HUT69970A - Strains of streptomyces for producing antiparasitic compoounds and processes thereuith - Google Patents

Strains of streptomyces for producing antiparasitic compoounds and processes thereuith Download PDF

Info

Publication number
HUT69970A
HUT69970A HU9303366A HU9303366A HUT69970A HU T69970 A HUT69970 A HU T69970A HU 9303366 A HU9303366 A HU 9303366A HU 9303366 A HU9303366 A HU 9303366A HU T69970 A HUT69970 A HU T69970A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
avermectin
culture
strain
streptomyces avermitilis
avermectins
Prior art date
Application number
HU9303366A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9303366D0 (en
Inventor
Raymond Che-Fong Yao
Otis Webster Godfrey
Rosanne Bonjouklian
Tim Allen Smitka
Original Assignee
Lilly Co Eli
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lilly Co Eli filed Critical Lilly Co Eli
Publication of HU9303366D0 publication Critical patent/HU9303366D0/hu
Publication of HUT69970A publication Critical patent/HUT69970A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/60—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin
    • C12P19/62—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen of the saccharide radical directly bound to a non-saccharide heterocyclic ring or a condensed ring system containing a non-saccharide heterocyclic ring, e.g. coumermycin, novobiocin the hetero ring having eight or more ring members and only oxygen as ring hetero atoms, e.g. erythromycin, spiramycin, nystatin
    • C12P19/623—Avermectin; Milbemycin; Ivermectin; C-076
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Az avermektinek a parazitaellenes rokonvegyületeknek olyan k csoportja, melyeket a Streptomyces avermitilis ATCC 31267, 31271 és 31272 törzsek állítanak elő aerob fermentációjuk során; lásd: a 4 310 519 és a 4 429 042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakat. Az utolsó két említett törzset a S.avermitilis ATCC 31267 törzs ultraibolya fénnyel történő besugárzásával kapták, a tenyészetek lefagyasztott, illetve fagyasztva szárított állapotban vannak.
A fent említett szabadalmakban szereplő S.avermitilis törzsek a C-076 néven leírt vegyületcsoportba tartozó vegyületeket termelik (avermiktinek; (I) általános képlet). A csoport nyolc, egymástól megkülönböztethető, de szoros rokonságban lévő tagját írták le: Az Alá, Alb, A2a, A2b, Bla, B2a és B2b avermektint. Az a sorozatban tartoznak azok a természetes avermektinek, ahol a 25-ös helyen egy (S)-szek-butil-csoport van, a b sorozatba tartozó természetes avermektinek szubsztituense a 25-ös helyen egy izopropilcsoport. Az A és B sorozat azt jelzi,hogy az avermektin 5-ös helyén a szubsztituens egy metoxicsoport, illetve egy hidroxilcsoport. Végül T'-es számmal vannak jelölve azok az avermektinek, melyeknél a 22-es és 23-as szénatomok között kettős kötés van, a 2-es számmal jelölteknél a 22-es helyen hidrogénatom, a 23-as helyen hidroxilcsoport kapcsolódik a molekulához.
Az avermektinek (I) általános képletű vegyületek, ahol a szaggatott vonal jelentése egyszeres vagy kétszeres kötés;
* r! jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, de < hidroxilcsoport csak akkor lehet, ha a szaggatott vonal jelentése egyszeres kötés;
R2 jelentése izopropil- vagy szek-butil-csoport;
R2 jelentése metoxi- vagy hidroxilcsoport.
Más S.avermitilis törzsek egy vagy több természetes - ahol a 25-ös hely szubsztituense izopropilcsoport vagy (S)-szek-butil-(1-metil-propil)-csoport - vagy nem természetes - ahol a 25-ös hely szubsztituense más, mint izopropil- vagy (S)-szek-butil-csoport - avermektint termelnek. Ilyenek például a S.avermitilis ATCC 31780 törzs (4 387 353 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom), az ATCC 53567 és ATCC 53568 törzsek (EP 276 131 számú európai szabadalmi bejelentés); az ATCC 53692 törzs (EP 276 103 számú európai szabadalmi bejelentés) és az NCIB 12121 törzs (EP 214 731 számú európai szabadalmi bejelentés). Mindezek a törzsek közvetlenül vagy közvetve a Streptomyces avermitilis ATCC 31267 törzsből származnak. Az egy vagy több avermektint termelő, fent említett törzsek kizárólag a szülőtörzset és leszármazottait foglalják magukba.
Az irodalomban szerepel egy másik S.avermitilis törzs is, az ATCC 53814 (5 015 662 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom) . Ez annyiban különbözik az előbbiektől, hogy képes átalakítani a milbemicin típusú vegyületeket és nem képes jelentős mennyiségű avermektint termelni.
A jelen találmány egy új avermektint termelő törzzsel, a • · · « Streptomyces avermitilis subspecies niger, NRRL 12005 törzzsel < szolgál.
A találmány tárgya, a Streptomyces avermitilis sp. niger NRRL 21005 törzs vagy avermektint termelő mutánsának vagy változatának biológiailag tiszta tenyészete.
A találmány további tárgya, eljárás egy vagy több avermektint termelésére, mely abból áll, hogy a Streptomyces avermitilis sp. niger NRRL 21005 törzset vagy avermektint termelő mutánsát vagy variánsát asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó vizes tápközegben süllyesztett, aerob körülmények között addig tenyésztjük, amíg egy vagy több avermektin nem termelődik, majd az így keletkezett avermektin(eke)t kinyerjük.
Az 1. ábrán bemutatjuk a Streptomyces avermitilis sp. niger NRRL 21005 (A58267.2) és más Streptomyces avermitilis törzsek dendrogramj át.
A 2. ábra az A58267.2 törzs és más Streptomyces avermitilis törzsek közötti rokonsági viszonyt mutatja be a zsírsavanalízis adatai alapján.
A találmány tárgya a Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005 (az NRRL 21005 törzs) vagy ennek avermektint termelő mutánsának vagy változatának biológiailag tiszta tenyészete.
A találmány szerinti új, avermektint termelő mikroorganizmust A58267.2 tenyészet elnevezéssel láttuk el. Az A58267.2 • tenyészet az A58267.21 tenyészetnek egy javított törzse. Az < A58267.21 törzs az A58267 tenyészetnek egy természetes változata.
Az A58267 törzset Olaszországban gyűjtött talajmintából izolálták.
Az A58267.2 tenyészetet a Budapesti Egyezmény szerint helyeztük letétbe NRRL 21005 nyilvántartási számon a Northern Régiónál Research Center törzsgyűjteményben (Agricultural Research Service, North Central Region, United States Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604).
