CZ282908B6

CZ282908B6 - Kmen Streptomyces a způsob produkce avermectinových sloučenin

Info

Publication number: CZ282908B6
Application number: CZ932502A
Authority: CZ
Inventors: Rosanne Bonjouklian; Otis Webster Godfrey Jr.; Tim Allen Smitka
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1992-11-30
Filing date: 1993-11-22
Publication date: 1997-11-12
Also published as: PL301204A1; EP0600656A3; IL107702A; MX9307410A; NO934293D0; CN1088983A; ZA938723B; CA2109767A1; RU2125609C1; JPH06237761A; KR940011630A; EP0600656A2; NZ250247A; HUT69970A; FI935246A0; CZ250293A3; IL107702A0; NO934293L; HU9303366D0; CO4130314A1

Abstract

Kmen Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005, je vhodný pro produkci známých avermectinů a ivermectinu, sloučenin s antiparasitickým působením. Způsob produkce avermectimových sloučenin kultivací kmene Streptomyces ve vodném kultivačním prostředí.ŕ

Description

Vynález se týká kmene streptomyces pro produkci antiparazitických sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že jsou avermectiny, komplex příbuzných činidel s antiparazitickou účinností, produkovány aerobní fermentací Streptomyces avermitilis kmeny ATCC 31267, 31271 a 31272 (americký patentový spis číslo 4 310519 a 4 429042). Alespoň dva uvedené kmeny jsou uloženy ve formě mrazené fioly a lyofilizované zkumavky s kulturou, získanou ultrafialovým ozařováním S. avermitilis ATCC No. 31267.

Kmeny S. avermitilis, uvedené ve shora uvedených amerických patentových spisech, produkují třídu látek, obecně popisovaných jakožto C-076 (avermectiny dále uvedeného obecného vzorce I). Třída zahrnuje osm odlišných, avšak těsně příbuzných sloučenin, popisovaných jakožto avermectin Ala, Alb, A2a, A2b, Bia, Blb, B2a, B2b. Série a sloučenin se týká přírodních avermectinů, přičemž v poloze 25 je substituent (S)-sek.-butyl, a série b sloučenin se týká přírodních avermectinů, přičemž v poloze 25 je substituentem isopropyl. Označení A a B se týká avermectinů, kde je v poloze 5 substituentem methoxyskupina nebo hydroxyskupina. Konečně číslice 1 se týká avermectinů, kde je dvojná vazba v poloze 22-23 a číslice 2 se týká avermectinů, majících atom vodíku v poloze 22 a hydroxyskupinu v poloze 23.

Avermectiny mají tedy obecný vzorec I

- 1 CZ 282908 B6 kde znamená přerušovaná čára jednoduchou nebo dvojnou vazbu,

R¹ atom vodíku nebo hydroxyskupinu a toliko hydroxyskupinu v případě, že přerušovaná čára znamená jednoduchou vazbu,

R² isopropylovou nebo sek-butylovou skupinu, a

R³ methoxyskupinu nebo hydroxyskupinu.

Jsou známy jiné kmeny S. avermitilis pro produkci jednoho nebo několika přírodních avermectinů, přičemž v poloze 25 je substituentem buď skupina isopropylová nebo (S)-sek.butyl-(l-methylpropyl)ová, nebo nepřírodních avermectinů, přičemž v poloze 25 je substituentem jiná skupina než isopropylová nebo (S)-sek.-butylová. Například S. avermitilis ATCC 31780 je popsán v americkém patentovém spise číslo 4 378353; ATCC 53567 a ATCC 53568 jsou popsány v evropském patentovém spise (EP) 276131; ATCC 53692 je popsán v evropském patentovém spise (EP) 276103; aNCIB 12121 je popsán v evropském patentovém spise (EP) 214731. Avšak každý z těchto kmenů Streptomyces avermitilis je přímým nebo nepřímým progenem kmene Streptomyces avermitilis ATCC 31267. Proto shora uvedené kmeny Streptomyces avermitilis, které jsou schopny produkovat jeden nebo několik avermectinových sloučenin, zahrnuje toliko mateřský kmen a jeho progeny.

Jiný kmen Streptomyces avermitilis, ATCC 53814, je popsán v americkém patentovém spise číslo 5 015662. Tento kmen byl odlišen podle své schopnosti biologicky převádět řady sloučenin milbemycinového typu a na základě své neschopnosti produkovat podstatné množství avermectinů.

Vynález se týká nového kmene, produkujícího avermectin, označovaného jakožto Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005. Vynález se dále týká nového způsobu produkce avermectinů za použití kmene Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je biologicky čistá kultura mikroorganismu Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005.

Způsob produkce alespoň jedné avermectinové sloučeniny spočívá podle vynálezu v tom, že se kultivuje Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005 ve vodném kultivačním prostředí, obsahujícím asimilovatelný zdroj uhlíku, dusíku a anorganických solí za submerzních aerobních podmínek až do produkce alespoň jedné avermectinové sloučeniny.

Vynález blíže objasňuje následující popis a připojené obrázky:

na obr. 1 je dendrogram Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005 (A58267.2) a jiných druhů Streptomyces avermitilis, na ose x jsou uvedeny euklidické vzdálenosti, na obr. 2 je hlavní složka, vynesená z analýzy mastných kyselin, objasňující vztah mezi

A58267.2 a druhy Streptomyces avermitilis, na ose x je vynesena hlavní složka 1, na ose y hlavní složka 2.

