CN1088983A - 产生抗寄生化合物的链霉菌属菌株及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种新的微生物，Streptomyces avermitilis黑色亚种NRRL 21005，以及使用该微生 物制备已知的阿凡曼菌素和ivermectin的方法。

Description

阿凡曼菌素类（avermectins）是具有抗寄生作用的有关试剂的一种复合物，已知可通过Streptomyces  avermitilis菌株ATCC  31267、31271和31272需氧发酵而制备。如见美国专利US  4，310，519和4，429，042。上述后两种菌株分别表示将S.avermitilis  ATCC  NO.31267经紫外线照射而获得的冷冻小瓶和冻干试管的培养物。
上述美国专利提到的S.avermitilis菌株可产生一组一般称为C-076的物质（阿凡曼菌素类，以下称式I）。该组物质包括8种不同的但十分相关的化合物，称为阿凡曼菌素A1a、A1b、A2a、A2b、B1b、B2a、B2b。“a”系列化合物指25位取代基为（S）-仲丁基的天然阿凡曼菌素，“b”系列是25位取代基为异丙基的天然阿凡曼菌素。“A”和“B”分别指其中的5位取代基是甲氧基或羟基的阿凡曼菌素。数字“1”指22-23位存在双键的阿凡曼菌素，数字“2”指的是其中在22位是氢而在23位上是羟基的阿凡曼菌素。
因此，阿凡曼菌素是式1的化合物：
Figure 931152941_IMG1
其中：
断线表示单键或双键;
R1是H或羟基，而当所述断线是单键时只能存在羟基;
R2是异丙基或仲丁基;
R3是甲氧基或羟基。
已知其它的S.avermitilis菌株可产生一种或多种已知的或“天然的”avermectins，其中的25位取代基或者是异丙基或者是（S）-仲丁基（1-甲丙基），或“非天然的”avermectins，其中25位取代基不是异丙基或（S）-仲丁基。例如，公开在US  4，378，353中的S.avermitilis  ATCC  31780;公开在欧洲专利申请（EP）276131中的ATCC  53567和ATCC  53568;EP  276103中的ATCC  53692;以及EP214731中所述的NCIB  12121。然而，这些S.avermitilis菌株中的每一个均是S.avermitilis  ATCC  31267菌株的直接或间接的子代。因此，能产生一种或多种阿凡曼菌素化合物的上述S.avermitilis菌株只包括亲株及其子代。
另一种S.avermitilis菌株，ATCC  53814，公开在US  5，015，662中。该菌株可通过它具有生物转化一系列milbemycin类型化合物的能力，而不能产生大量的阿凡曼菌素来识别。
本发明提供了一种新的产生阿凡曼菌素菌株，S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005。本发明还提供了使用S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005制备阿凡曼菌素的新方法。
本发明涉及微生物S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005的生物纯培养物，或其产生阿凡曼菌素的突变体或变异体。
本发明还涉及制备一种或多种阿凡曼菌素的方法，该方法包括在浸没需氧条件下，在含有碳、氮和无机盐的可同化源的水液培养基中培育S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005，或其产生阿凡曼菌素的突变体或变异体，直至产生一种或多种阿凡曼菌素并收集。
图1示出了S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005（A58267.2）和其他S.avermitilis种的树状图。
图2为从脂肪酸分析得出的表明A58267.2和S.avermitilis种之间相互关系的主要组分区。
本发明的一个方面是关于微生物S.avermitilis亚种黑色NRRL  21005（NRRL  21005菌株）的生物纯培养物，或其产生阿凡曼菌素的突变体或变异体。
本发明的产生阿凡曼菌素的新的微生物为了方便也称作培养物A58267.2。它是培养物A58267.21的改进的菌株，培养物A58267.21是培养物A58267的天然变异体。培养物A58267是从意大利收集的土壤试样中分离出的。