Az A58267.2 (NRRL 21005) törzs rendszertani vizsgálatát Frederick P.Mertz (Lilly Research Laboratories) végezte. A vizsgálatok alapján az új mikroorganizmust a Streptomyces avermitilis új alfajának (törzs) tekintjük és a
Streptomyces avermitilis sp. niger elnevezést javasoljuk. A meghatározás a hasonló fajok közölt leírásainak tanulmányozásán és közvetlen laboratóriumi rendszertani besorolási vizsgálatokon alapszik.
A rendszertani vizsgálatokhoz az International Streptomyces Project (ISP) a Streptomyces fajok jellemzésére ajánlott módszereit [Shirling E.B. és Gottlieb D., Methods fór characterisation of Streptomyces species, Int. J. Syst. Bacteriol., 16: 313-340 (1966)], valamint a Nocardia fajok jellemzésére ajánlott vizsgálatokat [Gordon R. E., Barnett D. A., Handerhan J. E. és Pang. C. H., Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica, and the • · • · · · · · · • ·· ··· · ···
Nocardin strain., Int. J. Syst. Bacteriol., 24(1): 54-63 (1974)] alkalmaztuk.
A színek megnevezése az ISCC-NBS Centroid Color Charts, standard sample No. 2106 (National Bureau of Standards, 1958, U.S. Department of Commerce, Washington, D.C.) alapján történt.
A morfológiai vizsgálatokhoz fénymikroszkópot és letapogató elektronmikroszkópot használtunk.
A diamino-pimelinsav (DAP) izomert és a szénhidrátokat Becker és munkatársai [Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chomatography of whole-cell hydrolysates., Appl. Microbiol., 12:421-423 (1964)] és Lechavalier és munkatársai [A University Laboratory Approach, Dietz és Thayer szerk., Society fór Industrial Microbiology, Special Publication No.6 Arlington, Virginia, 227-233. old.] kromatográfiás módszereivel határoztuk meg a teljes sejt hidrolizátumban.
Az antibiotikumokkal szembeni ellenállóképesség meghatározásához a beoltott ISP No.2 agarlemezek felszínére antibiotikumérzékenységi korongokat helyeztünk. Ha nem tapasztaltunk gátlási zónát az ellenálló képességet (+) jellel jelöljük, (-) jelet használunk, ha a gátlási zóna kialakulása megfigyelhető volt.
A menakinon összetételt Kroppenstedt R. M. (Chemical methods in bacterial systematics, szerk.: M. Goodfellow és D. E. Minnikin, 173-196. old. (1985) és Collins M. D. (idézett mű 267285. old.) módszerével határoztuk meg.
• · · · ·
A zsírsavanalízishez Miller L. és munkatársai módszerét alkalmaztuk [HP 5898A Microbial Identification Systematics; Bacterial identification by gas chromatography of whole-cell fatty acids, Hewlett-Packard Application Note 228-41, 8. old. (1985)] .
A zsírsav-metil-észtereket az azonos körülmények között növesztett sejtek fagyasztva szárított teljes sejtjeiből készítettük.
A nátrium-klorid-toleranciát ISP No.2 agaron határoztuk meg a kívánt mennyiségű sót adva a tápközeghez.
Az 1. ábra denárogromja az euklidészi távolságot alkalmazza és kompjuterrel alkottuk.
A 2. ábra komponens analízise kétdimenziós és ugyancsak kompjuterrel készült.
Az A58267.2 tenyészet a legtöbb tápközegen rosszul nő és nem képez légmicéliumot sem összetett, sem speciális táptalajon. A fonákoldal színe sárgásbarna, kivéve a Bennett agaron nőtt tenyészetét, ahol fekete festékanyag termelődik. Az ISP 2 táptalajon halványbarna pigment, a Bennett agaron vöröses-barna oldható pigment keletkezik. Az I. táblázatban összefoglaljuk a tenyészetek jellemző tulajdonságait.
© ·
I. TÁBLÁZAT
Az A58267.2(l) tenyészet jellemzői
táptalaj növekedés fonák oldal színe légmicélium felületi oldható
szín pigment
ISP 2 jó 80.gy. yBr. nincs nincs light-Br.
ISP3 gyenge 78.d.yBr. nincs nincs nincs
ISP4 közepes 93.y.Gray nincs nincs nincs
ISP5 nincs nincs nincs nincs nincs
ATCC med.172 nincs 78.d.yBr nincs nincs nincs
Bennett agar nagyon jó 65.br.Blk nincs nincs reddish-Br.
kálcium-
-malát gyenge 9 0 . gy. Y. nincs nincs nincs
gyapotmag-
-agar közepes 91.d.gy.Y. nincs nincs nincs
Czapek nincs nincs nincs nincs nincs
glükóz-
aszparagin nincs nincs nincs nincs nincs
glicerin-
glicin nincs nincs nincs nincs nincs
huminsavagar nincs nincs nincs nincs nincs
NPBM2 nagyon j ó 78.d.yBr. nincs nincs nincs
nutrient-
agar gyenge gy.d.gy.Y. nincs nincs nincs
keményítő-
kazein-agar közepes gy·d.gy.Y. nincs nincs nincs
paradicsom-
zabliszt nincs nincs nincs nincs nincs
csapvizes-
-agar nincs nincs nincs nincs nincs
élesztő-dext-
róz agar nagyon j ó 9 0.gy. Y. nincs nincs reddish-Br.
« ·· ·· · • · · · (1) - 18 napos tenyésztés 30°C hőmérsékleten (2) - NPBM = 1 liter ionmentes vízben 5 g szójaliszt, 5 g földi- mogyoróliszt, 5 g fekete melasz, 5 g erjesztés! gabonamaradék, 5 g zabliszt, 1 g glicerin, 50 g burgonya-dextrin, 2 ml Czapek-féle ásványisó-oldat.
A táblázatban használt színmegjelölések:
gy.yBr -szürkés, sárgás barnak; light-Br. - halvány barna,
d.yBr - sötét sárgásbarna; y.Gray - sárgás szürke; br.Blk. - barnás fekete; reddish-Br -vörösesbarna;
gy.Y. - szürkés sárga; d.gy.Y - sötét szürkés sárga.
Morfológiai megjelenés:
Az A58267.2 tenyészetnél léghifák nem keletkeztek. Következésképpen morfológiai és spórafelszín vizsgálatokat nem tudtunk végezni. Sporangium, rajzósejt vagy szkelerócium nem volt megfigyelhető. Az A58267.2 tenyészet szilárd vagy folyékony tápközegben tenyésztve sem fragmentálódott a növekedés alatt.