Jak shora uvedeno, týká se vynález biologicky čisté kultury mikroorganismu Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005 (kmen NRRL 21005) produkující avermectin.

Nový mikroorganismus, který produkuje avermectiny, se označuje pro jednoduchost také jakožto kultura A58267.2. Kultura A58267.2 je zlepšeným kmenem kultury A58267.21, který je přírodním variantem kultury A58267. Kultura A58267 byla izolována ze vzorku půdy z Itálie.

Kultura A58267.2 byla uložena v souhlase s Budapešťskou úmluvou a je součástí zásobní kultury organizace Northem Regional Research Center, Agricultural Research Service, North Centrál Region, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, pod registračním číslem NRRL 21005. Trvalost uložení této kultury v organizaci Northem Regional Research Center, Peoria, Illinois a její snadná dostupnost veřejností jsou nutné pro udělení patentu na tuto přihlášku vynálezu. Kultura je po dobu trvání patentu dostupná pod číslem 37 C.F.R. § 1.14 a 35 U.S.C. § 112. Všechna omezení dostupnosti kultury pro veřejnost jsou neodvolatelná po dobu platnosti patentu.

Taxonomnické studie A58267.2 (NRRL 21005) provedl Frederick P. Mertz, Lilly Research Laboratories. Na základě těchto studií je nový mikroorganismus klasifikován jakožto nový kmen (subspecies) rodu a kmene Streptomyces avermitilis, pro který byl navržen název Streptomyces avermitilis, subspecies niger. Tato klasifikace je založena na přímé laboratorní klasifikaci a přezkoušení publikovaných popisů podobných kmenů.

Použitý způsob

Taxonomnické studie se provedly za použití způsobů, doporučených organizací Intemational Streptomyces Project (ISP) pro charakterizaci kmene Streptomyces (E.B. Shirling a D. Gottlieb, Methods for characterization of Streptomyces species [Způsoby charakterizace kmene Streptomyces], Int. J. Syst. Bacteriol. 16, str. 313 až 340, 1966) a způsobů, doporučených pro charakterizaci kmenů Nocardia (R.E. Gordon, D.A. Bamett, J.E. Handerhan aC.H. Pang Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica and the Nocardia strain [Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica a kmen Nocardia], Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), str. 54 až 63,1974).

K posouzení barevných názvů se použilo barevných tabulek ISCC-NBS Centroid Color Charts, normalizovaný vzorek No. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S.Department of Commerce, Washington, D.C.).

Morfologie studována za použití optického mikroskopu a řádkovacího elektronového mikroskopu (SEM).

Isomer diaminopimelové kyseliny (DAP) a uhlohydráty v hydrolyzátech celých buněk se stanovily chromatografickými způsoby, které popsal Becker a kol., Rapid Differentiation between Nocardia and Streptomyces by Páper Chromatography of Whole-cell Hydrolysates [Rychlé rozlišení Nocardia a Streptomyces papírovou chromatografií hydrolyzátů celých buněk], Appl. Microbiol., 12, str. 421 až 423, 1964 aLechevalier a kol. A University Laboratory Approach, Dietz a Taxer (vyd.), Society for Industrial Microbiology, Speciál Publication No. 6, Arlington, Virginia, str. 227 až 233.

Odolnost antibiotik měřena položením kotoučků antibiotické citlivosti na povrch naočkovaných ISP No. 2 agarových destiček. Odolnost hodnocena jako (+), pokud se nepozoruje žádná inhibiční zóna a jako (-), pokud se pozoruje inhibiční zóna.

Menachinonové složení se stanovuje způsobem, který popsal R. M. Ktoppenstedt Chemical Methods in Bacterial Systematics [Chemické způsoby v bakteriálních systematikách],

-3 CZ 282908 B6

M. Goodfellow aD.E. Minnikin (vyd.) str. 173 až 196, 1985 aM.D. Collins tamtéž (Chemical Methods in Bacterial Systematics), str. 267 až 285.

Analýza mastné kyseliny se provádí za použití systému HP 5898A Microbial Identification Systém, který popsal L-Miller a kol., Bacterial Identification by Gas Chromatography of Whole-Cell Fatty Aceds [Bakteriální identifikace plynovou chromatografíí mastných kyselin celých buněk] Hewiett-Pacard Application Notě 228-41, str. 8, 1985.

Methylestery mastných kyselin se připravují z lyofilizovaných celých buněk, které rostly za stejných podmínek.

Snášenlivost pro chlorid sodný se měří přidáním chloridu sodného do ISP No. 2 agaru k vyrovnání na žádanou koncentraci.

Dendrogram na obr. 1 je založen na euklidických vzdálenostech a je zhotoven za použití počítače.

Analýza hlavních složek na obr. 2 je dvourozměrová a je zhotovena rovněž za použití počítače.

Charakteristiky kultury

Kultura A58267.2 neroste na většině prostředí a neprodukuje aeriální hyphae ani na komplexním, ani na definovaném prostředí. Barva obrácené strany je žlutohnědá s výjimkou růstu na Bennettově agaru, kdy se vytváří příznačný černý pigment. Mdle světle hnědý rozpustný pigment se produkuje v ISP prostředí 2 a červenohnědý rozpustný pigment se produkuje na Bennettsově agaru. V tabulce I jsou uvedeny tyto charakteristiky kultury.

