CN103848900B

CN103848900B - 一种从发酵液中分离纯化wf11899a的方法

Info

Publication number: CN103848900B
Application number: CN201210514096.4A
Authority: CN
Inventors: 芦现杰; 胡海峰; 朱宝泉; 张长清
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Priority date: 2012-12-04
Filing date: 2012-12-04
Publication date: 2015-12-02
Anticipated expiration: 2032-12-04
Also published as: CN103848900A

Abstract

本发明公开了一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法，其包含步骤：（1）用C1～C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液0.5～3h后，固液分离；（2）去除液体部分中的醇或酮后，过大孔吸附树脂，以甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液减压浓缩，得浓缩液；（3）将浓缩液通过聚苯乙烯反相色谱柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液洗脱，HPLC跟踪检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液，并减压浓缩得浓缩液；（4）将步骤（3）所得的浓缩液上样于聚苯乙烯反相色谱柱，用纯水冲洗脱盐，然后以纯甲醇洗脱，所得洗脱液即为含有WF11899A的洗脱液。本发明方法对WF11899A的提取纯度较高，收率高，纯化工艺简单，为从发酵液中分离纯化WF11899A提供了一种高效率低成本的工业化方法。

Description

一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法。

背景技术

WF11899A（FR901379）最初是从腔胞纲菌Coleophomasp.F-11899的发酵培养液中分离得到的一种脂肽类活性化合物，其分子式为C₅₁H₈₂N₈O₂₁S，经过结构修饰改造可得到一种抗真菌抗生素米卡芬净（Micafungin，MFG，FK463）。但是近年来，在其他近缘种中也逐渐发现一些菌株可以合成WF11899A及其结构类似物。

米卡芬净是日本藤泽公司开发的一类新型水溶性棘白菌素类抗真菌抗生素，具有良好的医用市场前景。其作用机制为通过非竞争性抑制β-(1,3)-葡聚糖合成酶的活性来抑制真菌细胞壁合成，且对人体正常细胞影响不大。临床实验表明其对由念珠菌属、曲霉菌属引起的深度真菌感染有广谱抗菌作用，对耐氟康唑、依曲康唑的念珠菌亦有作用。

目前关于WF11899A的纯化方法主要是硅胶柱层析和离心分配色谱。文献“WF11899A,BandC,novelantifungallipopeptides.I.Taxonomy,fermentation,isolationandphysico-chemicalproperties”（《theJournalofAntibiotics》,1994,47(10):1084-1091）和欧洲专利EP0431350A1中都公布了一种从Coleophomasp.F-11899发酵液中分离纯化WF11899A的方法：发酵液用等体积的丙酮浸泡2h，过滤后去除丙酮。乙酸乙酯洗涤2次，活性物质萃取至正丁醇相，处理后上样于Si60硅胶柱，利用CH₂C₁₂-甲醇混合液洗脱。浓缩后溶解在50%（体积百分比，下同）甲醇水溶液中，过ODS反相柱，用80%甲醇水溶液洗脱，再利用离心分配色谱进一步纯化。包含WF11899A的目标组分液富集后，再上样于硅胶柱、ODS反相柱，得到WF11899A洗脱液。干燥富集后溶于水，调pH至7.0，冷冻干燥后制得白色粉末WF11899A。但是这种方法存在以下缺点：1）分离纯化步骤较多，操作复杂；2）吸附过程中存在不可逆吸附，收率较低。因此，现有技术中关于WF11899A的分离纯化方法均不利于在工业生产上推广应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的上述缺陷而提供一种高效率、低成本的从含WF11899A的发酵液中分离纯化WF11899A的方法。

本发明提供的技术方案之一是：一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法，其包括如下步骤：

（1）用C1～C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液0.5～3h后，将发酵液进行固液分离，取液体部分；所述的C1～C4的醇或酮与含WF11899A的发酵液的体积比为1︰2～3︰1；