Fiziológiai jellemzők
ISP9 alaptáptalajon az A58267.2 tenyészet az alábbi szénhidrátokat hasznosítja: D és L arabinóz, cellobióz, D-fruktóz, D-galaktóz, D-glükóz, glicerin, glikogén, izo-inozitol, inulin, D-maltóz, D-mannitol, D-mannóz, melebióz, D-raffinóz, L-ramnóz, D-ribóz, trehalóz, xilitol és D-xilóz. ISP9 alaptáptalajon az A58267.2 tenyészet nem tudja hasznosítani a következő szénhid• « ♦
- 10 rátokat: adonitol, cellulóz, dextrin, dulcitol, etanol, izoeritritol, D-laktóz, melizitóz, α-metil-D-glükozid, szalicin, szorbitol, L-szorbóz és szacharóz.
Az A58267.2 lebontja az adenint, kálcium-malátot, kazeint, keményítőt és karbamidot.
Az A58267.2 katalázt, kén-hidrogént termel, elfolyósítja a zselatint, túléli a nyolcórás 50°C hőmérsékletnek kitettséget. Az A58267.2 eltűri a 6 %-os nátrium-klorid koncentrációt.
Az A58267.2 képtelen hidrolizálni az allantoint, elasztint, eszkulint, guanint, hippurátot, hipoxantint, tesztoszteront, elasztint, tirozint vagy xantint. Nem termel melanoid pigmenteket, nem redukálja a nitrátokat, nem képez foszfatázt és nem rezisztens a lizozimmal szemben 50 mg/ml koncentrációnál.
Az A58267.2 tenyészet rezisztens milliliterenként 2 μg linkomicinnel, 30 μg nalidixinsawal, 10 egység penicillin G-vel, 300 egység polimixin B-vel vagy 5 μρ trimetoprimmel szemben. Az A58267.2 szenzitív milliliterenként 10 egység bacitracinra, 30 μg cefalotinra, 30 μg kloromicinre, 15 μg eritromicinre, 10 μg gentamicinre, 30 μg neomicinre, 30 μg novobiocinre, 15 μg oleandomicinre, 5 μg rifampinra, 10 μg sztreptomicinre, 30 μg tetraciklinre, 10 μg tobramicinre vagy 30 μg vankomicinre.
Az A58267.2 tenyészet 15°C és 37°C közötti hőmérséklettartományban növekszik. A növekedés optimális hőmérséklete: 30°C.
c * »· ·· · ···
- 11 Sej tfalanalízis
A szülő A58267.21 törzs sejtfalanalízise azt mutatja, hogy a hidrolizált teljes sejt LL-diamino-pimelinsavat (DAP) tartalmaz. A teljes sejt extraktumában lévő cukor: glükóz és ribóz. Zsírsavtípus: 2C, a fő menakinon komponens: MK-9 (Ηθ). A vizsgálatok eredménye tipikusan a Streptomyces genusz sejtfaltípusát mutatja és várható a hasonlóság az A58267.2 törzséhez.
Az A58267.2 azonosítása
Az 58267.2 tenyészet I-es sejtfaltípusú, a teljes cukor összetétele NC típusú, a fő menakinon komponens az MK-9 (H6).
Az A58267.2 kemotaxonómiai adatai, a tenyészeti és morfológiai jellemzői alátámasztják, hogy az izolált törzs a Streptomyces genuszhoz tartozik [1. Lechevalier és munkatársai, Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic Actinomycetes; Int. J. Syst. Bacteriol., 20:435-443 (1970)] .
Noha az ATCC Catalogue of bacteria and bacteriophages (18. kiadás, 1192.) katalógusban a Streptomyces avermitilis 11 törzse szerepel, a 11 törzs közül 10 törzsnél bizonyították, hogy közvetlenül vagy közvetve a S.avermitilis ATCC 31267 a szülőtörzs. Amikor nem az ATCC 31267 (A54508), akkor gyakran az elsőgenerációs leszármazott ATCC 31272 (A54508.3) a közvetlen szülőtörzs. Az ATCC 31267 vagy 31272 leszármazottjának irodalmi leírása azt mutatja, hogy a leszármazott általában rendelkezik • · · *·····«*·
- 12 a szülőtörzs tulajdonságaival, de van(nak) bizonyos kis különbségiek). (Lásd például az ATCC 53567 és 53568 taxonómiaia leírását az EP 276 131 számú európai szabadalmi bejelentésben). így összehasonlítottuk az egyetlen ismert közvetlen vagy közvetett szülőtörzset, a S.avermitilis ATCC 31267/A54508 törzset, az egyik előgenerációs leszármazottját, az ATCC 31276/A54508.3 törzset és az ATCC 21005 (A58267.2) törzset.
Egy igen determinatív összehasonlításban zsírsavanalízist végeztünk az A58267.2, A54508 és A54508.3 törzseken. A II. táblázatban feltüntetjük, hogy az egyes törzsekben milyen a jellemző zsírsavak százalékos megoszlása.
- 13 II. TÁBLÁZAT
Az A58267.2 törzs és két Streptomyces avermitilis törzs (-*-) zsírsavösszetétele
zsírsav A58267.2 A54508 A54508.3
14:0 izo (izo-mirisztinsav) 3,36 7,95 4,67
15:0 izo 22,30 11,11 11,24
15:0 anteizo 19,29 21,41 22,99
15:0 (pentadekánsav) 2,45 2,08 2,17
16:1 izo H 4,23 4,68 1,96
16:0 izo (izo-palmitinsav) 14,02 19,85 16,43
16:1 cisz 9 (plamitoleinsav) 3,93 3,31 2,82
16:0 (palmitinsav) 4,53 3,26 5,14
17:1 izo F 7,57 6,07 6,27
17:1 anteizo C 3,42 3,56 3,07
17:0 izo (izo-margarinsav) 5,51 5,12 7,83
17:0 anteizo 5,88 8,23 11,93
A sejtek TSB-ben voltak nőve s z tve 28°C-on 4 napon át.
A zsírsavösszetétel kompjuterrel készített dendrogramj
az 1. ábrán mutatjuk be. A dendrogram az euklideszi távolságokon mutatja be az A58167.2 törzs rokoni kapcsolatát a többi
Streptomyces avermitilis törzshöz.
A tenyészetek 10,00-es szint alatti rokonsági viszonyát szinonimának, azaz azonos fajnak tekintjük. Az A58267.2 a 10,00-es szint feletti viszonyban van az S.avermitilishez.