Tabulka I

Charakteristiky kultury A58267.2¹

Prostředí	Růst	Barva na obrácené straně	Aeriální růst	Aeriální barva	Rozpustný pigment
IPS prostředí 2	dobrý	80.gy.žlutohnědá	žádný	žádná	světle hnědý
IPS prostředí 3	špatný	80.d.žlutohnědá	žádný	žádná	žádný
IPS prostředí 4	slušný	93 .y.šedá	žádný	žádná	žádný
IPS prostředí 5	žádný	žádná	žádný	žádná	žádný
ATCC 172	žádný	78.d.žlutohnědá	žádný	žádná	červenohnědý
Bennettův agar	hojný	65. br. Blk	žádný	žádná	červenohnědý
kalciummalát	špatný	9O.gy .žlutá	žádný	žádná	žádný
agar bavlníko-
vých semen	slušný	91.d.gy. žlutá	žádný	žádná	žádný
Czapeks	žádný	žádná	žádný	žádná	žádný
glukosa-
asparagin	žádný	žádná	žádný	žádná	žádný
glycerol-glycin	žádný	žádná	žádný	žádná	žádný
agar humové
kyseliny	žádný	žádná	žádný	žádná	žádný
NPBM²	hojný	78.d.žlutohnědá	žádný	žádná	žádný
živný agar	špatný	91.d.gy. žlutá	žádný	žádná	žádný

agar škrob

-4CZ 282908 B6

kasem	slušný	91.d.gy. žlutá	žádný	žádná	žádný
tomátová pastaovesná mouka	žádný	žádná	žádný	žádná	žádný
voda z vodovodu agar	žádný	žádná	žádný	žádná	žádný
kvasinkydextrosa agar	hojný	9O.gy.žlutá	žádný	žádná	červenohnědý

inkubováno při teplotě 30 °C po dobu 18 dní, ² NPBM = nutriční sojová mouka 5 g, moučka z arašídových oříšků 5 g, melasa (black strap molasses) 5 g, destilátová zrna (distillers grains) 5 g, ovesná moučka 5 g, glycerol 1 g, bramborový dextrin 50 g, minerální směs Czapeks 2 ml, deionizovaná voda 1 litr.

Morfologické charakteristiky

Aeriální hypae se neprodukuje kulturou A58267.2. Následkem toho studie morfologické a povrchu spor nelze provádět. Sporangia, pohyblivé buňky nebo sklerotia se nepozorují. A58267.2 kultura nevytváří při růstu fragment na pevném nebo na kapalném prostředí.

Fyziologické charakteristiky

Jakožto uhlohydráty s ISP prostředím 9 se pro základní prostředí pro kulturu A58267.2 uvádějí: D-arabinóza a L-arabinóza, cellobióza, D-fruktóza, D-galaktóza, D-glukóza, glycerol, glykogen, iso-inositol, inulin, D-maltóza, D-mannitol, D-mannóza, melobióza, D-raffinóza, L-rhamnóza, Dribóza, trehalóza, xylitol a a D-xylóza. Jakožto uhlohydráty s ISP prostředím 9, nevhodné pro základní prostředí pro kulturu A58267.2, se uvádějí: adonitol, celulóza, dextrin, dulcitol, ethanol, iso-erythritol, D-laktóza, melizitóza, H-methyl-D-glukosid, salicin, sorbitol, L-sorbóza a sacharóza.

Kultura A58267.2 rozkládá adenin, kalciummalát, kasein, škrob a močovinu.

Kultura A58267.2 produkuje katalázu, sirovodík aztekucenou želatinu a je schopna přežít vystavení teplotě 50 °C po dobu osmi hodin. Kultura A58267.2 snáší chlorid sodný v koncentraci až 6 % včetně.

Kultura A58267.2 je neschopná hydrolyzovat allantoin, elastin, eskulin, guanin, hippurát, hypoxanthine, testosteron, L-tyrosin nebo xanthin. Neprodukuje melanoidní pigmenty, neredukuje dusičnany, nebo neprodukuje fosfatázu ani není odolná lysozymu v koncentraci 50 mg/ml.

Kultura A58267.2 je odolná k2 pg lincomycinu, 30 pg nalidixové kyseliny, 10 jednotkám penicilinu G, 300 jednotkám polymixinu B a 5 pg trimethoprimu. Kultura A58267.2 je citlivá k 10 jednotkám bacitracinu, k 30 pg cephalothinu, k 30 pg chloromycetinu, k 15 μ erythomycinu, k 10 pg gentamycinu, k 30 pg neomycinu, k30 pg novobiocinu, k 15 μ oleandomycinu, k 5 pg rifampinu, k 10 pg streptomycinu, k30 pg tetracyklinu, k 10 μ tobramycinu a k 30 pg vancomycinu.

Kultura A58267.2 je šedá při teplotě 15 až 37 °C. Optimální teplota růstu je přibližně 30 °C.

60 60

- 5 CZ 282908 B6

Analýza buněčné stěny

Analýza buněčné stěny mateřského kmene A58267.21 dokládá, že hydrolyzované celé buňky obsahují LL-diaminopimelovou kyselinu (DAP). Cukry, obsažené v extraktech celých buněk, 5 jsou glukóza a ribóza. Mastná kyselina je typu 2C, a hlavní menachinon je MK-9(H₆). Měření dokládají typickou buněčnou stěnu pro rod Streptomyces a očekává se podobnost pro kmen A58267.2.

Identita kmene A5 8267.2

Kultura A58267.2 má pravděpodobně buněčné stěny typu I, celkový obraz cukrů typu NC a menachinonové složení primárně MK-9(H₆). Tyto chemotaxonomické vlastnosti a kulturální a morfologické charakteristiky A58267.2 podporují zařazení izolátu krodu Streptomyces (Lechevalier a kol., Chemical Composition as aCriterion in the Classification of Aerobic 15 Actinomycetes [Chemické složení jakožto kriterium klasifikace aerobních Actimomycetes], Int.

