Der Niederschlag wurde in 2 ml Wasser suspendiert und diese Suspension durch Zugabe einer wässrigen 1 n-Natri- umhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt, wodurch der Niederschlag gelöst wurde. Hierauf wurde die Lösung durch Zugabe von 1 n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt und über Nacht in einem Kühlschrank (5 "C) stehen gelassen, wobei sich Kristalle bildeten, welche durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet wurden. Auf diese Weise erhielt man 10 mg Nocardicin D in Form von weissen Kristallen.
Beispiel 3 Herstellung von Nocardicin E
Ein wässriges Medium (300 ml), welches 2% Saccharose, 2% Baumwollsamenmehl, 1% getrocknete Hefe, 2,18% KH2PO4 und 1,43% NaHPO'- zu 1 2H20 enthielt, wurde in einen 1Liter Erlenmeyerkolben eingetragen und während 20 Minuten bei 120 "C sterilisiert. Dann wurde mit einer Öse voll Schrägkultur von Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 geimpft und hierauf während 54 Stunden bei 30 "C gezüchtet.
Ein 500-Liter-Fermentierbehälter wurde mit dem gleichen Medium (150 Liter), wie es oben erwähnt worden ist, beschickt.
Das Fermentiermedium wurde während 20 Minuten bei 120 C sterilisiert und hierauf mit dem gesamten Volumen an vegetativem Inokulum, wie es nach den obigen Angaben erhalten worden ist, inokuliert und während 42 Stunden bei 30 "C gezüchtet.
Andererseits wurde ein wässriges Medium (3000 Liter), welches 2% lösliche Stärke, 1% Pepton, 0,4% Hefeextrakte, 1% KH2PO4, 1% Na2HPO4 1 2H20, 0,5% MgSO - 7H20, 0,1% L-Tyrosin und 0,1% Glycin enthielt, in einen 4000-Liter-Fermentierbehälter eingetragen und darin während 20 Minuten bei 120 OC sterilisiert. Dann wurde das Medium mit dem gesamten Volumen der nach den obigen Angaben erhaltenen Kulturbrühe geimpft.
Der Organismus wurde im Fermentiermedium während 119 Stunden bei 30 C wachsen gelassen. Während dieser Wachstumsperiode wurde die Kulturbrühe mit 230 Umdrehungen pro Minute gerührt, wobei man gleichzeitig sterile Luft durch die Brühe in einer Menge von 3000 Litern pro Minute hindurchleitete. Nach beendeter Züchtung wurde die Kulturbrühe mit Hilfe von Diatomeenerde (180 kg) filtriert. Zu einem Teil des Filtrats (1500 Liter) wurden 45 kg Aktivkohle zugegeben, worauf das Gemisch während 30 Minuten gerührt und filtriert wurde, um die Aktivkohle abzutrennen.
Die Aktivkohle wurde hierauf mit einer Mischung von Aceton und Wasser im Mischungsverhältnis 7 :3 (200 Liter) versetzt, worauf das erhaltene Gemisch durch Zugabe von wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und während 60 Minuten gerührt wurde. 500 Liter des so erhaltenen Eluats wurden auf ein Volumen von 50 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde durch Zugabe von 6n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 angesäuert. Anschliessend wurde das Konzentrat mit 60 Litern n-Butanol versetzt, worauf man das Gemisch während 30 Minuten rührte. Die n-Butanolschicht (50 Liter) wurde abgetrennt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 10 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde mittels 5%igem wässrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und während 30 Minuten gerührt.
Dann wurde die wässrige Schicht (15 Liter) abgetrennt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 1,3 Litern eingeengt. Das Konzentrat wurde durch Zugabe von 6n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt, mit 1,3 kg Diatomeenerde vermischt und hierauf getrocknet.
Das Pulver wurde mit 3 Liter Chloroform gewaschen und die gewünschte Verbindung mit Äthylacetat eluiert. Das Eluat (5 Liter) wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. Dann wurde das Konzentrat mit 50 g Diatomeenerde vermischt und getrocknet. Das Pulver wurde über Kieseläure (Entwicklerlösungsmittel: Äthylacetat) der Säurenchromatographie unterworfen. Das Eluat (600 ml) wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 10 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 10 g Diatomeenerde vermischt und getrocknet. Das Pulver wurde anschliessend über Kieselsäure (Entwicklerlösungsmittel: Mischung von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 100 :7) der Säulenchromatographie unterworfen. Das Eluat (200 ml) wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 3 ml eingeengt. Hierauf wurde das Konzentrat mit 3 g Diatomeenerde vermischt und getrocknet.
Das Pulver wurde über Kieselsäure (Entwicklerlösungsmittel: eine Mischung von Chloroform und Äthylacetat im Mischungsverhältnis von 1 der Säulenchromatographie unterworfen. Das Eluat (50 ml) wurde unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wurde in 1 ml Methanol gelöst. Diese
Lösung wurde anschliessend mit 5 ml Chloroform versetzt und bei 4 C über Nacht stehen gelassen, wobei sich 230 mg Kristalle bildeten, welche man aus einer Mischung von Methanol und Chloroform (1:5) (12 ml) umkristallisierte. Auf diese Weise erhielt man Nocardicin Ein einer Menge von 190 mg in Form von weissen Kristallen.