Az alapvető komponensanalízis a sokváltozós statisztika egyik ágazata, ami a változók sorozatának belső összefüggéseivel foglalkozik. Az ilyen analízisben az eredeti adatok vagy vizsgálati eredmények varianciájának legnagyobb mennyiségi értékét jelenítjük meg, mint alapvető komponenst. [Alderson G. The application and relevance of nonhierarchie methods in bacterial taxonomy, in Computerassisted bacterial systematics; szerk.: Goodfellow és munkatársai, Academic Press, New York (1985)]. így megszerkeszthető a szóródást vagy variabilitást mutató grafikon. Ezután a variancia tanulmányozásával megállapíthatók a rokonsági viszonyok és jellemezhető egy mikrobiális populáció. A zsírsavakra vonatkoztatott kétdimenziós alapkomponens görbe megmutatja az A58367.2 tenyészetnek és szülőtörzsének, az A58267 törzsnek a viszonyát más S.avermitilis fajhoz. Ezeket az adatokat mutatjuk be a 2. ábrán.
Úgy a dendrogramban, mint az alapkomponens grafikonján két elkülönült csoport jelenik meg. Az A58267.2 és az A58267.1 alkot egy csoportot és az A54580, valamint az A54580.3 alkot egy másik csoportot. Ez a két csoport kellően hasonlít annak megállapításához, hogy közöttük rokoni kapcsolat van, de ugyancsak kellően különbözik is egymástól ahhoz, hogy megállapíthassuk sem a két
csoport, sem az egyes törzsek nem azonosak.
Az A58267.2 és az A54840.3 közötti különbözőségeket a III. táblázatban mutatjuk be.
III. TÁBLÁZAT
A S.avermitilis A58267.2 és A54580.3 törzsek közötti eltérések tulaj donság
A58267.2 A54580.3
spóraképzés légmicéliumon - -
növekedés kalcium-malát agaron - +
pigmentképződés a fonák oldalon
Bennett agaron fekete barna
oldható pigment termelése élesztő-
-dextróz agaron + -
antibiotikum rezisztencia:
linkomicin + -
polimixin B + -
növekedés 7 % NaCl-ban - +
lebontás:
eszkulin - +
hippurát - +
hipoxantin - +
xantin - +
lizozim rezisztencia, 50 μg/ml - +
melanoid pigment termelése - +
nitrát redukció - +
savas termék raffinózból + -
zsírsavösszetétel, %:
15:0 izo 22,30 11,24
15:0 anteizo 19,29 22,99
15:1 izo H 4,23 1,96
16:0 izo 14,02 16,43
17:0 izo 5,51 7,83
17:0 anteizo 5,88 11,93
Amint az előzőekben megállapítottuk, nincs kellő különbség az S.avermitilis A58267.2 törzs és az A54508/A54508.3 között ahhoz, hogy megállapíthassuk, az A58267.2 egy elkülönült faj. A két törzs között azonban kellő hasonlóság van ahhoz, hogy megállapítsuk, hogy az A58267.2 az ismert Streptomyces avermitilis törzsek megkülönböztethető és elválasztható alfaja (törzs), így az A58267.2 törzset Streptomyces avermitilis subspecies niger NRRL 21005 elnevezéssel láttuk el. A niger elnevezés a Bennett agaron megjelenő megkülönböztető színből származik.
A találmány egy másik tárgya, eljárás egy vagy több avermektin előállítására, ami abból áll, hogy a Streptomyces avermitilis sp. niger NRRL 21005 törzset vagy annak avermektint termelő mutánsát vagy változatát asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó vizes tápközegben · ··· Λ • ···· · . * ··· ·· · ·. · · tenyésztjük süllyesztett tenyészetként, aerob körülmények között, amíg egy vagy több avermektin nem termelődik, majd a nevezett avermektineket kinyerjük. A termelődött avermektinek kinyerésére és tisztítására az ismert módszerek valamelyikét használjuk fel.
Mint más mikroorganizmusok esetében, az avermektint termelő Streptomyces avermitilis sp. niger NRRL 21005 is kitett a változásoknak. A törzs mutásai ismert módon állíthatók elő, így például különféle fizikai és kémiai mutagénekkel való kezeléssel. Mutagén hatású az ultraibolya, röntgen, gamma besugárzás, az N-metil-N'-nitro-N-nitrozoguanidines kezelés. A törzs természetes változatait ugyancsak megkaphatjuk az ismert módszerek alkalmazásával, például a szülőtörzs szűrővizsgálatával. A
S.avermitilis sp. niger NRRL 21005 avermektint tartalmazó természetes változatai és indukált mutánsai a találmány részét képezik.
A találmány szerinti S.avermitilis tenyészetének kinövesztéséhez nagyszámú tápközeget felhasználhatunk. így például a nagy méretben végzett fermentáció szénhidrát forrása lehet a glükóz, mannóz és különösen a burgonyadextrin, de más szénhidrátok is alkalmazhatók, például ribóz, xilóz, fruktóz, galaktóz, mannitol, stb.
Előnyös nitrogénforrás a szójaliszt, de alkalmazható az enzimmel vagy savval hidrolizált kazein, élesztő, májliszt, húspeptonok, halliszt, stb.
A tápközegben lévő szervetlen sók azok, melyek a tápközegben oldódva cink-, nátrium-, magnézium-, kálcium-, ammónium-, ··· • · · · ·
- 18 klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrát- stb. ionokat szolgáltatnak.
A táptalajnak tartalmaznia kell a mikroorganizmusok növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges nyomelemeket is. Ezek a nyomelemek a táptalaj más komponenseiben szennyezésként általában a növekedéshez szükséges mennyiségben megtalálhatók. Ha habzási probléma jelentkezik, kis mennyiségű (például 0,2 g/liter) habzásgátlót - például 2000 molekulatömeg körüli polipropilén-glikolt - is adhatunk a nagyméretű fermentorba.
A tápközeg alkotórészeinek előnyös koncentrációjára adatokat az 1. példában adunk meg.
Jelentős mennyiségű avermektin termeléséhez előnyös süllyesztett, aerob tenyészetet használni fermentációs tankban. Kisebb mennyiségű A58267.2 tenyészethez rázott lombikban is hozzájuthatunk. A lag-fázis miatt az avermektin termeléshez előnyös vegetatív oltóanyagot használni. A vegetatív oltóanyag elkészítéséhez a kis térfogatú táptalajt a friss, aktívan növekvő tenyészetről nyert spórákkal vagy micélium-fragmensekkel oltjuk be. A vegetatív oltóanyagot azután átvisszük a nagy fermentorba és ezzel megindítjuk az avermektin termelést. A vegetatív tenyészet tápközege lehet ugyanaz, mint amit a nagy fermentorban használunk vagy lehet attól eltérő.