J. Syst. Bacteriol., 20, str. 435 až 443, 1970).

Jakkoliv je 11 kmenů Streptomyces avermitilis chráněno v ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophages (Katalog bakterií a bakteriofágů), 18, vydání, 1992, označuje se Streptomyces 20 avermitilis ATCC 31267 v literatuře jakožto přímý nebo nepřímý mateřský kmen 10 z 11 kmenů.

Jestliže není ATCC 31267 (A54508) přímým mateřským kmenem, je první generační progen ATCC 31272 (A54508.3) často přímým mateřským kmenem. Z popisů v literatuře progenů buď ATCC 31267 nebo 31272 je zřejmé, že se progeny obecně podílejí na charakteristikách mateřského kmene, mají však některou menší odlišnou vlastnost nebo některé menší odlišné 25 vlastnosti (viz například taxonomický popis ATCC 53567 a 53568 v evropském patentovém spise číslo EP 276131). Proto přímý nebo nepřímý mateřský kmen, téměř známý kmen Streptomyces avermitilis ATCC 31267/A54508 a jeden zjeho prvních generačních progenů (ATCC 31272/A54508.3) byly zvoleny jakožto kmeny, se kterými se kmen ATCC 21005 (A5 8267.2) porovnává.

Při vysoce determinativním porovnání se analýza mastné kyseliny provádí na A58267.2, A54508 aA54508.3. Tabulka 2 uvádí porovnání procenta specifických mastných kyselin, zjištěných v každém kmeni.

Tabulka II

Aminokyselinové složení A58267.2 a dvou kmenů ¹ Streptomyces avermitilis

Mastná kyselina	A58267.2,	A54508	aA54508.:
14:0 iso (isomyristová kyselina)	3,36	7,95 '	4,67
15:0 iso	22,30	11,11	11,24
15:0 anteiso	19,29	21,41	22,99
15:0 (pentadekanoová kyselina)	2,45	2,08	2,17
16:1 iso H	4,23	4,68	1,96
16:0 iso (palmitová kyselina)	14,02	19,85	16,43
16:1 cis 9 (palmitolejová kyselina)	3,93	3,31	2,82
16:0 (palmitová kyselina)	4,53	3,26	5,14
17:1 iso F	7,57	6,07	6,27
17:1 anteiso C	3,42	3,56	3,07
17:0 iso (isomargarová kyselina)	5,51	5,12	7,83
17:0 anteiso	5,88	8,23	11,93

buňky se nechávají růst po dobu 4 dnů v prostředí TSB při teplotě 28 °C.

-6CZ 282908 B6

Počítačem generovaný dendrogram, konstruovaný z profilů mastných kyselin, je na obr. 1. Tento dendrogram dokládá vztah A58267.2 kjiným kmenům Streptomyces avermitilis, jak ukazuje euklidická vzdálenost. Kultury, vykazující příbuznost pod hladinou 10,00, jsou označovány jako synonymné, to znamená téhož druhu. A58267.2 je ve vztahu ke Streptomyces avermitilis nad hladinou 10,00.

Hlavní složkou analýzy je větev multivariačních statistik, která se týká vnitřních vztahů řady proměnných. Při této analýze největší množství variant v rámci původních hodnot nebo 10 zkušebních výsledků se vyjadřuje jakožto hlavni složky (Alderson G., The Application and

Relevance of Nonhierarchic Methods in Bacterial Taxonomy [Aplikace a relevance nehierarchických metod v taxonomii bakterií], Computer-assisted Bacterial Systematics, Goodfellow M. a kol., (vyd.) Academie Press, New York, 1985). Tak se může konstruovat rozptyl nebo variabilita. Vztah se může hodnotit zkoušením této variace a může se charakteri15 zovat mikrobiální populace. Konstruuje se dvourozměrný graf hlavní složky na základě mastných kyselin, dokládající vztah kultury A58267.2 ajejího mateřského kmene A58267.21 kjiným druhům Streptomyces avermitilis. Tyto hodnoty jsou uvedeny na obr. 2.

Jak na dendrogramu, tak v diagramu hlavní složky, jsou vytvořeny dva zřetelné shluky. 20 A58267.2 aA58267.21 vytvářejí jeden shluk, zatímco A54508 aA54508.3 vytvářejí druhý shluk. Tyto dva shluky jsou dostatečně podobné, aby se mohly kmeny v obou shlucích označit jako příbuzné, avšak dostatečně odlišné k doložení, že ani shluky, ani jednotlivé kmeny nejsou totožné.

Přehled rozdílů A58267.2 a A54508.3 je uveden v tabulce III.

