DE3422891A1 - Desacetyl-ravidomycin - Google Patents

Description

1A-4638 29,352

AMERICAN CYANAMID COMPANY Wayne, N. J., USA

Desacetyl-ravidomycin

Die vorliegende Erfindung "betrifft eine antibakterielle und Anti-Tumorverbindung sowie Verfahren zur Verwendung und Synthese dieser Verbindung. Die Erfindung betrifft insbesondere ein antibiotisches und antineoplastisches Mittel, das isoliert wurde aus einer neuen Species von Streptomyces, sowie dessen Verwendung bei der Behandlung von Infektionen und zur Inhibierung von Tumorwachstum.

Streptomyces, eine Familie der Ordnung Actinomycetales, sind gekennzeichnet durch stabiles, verzweigendes, faserartiges (filamentous) Wachstum und die Bildung von Luftmyzel mit Sporen. Streptomyces-Bakterien sind im Erdboden allgegenwärtig. Im Erdboden sind Streptomyces weitverbreitete Schmutzfresser, welche Proteine, Cellulose und organische Materien, wie Wachse, Gummi und Paraffin, abbauen.

Bis vor etwa 40 Jahren befaßten sich lediglich wenige Bodenmikrobiologen mit Streptomyces. Nachdem jedoch Actinomycin und anschließend Streptomycin isoliert wurden, hat man Streptomyces aus Bodenproben von überall auf der Welt hinsichtlich der Produktion von Antibiotika untersucht.

In jüngster Zeit gelang es, aus einer neuen Species von Streptomyces, nämlich Streptomyces ravidus NRRL 11 300, ein neues Antibiotikum zu isolieren. Dieses als Ravidomycin bekannte Antibiotikum ist beschrieben in der US-PS 4 230 692, ausgegeben am 28. Oktober 1980. Ravidomycin besitzt nicht nur antibakterielle Wirksamkeit, sondern weist auch eine Anti-Tumorwirksamkeit auf.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, antibakterielles und Anti-Tumormittel, nämlich Desacetyl-ravidomycin, sowie dessen Herstellung durch Fermentation, Verfahren zu seiner Isolierung und Konzentrierung aus rohen Lösungen sowie Verfahren zu seiner Reinigung.

Die Molekularstruktur von Desacetyl-ravidomycin ist in Fig. 1 dargestellt.

S - Mr-

OH

OCH₃

OCH₃

H-

Figur I

Ravidomycin ist in der US-PS 4 230 692, ausgegeben am 28.Oktober 1980, beschrieben. Die Molekularstruktur von Ravidomycin ist in Figur II dargestellt.

OCH₃

OCH₃

Figur II.

Desacetyl-ravidomycin bildet sich, wenn man unter kontrollierten Bedingungen eine neue Species von Streptomyces mit dem Namen Streptomyces olivaceo-griseus kultiviert. Die neue Substanz wurde mit LL-C23201 ψ bezeichnet und wird im folgenden als "Desacetyl-ravidomycin" bezeichnet.

Die neue, Antibiotikum_Aproduzierende Species Streptomyces olivaceo-griseus wurde als eine Luftverunreinigung isoliert bei Medical Research Division American Cyanamid Company, Pearl River, New York, und ist in der Kulturensammlung der obengenannten Medical Research Division als Kultur Nr. LL-C232O1 enthalten. Eine lebensfähige Kultur dieses neuen Mikroorganismus wurde bei Agricultural Research Culture Collection, Northern Reginal Research Center, U.S.Department of Agriculture, Peoria, Illinois, hinterlegt und in deren permanente Sammlung aufgenommen. Es erhielt die Stammbezeichnung NRRL 15357. Im folgenden wird dieser Mikroorganismus als NRRL 15357 bezeichnet. Von dem Anmelder der vorliegenden Anmeldung wurde eine Patentanmeldung eingereicht am

S. N. »in der diese neue Streptomyces-

Species beschrieben und beansprucht ist. Die Kultur ist während der Anhängigkeit dieser Anmeldung für berechtigte Dritte zugänglich nach den Bestimmungen des Commissioner of Patents and Trademarks gemäß 37 C.F.R. §1.14 und 35 U.S.C. §122. Alle Einschränkungen hinsichtlich des freien Zugangs zu der Kultur NRRL 15357 fallen unwiderruflich fort bei Erteilung eines Patents auf diese Anmeldung.