A találmány szerinti eljárásban az A58267.2 mikroorganizmus 15°C és 37°C között tenyésztve termeli az avermektint. Az avermektintermelés szempontjából az optimális hőmérséklet 29°C és
31°C közé esik.
Amint az a süllyesztett aerob fermentációs eljárásnál szokásos, az edény aljáról steril levegőt fújunk a tenyészetbe, mialatt a szokásos turbinalapátos keverővei kevertetjük. Az alkalmazott körülmények között a fermentáció maximális oxigénfelvétele nem haladta meg a 0,16 mM/l/perc értéket. Egy 115 literes, terelőkkel teljesen ellátott fermentor esetében, mely 107 liter tápközeget tartalmaz a levegőztetés és a kevertetés mértékének ahhoz elegendőnek kell legyen, hogy 5,0 atmoszféra belső nyomásnál az oldott oxigén szintje elérje a levegőtelítettségnek legalább 45 %-át.
A fermentáció alatt az avermektin termelődését a tenyészetből vett minták ismert módszerekkel - például HPLC-vel végzett analízisével követhetjük nyomon.
A termelést követően az avermektineket ismert módszerekkel nyerhetjük ki a tenyészléből. Az A58267.2 tenyészet vagy annak avermektint termelő mutánsa vagy változata által termelt avermektinek általában megtalálhatók a tenyészlé szürletében és a kiszűrt micéliumtömegnek is. így, ha az avermektint közvetlenül akarjuk az állatokkal megetetni, a teljes fermentlevet beszáráthatjuk és hozzákeverhetjük az állatok táplálékához.
Előnyösebb azonban az avermektineket kinyerni a tenyészléből. Az egyes avermektin vegyületeket elválaszthatjuk oldószeres extrahálással és kromatográfiás szétválasztással, különféle kromatográfiás technikákat és oldószerrendszereket alkalmazva.
Az avermektinek elválasztására és kinyerésére szolgáló eljárásokat a 4 429 042 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban és Miller T.W. és munkatársai munkájában [Antimicrob. Agents Chemother., 15(3):368-371 (1979)] találhatjuk meg. A szétválasztásra és kinyerésre szolgáló előnyös eljárásokat a későbbiekben a példáknál adjuk meg.
Kinyerés után az avermektinek gyakorlatilag máris felhasználhatók állatok parazitás fertőzésének kezelésére. Különösen alkalmasak arra, hogy féreghajtószerként, inszekticidként vagy rühellenes szerként alkalmazzuk őket. Az antiparazita ellenes szerek alkalmazása jól ismert az állatgyógyászatban és jói dokumentált (lásd például a 4 429 042 és a 4 310 519 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakat)
Továbbá, az ivermektin jól ismert származéka a redukált avermektin Bla és Blb kombinációjának, melynek adott esetben történő előállítására Chabula és munkatársai adnak meg módszereket (4 199 569 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom).
Az elmondottak részletesebb szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg.A példák kizárólag szemléltető célzatúak és a találmány oltalmi körét semmi vonatkozásban nem korlátozzák.
A példákban az Alá, Alb, A2a, A2b, Bla, B2a és B2b avermektin vegyületek mágneses magrezonanciaspektrumát deuterált kloroformban készítettük Generál Electric Mode QE 300 spektrometer (Fremont, CA, USA) alkalmazásával. Valamennyi minta térfogata 0,7 ml oldat. Az avermektin vegyületek kémiai eltoló-
dását deuterált kloroformhoz viszonyítva adjuk meg ppm-ben kifejezve (77 ppm). A FAB-MS adatokat ZABII-SE spektrométerben nyertük (VG Analytical, Manchester, England).
1. példa
Az A58267.2 tenyésztése
A) Rázott lombikban
Az első lépéses vegetatív oltóanyag elkészítéséhez a folyékony nitrogénben tartott Streptomyces avermitilis sp. niger NRRL 21005 tenyészettel az alábbi összetételű tápközeget oltjuk be:
vegetatív tápközeg alkotórész mennyiség g/liter
Tripticase Soy Broth
(enzimmel kezelt szója) 30,0
élesztőkivonat 3,0
magnézium-szulfát.7 víz 2,0
glükóz 5,0
maltóz 4,0
ionmentes vízzel feltöltve 50 ml-re
pH = 7,0 (nem beállított), a kémhatást nem állítjuk be sterilizálás után; sterilizálás után a kémhatás pH = 6,9.
A beoltott táptalajt 250 ml-es szélesszájú Erlenmeyer lombikban rázatjuk 30°C hőmérsékleten 46 órán át. A rázógép
- 22 kitérése 5,08 cm, fordulatszáma 250 percenként. Az edényeket két biológiailag védő lappal zárjuk le, a rázógép asztala 0° szögben áll.
B) Az A58267.2 tankfermentálása
Hogy nagyobb térfogatú oltóanyaghoz jussunk, 10 ml, a fentiek szerint előállított tenyészettel beoltunk 400 ml második lépéses vegetatív tápközeget, melynek összetétele ugyanaz, mint az első lépésnél alkalmazott táptalajé. A második lépéses tenyészetet 2 literes szélesszájú Erlenmeyer lombikokban rázatjuk 30°C hőmérsékleten 48 órán át. A rázógép kitérése 5,08 cm, fordulatszáma percenként 250. A lombikokat ugyancsak két lappal zárjuk le, az asztal állásszöge 0°.
A 400 ml vegetatív tenyészettel 107 liter steril termelő tápközeget oltunk be, mely az alábbi összetételű:
termelő táptalaj alkotórész mennyiség (literenként)
szőj aliszt 5,0 g
burgonya-dextrin 80,0 g
zabliszt 5,0 g
cukoripari melasz 5,0 g
kalcium-karbonát 2,0 g
glicerin 1,0 ml
Czapek-féle ásványisó-oldat 2,0 ml
ionmentes vízzel kiegészítve
107 literre.
• · · Ι_Λ ·· - * **··«* * ·Λ· • ’·· · ·. · .·
- 23 Be nem állított kémhatás pH = 6,5; a tápközeg kémhatását kb.
ml 5 n nátrium-hidroxid oldattal beállítjuk pH = 7,3 értékre; sterilizálás után a kémhatás: pH = 7,0. Adagolt habzásgátló: SÁG 471, literenként 0,2 g (Unión Cambridge, Sistersville, West Virginia).
A beoltott tápközeget 115 literes kevertetett fermentortankban fermentáljuk 30°C hőmérsékleten 10-11 napon át. Fenntartott oldott oxigénszint a levegőtelítettségű érték 45 %-a, a kevertetés fordulatszáma percenként 137-255.