Tabulka III

Rozdíly mezi kmeny Streptomyces avermitilis A58267.2 a A54508.3

Vlastnost aeriální produkce spor růst na kalciummalátovém agaru reverzní pigment produkovaný na agaru Bennetts rozpustný pigment produkovaný na kasničnodextrózovém agaru antibiotická odolnost lincomycin polymixin B růst v 7% chloridu sodném rozklad esculinu hippurátu hypoxanthinu xanthinu lysozymová odolnost 50 pg/ml produkce melanoidního pigmentu redukce dusičnanu produkce kyseliny z raffinózy

A58267.2	A54508.3
-	-
-	+
černý	hnědý
+	-
+
+	-
-	+
	+
	+
	+
	+
	+
-	+
-	+
+

aminokyselinové složení v procentech:

15:0 iso	22,30	11,24
15:0 anteiso	19,29	22,99
16:1 isoH	4,23	1,96
16:0 iso	14,02	16,43
17:0 iso	5,51	7,83
17:0 anteiso	5,88	11,93

Jak shora uvedeno, jsou mezi kmeny Streptomyces avermitilis A58267.2 a A54508/A54508.3 nedostatečné rozdíly k ustavení A58267.2 za oddělený kmen. Mezi těmito kmeny je však dostatečně rozdílů k ustavení A58267.2 jakožto odlišného a odděleného subkmene známých kmenů Streptomyces avermitilis. Proto se ustavuje A58267.2 za subkmen Streptomyces avermitilis a klasifikuje se jakožto Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005. Jméno subspecies niger se vztahuje k výrazné barvě na Bennetsově agaru.

Vynález se také týká způsobu produkce jednoho nebo několika avermectinů, při kterém se kultivuje Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005 nebo jeho mutant nebo variant, produkující avermectin, ve vodném kultivačním prostředí, obsahujícím asimilovatelné zdroje uhlíku, dusíku a anorganických solí, za submerzních aerobních podmínek tak dlouho, až se získá jeden nebo několik avermectinů a tyto avermectiny se izolují. Produkované avermectiny se mohou izolovat různými v oboru o sobě známými způsoby.

Podobně, jako v případě jiných mikroorganismů, mohou se charakteristiky kultury, produkující avermectin podle vynálezu, Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005, obměňovat. Mutanty kmenů se mohou získat o sobě známými způsoby, například zpracováním různými fyzikálními a chemickými mutageny, jako jsou například ultrafialové světlo, rentgenový paprsky, gamma paprsky, a chemicky například působením n-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidinu. Přírodní varianty kmene se mohou rovněž získat o sobě známými způsoby v oboru, například tříděním kultur mateřského kmene. Přírodní varianty a navozené mutanty Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005, které si ponechávají charakteristiky se zřetelem na produkci avermectinů, spadají rovněž do rozsahu vynálezu.

Kultivačním prostředím, používaným pro růst kultury Streptomyces avermitilis, může být jakékoliv z četných prostředí. Například výhodnými uhlohydrátovými zdroji pro fermentaci v provozním měřítku jsou glukóza, mannóza a především bramborový dextrin. Může se však také použít jiných uhlohydrátů, jako jsou například ribóza, xylóza, fruktóza, galaktóza a mannitol.

Jakožto zdroje dusíku se uvádějí sojová mouka, jakkoliv se také může použít enzymem nebo kyselinou hydrolyzovaného kaseinu, kvasnic, jatemí moučky, masových peptonů a rybího masa.

Jakožto nutriční anorganické soli, které se mohou vnášet do kultivačního prostředí, se uvádějí rozpustné běžné soli, schopné poskytovat zinečnaté, sodné, hořečnaté, vápenaté, amonné, chloridové, uhličitanové, sulfátové, nitrátové a podobné ionty.

Esenciální stopové prvky, nutné pro růst a vývoj organismu, se rovněž mohou včleňovat do kultivačního prostředí. Takovými stopovými prvky jsou běžně nečistoty v jiných složkách prostředí v množstvích, dostatečných pro požadavky růstu organismu. Pokud je problémem pěnění, mohou se do provozního fermentačního prostředí přidávat malá množství (například 0,2 mg/1) protipěnicích činidel, například polypropylenglykolu o molekulové hmotnosti přibližně 2000.

Příklady výhodných koncentrací složek v kultivačním prostředí jsou uvedeny v příkladu praktického provedení 1.

-8CZ 282908 B6

Pro produkci podstatného množství avermectinů jsou výhodné nádoby pro submerzní aerobní fermentaci. Malá množství A58267.2 kultury se mohou získat kultivací v třepačce. Jelikož se doba při produkci avermectinů běžně spojuje s inokulací velkých nádrží organismem ve formě spor, je výhodné používat vegetativního inokula. Vegetativní inokulum se připravuje inokulací malého objemu kultivačního prostředí sporovou formou nebo mycelialními fragmenty organismu k získání čerstvých, aktivně rostoucích kultur organismu. Vegetativní inokulum se pak převádí do velké nádoby a iniciuje se produkční stadium avermectinů. Vegetativní inokulační prostředí může být stejné, jakého se používá pro fermentace ve větším měřítku, vhodné může být však také jiné prostředí.

Při způsobu podle vynálezu se avermectiny produkují organismem A58267.2 při jeho růstu při teplotě přibližně 15 až přibližně 37 °C. Optimální teplotou pro produkci avermectinů se jeví přibližně 29 až přibližně 31 °C.

Jak je obvyklé v případě submerzních aerobních procesů, vhání se sterilní vzduch do nádoby ode dna, přičemž se prostředí míchá běžnými turbínovými míchadly. Maximum příjmu kyslíku fermentaci za uvedených podmínek tak nepřekračuje přibližně 0,16 mM/l/min. V plně přepážkami vybaveném fermentoru o obsahu 115 litrů, obsahujícím přibližně 107 litrů půdy, se provzdušňováni a míchání má udržovat na dostatečné míře k udržení koncentrace rozpuštěného kyslíku alespoň 45 % zaváděním vzduchu za vnitřního tlaku 0,5 MPa.