Die Kultur NRRL 15357 wurde taxonomisch charakterisiert und als eine neue Species der grau-sporigen Streptomyces, genannt Streptomyces olivaceo-griseus, identifiziert. Es wurden die kulturellen, physiologischen und morphologischen Merkmale der Kultur untersucht, und zwar gemäß den Methoden von E.B.Shirling und D.Gottlieb, Internat. J.Syst.Bacteriol., IjS, 313-340 (1966). Die bei diesen Untersuchungen verwendeten Medien wurden ausgewählt unter denen, wie sie von T.G.Pridham et al., Antibiotics Annual, Seiten 947-953 (1956/57), und R.E.Gordon et al.,

Internat.J.Syst.Bacteriol., 24, 54-63 (1974), für taxonomische Untersuchungen von Actinomycetes bzw. Bodenbakterien, wie Streptomyces, empfohlen werden. Die chemische Zusammensetzung der Zellwände der Kultur wurde bestimmt nach dem Verfahren von Lechevalier et al., ADV. Appl.Microbiol., 14, 47-72 (1971). Die Einzelheiten dieser Untersuchungen sind in den Tabellen I bis V zusammengestellt und eine allgemeine Beschreibung der Kultur wird nachstehend angegeben. Die unterstrichenen, beschreibenden Farben sind entnommen aus K.L.Kelly und D.B.Judd, Nat.Bur.Stand., Spec.Publ.440(1976), sowie den zugehörigen Farbtafeln (Inter-Society Color Council, National Bureau of Standards, Centroid Color Charts).

Das Isolat NRRL 15357 wurde mit einem geeigneten Bezugsstamm verglichen, und zwar mit Streptomyces ravidus NRRL 11300, einer Kultur, welche Ravidomycin produziert; siehe US-PS 4 230 692. Ein Vergleich des 14 Tage-Wachstums jeder dieser Kulturen auf Hickey-Tresner-Agar ist nachfolgend angegeben.

Kultur Sporenmassen-Farbe Lösliche Pig- Rückseimente tenfarbe

S.ravidus hellgrau rot gräulich NRRL 11300 rötlich

braun

S.olivoceo- hellgrau keine schwärzgriseus lich-

NRRL 15357 grün

Die grobe Kolonial-Morphologie von NRRL 15357 gleicht nicht der von S.ravidus, und es werden auch signifikante, physiologische Unterschiede beobachtet. S.ravidus reduziert Nitrate und nutzt Arabinose, wohingegen Mannit oder Saccharose nicht genutzt wird. Bei einer Literaturrecherche der jüngsten Streptomycetes-Literatur konnte keine beschriebene Species gefunden werden, welche

NRRL 15357 ähnlich ist. Folglich handelt es sich um eine neue Species, welche als Streptomyces olivaceo-griseus benannt wird.

Mikromo rpho Io gi e

Sporen bilden sich in gewendelten Ketten (Spira) auf Luftsporophoren von NRRL 15357. Die Sporen sind ovoid (etwa 1,5 bis 1,8 Mikron χ etwa 2,0 bis 2,5 Mikron) und die Oberfläche der reifen Sporen ist glatt, und zwar beobachtet mittels Rasterelektronen-Mikroskopie.

Zellwandzusammensetzung

Gesamtzellhydrolysate von kultiviertem NRRL 15357 enthalten das LL-Isomere von Diaminopimelinsäure. Damit gehört es in die Typ I Zellwandgruppe gemäß Lechevalier et al. (siebe oben). Dieser Sachverhalt ist typisch für alle Streptomyces-Species.

Wachstum von NRRL 15357

Auf den meisten Media wird ein gutes Wachstum beobachtet; auf Glycerin-Asparagin-Agar wird mäßiges Wachstum beobachtet; auf Weizenmehl-Agar wird schlechtes Wachstum beobachtet und auf Tomatenpaste-Weizenmehl-Agar wird kein Wachstum beobachtet.

Luftmyzel und Sporenfarbe

Das Luftmyzel ist auf den meisten Media weiß, wird jedoch auf anorganischen Salzen-Stärke-Agar rosa getönt. Die Farbe der Sporenmasse ist 264 light gray.