2. példa
Az avermektinek kinyerése
Az 1. példában leírtak szerint nyert teljes fermentlevet 5 n sósavoldattal pH = 6,5 értékre állítjuk be. Azonos térfogatú metanolt adunk a fermentléhez és átszűrjük egy Membralox kerámia szűrőn (U.S. Filter/SCT, Bazet, Franciaország). A szürletet átengedjük egy 10 liter HP-20SS (Diaion) (Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokió, Japán) gyantából készült oszlopon. Az elücióhoz gradiens elüciót használunk, melyhez vizes metanol elegyet használunk a metanol koncentrációját 50 %-ról 100 %-ra emelve. Az összegyűjtött frakciókat HPLC-vel analizáljuk 4,6 mm (átmérő)x 30 cm Dynamax C18 oszlopon (Rainin Company, Woburn, MA, USA). Az oszlopot izokratikus körülmények között eluáljuk, eluensként metanol/acetonitril/0,2 % ecetsav (pH = 5,0 nátrium
-hidroxid oldattal beállítva), 44:44:12 arányú elegyet használva;
átfolyási sebesség percenként 1,5 ml. A HPLC analízis alapján a frakciókat két főfrakcióban egyesítjük, melyeket csökkentett nyomáson 500 ml térfogatú vizes oldatig bepárlunk. A vizes oldatokat kloroformmal extraháljuk, az extraktumokat bepárolva, 18,25 g olajat (A főfrakció), illetve 6,48 g olajat (B főfrakció) nyerünk.
3. példa
Az A főfrakció feldolgozása
18,25 g a 2. példában leírtak szerint nyert A főfrakció bepárlási maradékot feloldunk 45 ml metanolban és egy 5 cm (átmérő)x 1,1 m méretű Sephadex LH-20 oszlopon (Pharmacia, Iscataway, New Jersey, USA) kromatografáljuk. Az oszlopot metanollal eluáljuk, a frakciókat HPLC-vel analizáljuk. Az avermektineket tartalmazó frakciókat két újabb főfrakcióban egyesítjük és ezek bepárlásával 10,96 g (C főfrakció), illetve 1,45 g (D főfrakció) terméket nyerünk.
4. példa
C főfrakció feldolgozása g, a 3. példában leírtak szerint előállított C főfrakció bepárlási maradékot feloldunk 4,5 ml metanolban és 41,4 mm (átmérő)x25 cm méretű Dynamax-60A C18 (Rainin, Woburn,
Massachusettes, USA) oszlopon kromatografáljuk, a lineáris grádiens elúcióhoz acetonitril/metanol/víz elegyet használva, • · t melynek összetétele 10 perc alatt 40:40:20 arányról 46:46:8 arányra változik; átfolyási sebesség percenként 15 ml. A HPLC analízis szerint négy főfrakciót gyűjtünk össze: 489 mg E főfrakció, 624 mg F főfrakció, 656 mg G főfrakció és 177 mg H főfrakció.
5. példa
Az Alá avermektin kinyerése
A 2. példában leírtak szerint nyert B főfrakció bepárlási maradékot 30 ml metanolban oldjuk és a 3. példában leírtak szerint kromatografáljuk. Az oszlopot metanollal eluáljuk, a frakciókat HPLC-vel analizáljuk. Az avermektineket tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk, 658 mg maradékot nyerve. 200 mg bepárlási maradékot 2,5 cm (átmérő)x30 cm méretű Chromegabond MC18 (ES Industries, Berlin, New-Jersey, USA) oszlopon kromatografálunk, a grádiens elúcióhoz acetonitril/metanol/víz elegyet használva, melynek összetételét 90 perc alatt 40:40:20 arányról 42:42:16 arányra változtatjuk; átfolyási sebesség percenként 5 ml. 63 mg Alá avermektint nyerünk.
MS:FAB m/z = 909. [AverAla+Na]+;
I3c-NMR (75 MHz, CDC13) , δ:
11,96, 12,88, 15,03, 16,30, 17, 62, 18,32, 19, 82, 20, 18,
27,44, 30,50, 34,18, 34,43, 35, 13, 36,52, 39, 66, 40,41,
45,61, 56,32, 56,41, 57,69, 67, 18, 68,07, 68, 15, 68, 32,
74,83, 76,01, 76,89, 77,41, 78,15, 80,43, 80,50, 81,92,
118,25, 119,58, 124,79, 135,10, 135,98, 136,08, 137,58,
139,85, 173,81, 94,88, 98,44, 68,33, 127,74.
6. példa
Az A2a és Blb avermektinek kinyerése
A 4. példában leírtak szerint nyert F főfrakció bepárlási maradékot 2,5 ml metanolban oldjuk és a 4. példában leírtak szerint kromatografáljuk. Az oszlopot izokratikus körülmények között eluáljuk metanol/víz, 85:15 elegyet használva; átfolyási sebesség percenként 15 ml.
202 mg kellő tisztaságú A2a avermektint és 79 mg Blb avermektint nyerünk.
A2a avermektin:
MS:FAB m/z = 927 [AverA2a+Na]+;
13C-NMR (75 MHz, CDC13), δ:
173,4, 139,83, 137,48, 135,79, 135,60, 124,80, 119,65,
118,43, 117,47, 99,56, 98,41, 94,78, 81,67, 80,50,
80, 36, 79, 24, 78,15, 77,50, 76,80, 75,90, 70,67,
69, 79, 68, 25, 68,12, 68,06, 67,55, 67,18, 57,60, 56,38,
45, 54, 41, 06, 40,70, 39,62, 36,27, 35,61, 35,04, 34,41,
34, 26, 34, 07, 27,18, 20,20, 19,86, 18,31, 17,65, 15,06,
13,72, 12,37, 11,75.
Blb avermektin:
MS:FAB M/z = 881 [AverBlb+Na]+;
£ «
13C-NMR 875 MHz, CDCI3), δ:
173,56, 139,54, 137,95, 137,80, 135,97, 135,07, 127,72,
124,70, 120,31, 118,28, 118,00, 98,43, 96,63, 94,88,
81,83, 80,38, 80,32, 79, 32, 79,22, 78,22, 77,26, 75,96,
68,32, 68,24, 68,10, 67, 67, 67,21, 56,46, 56,36, 45,66,
40,45, 39,72, 36,63, 34, 52, 34,22, 30,88, 28,31, 21,03,
20,18, 19,88, 18,37, 17, 68, 16,51, 15,08, 14,86.