Produkce avermectinů se může v průběhu fermentace sledovat zkoušením vzorků půdy porovnáním se známými standardy různými způsoby, například vysokotlakovou chromatografií.

Po produkci za podmínek submerzní aerobní fermentace se mohou avermectiny získat z fermentačního prostředí o sobě známými způsoby v oboru. Obecně se avermectiny, produkované při fermentaci kultury A58267.2 nebo mutantu nebo variantu produkujícího avermectin, vyskytují jak ve filtrované půdě, tak zvláště v myceliální hmotě. Proto, jestliže se avermectiny mají přímo zkrmovat zvířaty, má se veškerá fermentační půda sušit a smíchat s krmivém pro taková zvířata.

Výhodněji se avermectiny oddělují od fermentační půdy jako celku a izolace jednotlivých avermectinových sloučenin se provádí rozpouštědlovou extrakcí a chromatickou frakcionací za použití různých chromatografických technik a rozpouštědlových systémů. Způsoby oddělování a izolace avermectinů jsou popsány v americkém patentovém spise číslo 4 429042 a v článku Miller, T.W a kol., Antimicrob. Agents Chemother., 15(3), str. 368 až 371, 1979. Výhodné způsoby takového oddělování a izolace jsou popsány v následujících příkladech.

Produkované a izolované avermectiny jsou zvláště vhodné pro ošetřování zvířat, která jsou infikována parazity a jsou zvláště užitečné jakožto antihelmentika, insekticidy aakaricidy. Antiparazitické použití je dobře známé pro ošetřování zvířat (například americký patentový spis číslo 4 429042 a 4 310519).

Kromě toho avermectin, dobře známý derivát směsi redukovaného avermectinů Bia a Blb, se případně připravuje způsobem, který popsali Chabula a kol., americký patentový spis číslo 4 199569).

Vynález blíže objasňují následující příklady praktického provedení, které však nejsou míněny jako nějaké omezení vynálezu.

V následujících příkladech ¹³C nukleární magnetické rezonanční spektrální hodnoty pro avermectinové sloučeniny Ala, Alb, A2a, A2b, Bia, Blb, B2a, B2b v deuterovaném chloroformovém roztoku jsou získány na spektrometru Generál Electric Model QE 300

CZ 282908 B6

(Fremont, CA). Objem roztoku každého vzorku je 0,7 ml. Chemické posuny pro každou avermectinovou sloučeninu se zřetelem na deuteterovaný chloroform jsou udávány v ppm (77 ppm). Hodnoty FABMS jsou získány za použití spektrometru ZABII-SE (VG Analytical, Manchester, Anglie).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Fermentace A58267.2

A. Třepací baňka

Kultury Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005, udržované v kapalném dusíku, se používá k inokulaci (0,5 ml) prvního stupně vegetativního prostředí o následujícím složení:

Vegetativní prostředí

Složka sojová půda tripticase kvasničný extrakt heptahydrát síranu hořečnatého glukóza maltóza

Množství (g/1) 30,0 3,0 2,0 5,0 4,0

deionizovaná voda q.s do 50,0 ml, bez nastavení hodnota pH 7,0, hodnota pH nenastavena, následuje sterilizace, po sterilizaci je hodnota pH 6,9.

Naočkované vegetativní prostředí se inkubuje v Erlenmayerově baňce se širokým hrdlem o obsahu 250 ml při teplotě 30 °C po dobu přibližně 46 hodin na třepačce, kroužící v 5,08 cm kruhu při otáčkách 250/min. Baňka se chrání dvěma biologicky stíněnými filtry a úhel plošiny třepačky je 0°.

B. Fermentace A58267.2 v tanku

K vytvoření většího objemu inokula, 10 ml inkubovaného prvního stupně prostředí, připraveného jak shora popsáno v odstavci A, se používá k inokulaci 400 ml druhého stupně vegetativního prostředí, majícího stejné složení jako první stupeň vegetativního prostředí. Tento druhý stupeň se inkubuje v Erlenmayerově baňce se širokým hrdlem o obsahu 2 litry při teplotě 30 °C po dobu přibližně 48 hodin na třepačce, kroužící v 5,08 cm kruhu při otáčkách 250/min. Baňka se rovněž chrání dvěma biologicky stíněnými filtry a úhel plošiny třepačky je 0°.

Pro druhý stupeň se používá vegetativního prostředí (400 ml) k inokulaci 107 litrů sterilního prostředí o složení:

Produkční prostředí

Složka sojová mouka bramborový dextrin ovesná mouka baby melasa (blackstrap)

Množství (na 1 litr) 5,0 g 80,0 g 5,0 g 5,0 g

uhličitan vápenatý glycerol minerální produkt Czapek

2,0 g

1,0 ml

2,0 ml deionizovaná voda q.s do 170 1, bez nastavení hodnota pH 6,5, hodnota pH nastavena na 7,3 přibližně 30 ml 5N roztoku hydroxidu sodného, po sterilizaci je hodnota pH 7,0, přidán protipěnicí prostředek SAG 471 v množství 0,2 g/1 (Union Carbide, Sistersville, West Virginia).

Inokulované produkční prostředí se nechává fermentovat v míchaném fermentačním tanku o obsahu 115 litrů po 10 až 11 dní při teplotě 30 °C. Udržuje se koncentrace rozpuštěného kyslíku přibližně 45 % sycením vzduchem a nízký počet otáček (přibližně 137 až přibližně 225) v míchané nádobě.