（2）去除步骤（1）得到的液体部分中的C1～C4的醇或酮后，过大孔吸附树脂，以甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液；

（3）将步骤（2）所得的浓缩液通过聚苯乙烯反相色谱柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液洗脱，对洗脱过程进行HPLC跟踪检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液；在所述的乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液中，乙腈的体积百分比为40%～60%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.4%～0.6%；

（4）将步骤（3）所得的浓缩液上样于聚苯乙烯反相色谱柱，用纯水冲洗脱盐，然后以纯甲醇洗脱，所得洗脱液即为含有WF11899A的洗脱液。

本发明中，步骤（1）所述的含WF11899A的发酵液可以是任何已知的含有WF11899A的菌体发酵液，优选Coleophomasp.F-11899发酵液。所述的Coleophomasp.F-11899发酵液可以通过现有技术中常规的培养Coleophomasp.F-11899的培养基培养获得，较佳地如欧洲专利EP0431350A1中公开的培养基配方，具体包括：斜面、平板培养基配方为（g/L）：玉米粉17、KH₂PO₄0.3、MgSO₄·7H₂O0.3、琼脂20、pH6.5；种子培养基配方为（g/L）：蔗糖40、棉籽蛋白粉20、干酵母粉10、蛋白胨10、KH₂PO₄2、CaCO₃2、pH自然，另加入1‰（v/v）的Tween-80；发酵培养基配方为（g/L）：可溶性淀粉60、葡萄糖10、小麦胚芽粉10、棉籽蛋白粉5、KH₂PO₄20、Na₂HPO₄·2H₂O15、MgSO₄·7H₂O0.5、ZnSO₄·7H₂O1、pH自然。

步骤（1）所述的固液分离的方法可以是已知的任何可以使菌体发酵液实现固液分离的方法，如离心分离法、过滤法、静置沉淀法等，本发明优选离心分离法；所述离心分离法为本领域常规的离心操作；较佳地，所述离心分离法的条件为以2000～6000r/min离心10～40min；更佳地，所述离心分离法的条件为以4000r/min离心20min。所述C1～C4的醇或酮可以是本领域常规，较佳地选自甲醇、乙醇、丙酮和正丁醇中的任一种，优选丙酮。所述用C1～C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液的时间较佳地为1.5～3h，更佳地为2h。

本发明步骤（2）中，所述的大孔吸附树脂可以为非极性、弱极性或中等极性大孔吸附树脂，优选X-5、XAD-2、XAD-7和ADS-17中的任一种。所述的甲醇水溶液中甲醇的体积百分比较佳地为60%～100%，更佳的为85～95%。所述的去除步骤（1）得到的液体部分中的C1～C4的醇或酮的方式可以是本领域常规的方式，优选减压去除。

本发明步骤（3）中，所述的聚苯乙烯反相色谱柱可以是本领域常规的聚苯乙烯反相色谱柱，优选PS25-300或NMPS-100。在所述的乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液中，乙腈的体积百分比优选40～45%，磷酸二氢铵的质量百分比优选0.5%。

本发明步骤（4）中，所述的HPLC的检测条件为本领域常规的HPLC检测条件，较佳地为：AgilentXDB-C18柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液（其中，乙腈的体积百分比为45%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%）为流动相，流速为1.0ml/min，进样量20μl，柱温30℃，检测波长212nm。在所述脱盐的处理过程中，纯水体积较佳地为柱体积的2～3倍。

本发明中，较佳地，在步骤（4）之后还包括步骤（5）：将步骤（4）所得的含有WF11899A的洗脱液通过旋转蒸发并进行真空干燥，从而得到白色粉末状固体，即WF11899A产品。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：根据本发明方法可有效地将WF11899A从Coleophomasp.F-11899发酵液等含有WF11899A的发酵液中分离出来，其中WF11899A的纯度可达到91%以上，收率可达到70%以上。与现有技术相比，本发明方法对WF11899A的提取纯度较高，收率高，纯化工艺简单，成本较低，为从发酵液中分离WF11899A提供了一种高效率低成本的工业化方法。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，部分材料和设备的来源如下：

1.大孔吸附树脂

（1）X-5：日本三菱化学株式会社产品；

（2）XAD-2、XAD-7：美国罗门哈斯产品；

（3）ADS-17：天津南开和成科技有限公司产品。

2.聚苯乙烯反相树脂：

PS25-300、NMPS-100：天津南开和成科技有限公司产品。

在下述实施例中，含有WF11899A的发酵液的获得按如下方式进行。

菌种：Coleophomasp.F-11899。

将经过生产能力验证、生长良好的菌种Coleophomasp.F-11899，以脱脂牛奶作为保护剂，用真空冷冻的方式保存。使用时将菌种转接到平板培养基，28℃培养6天，然后分离纯化1次，将合格菌种转接到斜面培养基，28℃培养6天，保存于4℃冰箱，7天内可随时作为发酵培养菌种。发酵种子培养温度为28℃，摇瓶培养时间4天，转速为240r/min。种子罐的培养时间随种子罐的大小而变，以种子质量为最终控制标准。在本实施方式中，由于实验室主要是发酵小试阶段，采用5L或10L种子罐，装液量在50%左右，温度为28℃，转速在220r/min-240r/min，培养时间为4-5天。在发酵过程中，培养温度为28℃，调控溶氧、搅拌转速、通气量等参数，并补加葡萄糖、氨基酸和水。当发酵液中的WF11899A的效价不再有明显的上升趋势、其他发酵参数表现为发酵已接近终结阶段时就可以放罐，发酵时间一般为9天左右。

以上工作中所用培养基引入欧洲专利EP0431350A1中公开的培养基配方，具体如下：斜面、平板培养基配方为（g/L）：玉米粉17、KH₂PO₄0.3、MgSO₄·7H₂O0.3、琼脂20、pH6.5；种子培养基配方为（g/L）：蔗糖40、棉籽蛋白粉20、干酵母粉10、蛋白胨10、KH₂PO₄2、CaCO₃2、pH自然，另加入1‰（v/v）的Tween-80；发酵培养基配方为（g/L）：可溶性淀粉60、葡萄糖10、小麦胚芽粉10、棉籽蛋白粉5、KH₂PO₄20、Na₂HPO₄·2H₂O15、MgSO₄·7H₂O0.5、ZnSO₄·7H₂O1、pH自然。

需要说明的是，通过发酵产生WF11899A的其他菌株的发酵液也适用于本发明的方法。

实施例1

Coleophomasp.F-11899发酵液500ml，加入500ml丙酮，浸泡提取1.5h，4000r/min离心20min得上清液，其中WF11899A的浓度为260μg/ml。上清液减压去除丙酮后，过ADS-17大孔吸附树脂，以60%的甲醇水溶液进行洗脱，流速为2BV，收集洗脱液600ml。洗脱液减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液（其中，乙腈的体积百分比为40%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%）进行洗脱，线性流速为10cm/h，并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液300ml，其中WF11899A的浓度为368μg/ml。减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，先以200ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥得到白色粉末状固体WF11899A116mg，纯度为91.7%，收率为82.1%。

实施例2

Coleophomasp.F-11899发酵液4.5L，加入2.25L丙酮，浸泡提取3h，4000r/min离心20min得上清液，其中WF11899A的浓度为400μg/ml。上清液减压去除丙酮后，过XAD-7大孔吸附树脂，以90%甲醇水溶液进行洗脱，流速为3BV，收集洗脱液600ml。洗脱液减压浓缩后，过PS25-300反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液（其中，乙腈的体积百分比为45%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.4%）进行洗脱，线性流速为8cm/h，并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液530ml，其中WF11899A的浓度为1372μg/ml。减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，先以500ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥得到白色粉末状固体WF11899A796mg，纯度为91.0%，收率为80.5%。