Lösliche Pigmente

Auf vielen Medien nicht vorhanden; es werden bräunliche Schattierungen gebildet.

Rückseitenfarbe

Auf allen Medien grünlich-schwarzebis oliv-schwarze Schattierungen.

Physiologische Reaktionen

Nitrate werden innerhalb von 14 Tagen nicht zu Nitriten reduziert; keine Verflüssigung von Gelatine innerhalb von 14 Tagen; kein schwarzes Pigment (Melanin) bildet sich, und zwar weder auf Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar noch auf Tyrosin-Agar; starke Peptonisierung von Lackmusmilch innerhalb von 14 Tagen. Kohlenwasserstoff-Nutzung gemäß der Methode von T.G.Pridham und D.Gottlieb, J.Bacteriol., £6, 107-144 (1948): gute Nutzung von Glucose; mäßige Nutzung von Fructose und Inosit; geringe Nutzung von Galactose, Mannit, Saccharose und Xylose; keine Nutzung von Arabinose, Raffinose, Rhamnose oder Salicin. Es werden mehrere organische Säuren als einzige Kohlenstoffquellen untersucht: Citrat, Malat und Succinat werden stark genutzt; Lactat wird schwach genutzt; und Benzoat, Mucat und Oxalat werden nicht genutzt. Adenin, Hypoxanthin und Tyrosin werden innerhalb von 14 Tagen hydrolysiert, während Guanin und Xanthin nicht hydrolysiert wurden.

Tabelle I Kulturelle Charakteristikct von Streptomyces olivaceo-griseus NRRL-15357

Inkubation: 14 Tage

Medium

Wachstum

Luftmyzel und/oder Sporen Temperatur: etwa 28 C

Lösliches Rückseiten-Pigment farbe

Glycerin-Aspara- mäßig
gin-Agar

Hickey-Tresner-Agar

anorganische SaI-ze-Stärke-Agar

NZ-Amine^-Glucose-Stärke-Agar

Weizenmehl-Agar

Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar

relativ flach,wachsartiges Wachstum ohne Luftmyzel{Wachstum 77. moderate yellowish brown

gut erhabene,wachsartige Kolonien mit PIikatzentren;vegetatives Wachstum 152. blackish green;sehr wenig Luftmyzel oder Sporenbildung;Sporen 264.light gray

mäßig geringfügig erhabene,wachsartige KoIobis nien;11ü. grayish olive bis 114.olive gut black, wird in sporulierenden Bereichen pulvrig; Luftmyzel weiß bis 28.light grayish pink in Bereichen; Sporen 264. light gray

gut erhabenes,gratbildendes Wachstum;vegetatives Myzel 157.greenish black;starke Bildung von Luftmyzel und Sporen; Sporen 264.light gray

schlecht flach,stumpfes Wachstum ohne Luftmyzel; vegetatives Myzel 90.grayish yellow bis 112.light olive gray

gut erhabene,gratbild.Kolonien mit starker Sporulation;vegetatives Myzel 114.olive black;Sporenmasse 264. light gray bräunlich grünlichschwarz

keines

keines

schwärzlich grün

bräunlich grünlichschwarz

keines

braun

olive-schwarz

Tabelle II Mikromorphologie von Streptomyces olivaceo-firiseus NRRL-15357

Medium Luftmyzel und/oder sporifere Stmikturen Sporen- Sporengröße Sporenober-

form fläche

anorgani- Sporenketten erheben sich in Form ge- ovoid etwa 1,5-1,8 Mikron glatt
sehe SaI- wendelter Ketten aus dem Luftmyzel χ

ze-Stärke- (Spira) etwa 2,0-2,5 Mikron

//2

Tabelle III

Physiologische Reaktion von Streptomyces olivaceogriseus NRRL 15357

Medium

Inkubations zeit (Tage)