Příklad 2

Obecná izolace avermectinů

Veškerá fermentační půda 115 litrů, připravená podobným způsobem, jako je popsáno v příkladu 1, se upraví na hodnotu pH 6,5 5N kyselinou chlorovodíkovou. Přidá se stejný objem methanolu do roztoku a roztok se zfíltruje keramickým filtrem Memvralox (U.S. Filter/SCT, Bazet, France). Filtrát se pak vede sloupcem, obsahujícím 10 litrů HP-20SS (Diaion) (Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japonsko). Sloupec se nejdříve eluuje lineárním gradientem 50 až 100 % methanolu ve vodě. Shromážděné frakce se analyzují vysokotlakovou chromatografií na 4,6 mm (vnitřní průměr) x 30 cm sloupci, obsahujícím Dynamax C_I8 (Rainin Company, Wobum, MA). Sloupec se eluuje za použití isokratického gradientu systému methanol:methylkyanid:(0,2% kyselina octová, hodnota pH nastavena na 5,0 hydroxidem sodným), 44 : 44 : 12 za průtoku

1,5 ml/min. Frakce se spojí do dvou souborů na základě analýzy vysokotlakovou chromatografií. Spojené frakce se zkoncentrují za sníženého tlaku na přibližně 500 ml vodného roztoku. Spojené frakce se extrahují chloroformem a extrakty se odpaří, čímž se získá 18,25 g oleje (spojené frakce A) a 6,48 g oleje (spojené frakce B).

Příklad 3

Zpracování spojené frakce A

Spojené frakce A (18,25 g) podle příkladu 2 se rozpustí ve 45 ml methanolu a chromatografuj í se na 5 cm (vnitřní průměr) x 1,1 m sloupci, obsahujícím Sephadex LH-20 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Sloupec se eluuje methanolem a frakce se analyzují vysokotlakovou chromatografií. Frakce, obsahující avermectiny, se spojí na dvě spojené frakce a odpaří se, čímž se získá spojená frakce C (10,96 g) a spojená frakce D (1,45 g).

Příklad 4

Zpracování spojené frakce C

Materiál ze spojené frakce C (2 g) podle příkladu 3 se rozpustí ve 4,5 ml methanolu a chromatografuje se na 41,4 mm (vnitřní průměr) x 25 cm sloupci, obsahujícím Dynamax-60A C]₈ (Rainin. Wobum, Massachusetts). Sloupec se eluuje lineárním gradientem methylkyanid:methanol:voda 40 : 40 : 20 až 46 : 46 : 8 po dobu 100 minut za průtoku 15 ml/min. Na základě vysokotlakové chromatografie se získají čtyři spojené frakce: spojená frakce E (489 mg), spojená frakce F

- 11 CZ 282908 B6 (624 mg), spojená frakce G (656 mg), spojená frakce H (177 mg).

Příklad 5

Izolace avermectinu Ala

Spojené frakce B podle příkladu 2 se rozpustí ve 30 ml methanolu a chromatografují se způsobem podle příkladu 3. Sloupec se eluuje methanolem a frakce se analyzují vysokotlakovou chromatografií. Frakce, obsahující avermectiny, se spojí a odpaří se, čímž se získá zbytek (658 mg). Část (200 mg) tohoto zbytku se chromatografuje na 2,5 cm (vnitřní průměr) x 30 cm sloupci, obsahujícím Chromegabond MC18 (ES Industries, Berlin, New Jersey) za použití gradientu methylkyanid:methanol:voda 40 : 40 : 20 až 42 : 42 : 16 po dobu 90 minut za průtoku 5 ml /min. Tak se získá 63 ml avermectinu Ala,

MS: FAB m/z = 909 [Aver_Ai_a+Na]⁺ ^,3C NMR (75 MHz, CDC1₃) _bI 11,96 12,88 15,03 16,30 17,62 18,32 19,82 20,18 27,44 30,50 34,18 34,43 35,13 36,52 39,66 40,41 45,61 56,32 56,41 57,69 67,18 68,07 68,15 68,32 74,83 74,83 76,01 76,89 77,41 78,15 80,43 80,50 81,92 118,25 118,31 119,58 124,79 135,10 135,98 136,08 137,58 139,85 173,81 94,88 98,44 68,33 127,74.

Příklad 6

Izolace avermectinu A2a a Blb

Materiál ze spojené frakce F podle příkladu 4 se rozpustí ve 2,5 ml methanolu a chromatografuje se na sloupci podle příkladu 4. Sloupec se eluuje izokraticky gradientem methanokvoda 85 : 15 za průtoku 15 ml/min, čímž se získá čistý avermectin A2a (202 mg),

MS: FAB m/z = 927 [Aver^Na]* ^l3C NMR (75 MHz, CDCl₃)_bI 173,4 139,83 137,48 135,79 135,60 124,80 119,65 118,43 117,47 99,56 98,41 94,78 81,67 80,50 80,36 79,24 78,15 77,50 76,80 75,90 70,67 69,79 68,25 68,12 68,06 67,55 67,18 57,60 56,38 45,54 41,06 40,70 39,62 36,27 35,61 35,04 34,41 34,26 34,07 27,18 20,20 19,86 18,31 17,65 15,06 13,72 12,37 11,75;

a avermectin Blb (79 mg); MS:FAB m/z= 881 [Aver_Bi_b+Na]⁺;

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃) _bI 173,56 139,54 137,95 137,80 135,97 135,07 127,72 124,70 120,31 118,28 118,00 98,43 95,63 94,88 81,83 80,38 80,32 79,32 79,22 78,22 77,26 75,96 68,32 68,28 68,24 86,10 67,67 67,21 56,46 56,36 45,66 40,45 39,72 36,63 34,52 34,22 30,88 28,31 21,03 20,18 19,88 18,37 17,68 16,51 15,08 14,86.