Beispiel 4 Herstellung von Nocardicin F
Ein wässriges Medium (100 ml), welches 2% Saccharose, 2% Baumwollsamenmehl, 1% getrocknete Hefe, 2,18% KH2PO4 und 1,43% Na2HPO4 - 12H20 enthielt, wurde in jeweils 24 500-ml-Sakaguchikolben gegossen und während 20 Minuten bei
120 "C sterilisiert. Dann wurde mit einer Öse voll Schrägkultur von Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 geimpft und der Organismus während 48 Stunden bei 30 "C gezüchtet.
Andererseits wurde ein wässriges Medium (20 Liter), welches 2% lösliche Stärke, 1% Pepton,0,4% Hefeextrakt, 1% KH2PO4, 1% Na2HPO4- 12H2O, 0,5% MgSO- 7H20,0,1%
L-Tyrosin und 0,1% Glycin enthielt in jeweils sechs 30-Liter-Fermentierbehälter gegossen und darin während 20 Minuten bei
120 "C sterilisiert. Hierauf wird die nach den obigen Angaben erhaltene Kulturbrühe zur Impfung in jedes der Medien in einem Verhältnis von 2 Volumen-% des Mediums hinzugegeben. Der Organismus wurde dann während 96 Stunden bei 30 "C im Medium wachsen gelassen. Während der Wachstumsperiode wurde die Brühe mit 250 Umdrehungen pro Minute gerührt und sterile Luft gleichzeitig mit einer Geschwindigkeit von 20 Liter pro Minute in die Brühe eingeleitet.
Nach beendeter Züchtung wurde die Kulturbrühe (100 Liter) durch Diatomeenerde kg) filtriert. Das Filtrat (90 Liter) wurde hierauf mit 1,5 kg Aktivkohle versetzt, worauf man das Gemisch wäh- rend 10 Minuten rührte und hierauf filtriere. Die Aktivkohle wurde zweimal mit Wasser (10 Liter) gewaschen und die gewünschte Verbindung zweimal mit 80%igem wässrigem Methanol (30 Liter bzw. 20 Liter) eluiert. Das Eluat (50 Liter) wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 6 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde durch Zugabe von 6n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und dann durch eine mit Diaion HP20 (3 Liter) beschickte Säule geleitet. Nach dem Waschen der Säule mit 1 Liter Wasser wurde die gewünschte Verbindung mit 40%igem Äthanol (8 Liter) eluiert.
Die Fraktionen (4 Liter), welche die gewünschte Verbindung enthielten, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 100 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit 300 g pulvriger Cellulose gemischt, worauf man das Gemisch unter vermindertem Druck trocknete. Das getrocknete Pulver wurde einer Säule zugeführt und darin mit Aceton (6 Liter) eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. Hierauf wurde es mit 50 g Diatomeenerde vermischt und das Gemisch getrocknet. Das getrocknete Gemisch wurde anschliessend in einer mit Kieselsäure beschickten Säule (Entwicklerlösungsmittel: ein Gemisch von Chloroform und Methanol im Mischungsverhältnis von 10:1) der Säulenchromatographie unterworfen. Die die gewünschte Verbindung enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft.
Der so erhaltene Rückstand wurde in 20 ml Methanol gelöst. Diese Lösung wurde mit 40 ml Wasser versetzt, worauf das Gemisch über Nacht bei 4 "C stehen gelassen wurde, wodurch sich ein Niederschlag (560 mg) bildete, der durch Filtrieren abgetrennt und hierauf in 10 ml Methanol gelöst wurde.
Zu dieser Lösung gab man 20 ml Wasser hinzu, worauf das Gemisch über Nacht bei 4 "C stehen gelassen wurde. Dabei bildeten sich Kristalle, die man abtrennte und trocknete, um,auf diese Weise Nocardicin F (300 mg) in Form von weissen Kristallen zu erhalten.
Beispiel 5 Herstellung von Nocardicin G
Ein wässriges Medium (100 ml), welches 2% Saccharose, 2% Baumwollsamenmehl, 1% getrocknete Hefe, 2,18% KH2PO4 und 1,43% NaHPO4- 12H20 enthielt, wurde in jeweils acht 500-ml-Schüttelkolben eingetragen und darin während 20 Minuten bei 120 "C sterilisiert Hierauf wurde mit einer Öse voll Schrägkultur von Nocardia uniformis subsp. tsuyamanensis ATCC 21806 jedes Medium angeimpft und der Organismus während 48 Stunden bei 30 "C gezüchtet.
Andererseits wurde ein anderes wässriges Medium (40 Liter), welches 2% lösliche Stärke, 2% Baumwollsamenmehl, 2% getrocknete Hefe, 2,18% KH2PO4, 1,43% NaHPO4- 12H2O, 0,5% MgSO- 7H20,0,1% L-Tyrosin und 0,1% Glycin enthielt, durch Zugabe einer wässrigen 6n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, worauf man 20 Liter des Mediums in zwei 30-Liter-Fermentierbehälter goss und wäh- rend 20 Minuten bei 120 "C sterilisierte. Ein jedes dieser Medien wurde mit der nach den obigen Angaben erhaltenen Samenkultur in einer Menge von 2 Volumen% des Mediums versetzt.
Der Organismus wurde während 96 Stunden bei 30 "C im Medium wachsen gelassen. Während dieses Wachstumszustandes wurde die Brühe mit einer Geschwindigkeit von 300 Umdrehungen pro Minute gerührt und sterile Luft gleichzeitig mit einer Geschwindigkeit von 20 Litern pro Minute in die Brühe eingeleitet.
Hierauf wurde die Kulturbrühe (35 Liter) durch Diatomeenerde (3,5 kg) hindurchfiltriert. Das Filtrat (30 Liter) wurde unter vermindertem Druck auf 3 Liter eingeengt. Das Konzentrat wurde hierauf unter Rühren mit 15 Liter Methanol versetzt, worauf man das Gemisch während 1 Stunde stehen liess.
Dabei bildete sich ein Niederschlag, welcher durch Filtrieren entfernt wurde. Das Filtrat (17 Liter) wurde unter vermindertem Druck auf 1 Liter eingeengt.
Sämtliche oben erwähnten Vorzüge wurden bei niedriger Temperatur von 4 "C durchgeführt.
Das Konzentrat wurde durch Zugabe von 6n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Dann wurde es mit 2 Liter Äthylacetat versetzt, worauf man das Gemisch während 10 Minuten rührte und die wässrige Schicht abtrennte. Zur wässrigen Schicht gab man 1,5 Liter n-Butanol und 250 g Natriumchlorid hinzu, worauf man das Gemisch während 10 Minuten rührte und die n-Butanolschicht abtrennte. Diese Extraktion wurde noch einmal wiederholt. Die vereinigten n-Butanolschichten (3 Liter) wurden mit 3 Liter n-Hexan versetzt, worauf man das Gemisch während 10 Minuten rührte und die wässrige Schicht (400 ml) abtrennte. Die wässrige Schicht wurde durch Zugabe einer wässrigen 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und dann unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 300 ml eingeengt.
Das Konzentrat wurde anschliessend mit 5 Liter Wasser und 50 g Natriumchlorid versetzt, worauf man das Gemisch durch Zugabe von I n-Salzsäure auf einen pH-Wert von 4,0 ansäuerte. Das Gemisch wird dann durch eine mit Diaion HP20 (2 Liter) beschickten Säule geleitet. Anschliessend wurde die gewünschte Verbindung mit 20 Liter Wasser aus der Säule eluiert. Das die gewünschte Verbindung enthaltende Eluat wurde gesammelt. Das Eluat wurde dann mit 60 g Na2HPO4 12H20 versetzt, worauf man das Gemisch mittels einer wässrigen 1 n-Natriumhydroxydlösung auf einen pH-Wf von 9,0 einstellte. Dann wird dieses Material in einer mit 700 X Diaion HP20 beschickten Säule der Säulenchromatographie unterworfen.
Die Säule wurde mit 1%iger wässriger Lösung von sek. Natriumphosphat (1 Liter) gewaschen. Anschliessen wurde das gewünschte Produkt mit 3 Liter Wasser eluiert. De Eluat (2 Liter), welches die gewünschte Verbindung enthielt, wurde gesammelt und dessen pH-Wert durch Zugabe von ln-Salzsäure auf 8,0 eingestellt. Hierauf wurde das ganze Mat rial durch eine mit 300 g Aktivkohle beschickte Säule geleitet Die Säule wurde anschliessend mit 1 Liter Wasser gewascher Hierauf wurde die gewünschte Verbindung mit 2 Liter 80%igem wässrigem Methanol eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 50 ml eingeengt.
Dann wurde das Konzentrat lyophilisiert, mit wenig Cellulose gemischt und schliesslich über Cellulose der Säulenchromato graphie unterworfen. Die Säule wurde mit mit Wasser gesätti tem n-Butanol entwickelt. 400 ml dieses Eluats, welches die gewünschte Verbindung enthielt, wurden gesammelt. Dieses Eluat wurde dann mit 400 ml n-Hexan versetzt, worauf man d Gemisch während 10 Minuten rührte und die wässrige Schicht (60 ml) abtrennte. Die wässrige Schicht wurde dann durch Zugabe einer wässrigen 1 n-Natriumhydroxydlösung auf eine pH-Wert von 5,0 gebracht und unter vermindertem Druck au ein Volumen von 30 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wurde dann über Nacht stehen gelassen, wobei sich Kristalle bildete die man abtrennte, mit wenig Wasser wusch, trocknete und hierauf umkristallisierte, um auf diese Weise Nocardicin G (1 mg) in Form von weissen Kristallen zu erhalten.