Wachstum Physiologische Reaktion

Pepton-Eisen- Agar	7 14	gut gut	keine Schwärzung keine Schwärzung
Tyrosin-Agar (ISP-7)	7 14	gut gut	keine Schwärzung grünlich-schwarzes Pigment
Lackmusmilch	7 14	gut gut	geringe Proteolyse starke Proteolyse
Nährgelatine	7 14	gering gering	keine Proteolyse keine Proteolyse
Nitratbrühe	7 14	gut gut	keine Reduktion keine Reduktion
Adenin-Agar	7 14	gut gut	starke Hydrolyse starke Hydrolyse
Guanin-Agar	7 14	gut gut	keine Hydrolyse keine Hydrolyse
Hypoxanthin- Agar	7 14	gut gut	keine Hydrolyse starke Hydrolyse
Tyrosin-Agar	7 14	gut gut	keine Hydrolyse schwache Hydrolyse
Xanthin-Agar	7 14	gut gut	keine Hydrolyse keine Hydrolyse

	Inkubation: 14 Tage	sriseus NRRL 15357
	Kohlenstoffquelle	Temperatur: etwa 280C
	1-Arabinose	Nutzung
/3 34228!	Fructose	0
- JM* -	d-Galactose	2
Tabelle IV	d-Glucose	1
Kohlenstoffquellen-Nutzung von Streptomyces olivaceo-	i-Inosit	3
l	d-Mannit	2
d-Raffinose	1
1-Rhamnose	0.
Sallcin	0
Saccharose	0
Xylose	1
negative Kontrolle	1
0

3 = gute Nutzung

2 = mäßige Nutzung

1 = schlechte Nutzung

Ö = keine Nutzung

Tabelle V

Nutzung organischer Säuren durch Streptomyces olivaceogriseus NRRL 15357 auf Gordon's Modifikation von Koser's Basal Agar (Koser's Citrat Agar)
Inkubation: 14 Tage Temperatur: etwa 28⁰C

Kohlenstoff quelle Nutzung

Benzoat

Citrat +

Lactat +

Malat +

Muzinsäure

Oxalat

Succinat +

-: keine Nutzung; +: starke Nutzung; +: etwas Nutzung

Es sei darauf hingewiesen, daß zur Erzeugung dieses antibakteriellen und Anti-Tumormittels die vorliegende Erfindung nicht auf den speziellen Streptomyces-Organismus, der mit NRRL 15357 bezeichnet ist, oder auf einen Organismus, welcher vollständig den oben angegebenen Wachstums- bzw. mikroskopischen Charäkteristika entspricht, beschränkt ist. Diese Angaben erfolgen lediglich zum Zwecke der Erläuterung. Von der Erfindung umfaßt sind, soweit sie zur Bildung von Desacetyl-ravidomycin in der Lage sind, die natürlichen Mutanten des mit NRRL 15357 bezeichneten Organismus sowie Mutanten, die daraus auf verschiedene Weise erzeugt werden können, z.B. durch Behandlung mit Röntgenstrahlen, ultravioletter Bestrahlung, Stickstoffmustard (Senfgas), Actinophagen und dergl.

Das antibakterielle und Anti-Tumormittel Desacetylravidomycin ist in vitro gegen eine Vielzahl von grampositiven Bakterien und Neoplasmen wirksam.

Das in vitro-antibakterielle Spektrum von Desacetyl ravidomycin wird bestimmt mittels des Agarplatten-Verdünnungsverfahrens mit Mueller-Hinton-Agar und einem Inoku-Ium des jeweiligen Testorganismus von etwa 10 koloniebildenden Einheiten, die durch eine Steers Replikationsvorrichtung geliefert werden. Die minimale Hemmkonzentration wird definiert als die niedrigste Konzentration an Desacetyl ravidomycin, weiche das sichtbare Wachstum nach etwa 18 Tagen Inkubation bei etwa 35⁰C inhibiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI angegeben.

Staphylococcus	aureus	Smith
η	π	LL Nr.14 ·
η	Il	LL Nr.27
η	π	LL Nr.45
η	η	ATCC 25923

- VS -

Tabelle VI Antibakterielles Spektrum von Desacetvl ravidomvcin Grampositive Bakterien Minimale Hemmkonzentra-

tion (mcg/ml)

*· 0,25 * 0,25

0,5

0,5

0,5

Staphylococcus epidermidis gmc-83-56 1

η » ATCC 12228 0,5

Streptococcus faecalis ATCC 29212 ^ 0,25 Streptococcus mutans ATCC 27352 1 Streptococcus sanguis G9B(a) - 0,25 Streptococcus(Enterococcus)sp OSU-75-