Příklad 7

Izolace avermectinu Alb a Bia

Materiál ze spojené frakce G podle příkladu 4 se rozpustí ve 3 ml methylkyanidu a chromatografuje se na 2,5 cm (vnitřní průměr) x 30 cm sloupci, obsahujícím Chromegabond MC18 (ES Industries, Berlin, New Jersey) za použití lineárního gradientu methylkyanid:voda 73 : 27 až 80 : 20 po dobu 100 minut za průtoku 5 ml/min ve třech oddělených operacích. Tak se získá čistý avermectin Alb (145 mg),

- 12CZ 282908 B6

MS: FAB m/z = 895 [Aver_Alb+Na]⁺;

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃) _ω 173,39 139,61 137,35 135,60 134,87 127,58 119,45 118,29 118,07 98,22 94,41 94,69 81,68 80,29 80,22 79,10 77,99 77,28 77,00 76,65 75,73 68,08 68,05 67,91 66,98 57,43 56,21 56,18 45,39 40,24 39,45 36,36 34,30 34,05 30,65 28,09 20,82 20,03 5 19,66 18,15 17,48 16,31 14,87 14,64 124,63;

a avermectin Bia (245 mg); MS:FAB m/z = 895 [AverBia+Na]⁺;

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃) _bI 173,40 139,53 137,84 137,70 136,08 135,08 127,74 124,69 120,23 118,23 117,94 98,42 95,69 94,87 81,69 80,23 80,15 79,13 78,05 75,69 74,61 68,12 68,03 ίο 67,93 67,46 67,01 56,26 56,17 45,43 40,28 39,51 36,33 34,93 34,23 34,05 30,32 27,25 19,99

19,66 18,14 17,50 16,15 14,85 12,74 11,81.

Příklad 8

Izolace avermectinu A2b, B2a a B2b

Materiál ze spojené frakce E podle příkladu 4 se rozpustí ve 1,9 ml methylkyanidu a chromatografuje se na sloupci podle příkladu 7. Sloupec se eluuje lineárním gradientem 20 methylkyanid:voda 65 : 35 až 75 : 25 po dobu 100 minut za průtoku 5 ml/min ve dvou oddělených operacích. Tak se získá čistý avermectin A2b (80 mg),

MS: FAB m/z = 913 [Aver^+Na]’;

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃) _bI 137,60 139,83 137,47 135,92 135,54 124,75 119,52 118,21 25 117,44 99,53 98,37 94,69 81,53 80,43 80,30 79,21 78,10 77,34 76,81 75,92 72,24 69,75 68,24

68,10 68,05 67,45 67,14 57,65 56,38 56,31 45,52 40,99 40,63 39,60 36,37 35,95 34,47 34,14

27,86 20,68 20,16 19,80 18,29 17,59 15,05 13,85 13,55;

avermectin B2a (125 mg); MS:FAB m/z = 913 [Aver_B2a+Na]⁺;

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃) _b[ 173,63 139,68 138,01 135,62 - 135 124,72 120,34 117,92 117,54

99,63 98,47 94,77 81,55 80,35 79,31 79,08 78,17 76,07 72,35 69,86 68,43 68,32 68,10 67,68

67,51 67,25 -56,3 -56,3 45,67 41,11 40,72 39,75 36,55 36,07 34,57 34,24 34,17 34,17 27,96

20,80 20,21 19,97 18,41 17,68 15,17 13,95 13,67;

a avermectin B2b (145 mg); MS:FAB M/Z = 899 [AverB2b+Na]⁺;

¹³C NMR (75 MHz, CDC1₃) _bI 173,09 139,44 137,65 137,57 135,44 124,50 120,90 117,76 117,34 99,41 98,26 94,63 81,47 80,19 79,20 79,10 78,04 75,72 70,57 69,66 68,10 68,03 67,97 67,45 67,36 67,05 56,28 56,24 45,45 40,57 39,52 36,17 35,46 34,90 34,26 34,09 33,91 27,04 20,00 19,69 18,16 17,51 14,91 13,56 12,33 11,59.

Průmyslová využitelnost

Nový mikroorganismus, Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005, je vhodný pro 45 produkci známých avermectinů a ivermectinu, sloučenin s antiparazitickým působením.

Claims

1. Kmen Streptomyces, kterým je biologicky čistá kultura mikroorganismu Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005.

2. Způsob produkce alespoň jedné avermectinové sloučeniny, vyznačující se tím, že se kultivuje Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005 ve vodném kultivačním prostředí, obsahujícím asimilovatelný zdroj uhlíku, dusíku a anorganických solí za submerzních aerobních podmínek až do produkce alespoň jedné avermectinové sloučeniny.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že produkovaná avermectinová sloučenina je ze souboru, zahrnujícího avermectin Ala, Alb, A2a, A2b, Bia, Blb, B2a, B2b.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se produkovaný avermectin nebo produkované avermectiny izolují z kultivačního prostředí.

5. Způsob produkce avermectinu podle nároku 2, vyznačující se tím, že se kultivuje Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005 ve vodném kultivačním prostředí, obsahujícím asimilovatelný zdroj uhlíku, dusíku a anorganických solí za submerzních aerobních podmínek až do produkce avermectinové sloučeniny Bia a Blb, načež se Bia a Blb redukuje.