7. példa
Az Alb és a Bla avermektinek kinyerése
A 4. példában leírtak szerint nyert G főfrakció bepárlási maradékot feloldjuk 3 ml acetonitrilben és 2,5 cm x 30 cm Chromegabond MC18 (ES Industries, Berlin, New Jersey, USA) oszlopon kromatografáljuk három adagban a lineáris grádienshez acetonitril/víz elegyet használva, melyben az arány 100 perc alatt 73:27-ről 80:20-ra változik; átfolyási sebesség percenként 5 ml.
145 mg kellő tisztaságú Alb avermektinhez és 245 mg Bla avermektinhez jutunk.
Alb avermektin:
MS:FAB m/z = 895 [AverA11D+Na]+;
13C-NMR (75 MHz, CDCI3), δ:
173,39, 139,61, 137,35, 135,60, 134,87, 127,58, 119,45,
118,29, 118,07, 98,22, 94,41, 94,69, 81,68, 80,29,
80,22, 79,10, 77,99, 77,28, 77,00, 76,65, 75,73, 68,08, 68,05, 67,91, 66,98, 57,43, 56,21, 56,18, 45,39, 40,24,
39,45, 19,66, 36,36, 18,15, 34,30, 17,48, 34,05, 16,31, 30,65, 14,87, 28,09, 14,64, 20,82, 124,63 20,03,
Bla avermektin:
MS: FAB m/z =895 [AverBla+Na]+; r
13c -NMR (75 MHz, CDCI3) , δ:
173,40, 139,53, 137,84, 137,70, 136,08, 135,08, 127,74,
124,69, 120,23, 118,23, 117,94, 98,42, 95, 69, 94 , 87,
81,69, 80,23, 80,15, 79,13, 78,05, 75,69, 74,61, 68,12,
68,03, 67,93, 67,46, 67,01, 56,26, 56,17, 45,43, 40,28,
39,51, 36,33, 34,93, 34,23, 34,05, 30,32, 27,25, 19,99,
19,66, 18,14, 17,50, 16,15, 14,85, 12,74, 11,81.
8. példa
Az A2b, B2a és B2b avermektinek kinyerése
A 4. példában leírtak szerint nyert E főfrakció bepárlási maradékot 1,9 ml acetonitrilben oldjuk és a 7. példában leírtak szerint kromatografáljuk két adagban. Az oszlopot lineáris grádienssel eluáljuk, eluensként acetonitril/víz elegyet használva, melynek összetételét 65:35 arányról 100 perc alatt 75:25 arányra változtatjuk; átfolyási sebesség percenként 5 ml.
mg kellő tisztaságú A2b avermektint, 125 mg B2a avermektint és 145 mg B2b avermektint nyerünk.
A2b avermektin:
MS:FAB m/z = 913 [AverA2b+NA]+;
13C-NMR (75 MHz, CDC13), δ:
173,60, 139,83, 137,47, 135,92, 135,54, 124,75, 119,52, • · ·
- 29 118,21, 117,44, 99,53, 98,37, 94,69, 81,53, 80,43,
80,30, 79,21, 78,10, 77,34, 76,81, 75,92, 72,24,
69,75, 68,24, 68,10, 68,05, 67,45, 67,14, 57,65, 56, 38,
56,31, 45,52, 40,99, 40,63, 39,60, 36,37, 35,95, 34,47,
34,14, 27,86, 20,68, 20,16, 19,80, 18,29, 17,59, 15, 05,
13,85, 13,55;
B2a avermektin:
MS:FAB m/z = 913 [AverB2a+Na]+ t
13C-NMR (75 MHz, CDC13), δ:
173,63, 139,68 l, 138, 01, 135, 62, kb . 135, 124,72,
120,34, 117,92 !, 117,54, 99,63, 98,47, 94,77, 81,55,
80,35, 79,31, 79,08, 78,17, 76,07, 72,35, 69,86,
68,43, 68,32, 68,10, 67,51, 67,25, kb. 56,3, kb. 56, 3,
45,67, 41,11, 40,72, 39,75, 36,55, 36,07, 34,57, 34, 24,
34,17, 34,17, 27,96, 20,80, 20,21, 19,97, 18,41, 17, 68,
15,17, 13,95, 13,67;
B2b avermektin:
MS:FAB m/z = 899 [AverB2b+Na]+ f
13C-NMR (75 MHz, CDCI3), δ:
173,09, 139,44, 137, 65, 137, 57, 135,44, 124,50, 120, 90,
117,76, 117,34, 99,41, 98,26, 94,63, 81,47, 80,19,
79,20, 79,10, 78,04, 75,72, 70,57, 69,66, 68,10, 68, 03,
67,97, 67,45, 67,36, 67,05, 56,28, 56,24, 45,45, 40, 57,
39,52, 36,17, 35,46, 34,90, 34,26, 34,09, 33,91, 27, 04,
20,00, 19,69, 18,16, 17,51, 14,91, 13,56, 12,33, 11.59

Claims (9)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Streptomyces avermitilis sp. niger NRRL 21005 vagy ennek avermektint termelő mutánsának vagy változatának biológiailag tiszta tenyészete.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti tenyészet, ahol a mikroorganizmus a Streptomyces avermitilis sp. niger NRRL 21005.
  3. 3. Eljárás egy vagy több avermektin előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces avermitilis sp. niger NRRL 21005 törzset vagy annak avermektint termelő mutánsát vagy változatát asszimilálható szén-, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó vizes tápközegben süllyesztett tenyészetként aerob körülmények között addig tenyésztjük, amíg legalább egyféle avermektin vegyület termelődik.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett avermektin vegyület Alá, Alb, A2a, A2b, Bla, B2a vagy B2b.
  5. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus a Streptomyces avermitilis sp. niger NRRL 21005.
  6. 6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy következő lépésként a nevezett avermektint vagy avermektineket kinyerjük a tenyészléből.
  7. 7. Avermektin vegyület, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerinti eljárással állítjuk elő.
  8. 8. Eljárás ivermektin előállítására, azzal jellemezve, hogy j> V· * « a Streptomyces avermitilis sp. niger NRRL 21005 törzset vagy avermektint termelő mutánsát vagy változatát asszimilálható szénforrást, nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó vizes tápközegben süllyesztett tenyészetként aerob körülmények között addig tenyésztjük, amíg a Bla és Blb avermektin vegyületek termelődnek, majd a nevezett Bla és Blb vegyületeket redukáljuk.
  9. 9. Ivermektin, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti eljárással állítjuk elő.