按照布达佩斯条约，已将培养物A58267.2保藏，并已成为指定保藏号NRRL  21005的the  Northern  Regional  Research  Center，Agricultural  Research  Service，North  Central  Region，Unit-ed  states  Department  of  Agriculture，1815  North  University  Street，Peoria，Illinois  61604的原种培养物部分。任何这种专利申请授权的整个有效期限内，可保证保藏在Northern  Regional  Research  Center（在Peoria，Illinois）的该培养物的稳定不变，而且公众易于得到该培养物。在本申请待批期间内，在37℃.F.R§1.14和35  U.S.C.§112条款条件下可以得到该培养物。一旦该专利被批准，对公众获得培养物的所有限制则将最后被取消。
Frederrick  P.Mertz（the  Lilly  Research  Laboratories）进行了A52867.2（NRRL  21005）的分类学研究。基于这些研究，该新微生物被分类为该属的新亚种（菌株）和S.avermitilis种，提议将它们命名为S.avermitilis黑色亚种。这种分类基于公开说明的类似物种的实验室直接分类法和检验法。
使用方法
使用由the  International  Streptomyces  Prjeet（ISP）推荐的用于鉴定链霉菌属种的方法来进行分类学研究[Shirling，E.B.and  Gottlieb.D.，“鉴定链霉菌属种的方法”，Int.J.Syst。Bacter-ial，16：313-340（1966）]以及被推荐用于鉴定诺卡氏菌种的方法[Gordon  R.E.，Barnett，D.A.，Handerhan，J.E.，and  Pang，C.H.，“Nocardia  Coeliaca，Nocardia  antotrophica，and  the  Nocardin  Strain”，Int，I.Syst.Bacteriol.，24（1）：54-63（1974）]。
使用ISCC-NBS  Centroid  Color  Charts，标准品No.2106（National  Bureau  of  Standards，1958，U.S.Department  of  Commerce，Washington，D.C.）来命名颜色。
用光学显微镜和扫描电镜（SEM）来进行形态学研究。
用Becker等人[“Rapid  Differentiation  between  Nocardia  and  Streptomyces  by  paper  Chromatography  of  Whole-Cell  Hydroly  sates”，Appl.Microbiol，12：421-423（1964）]和Lecheraliver等人[A  University  Laboratory  Approach，Dietz  and  Thayer（eds.），Society  for  Industrial  Microbiology，Special  Publication  NO.6，Arlington，Virginia，PP.227-233]的色谱法证实全细胞水解物中的二氨基庚二酸（DAP）和碳水化合物的异构体。
通过将抗生素敏感盘置于接种ISP  NO.2琼脂平板上而测量抗生素抗性。当观察到不存在抑制作用区时，则抗性记作（+），当观察到存在抑制作用区时，则抗性记作（-）。
按照Kroppenstedt，R.M.[“Chemical  Methods  in  Bacterial  Systematics”，M.Goodfellow  and  D.E.Minnikin（eds），PP.173-196（1985）]和Collins，M.D.[id.PP.267-285]的方法确定甲基萘醌类组合物。
用HP5898A  Microbial  Identification  System（Miller，L.等人，“Bacterial  Identification  by  Gas  Chromatography  ofWhole-Cell  Fatty  Acids”，Hewlett  Packard  Application  Note228-41，PP8（1985）]方法进行脂肪酸分析。
脂肪酸甲酯由在相同条件下生长的冻干的全细胞制得。
通过将NaCl加到ISP  NO.2琼脂中以达到所需浓度来测量NaCl耐性。
图1中所示的树状图是基于Euclidean距离，并且是由计算机作出的。
图2所示的主要组分分析是二维的，也是由计算机作出的。
培养物特征
培养物A58267.2在多数培养基上不能很好地生长，并且在复合或限制培养基上不产生气生菌丝。在Bennetts琼脂上生长时除了产生特有的黑色色素外，反侧的颜色是黄褐色。在ISP培养基2中产生淡亮褐色可溶颜料，在Bennetts琼脂中产生带淡红褐色的可溶色素。表一表示了这些培养物的特征。
表1 A58267.2[1]的培养物特征
培养基  生长  反侧  气生  气生  可溶性
状况  颜色  生长  颜色  色素
ISP培养基2  好  80.gy.yBr.  无  无  淡褐
ISP培养基3  不好  78.d.yBr.  无  无  无
ISP培养基4  一般  93.y.Gray  无  无  无
ISP培养基5  无  无  无  无  无
ATCC培养基172  无  78.d.yBr  无  无  无
Bennetts琼脂  丰富  65.br.Blk  无  无  淡红-褐
苹果酸钙  不好  90.gy.Y.  无  无  无
棉籽琼脂  一般  91.d.gy.Y  无  无  无
察氏(Czapeks)  无  无  无  无  无
培养基
葡糖-天冬酰胺  无  无  无  无  无
甘油-甘氨酸  无  无  无  无  无
腐殖酸琼脂  无  无  无  无  无
NPBM[2]丰富 78.d.yBr 无 无 无
营养琼脂  不好  91.d.gy.Y  无  无  无
淀粉酪蛋白琼脂  一般  91.d.gy.Y  无  无  无
蕃茄浆燕麦粉  无  无  无  无  无
自来水琼脂  无  无  无  无  无
酵母-葡萄糖琼脂  丰富  90.gy.Y.  无  无  淡红-褐
[1]在30℃培育18天。
[2]NPBM＝Nutrisoy粉5gm，花生粉5gm，黑舌叶糖蜜5gm，酒糟5gm，麦片5gm，甘油1gm，马铃薯糊精50gm，查贝克氏无机物混合物2ml，去离子水1升。
形态学特征
培养物A58267.2不产生气生菌丝。因此，不必进行形态学和孢子表面的研究。没有观察到孢子囊、游动细胞或巩膜。培养物A58267.2在固体或液体培养基上生长期间内不分裂。
生理学特征
培养物A58267.2利用下述的碳水化合物与ISP培养基9一起作为基础培养基：D和L-阿拉伯糖、纤维二糖、D-果糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、甘油、糖原、异-肌醇、菊粉、D-麦芽糖、D-甘露醇，D-甘露糖、蜜二糖、D-蜜三糖、L-鼠李糖、D-核糖、海藻糖、木糖醇和D-木糖。培养物A58267.2不能使用下述碳水化合物与ISP培养基9一起作为基础培养基：阿东糖醇、纤维素、糊精、半乳糖醇、乙醇、异-赤藓糖醇、D-乳糖、松三糖、a-甲基-D-葡萄糖苷、水杨苷、山梨醇、L-山梨糖和蔗糖。
A58267.2分解腺嘌呤、苹果酸钙、酪蛋白、淀粉和脲。
A58267.2产生过氧化氢酶、H2S和液化的明胶，并在50℃下能存活8小时。A58267.2对NaCl的耐性高达6%。
A58267.2能水解尿囊素、弹性蛋白、七叶苷、鸟嘌呤、马尿酸盐、次黄嘌呤、睾酮、L-酪氨酸、或黄嘌呤。它不产生类黑素色素、还原硝酸盐、或产生磷酸酶，并且在50mg/ml的浓度时对溶菌酶也不具有抗性。
培养物A58267.2对2μg（微克）林肯霉素、30μg萘啶酮酸、10单位青霉素G、300单位多粘菌素B、和5μg三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。A58267.2对10单位杆菌肽、30μg头孢金素、30μg氯霉素、15μg红霉素、10μg庆大霉素、30μg新霉素、30μg新生霉素、15μg夹竹桃霉素、5μg利福平、10μg链霉素、30μg四环素、10μg妥布霉素以及30μg万古霉素敏感。
培养物A58267.2在15-37℃温度范围内生长。适宜的生长温度为约30℃。
细胞壁分析
亲株A58267.21的细胞壁分析表明水解的全细胞含有LL-二氨基庚二酸（DAP）。存在于全细胞萃取物中的糖是葡萄糖和核糖。脂肪酸类型是2C，而主要的甲基萘醌类是MK-9（H6）。该检测表明是链霉菌属的典型细胞壁类型，并预期类似于A58267.2菌株。
菌株A58267.2的特性
认为培养物A58267.2具有类型I细胞壁，NC型全糖结构，以及主要是MK-9（H6）的甲基萘醌类组成。A58267.2的这些化学分类学特性以及培养和形态学特征支持了将该分离菌鉴定为链霉菌属的观点[见：Lechevalier等人，“Chemical  Composition  as  a  Criterion  in  the  Classification  of  Aerobic  Actinomycetes，Int.J.Syst.Bacteriol.，20;435-443（1970）]。
尽管S.avermitilis的11个菌株已公开在ATCC“Catalogue  of  Bacteria  and  Bacteriophages”（18  th  edition（1992））中，通过该文献，S.avermitilis  ATCC  31267已被鉴定为11个菌株中的10个直接或间接的亲株。当ATCC  31267（A54508）不是直接亲株时，则为第一代子代，ATCC  31272（A54508.3），通常是直接亲株。文献中对ATCC  31267或31272的子代的描述说明该子代通常具有亲株的特征，但含有某些次要的区别特征（见：例如在EP  276131中对ATCC  53567和53568的分类学描述）。因此，选择除一个已知的S.avermitilis菌株、ATCC  31267/A54508，以及一个其首次产生的子代（ATCC  31272/A54508.3）之外的全部的直接或间接亲株作为与ATCC21005（A58267.2）菌株相比较的菌株。
在一种高确定性比较中，对A58267.2、A54508和A54508.3进行脂肪酸分析。表2表明了在每种菌株中测得的特性脂肪酸百分数比较结果。
表2  A58267.2与两种S.avermitilis菌株的脂肪酸成分
脂肪酸  A58267.2  A54508  A54508.3
14:0异(异豆蔻酸)  3.36  7.95  4.67
15:0异  22.30  11.11  11.24
15:0反异  19.29  21.41  22.99
15:0(十五烷酸)  2.45  2.08  2.17
16:1异H  4.23  4.68  1.96
16:0异(异十六烷酸)  14.02  19.85  16.43
16:1顺9(棕榈油酸)  3.93  3.31  2.82
16:0(十六烷酸)  4.53  3.26  5.14
17:1异下  7.57  6.07  6.27
17:1反异C  3.42  3.56  3.07
17:0异(I异十七烷酸)  5.51  5.12  7.83
17:0反异  5.88  8.23  11.93
1.在28℃细胞于TSB（胰肮酶大豆肉汤）中生长4天。
图1示出了计算机作出的由脂肪酸外形构成的树状图。该树状图表明了A58267.2与其他S.avermitilis菌株之间的相互关系，以Euclidean距离表示。相关度低于10.00的培养物被认为是同类，即同种。A58267.2以相关度高于10.00的水平与S.avermitilis相关。
主要组分的分析是多变量统计的部分，这涉及一系列变量间内在的相互关系。在这种分析中，在原始数据或试验结果中最大的变量为主要的组分[Alderson，G.“The  Application  and  Relevance of  Nonhierarchic  Methods  in  Bacterial  Taxonomy”，in  Comp-uterassisted  Baeterial  Systematics，Goodfellow，M.，et  al.，（eds），Academic  Press，New  York（1985）]。因此，可以绘制表示分布或变化的曲线。然后通过检验这些变量即可评价相互关系，这样，一种微生物种群被鉴定。绘制了基于脂肪酸的两维的主要组分曲线，它表明了培养物A58267.2及其亲株A58267.21与其它S.aver-mitilis种之间的相互关系。这些数据示于图2中。
在树状图和主要组分曲线两者中，形成了两种不同的丛群。A58267.2和A58267.21形成一群，而A54580和A5458.3形成另一群。这两个群非常类似，足以表明在该两个群中的菌株是相关的，但也存在明显的区别，表明无论从群或各个菌株都是不相同的。
A58267.2和A54840.3之间的差别的研究示于表3中。
表3  S.avermitilis菌株A58267.2和A54580.3之间的差别
特征  A58267.2  A54580.3
气生孢子的产物  -  -
在苹果酸钙琼脂上生长  -  +
在Bennetts琼脂上反侧  黑色  褐色
色素的产生
在酵母葡萄糖琼脂上可溶  +  -
性色素的产生
抗生素抗性:
林肯霉素  +  -
多粘菌素B  +  -
在7%NaCl中生长  -  +
分解:
七叶苷  -  +
马尿酸盐  -  +
次黄嘌呤  -  +
黄嘌呤  -  +
溶菌酶抗性50μg/ml  -  +
类黑素色素产生  -  +
硝酸盐还原性  -  +
蜜三糖产生的酸产物  +  -
脂肪酸成分%:
15:0异  22.30  11.24
15:0反异  19.29  22.99
16:1异H  4.23  1.96
16:0异  14.02  16.43
17:0异  5.51  7.83
17:0反异  5.88  11.93
如前面所指出的，在S.avermitilis菌株A58267.2和A54508/A54508.3之间没有足够差别以将A58267.2确定为一单独的种。但是，在这些菌株之间存在足够的差别以将A58267.2确定为一种不同的和独立的已知的S.avermitilis的亚种（菌株）。因此，将A58267.2确立为S.avermitilis的亚种，并分类为S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005。该亚种名称“黑色”指在Bennetts琼脂上所呈现的特殊颜色。
此外，本发明提供了制备一种或多种阿凡曼菌素的方法，该方法包括在浸没的需氧条件下在含有碳、氨和无机盐的可同化源的水液培养基中培育S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005，或其可产生阿凡曼菌素的突变体或变异体，直至产生一种或多种阿凡曼菌素，并收集。可使用现有技术中已知的各种分离和纯化方法来收集所产生的阿凡曼菌素。
与其它微生物的情况相同，本发明中产生阿凡曼菌素的培养物，S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005的特征也是易发生变化的。用现有技术中已知的方法可以得到该菌株的突变体，例如用各种物理的和化学的诱变剂如紫外线、X-射线、ㄚ-射线和化学物质如n-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍进行处理。用现有技术中已知的方法也可得到该菌株的天然的变异体，例如，筛选亲株的培养物。保持产生阿凡曼菌素特征的S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005的天然变异体和诱发突变体也是本发明的一部分。
用于生长本发明S.avermitilis培养物的培养基可以是众多培养基中的任何一种。因此，例如，在大规模发酵中优选的碳水化合物源是葡萄糖、甘露糖以及特别是蕃茄糊精。但是，也可使用其他的碳水化合物，如核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露醇等。
优选的氮源是大豆粉，尽管酶或酸水解的酪蛋白、酵母、肝粉、肉胨、鱼粉等也是有用的。
可以掺入培养基中的营养的无机盐包括能提供锌离子、钠离子、镁离子、钙离子、铵离子、盐酸根离子、碳酸根离子、硫酸根离子、硝酸根离子等离子的常用的可溶性盐。
在培养基中还应有生物生长和发育所必需的微量元素。这种微量元素通常以混杂物形式存在于培养基的其他组分中，其量足以满足生物生长所需。如果出现起泡问题，需要时可在大规模发酵培养基中加入少量（如0.2gm/L）泡沫抑制剂，如分子量约2000的聚丙二醇。
培养基组分的优选浓度的例子示于下面的实施例1中。
制备大量的阿凡曼菌素，优选在罐中进行浸没需氧发酵。少量的A58267.2培养物可通过摇瓶培养得到。因为在阿凡曼菌素制备过程中时间的延迟通常与在大罐中孢子形生物的接种有关，所以应优选地使用营养种菌。通过在少量的培养基上接种孢子形成物或菌丝体的片段可以制得营养种菌，得到新鲜的、有活性的该生长培养物。然后将该营养种菌转移到较大容器中，开始阿凡曼菌素的制备阶段。该营养种菌培养基可以与用于较大量发酵过程的相同，但其他的培养基也是适宜的。
本发明的制备中，由A58267.2生物制备阿凡曼菌素。在约15℃至37℃之间生长。制备阿凡曼菌素最佳的温度是约29℃至31℃。
如同通常的浸没需氧培养方法，从容器的底部通入无菌的空气，而同时该培养基用通用的叶轮搅拌机搅拌。在该条件下发酵过程中最大的氧吸收量至此不会超过约0.16mM/L/分钟。在一全部挡板的115升发酵罐中含有约107升的液体培养基，通气速度和搅拌速度在容器内压为5.0大气压下应足以保持溶解的氧至少为45%的空气饱和度。
在发酵过程中，通过用各种方法（如HPLC）对液体培养基的试样与已知标准品进行对照来进行阿凡曼菌素的制备。
在浸没需氧发酵条件下制备之后，用发酵技术中已知的方法从该发酵培养基中收集阿凡曼菌素。通常，在A58267.2培养物或其产生阿凡曼菌素的突变体或异变体的发酵过程中产生的阿凡曼菌素存在于过滤的液体培养基和特别是存在于菌丝体物质中。因此，如果将avermectins直接喂给动物，则可将全部发酵液体培养基干燥并与喂这种动物的食物掺在一起。
更为优选的是，将avermectins从全部发酵液体培养基中分离出来，分离的avermectin化合物的收集可用溶剂萃取并应用色谱来进行分级分离，这可使用各种色谱技术和溶剂体系。分离和收集阿凡曼菌素的技术在US  4，429，042，以及Miller，T.W.，等人的文章[Antimicrob，Agents  Chemother.，15（3）：368-371（1979）]中已有描述。优选的用于这种分离和收集的技术在下面实施例中说明。
制得并分离出的阿凡曼菌素特别适用于治疗被寄生虫感染的动物，并且特别适于用作驱肠虫剂、杀虫剂和杀螨剂。这种抗寄生虫的用途在动物保健领域中是公知的并且有文献记载（见US  4，429，042和4，310，519）。
另外，ivermectin，一种已知的还原的avermectin  Bla和Blb结合体的衍生物，可任选地用Chabula等人在US  4，199，569中所述方法制得，该专利作为参考而引入本文。
为了更完整地说明本发明的操作过程，提供了如下的实施例。但是，这些实施例在任何方面均不试图并也不应解释为限制本发明的范围。
在下面实施例中，在氘化氯仿溶液中，阿凡曼菌素化合物A1a，A1b、A2a、A2b、B1a、B1b、B2a和B2b的13C核磁共振谱数据是由General Electric Model QE 300光谱仪（Fremont，CA）而得到的。每个样品溶液的体积约为0.7ml。对于每种avermectin化合物相对氘化氯仿的化学位移以ppm给出（77 ppm）。用2ABII-SE分光计（VG Analgtical，Manchester，Engtand）得出FABMS数据。
实施例1
A58267.2的发酵
A、摇瓶
使用保存在液氮中的培养物S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005接种于（0.5ml）具有下列成分的第一阶段营养培养基：
营养培养基
成分  含量（g/l）
胰酶鲜酪蛋白大豆液体培养基  30.0
酵母萃取物  3.0
MgSO4.7H2O 2.0
葡萄糖  5.0
麦芽糖  4.0
去离子水加至到50ml
未调节的pH＝7.0;在灭菌处理后不调节pH;
灭菌处理后的pH＝6.9。
该接种的营养培养基在250ml广口锥形瓶中于30℃培育约46小时，以250  rpm以2英寸（5.08cm）的圆周轨迹摇动。该瓶用两张生物保护滤纸防护，该振荡器的置放板（board）角度为0°。
B、A58267.2的罐发酵
为了提供更大体积的种菌，将上面A节中所制得的10ml已接种的第一阶段培养基用于接种与第一阶段培养基具有相同组成的400ml第二阶段营养培养基。该第二阶段培养基在2L广口锥形瓶中于30℃培育约48小时，以250  rpm以2英寸（约5.08cm）的圆周轨迹摇动。该瓶也用两张生物保护滤纸防护，该振荡器的置放极角度为0°。
将该第二阶段营养培养基（400ml）用于接种具有下面组成的107L无菌制备培养基：
制备培养基
成分  含量（/L）
大豆粉  5.0g
蕃茄糊精  80.0g
嫩燕麦粉  5.0g
废糖蜜  5.0g
CaCO32.0g
甘油  1.0ml
Czapek′s  Mineral  Stock  2.0ml
去离子水加到107L。
未调节的pH＝6.5，约用30  ml  5N  NaOH将pH调到7.3，灭菌后PH＝7.0。
加入抑泡剂：SAG  471，浓度为0.2mg/l（Union  Carbide  Sistersville，West  Virginia）。
在30℃温度下将制种的制备培养基在115L无菌发酵罐中发酵10天和11天之间。保持溶解的氧量为约45%空气饱和度，在搅拌的容器中搅拌速度是低的（约137～约255rpm）。
实施例2
阿凡曼菌素的一般分离
用5N HCl将115L按类似实施例1所述方法制得的全部发酵液体培养基调至pH6.5。将等体积的甲醇加到该溶液中，并经过Membr-alox陶瓷过滤器（U.S.Filter/SCT，Bazet，France）过滤该溶液。然后将滤液经过含10 L HP-20SS（Diaion）的柱（Mitsubishi Chemical Industries Ltd，Tokyo，Japan）。接着用线性梯度的50～100%甲醇水溶液洗脱该柱。用含Dynamax C18的4.6mm（直径）×30cm的柱子（Rainin Company，Woburn，MA）通过HPLC来分析搜集的洗脱液。用常液梯度的MeOH∶CH3CN∶（0.2% HOAC，用NaOH调至pH 5.0）（44∶44∶12）洗脱该柱，流速为1.5ml/分钟。基于该HPLC分析将洗液合成两份。在减压下将每份浓缩至约500ml。用CHCl3将每份萃取，将萃取物蒸发，产出18.25g的油（份A）和6.48g的油（份B）。
实施例3
份A的处理
将由实施例2得到的份A（18.25g）溶于45ml甲醇中，并在5cm（直径）×1.1m的含Sephadex  LH-20的柱上（Pharmacia，Piscataway，New Jersey）色谱分离。用甲醇洗脱该柱并用HPLC分析洗脱液。将含有阿凡曼菌素的那些洗脱液合并成两份并蒸发则产出份C（10.96g）和份D（1.45g）。
实施例4
份C的处理
将份C（由实施例3得出，2g）物质溶于4.5ml甲醇中并用41.4mm（直径）×25cm的含有Dynamax-60AC18的柱（Rainin，Woburn，Massachusetts）作色谱分离。在100分钟内，用线性梯度的CH3CN∶MeOH∶H2O（40∶40∶20至46∶46∶8）洗脱该柱，流速为15ml/分。基于HPLC制得4份：份E（489 mg），份F（624 mg），份G（656 mg），以及份H（177 mg）。
实施例5
阿凡曼菌素Ala的分离
将由实施例2得到的份B溶于30ml甲醇中并如实施例3中所述进行色谱分离。用甲醇洗脱该柱并用HPLC分析该洗脱液。将含有阿凡曼菌素的那些洗脱液合并，蒸发得残余物（658 mg）。将残余物的一部分（200 mg）作色谱分析，用2.5cm（直径）×30cm的含Chromegabond MC18的柱（ES Industries，Berlin，New Jersey），使用梯度的CH3CN∶MeOH∶H2O（40∶40∶20～42∶40∶16）以5ml/分流速洗脱90分钟以上。该方法得出63mg的阿凡曼菌素Ala。MS∶FAB m/z＝909
[AverAla+Na]+;13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ11.96，12.88，15.03，16.30，17.62，18.32，19.82，20.18，27.44，30.50，34.18，34.43，35.13，36.52，39.66，40.41，45.61，56.32，56.41，57.69，67.18，68.07，68.15，68.32，74.83，76.01，76.89，77.41，78.15，80.43，80.50，81.92，118.25，118.31，119.58，124.79，135.10，135.98，136.08，137.58，139.85，173.81，94.88，98.44，68.33，127.74.
实施例6
阿凡曼菌素A2a和B1b的分离
将由实施例4得到的份F物质溶于2.5ml甲醇中并用实施例4中所述的柱色谱分离。使用MeOH∶H2O（85∶15）常液以15ml/分流速洗脱该柱，得出纯的阿凡曼菌素A2a。
MS：FAB m/z＝927[AverA2a+Na]+;13C
NMR（75 MHz，CDCl3）δ173.4，139.83，137.48，135.79，135.60，124.80，119.65，118.43，117.47，99.56，98.41，94.78，81.67，80.50，80.36，79.24，78.15，77.50，76.80，75.90，70.67，69.79，68.25，68.12，68.06，67.55，67.18，57.60，56.38，45.54，41.06，40.70，39.62，36.27，35.61，35.04，34.41，34.26，34.07，27.18，20.20，19.86，18.31，17.65，15.06，13.72，12.37，11.75;and avermectin Blb（79mg）：MS：FAB m/z＝881［AverBlb+Na]；13C NMR（75MHz，CDCl3）δ173.56，139.54，137.95，137.80，135.97，135.07，127.72，124.70，120.31，118.28，118.00，98.43，95.63，94.88，81.83，80.38，80.32，79.32，79.22，78.22，77.26，75.96，68.32，68.28，68.24，68.10，67.67，67.21，56.46，56.36，45.66，40.45，39.72，36.63，34.52，34.22，30.88，28.31，21.03，20.18，19.88，18.37，17.68，16.51，15.08，14.86.
实施例7
阿凡曼菌素A1b和B1a的分离
将由实施例4中得到的份G物质溶于3ml CH3CN中并用含Chromegabond C18的2.5cm（直径）×30cm的柱（ES Industries，Berlin，New Jersey）作色谱分离，以5ml/分钟流速在三个分离的中用线性梯度的CH3CN∶H2O（73∶27至80∶20）洗脱100分钟以上，则得出纯的阿凡曼菌素。
MS：FAB m/z＝895［AverA1b+Na]+;13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ173.39，139.61，137.35，135.60，134.87，127.58，119.45，118.29，118.07，98.22，94.41，94.69，81.68，80.29，80.22，79.10，77.99，77.28，77.00，76.65，75.73，68.08，68.05，67.91，66.98，57.43，56.21，56.18，45.39，40.24，39.45，36.36，34.30，34.05，30.65，28.09，20.82，20.03，19.66，18.15，17.48，16.31，14.87，14.64，124.63;and avermectin Bla（245mg）：MS：FAB m/z＝895[AverBla+Na]；13c NMR（75 MHz，CDCl3）δ173.40，139.53，137.84，137.70，136.08，135.08，127.74，124.69，120.23，118.23，117.94，98.42，95.69，94.87，81.69，80.23，80.15，79.13，78.05，75.69，74.61，68.12，68.03，67.93，67.46，67.01，56.26，56.17，45.43，40.28，39.51，36.33，34.93，34.23，34.05，30.32，27.25，19.99，19.66，18.14，17.50，16.15，14.85，12.74，11.81.
实施例8
阿凡曼菌素A2b、B2a和B2B的分离
将由实施例4得到的份E物质溶1.9ml CH3CN中并在实施例7中所述的柱上进行色谱分离。在100分钟内以5ml/分的流速用线性梯度的CH3CN∶H2O（65∶35至75∶25）洗脱该柱两次，则得出纯阿凡曼菌素
MS：FAB m/z＝913[AverA2b+Na]+;13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ173.60，139.83，137.47，135.92，135.54，124.75，119.52，118.21，117.44，99.53，98.37，94.69，81.53，80.43，80.30，79.21，78.10，77.34，76.81，75.92，72.24，69.75，68.24，68.10，68.05，67.45，67.14，57.65，56.38，56.31，45.52，40.99，40.63，39.60，36.37，35.95，34.47，34.14，27.86，20.68，20.16，19.80，18.29，17.59，15.05，13.85，13.55;avermectic B2a（125mg）;MS：FAB m/z＝913[AverB2a+Na]+;13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ173.63，139.68，138.01，135.62，～135，124.72，120.34，117.92，117.54，99.63，98.47，94.77，81.55，80.35，79.31，79.08，78.17，76.07，72.35，69.86，68.43，68.32，68.10，67.68，67.51，67.25，～56.3，～56.3，45.67，41.11，40.72，39.75，36.55，36.07，34.57，34.24，34.17，34.17，27.96，20.80，20.21，19.97，18.41，17.68，15.17，13.95，13.67;and avermectin B2b（145mg）;MS：FAB M/Z＝899[AverB2b+Na]+;13C NMR（75 MHz，CDCl3）δ173.09，139.44，137.65，137.57，135.44，124.50，120.90，117.76，117.34，99.41，98.26，94.63，81.47，80.19，79.20，79.10，78.04，75.72，70.57，69.66，68.10，68.03，67.97，67.45，67.36，67.05，56.28，56.24，45.45，40.57，39.52，36.17，35.46，34.90，34.26, 34.09，33.91，27.04，20.00，19.69，18.16，17.51，14.91，13.56，12.33，11.59.

Claims (7)

1、一种生物纯的微生物Streptomyces  avermitilis黑色亚种NRRL  21005培养物，或者其产生阿凡曼菌素的突变体或变异体。
2、权利要求1的培养物是Streptomyces  avermitilis黑色亚种NRRL  21005。
3、一种制备至少一种阿凡曼菌素化合物的方法，该方法包括在浸没需氧条件下，在含有碳、氮和无机盐的可同化源的水液培养基中培育S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005，或其产生阿凡曼菌素的突变体或变异体，直至产生至少一种阿凡曼菌素化合物。
4、权利要求3的方法，其中所述的阿凡曼菌素化合物选自A1a、A1b、A2a、A2b、B1b、B2a和B2b。
5、权利要求3的方法，其中使用S.avermitilis黑色亚种NRRL  21005。
6、权利要求3的方法，它还包括另一个从所述培养基中收集所述的一种或多种阿凡曼菌素的步骤。
7、一种制备ivermectin的方法，该方法包括在浸没需氧条件下，在含有碳、氮和无机盐的可同化源的水液培养基中培育S.avermit-ilis黑色亚种NRRL  21005，或其产生阿凡曼菌素的突变体或变异体，直至阿凡曼菌素化合物B1a和B1b产生，并还原所述的B1a和B1b化合物。
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