实施例3

Coleophomasp.F-11899发酵液10.0L，加入30.0L丙酮，浸泡提取0.5h，6000r/min离心10min得上清液，其中WF11899A的浓度为78.7μg/ml。上清液减压去除丙酮后，过X-5大孔吸附树脂，以100%甲醇进行洗脱，流速为2BV，收集洗脱液1200ml。洗脱液减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液（其中，乙腈的体积百分比为60%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.6%）进行洗脱，线性流速为10cm/h,并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液780ml，其中WF11899A的浓度为2260μg/ml。减压浓缩后，过PS25-300反相树脂，先以800ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥后得到白色粉末状固体WF11899A1941mg，纯度为91.3%，收率为75.1%。

实施例4

Coleophomasp.F-11899发酵液10.0L，加入10.0L甲醇，浸泡提取2h，2000r/min离心40min得上清液，其中WF11899A的浓度为162μg/ml。上清液减压去除丙酮后，过XAD-2大孔吸附树脂，以90%甲醇水溶液进行洗脱，流速为2BV，收集洗脱液800ml。洗脱液减压浓缩后，过PS25-300反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液（其中，乙腈的体积百分比为45%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%）进行洗脱，线性流速为10cm/h,并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液530ml，其中WF11899A的浓度为2256μg/ml。减压浓缩后，过PS25-300反相树脂，先以400ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥后得到白色粉末状固体WF11899A1236mg，纯度为92%，收率为70.2%。

实施例5

Coleophomasp.F-11899发酵液500ml，加入500ml乙醇，浸泡提取1.5h，4000r/min离心20min得上清液，其中WF11899A的浓度为200μg/ml。上清液减压去除丙酮后，过ADS-17大孔吸附树脂，以60%的甲醇水溶液进行洗脱，流速为3BV，收集洗脱液500ml。洗脱液减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液（其中，乙腈的体积百分比为50%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%）进行洗脱，线性流速为10cm/h，并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液300ml，其中WF11899A的浓度为309μg/ml。减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，先以300ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥后得到白色粉末状固体WF11899A89.7mg，纯度为90.3%，收率为81%。

实施例6

Coleophomasp.F-11899发酵液5L，加入5L正丁醇，浸泡提取2h，4000r/min离心20min得上清液，其中WF11899A的浓度为125μg/ml。上清液减压去除丙酮后，过ADS-17大孔吸附树脂，以60%的甲醇水溶液进行洗脱，流速为2BV，收集洗脱液900ml。洗脱液减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液（其中，乙腈的体积百分比为40%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%）进行洗脱，线性流速为10cm/h，并对洗脱过程进行HPLC检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液500ml，其中WF11899A的浓度为1087μg/ml。减压浓缩后，过NMPS-100反相树脂，先以400ml纯水冲洗脱盐，再以纯甲醇冲洗，收集洗脱液，旋蒸得到固体，真空干燥后得到白色粉末状固体WF11899A522mg，纯度为91%，收率为76.0%。

Claims

1.一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的含WF11899A的发酵液为Coleophomasp.F-11899发酵液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的固液分离的方法为离心分离法。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述离心分离法的条件为以2000～6000r/min离心10～40min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述C1～C4的醇或酮选自甲醇、乙醇、丙酮和正丁醇中的任一种。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述的用C1～C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液的时间为1.5～3h。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述的大孔吸附树脂为X-5、XAD-2、XAD-7和ADS-17中的任一种；所述的甲醇水溶液中甲醇的体积百分比为60%～100%。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中，所述的聚苯乙烯反相色谱柱为PS25-300或NMPS-100。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（3）中所述的乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液中，乙腈的体积百分比为40～45%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.5%。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（4）之后还包括步骤（5）：将步骤（4）所得的洗脱液通过旋转蒸发并进行真空干燥，从而得到白色粉末状固体，即WF11899A产品。