1 ^ 0,25 " « SM-77-15 * 0,25

Micrococcus luteus PCI 1001 ^ 0,25 Bacillus subtilis ATCC 6633 * 0,25 Bacillus cereus PCI 213

Vom National Cancer Institute wurden verschiedene in vivo-Testsysteme und Protokolle entwickelt zur Untersuchung von Verbindungen, um deren Eignung als antineoplastische Mittel zu bestimmen. Diese Testsysteme sind beschrieben in "Cancer Chemotherapy Reports", Teil III, Band 3, Nr.2 (1972), von Deran et al.. Diese Protokolle sind als standardisierte Screeningstests (Auswahlkriterien) entwickelt und eingeführt worden, und nach ihnen wird auf dem Gebiet der Ermittlung von Anti-Tumormitteln allgemein verfahren. Unter diesen Systemen sind lymphozytische Leukämie P388 und melanotisches Melanom B₁^ für die vorliegende Erfindung besonders signifikant. Derartige Neoplasmen findet man in Mäusen· Im allgemeinen kann aufgrund einer guten Anti-Tumorwirkung, wie sie sich anhand dieser Protokolle durch eine prozentuale Zunahme der mittleren Überlebenszeit von behandelten Tieren (T) gegenüber den Kontrolltieren (C) zeigt, ein ähnliches Ergebnis bei Human-Leukämie vorhergesagt werden. Id.

Die Verbindung Desacetyl-ravidomycin besitzt die Eigenschaft, das Wachstum von transplantierten Mäusetumoren zu inhibieren. Dies wird durch die folgenden Tests belegt.

Lymphozytische Leukämie P388-Test

Es werden BDF₁-MaUSe als Versuchstiere verwendet, die alle vom gleichen Geschlecht sind,mindestens etwa 17 g wiegen und alle in einem Gewichtsbereich von etwa 3 g liegen. Pro Testgruppe werden 5 oder 6 Mäuse verwendet. Die Tumorübertragung erfolgt durch intraperitoneale Injektion von etwa 0,5 ml verdünnter ascitischer Flüssigkeit mit einem Gehalt an etwa 10 Zellen lymphozytischer Leukämie P388. Die Testverbindungen werden intraperitoneal verabreicht, und zwar mit einem Volumen von etwa 0,5 ml in etwa 0,2% Klucel in normaler Salzlösung an den Tagen 1, 5 und 9, bezogen auf die Tumor-Einimpfung, mit den angegebenen Dosismengen. Die Mäuse werden während 30 Tagen regelmäßig gewogen und die überlebenden Tiere werden festgestellt. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle VII zusammengestellt.

Tabelle VII

Desacetyl-ravidomycin und Ravidomycin-Aktivität gegen P388 Leukämie bei Mäusen

Verbindung Dosis Mittlere¹ T/C x100

(mg/kg) Überle- % benszeit (Tage)

Desacetyl-ravidomycin 25 20,5 174

(Test Nr. 1) 12 19,5 165

6 17,5 148

3 15,5 131

Kontrolle - 11,8

1,4-Dihydroxy-5,8-bis[[2-(2-

hydroxyethylamino)-ethyl]-ami-

no j-anthrachinon-dihydrochlorid

(nachstehend "Positivkontrolle¹¹

genannt) 1,6 18,2 >154

Tabelle VII (Forts.) Desacetyl-ravidomycin (Test Nr. 2)

Kontrolle Positivkontrolle

25 6

1,6 0,4

0,4

16,5
14
12,5
10,5

9
14

183 156 139 117

156

Ravidomycin-hydrochlorid

Kontrolle Positivkontrolle

50

25

12

1,6

20,5

17

12

12

11,8
18,2

178 174 144 102 102

>154

Ravidomycin

Kontrolle Positivkontrolle

400

100

25

1,6

0,4

16

17,5

14

10

10

9
14

178 194 156 111 111

156

Melanotisches Melanom Bi6-Test

Es werden BDF₁-Mäuse als Versuchstiere verwendet, und zwar alle vom gleichen Geschlecht, mit einem Mindestgewicht von etwa 17 g und alle in einem Gewichtsbereich von etwa 3 g. Normalerweise sind 6 Tiere in jeder Testgruppe. Eine etwa 1 g Portion von melanotischem Melanom Bi6-Tumor wird in etwa 10 ml kalter, ausgewogener Salzlösung homogenisiert und etwa 0,5 ml aliquote Mengen des Homogenats werden jeder Testmaus intraperitoneal implantiert. Die Testverbindungen werden intraperitoneal verabreicht, und zwar an den Tagen 1 bis einschließlich (bezogen auf die Tumor-Inokulation) mit verschiedenen Dosismengen. Die Mäuse werden während 60 Tagen regelmäßig gewogen und Überlebende werden festgestellt. Die mittlere Überlebenszeit und das Verhältnis von Überlebenszeit der behandelten (T) zu Kontroll(C)-Mäusen wird berechnet.

Die positive Kontrollverbindung ist die gleiche, wie sie bei dem P388-Test verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII angegeben, und zwar im Vergleich mit Ravidomycin.

Tabelle VIII

Desacetyl-ravidomycin und Ravidomycin-Aktivität gegen

B16 Melanom bei Mäusen

Verbindung

Dosis Mittl. T/C χ 100 (mg/kg) Überle- %

benszeit (Tage)

Desacetyl-ravidomycin

Kontrolle
Positivkontrolle

12 3 0 0	,8 ,2	38 32 29,5 26	184 155 143 126
-		20,7
0	,8	>39	>190
12 3 0 0	,8 ,2	39 32 27,5 23,5	188 155 133 114
-		20,7	-
0	,8	>39	>190

Ravidomycin-hydrochlorid

Kontrolle
Positivkontrolle

Allgemeine Fermentationsbedingungen

Die Kultivierung von Streptomyces olivaceo-griseus NRRL 15357 kann in einer großen Vielzahl von flüssigen Kulturmedien durchgeführt werden. Brauchbare Medien zur Herstellung von Desacetyl-racidomycin umfassen eine assimilierbare Quelle von Kohlenstoff, wie Stärke, Zucker, Melasse, Glycerin und dergl.; eine assimilierbare Quelle von Stickstoff, wie Protein, Proteinhydrolysat, Polypeptide, Aminosäuren, Maisquellwasser und dergl.; und anorganische Anionen und Kationen, wie Kalium, Natrium, Ammonium, Calcium, Sulfat, Carbonat, Phosphat, Chlorid und dergl. Spurenelemente, wie Bor, Molybdän, Kupfer und

dergl., werden in Form von Verunreinigungen der anderen Bestandteile der Medien zugeführt. Die Belüftung in Tanks und Flaschen erfolgt, indem man sterile Luft durch das fermentierende Medium hindurchleitet oder auf die Oberfläche desselben aufpreßt. Eine weitere Bewegung in den Tanks erfolgt durch einen mechanischen Rührer. Gegebenenfalls kann ein Antischaummittel, wie Specköl (lard oil), zugesetzt werden.

Allgemeines Verfahren zur Isolierung von Desacetyl ravidomycin

Desacetyl ravidomycin wird aus der Fermentationsmaische isoliert durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Dichlormethan, Konzentrierung des Extrakts und Chromatographie dieses Extrakts auf einer Silikagelsäule unter Eluierung mit einem geeigneten Lösungsmittelsystem.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von speziellen Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1

Inokulum-HerstellunK	gemäß der folgenden Formulie-
Ein Inokulum-Medium wird
rung hergestellt:	JL
	etwa 0,3
Rinderextrakt	11 0,5
Tryptose	" 1,0
Dextrose	" 0,5
Hefeextrakt	100
Wasser αso

Dieses Medium wird auf einen pH von etwa 6,8 eingestellt und nachfolgend sterilisiert. Etwa 50 ml dieses Mediums werden in eine 250 ml-Flasche gegeben und mit abgekratz-

tem Myzel von einem Agarslant (geneigte Agarplatte) der Kultur Streptomyces olivaceo-griseus (NRRL 15357) inoku liert. Die Flasche wird etwa 48 bis 72 h bei etwa 32⁰C auf einer Drehschüttelvorrichtung bei etwa 180 bis 220 U/min inkubiert.

Beispiel 2

Fermentation

Es wird ein Fermentationsmedium der folgenden Formulie rung hergestellt:

JL

Glucose etwa 1,5 Glycerin " 1,5

Sojabohnenmehl " 1,5

Calciumcarbonat "0,1

Natriumchlorid ⁿ 0,1 Wasser qsp 100

Das Medium, das vor der Sterilisation auf einen pH von etwa 6,7 eingestellt wurde, wird in etwa 100 ml aliquoten Mengen auf 500 ml Erlenmeyerkolben verteilt. Die Kolben werden anschließend sterilisiert und mit etwa 5,0 ml des Inokulums inokuliert, das gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde. Die Fermentierung wird 6 Tage bei etwa 28⁰C durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt wird die Maische geerntet. Diese Maische enthält etwa 10 mcg/ml Desacetyl ravidomycin.

Beispiel 3 Fermentation mit definiertem Medium

Es wird ein Fermentationsmedium der folgenden Formulie'-rung hergestellt:

U	Natriumnitrat	etwa	1	3422891	JL
	Eisen(II)-sulfat-heptahydrat	η	0,1
Magne s iumsulfat-heptahydrat	η	0,01
Calciumcarbonat	π	0,02
Dextrose	η	0,5
Natriumacetat	η	1,5
Wasser qsp	0,25
	00

Das vor der Sterilisation auf einen pH von etwa 7,2 eingestellte Medium wird in etwa 100 ml aliquoten Mengen auf 500 ml Erlenmeyerkolben verteilt. Die Kolben werden sterilisiert und nachfolgend mit etwa 50 ml des in Beispiel 1 beschriebenen Inokulums inokuliert. Die Fermentation wird 6 Tage bei etwa 28⁰C durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt wird die Maische geerntet. Diese Maische enthielt etwa 5 mcg/ml Desacetyl ravidomycin.

Beispiel 4 Isolierung von Desacetvl ravidomvcin

Die 1 1 Menge der geernteten Maische von Beispiel 2 wird zweimal mit etwa 500 ml Portionen Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethan-Extrakte werden vereinigt, zentrifugiert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und nachfolgend im Vakuum bei etwa 35⁰C eingedampft. Der Rückstand wird aufgelöst in etwa 2 ml Ethanol/Dichlormethan (1/1) und auf eine 15 x 400 mm Säule gegeben, die 40 g Silikagel, gepackt mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch, enthält. Die Säule wird mit der gleichen Lösungsmittelmischung entwickelt, und zwar mit einer Rate von etwa 2 bis 3 ml/min. Die Fraktionen werden in Intervallen von etwa 12 min gesammelt. Die Fraktionen 15 bis 26 werden vereinigt und eingedampft. Man erhält etwa 8,5 mg Desacetyl ravidomycin.

Desacetyl ravidomycin kann für sich allein oder in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verabreicht oder angewandt werden. Selbstverständlich sollte jedes Material, das als derartiger Träger verwendet wird, rein sein, in den verwendeten Mengen im wesentlichen nicht toxisch sein und die biologische Aktivität von Desacetyl ravidomycin nicht beeinträchtigen.

Claims (6)

1. Patentansprüche
2. 2. Verfahren zur Inhibierung des Tumorwachstums bei Warmblütern, dadurch gekennzeichnet, daß man den Warmblütern eine wirksame Menge einer Verbindung der folgenden Formel verabreicht

   OH OCH₃

   OCH₃
3. 3. Verfahren zur Behandlung bakterieller Infektionen bei Warmblütern, dadurch gekennzeichnet, daß man den Warmblütern eine wirksame Menge einer Verbindung der folgenden Formel verabreicht

   OCH₃
4. 4. Verfahren zur Herstellung von Desacetyl ravidomycin, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces olivaceo-griseus NRRL 15357 in einem flüssigen Medium, das assimilierbare Quellen von Kohlenstoff, Stickstoff und anorganischen Salzen enthält, kultiviert, bis wesentliche Mengen an Desacetyl-ravidomycin in dem Medium vorhanden sind.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivierung etwa 4 bis 6 Tage bei etwa 24 bis 32⁰C durchführt.
6. 6. Pharmazeutisches Mittel, umfassend eine Verbindung der folgenden Formel

   OH OCH₃

   OCH₃

   CH

   und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.