HU9303366A 1992-11-30 1993-11-26 Strains of streptomyces for producing antiparasitic compoounds and processes thereuith HUT69970A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/984,078 US5292647A (en) 1992-11-30 1992-11-30 Strain of streptomyces for producing avermectins and processes therewith

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9303366D0 HU9303366D0 (en) 1994-03-28
HUT69970A true HUT69970A (en) 1995-09-28

Family

ID=25530287

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303366A HUT69970A (en) 1992-11-30 1993-11-26 Strains of streptomyces for producing antiparasitic compoounds and processes thereuith

Country Status (21)

Country Link
US (1) US5292647A (hu)
EP (1) EP0600656A3 (hu)
JP (1) JPH06237761A (hu)
KR (1) KR940011630A (hu)
CN (1) CN1088983A (hu)
AU (1) AU667141B2 (hu)
BR (1) BR9304843A (hu)
CA (1) CA2109767A1 (hu)
CO (1) CO4130314A1 (hu)
CZ (1) CZ282908B6 (hu)
FI (1) FI935246A (hu)
HU (1) HUT69970A (hu)
IL (1) IL107702A (hu)
MX (1) MX9307410A (hu)
MY (1) MY109797A (hu)
NO (1) NO934293L (hu)
NZ (1) NZ250247A (hu)
PH (1) PH30116A (hu)
PL (1) PL301204A1 (hu)
RU (1) RU2125609C1 (hu)
ZA (1) ZA938723B (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100419554B1 (ko) * 1999-10-29 2004-02-19 주식회사유한양행 아버멕틴의 정제방법
GB2426621B (en) * 2004-01-08 2008-05-21 Sharp Kk Lighting device for display devices, liquid crystal display device, and light source lamp
CN100448984C (zh) * 2006-03-07 2009-01-07 广东省微生物研究所 粤蓝链霉菌
JP5616328B2 (ja) * 2008-04-25 2014-10-29 株式会社アモーレパシフィックＡｍｏｒｅｐａｃｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 生体内変換システムを利用したオルソ−ジヒドロキシイソフラボンの製造方法
CN102443555B (zh) * 2011-11-16 2013-04-24 南开大学 链霉菌Streptomyces sp.NK-660及其用于生产ε-聚赖氨酸的发酵培养方法
WO2017052232A1 (ko) * 2015-09-22 2017-03-30 주식회사 팜한농 밀베마이신을 생산하는 재조합 미생물 및 이를 이용한 밀베마이신 생산
KR102017788B1 (ko) * 2017-09-18 2019-09-03 주식회사 팜한농 밀베마이신 d를 생산하는 재조합 미생물 및 밀베마이신 d 생산 방법
CN114075527B (zh) * 2021-10-25 2024-03-26 成都大学 一种脂溶性抗生素生物发酵调控的方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE434277B (sv) * 1976-04-19 1984-07-16 Merck & Co Inc Sett att framstella nya antihelmintiskt verkande foreningar genom odling av streptomyces avermitilis
US4429042A (en) * 1978-09-08 1984-01-31 Merck & Co., Inc. Strain of Streptomyces for producing antiparasitic compounds
US4378353A (en) * 1981-02-17 1983-03-29 Merck & Co., Inc. Novel C-076 compounds
ES8800986A1 (es) * 1985-07-27 1987-12-01 Pfizer Un procedimiento para la produccion de un nuevo derivado de avermectina
IN167980B (hu) * 1987-01-23 1991-01-19 Pfizer
IL85119A (en) * 1987-01-23 1993-01-14 Pfizer Streptomyces avermitilis strains, their preparation and use in production of avermectins
US5015662A (en) * 1988-10-18 1991-05-14 Merck & Co., Inc. Anthelmintic bioconversion products
JP2888586B2 (ja) * 1990-03-05 1999-05-10 社団法人北里研究所 エバーメクチンの特定成分を選択生産するための微生物およびその選択的製造法

Also Published As

Publication number Publication date
FI935246A0 (fi) 1993-11-25
RU2125609C1 (ru) 1999-01-27
EP0600656A3 (en) 1995-07-05
PL301204A1 (en) 1994-06-13
CN1088983A (zh) 1994-07-06
AU667141B2 (en) 1996-03-07
HU9303366D0 (en) 1994-03-28
IL107702A (en) 1998-10-30
JPH06237761A (ja) 1994-08-30
EP0600656A2 (en) 1994-06-08
KR940011630A (ko) 1994-06-21
AU5196093A (en) 1994-06-09
CZ250293A3 (en) 1994-06-15
FI935246A (fi) 1994-05-31
NZ250247A (en) 1994-12-22
IL107702A0 (en) 1994-02-27
CA2109767A1 (en) 1994-05-31
NO934293L (no) 1994-05-31
MX9307410A (es) 1994-07-29
MY109797A (en) 1997-07-31
BR9304843A (pt) 1994-06-14
NO934293D0 (no) 1993-11-26
ZA938723B (en) 1995-05-22
US5292647A (en) 1994-03-08
CO4130314A1 (es) 1995-02-13
PH30116A (en) 1996-12-27
CZ282908B6 (cs) 1997-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU624458B2 (en) Macrolide compounds
GB2077731A (en) Macrolide antibiotics
US4407946A (en) Process for producing antibiotic X-14868A
CA1242159A (en) Bbm-2478 antibiotic complex
US4559301A (en) Process for preparing macrocin derivatives
CA1249235A (en) 4&#39;-deschlororebeccamycin and process for its preparation
JPH05130860A (ja) Ｆｋ−５０６の新規な製造方法
HUT69970A (en) Strains of streptomyces for producing antiparasitic compoounds and processes thereuith
HUT57832A (en) Process for producing macrolide compound and parasiticidal composition comprising same as active ingredient
US4824863A (en) Antibiotic A80438
EP1001957B1 (en) Macrolides with antitumor activity
EP0637244B1 (en) A strain of streptomyces avermitilis glycosylates avermectin compounds
EP0236110B1 (en) Animal growth promoting agents
EP0121328B1 (en) Macrolide derivatives
US4859598A (en) Antibiotic LL-D42067β
US4683204A (en) Process for producing antibiotic A80190
US5374552A (en) Production of pradimicin antibiotics
YAGINUMA et al. Sporeamicin A, a new macrolide antibiotic I. Taxonomy, fermentation, isolation and characterization
JPS6363554B2 (hu)
US5312753A (en) Strain of streptomyces avermitilis capable of glycosylating avermectin compounds at the 13- and 14A positions
EP0209971B1 (en) Polyether antibiotic and process for its production
US4656258A (en) Macrocin derivatives
CA1198386A (en) ANTIBACTERIAL AGENTS LL-C23024.beta. AND IOTA AND MICROORGANISM ACTINOMADURA YUMAENSE NRRL 12515
US4830967A (en) Process for producing antibiotic A80438
CA2106446A1 (en) Bu-4803t antibiotics

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal