HUT58820A - Process for producing new polypeptides - Google Patents
Process for producing new polypeptides Download PDFInfo
- Publication number
- HUT58820A HUT58820A HU907105A HU710590A HUT58820A HU T58820 A HUT58820 A HU T58820A HU 907105 A HU907105 A HU 907105A HU 710590 A HU710590 A HU 710590A HU T58820 A HUT58820 A HU T58820A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- formula
- salt
- compound
- hydrogen
- reaction
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/50—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link
- C07K7/54—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring
- C07K7/56—Cyclic peptides containing at least one abnormal peptide link with at least one abnormal peptide link in the ring the cyclisation not occurring through 2,4-diamino-butanoic acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Manufacture Of Macromolecular Shaped Articles (AREA)
- Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Stringed Musical Instruments (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
A jelen találmány tárgya eljárás uj polipeptidek és ezek gyógyászatilag elfogadható sói előállíts s ara ·
Részletesebben, a találmány tárgya eljárás antimikrobiális (és különösen gombaellenes) hatású, uj polipeptidek, ezek gyógyászatilag elfogadható sói, valamint az ezeket a vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására. Az ilyen vegyületekkel és készítményekkel emberek és állatok fertőző betegségeit kezelhetjük.
A fentieknek megfelelően, a jelen találmány tárgya egyrészt eljárás számos patogén (kórokozó) mikroorganizmussal szemben erős hatást mutató polipeptidek és ezek gyógyászatilag elfogadható sói előállítására.
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás olyan gyógyászati készítmények előállítására, amelyek hatóanyagként valamely említett polipeptidet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazzák.
A jelen találmány szerinti vegyületekkel patogén mikroorganizmusok által okozott fertőző betegségeket kezelhetünk, e célból a fertőzött embernek vagy állatnak valamely említett polipeptidet adagolunk.
• ·
A jelen találmány szerinti polipeptideket az (I) általános képlettel jellemezhetjük, ahol az (I) általános képletben
R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport,
R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, és
R jelentése hidroxilcsoport vagy hidroxi-szülioniloxi-csoport, azzal a megkötéssel, hogy ha
A
R jelentése hidrogénatom, akkor
R jelentése ugyancsak hidrogénatom.
A jelen találmány szerinti (I) általános képletü polipeptideket az A- és B-eljárásvázlattal szemléltetett módszerekkel állíthatjuk elő, az eljárásváltozatokban szereplő általános képletekben ή 2
R és R jelentése a fenti.
A jelen találmány szerinti (I) általános képletü vegyületek alkalmas, gyógyászatilag elfogadható sói a szokásos, önmagában ismert, nem-toxikus, egyértékü vagy kétértékű sók lehetnek, ilyenek például a fém-sók, mint például az alkálifém-sók (például nátrium-só, kálium-só és más, hasonlók), az alkáli-földfém-sók (például kalcium-só, magnézium-só és más, hasonlók), az ammónium-sók, a szerves bázisokkal képzett sók (például trimetil-amin-só, trietil-amin-só, pirid.in-só, pikolin-só, diciklohexil-amin-só, N,N-dibenzil-etilén-diamin-só és más, hasonlók), a szerves savakkal képzett savaddiciós sók (például formiét, acetát, trifluor-acetát, maleát, tartarát, metán-szulfonát, benzol-szulfonát, toluol-szulfonát és más, hasonlók), a szervetlen savakkal képzett savaddiciós sók (például hidroklorid, hidrobromid, hidrojodid, szulfát, foszfát és más, hasonlók), az aminosavakkal képzett sók (például arginin-só, aszparaginsavas só, glutaminsavas só és más, hasonlók) és más, hasonló sók.
Az (I) általános képletű vegyületek és ezek sói előállitására szolgáló, és a jelen találmány tárgyát képező eljárást az alábbiakban részletesen ismertetjük.
• ·
- 5 a) eljárásváltozat
Az (la) általános képletű vegyületeket (lásd A-reakeióvázlat) és ezek sóit egy mikroorganizmus tenyésztése utján állíthatjuk elő.
E tenyésztési eljárást az alábbiakban részletesen ismertetjük.
A jelen találmány szerinti (la) általános képletű vegyületeket és ezek sóit úgy állíthatjuk elő, hogy valamely, a Coleophoma nemzetséghez tartozó, és valamely (la) általános képletű vegyületet vagy ennek sóját termelni képes mikroorganizmus törzset, például a Coleophoma sp. F-11899 jelzésű törzset egy alkalmas, felhasználható szén- és nitrogénforrásokat tartalmazó táptalajon tenyésztjük.
A mikroorganizmus leírása:
Az (la) általános képletű vegyületek és ezek sói előállításához használt mikroorganizmust az alábbiakban ismertetjük.
Az F-11899 jelzésű törzset először egy talajmintából különítettük el, lelőhelye: Iwaki-shi, Fukushima-ken, Japán. E mikroorganizmus különféle táptalajokon meglehetősen lassan növekszik, és szürke-barnásszürke telepeket képez. Amikor a talajmintából ··· · · · ·« ·« ······ • · · · · · · elkülönített mikroorganizmus-tenyészettel egy Miura-féle LCA-lemezhez [Miura, K. és Μ. Y. Kudo: An agar-médium fór aquatic Hyphomycetes. (Egy szilárd halmazállapotú, agaros táptalaj a vizi Hyphomycetes tenyésztésére), Trans. Ycolo, Soc. Japan, 11, 116 - 118. (1970)] rögzített, vízgőzzel sterilezett levélszegmenst vagy kukoricalisztet tartalmazó, szilárd halmazállapotú agart oltottunk be, akkor anamorf (imperfekt, vagyis csak ivartalanul szaporodó), konidiumképző változatok keletkeztek. Másrészt, a szokásos agaros táptalajon sem anamorf, sem teleomorf (períekt, vagyis mind ivarosán, mind ivartalanul szaporodó) alakok nem képződtek. A mikroorganizmus morfológiai (alaktani), növekedési és élettani tulajdonságai a következők.
A különféle agaros táptalajokon megfigyelt növekedési sajátságait az I. táblázatban foglaljuk össze. A burgonya-dextróz agáron meglehetősen gyorsan növekszik, 25°C hőmérsékleten 2 hét alatt a telep átmérője eléri a 3»5 - 4,0 cm-t. A telep felszíne sík, nemezszerü, kissé ráncos, színe barnásszürke· A telep közepe halványszürke-barnásszürke szinü, és légmicélium fedi. A hátoldal színe sötétszürke. Malátakivonaton a telepek lassabban növekednek, a fentivel azonos körülmények között átmérőjük csak 2,5 - 3,0 cm.
• » «···· ·· « · * · · ·«· · · · ·« ·· ««···· · • · · · · «·
- 7 Felszínük sík, vékony-nemezes, olajbarna színű. A telep közepe sárgásszürke színű, és légmicélium fedi. A hátoldal színe barnásszürke.
A morfológiai sajátságokat a Miura-féle LCA lemezhez rögzített, sterilezett levélszegmensen növekedő tenyészetek alapján határoztuk meg. A csak konidiumok révén szaporodó változatok csak a levélszegmensen képződnek. E változatok pycnidiumokkal rendelkeznek, amelyek a közeg felszínén helyezkednek el, egymástól elkülönülten, formájuk a korong alak és az ampulla forma közé esik, alapjuk ellaposodik, egykamrásak, vékonyfaluak, színük fekete, átmérőjük 90 - 160(-200) /um, magasságuk 40 - 70 /um. Az ostiolumok (a spórazsákok pórusai) gyakran különállóak, köralakuak, középponti helyzetűek, szemölcsszerüek, átmérőjük 10 - 30 /um, magasságuk 10 - 20 yum. A konidiumtartók (conidiophore) a pycnidiumok belső falának alsó rétegéből képződnek. Ezek áttetszőek, egyszerűek vagy csak kevéssé elágazóak, szeptáltak (válaszfalakat tartalmaznak) és simák. A konidiumtermelő sejtekben enteroblasztumok láthatók, e sejtek fiola alakúak. Helyzetük rögzített, formájuk az ampulla alak és a fordított körte alak közé esik, áttetszőek, sima felszinüek, méretük 5 - 8 x 4 - 6 /um, és gallérjuk van. E gallérok alakja a harang alak és a hengeres forma közötti, méretük 14 - 18 x 3 - 5 yum.
·*· '·· · · »·· · ·· ·· • · ······ · • · · · · · ·
A konidiumok áttetszőek, hengeresek, vékonyfaluak, nem szeptáltak, sima felszinüek, méretük 14 - 16(-18) x 2 - 3 yum.
A vegetatív micélium fonalai szeptáltak, színük barna, felszínük sima, és a fonalak elágaznak. A fonalak sejtjei hengeresek, vastagságuk 2-7 /um. Klamidospórák nincsenek.
Az F-11899 jelzésű törzs a 0°C és 31 °C közötti hőmérséklet-tartományban növekszik, burgonyadextróz agáron az optimális hőmérséklet: 23 - 27°C. A fenti sajátságok azt jelzik, hogy az F-11899 jelzésű törzs a Coelomycetes rendhez tartozik [Arx, J. A. von: The Genera of Fungi - Sporulating in Pure Culture (A gombák nemzetségei - Spórázás tiszta tenyészetekben), 3. kiadás, J. Cramer, Vaduz, 1974} Sutton, B. C.: The Coelomycetes - Fungi Imperfecti with Pycnidia, Acervuli and Stromata. (A Coelomycetes - Pycnidiummal, acervulusokkal (konidiumtelepekkel) és sztrómával rendelkező konidiumos gombák), 696. oldal, Commonwealth Mycological Institute, Kew, 1980; Hawksworth, D. L., B. C. Sutton és G. C. Ainsworth: Dictionary of the Fungi (Gombalexikon),
7. kiadás, 445. oldal, Commonwealth Mycological Institute, Kew., 1983]· Ezért a törzset Coelomycetes F-11899 jelzésű törzs-nek neveztük el.
»* « V « · · »· • · · · * · · * · · ·· • · ·*.···· • · · · · · ·
Az alábbi táblázatban a következő rövidítéseket használjuk:
Ns növekedés, megadjuk a telep átmérőjét
F: a telep felszíne
H: hátoldal·
I. TÁBLÁZAT
Az F-11899 jelzésű törzs növekedési tulajdonságai
Táptalaj Növekedési jellemzők malátakivonat agar N: meglehetősen lassú növekedés, (Blakeslee 1915) 2,5 - 3,0 cm
F: köralaku, sik, vékony-nemezes, olajbarna (4F5), a telep közepéből légmicélium-fonalak emelkednek ki (színük sárgásszürke, 4B2)
H: barnásszürke (4F2)
I. TÁBLÁZAT • · ·«·>»· ·« • · « « · *»· » · · ·· • · ······ · * · · · · t 9 (folytatás) burgonya dextróz agar N:
(Difco 0013)
F:
meglehetősen gyors növekedés,
3,5 - 4,0 cm köralaku, sik, nemezes, kissé ráncos, barnásszürke (4F2), a telep közepéből légmicélium·
-fonalak emelkednek ki (szinük halványszürke, 4B1 - barnásszürke, 4F2)
Hs sötétszürke (4F1)
Czapeck-féle agar
Ns nagyon lassú növekedés, (Raper és Thom, 1949)
1,0 - 1,5 cm
F: szabálytalan, vékony, szórványos, a közeg alá merülő, félig áttetsző - fehér szinü
H: félig áttetsző - fehér
Sabouraud dextróz agar (Difco 0109)
Ns lassú növekedés, 2,0 - 2,5 cm
F: köralaku, sik, vékony, fehér, részekre osztott, a telep köz pontjában világosbarna szinü (6D5)
Hs halványsárga (4a3) dióliszt agar (Difco 0552)
Emerson Yp Ss (Difco 0739) kukoricaliszt (Difco 0386) ·· ···» · ·· • · «4 * «·· · ·· ·· • · ··«··· · • · · · · ♦ «
I. TÁBLÁZAT (folytatás)
Ní meglehetősen gyors növekedés, 4,0 - 4,5 cm
F: köralaku, sik, nemezes - vattaszerű, sötétszürke (4F1) barnásszürke (4F2)
H: barnásszürke (4D2) agar N: lassú növekedés, 2,0 - 2,5 cm
Fi köralaku - szabálytalan, sik, nemezes, sötétszürke (4F1) bamásszürke (4F2)
Hí középszürke (4E1) - sötétszürke (4F1) agar N: meglehetősen lassú növekedés,
2,5 - 3,0 cm
F: köralaku, sik, vékony - nemezes, sötétszürke (2F1) - olaj zöld (2F3)
H: sötétszürke (2F1) - olajzöld (2F3) t» ·*·· »·* • · · * · ··» » · · ·« ·· · · · r· ·· • 4 »» ···
MY20 agar
I. TÁBLÁZAT (folytatás)
N: lassú növekedés, 1,5 - 2,0 cm
Ps köralaku - szabálytalan, vékony, körcikkekre osztott -, sárgásfehér (4A2)
H: halványsárga (4A3) - narancssárgás-fehér (5A2) ·· ···· · ·♦ • · » · · ··· » · · ·* • · · ···· · · ·· · ··
A fenti növekedési tulajdonságokat 25°C hőmérsékleten 14 napon át végzett inkubálás után figyeltük meg. A színek kódszámait a színek Methuen-féle kézikönyvéből vettük [Kornerup, A. és Wanscher, J. H.: Methuen Handbook of Colour (A színek Methuen-féle kézikönyve), 3. kiadás, 252. oldal, Methuen, London, 1983]·
Az igy elnevezett Coelomycetes F-11899 jelzésű törzset 1989. október 26-án a FERM BP-2635 szám alatt letétbe helyeztük az alábbi cégnél: Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Teohnology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, IBARAKI 305 japán;
Ezek után azonban tovább vizsgáltuk az
F-11899 jelzésű törzs osztályba sorolását, és azt találtuk, hogy az F-11899 jelzésű törzs emlékeztet a Coelomycetes rendhez tartozó Coleophoma empetri (Rostrup) Petrák 1929 jelzésű törzsre [lásd Arx, J. A. von, Sutton, B. C., továbbá Hawksworth, D. L., B. C. Sutton és G. C. Ainsworth fent idézett müveit], azonban a pycnidiumok néhány jellemző tulajdonsága eltér az említett törzsétől, ugyanis az F-11899 jelzésű törzs pycnidiumai az alapjuknál gömbalakuak vagy ellaposodnak, belemerülnek a táptalajba, és nem szemölcsszerüek.
···· *49 • · · · · ··· 9 9 999 • * · 9999 9· ·· 99 ·99
- 14E jellemző tulajdonságaik alapján módosítottuk e törzs osztályba sorolását, és uj nevet adtunk neki, mégpedig a Coleophoma sp. F-11899 nevet.
E tekintetben már 1990. szeptember 21-én
- megtettük a szükséges lépéseket a Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology felé, hogy módosítsuk a Coelomycetes F-11899” jelzést a Coleophoma sp. F-11899 jelzésre.
Az (la) általános képletű vegyületek és ezek sói termelése
A jelen találmány szerinti (la) általános képletű vegyületeket és ezek sóit úgy állítjuk elő, hogy a Coleophoma nemzetséghez tartozó valamely, (la) általános képletű vegyületet vagy ennek sóját termelni képes mikroorganizmus törzset felhasználható szén- és nitrogénforrásokat tartalmazó táptalajban, levegőztetett körülmények között (például rázott tenyészetben vagy sülylyesztett tenyészetben) mindaddig tenyésztjük, mig a táptalajban az (la) általános képletű vegyület vagy sója a kivánt mennyiségben fel nem szaporodik.
A táptalajban felhasználható szénforrásként előnyösen szénhidrátokat, például glükózt, szaecharózt, keményítőt, fruktózt, glicerint vagy más, hasonlókat használunk.
t · ♦
- 15 Előnyös nitrogénforrások például az élesztőkivonat, pepton, teljes (sikértartalmú) liszt, gyapotmag liszt, szójaliszt, kukoricalekvár, szárított élesztő, búzacsíra és más, hasonlók, továbbá szervetlen és szerves, nitrogéntartalmú vegyületek, például ammónium-sók (például ammónium-nitrát, ammónium-szulfát, ammónium-foszfát és más, hasonlók), karbamid, aminosavak és más, hasonlók.
A szén- és nitrogénforrásokat egymással kombinálva alkalmazzuk ugyan, azonban nem szükséges ezeket tiszta formában használnunk, miután a kevésbé tiszta ilyen anyagok, amelyek növekedési faktorok nyomait, és számottevő mennyiségű ásványi tápanyagot is tartalmaznak, ugyancsak alkalmasak a jelen találmány szerinti eljárás céljaira.
Kivánt esetben a táptalajhoz ásványi sókat, például nátrium-karbonátot, kalcium-karbonátot, nátrium-foszfátot, kálium-foszfátot, nátrium-kloridot, kálium-kloridot, nátrium-jodidot, kálium-jodidot, magnézium-sókat, réz-sókat, cink-sókat, kobalt-sókat és más, hasonlókat is adhatunk.
Szükség esetén, különösen, ha a táptalaj számottevő mértékben habzik, akkor a közeghez hozzáadhatunk egy habzásgátló szert, például folyékony paraffint, zsíros olajat, növényi olajat, ásványi olajat vagy szilikon olajat, vagy más, hasonló habzásgátló szert.
Az egyéb, biológiailag hatásos anyagok nagyobb mennyiségeinek előállitásához alkalmazott előnyös módszerekhez hasonlóan, az (la) általános képletű vegyületek és ezek sóinak nagyobb mennyiségei előállitásához előnyösen úgy járunk el, hogy az említett mikroorganizmust süllyesztett, levegőztetett körülmények között tenyésztjük.
Ha kisebb mennyiségeket kívánunk előállítani, akkor inkább egy rázott vagy felszíni tenyészetet alkalmazunk, palackban vagy lombikban.
Továbbá, ha a tenyésztést nagy tartályokban végezzük, akkor a termelő tartályokhoz inokulumként (oltóanyagként) előnyösen a mikroorganizmus vegetatív formáját használjuk, hogy igy az (la) általános képletű vegyület vagy sója termelése során kiküszöböljük a növekedés késleltetési szakaszát. Ennek megfelelően, célszerűen úgy járunk el, hogy először a táptalaj viszonylag kis mennyiségét beoltjuk a mikroorganizmus spóráival vagy micéliumával, és igy tenyésztjük a mikroorganizmust, ezáltal vegetatív inokulumot állítunk elő, majd ez utóbbit visszük át a nagyobb tartályokba. A vegetatív inokulum előállitásához használt táptalaj lényegében ugyanaz lehet, de el is térhet az (la) általános képletű vegyület vagy sója termelése során használt táptalajtól.
A tenyésztés során az elegy keverését és levegőztetését sokféle módon oldhatjuk meg. A keveréshez használhatunk propeller-keverőt vagy más, hasonló, mechanikus keverő berendezést, a tenyésztőedényt forgathatjuk vagy rázathatjuk, használhatunk különféle szivattyúzó berendezéseket, vagy egyszerűen steril levegőt vezethetünk át a táptalajon. A levegőztetést úgy valósíthatjuh meg, hogy a közegen át steril levegőt vezetünk.
A tenyésztést általában körülbelül 10°C és 40°C közötti, és előnyösen 20°C és 30°ö közötti hőmérsékleten végezzük, körülbelül 50 - 150 órán át, az időtartam a tenyésztés körülményeitől és méretétől függően változhat.
A tenyésztés befejeződése után az (la) általános képletü vegyületet vagy sóját a biológiailag hatásos anyagok elkülönítésére és tisztítására szokásosan alkalmazott, önmagában ismert módszerekkel elkülönítjük a közegből. Ilyen módszerek például valamely alkalmas oldószerrel vagy bizonyos oldószerek keverékével végzett oldószeres kirázás, kromatografálás, egy alkalmas oldószerből vagy bizonyos oldószerek elegyéből való átkristályositás és más, hasonló módszerek.
A jelen találmány szerinti eljárásban az (la) általános képlett! vegyület vagy sója általában egyaránt megtalálható a micéliumban és a táptalajban is. Ennek megfelelően, az (la) általát os képletű vegyületet vagy sóját a tenyésztés során kapott teljes közegből különítjük el, mégpedig oly módon, hogy e közeget egy alkalmas szerves oldószerrel, például acetonnal vagy etil-acetáttal, vagy ezek keverékével, vagy más, hasonló oldószerrel kirázzuk.
Ezután a kivonatból az (la) általános képletű vegyületet vagy sóját valamely szokásos, önmagában ismert módszerrel különítjük el, igy például a kivonatból az oldószert ledesztilláljuk, vagy a kivonatot kisebb térfogatra töményitjük be, és az igy kapott, a hatóanyagot, vagyis az (la) általános képletű vegyületet vagy sóját tartalmazó maradékot valamely szokásos, önmagában ismert tisztítási eljárásnak vetjük alá, ilyen tisztítási eljárások például a kromatográfálás vagy egy alkalmas oldószerből vagy bizonyos oldószerek keverékéből való átkristályositás.
Ha a kívánt terméket az (la) általános képletű vegyület sója formájában különítjük el, akkor ezt átalakíthatjuk a szabad (la) általános képletű vegyületté vagy ennek valamely más sójává, mindezen műveleteket • ·
- 19 a szokásos, önmagában ismert módszerekkel hajthatjuk végre.
b) eljárásváltozat ssssssssssssssssssssssssssscsssss
Az (lb) általános képletű vegyületeket és ezek sóit úgy állíthatjuk elő, hogy valamely (la) általános képletű vegyületről vagy sójáról lehasitjuk a szulfocsoportot.
Az (lb) általános képletű vegyületek alkalmas sói ugyanolyan sók lehetnek, mint amilyeneket az (I) általános képletű vegyületekre példaképpen megadtunk.
Az említett lehasitási reakciót a szakirodalomból ismert, szokásos módszerekkel, például egy enzimmel való reagáltatás utján végezhetjük el.
Az enzimmel való reakciót úgy hajthatjuk végre, hogy valamely (la) általános képletű vegyületet vagy sóját egy olyan enzimmel reagáltatjuk, amely képes a szulfocsoportot lehasitani.
E célra alkalmas enzim lehet például egy szulfatáz enzim, mint például a IV. tipusu szulfatáz enzim, amelyet az Aerobacter aerogenes állít elő, vagy más, hasonló enzim.
E lehasitási reakciót általában valamely oldószerben, például foszfát-pufferoldatban, Trisz-HCl pufferoldatban, vagy bármely más, olyan oldószerben végezhetjük, amely nem gyakorol káros befolyást a reakcióra.
A reakció hőmérséklete nem döntő jelentőségű, és igy a reakciót szobahőmérsékleten vagy melegítés közben végezhetjük el.
Az (I) általános képletű vegyületek biológiai tulajdonságai
Az (I) általános képletű vegyületek biológiai hatásának bemutatása céljából az alábbiakban ismertetjük bizonyos biológiai adataikat.
1. vizsgálat: antimikrobiális hatás (1. módszer)
Az 1. példában leirt módon kapott, FR9O1379 jelzésű vegyület antimikrobiális hatását mikroméretben, táptalaj-higitásos módszerrel, egy 96 mélyedést tartalmazó mikrotitráló lemezen, YNBD (yeast nitrogén base dextrose, vagyis élesztő eredetű nitrogénforrást és dextrózt tartalmazó) táptalajon határozzuk meg. Egy 50 /ul térfogatú mintához (kétszeres sorozathigitás után) hozzáadjuk a mikroorganizmus fiziológiás só-oldattal • · · ·· • ·« • · · · • · ·····
- 21 készült szuszpenziójának 50 yul térfogatú részletét, igy a végső koncentráció 1 x 10 telepképző egység/ml.
A Candida és Aspergillus tenyészeteket 22 órán át 37°C hőmérsékleten, mig a Cryptococcus tenyészeteket 48 órán át 30°C hőmérsékleten tartjuk· Az inkubálás után a mikrotitráló lemez minden egyes mélyedésében zavarosságmérés utján meghatározzuk a mikroorganizmus növekedésének mértékét. Az eredményeket az ΙΟ^θ-értékekkel adjuk meg, amely a hatóanyagnak az a koncentrációja, amely a mikrotitráló lemez mélyedésében mért zavarosságot a hatóanyag nélküli mintában mért érték felére csökkenti. Az eredményeket a II· táblázatban adjuk meg.
II. TÁBLÁZAT
Mikro organizmus | ICsQ-érték |
Candida albicans FP578 | < 0,025 |
Candida albicans FP582 | < 0,025 |
Candida albicans FPÓ29 | 0,05 |
Candida albicans FP633 | 0,025 |
Candida krusei YC109 | 0,2 |
Candida utilis YC123 | 0,05 |
Candida tropicalis YC118 | 0,1 |
Cryptococcus neoformans YC203 | > 25 |
Cryptococcus albidus YC201 | > 12,5 |
Aspergillus niger ATCC9642 | 0,05 |
Aspergillus fumigatus FD050
0,8
2. vizsgálat: az FR9O1379 jelzésű vegyület védőhatása szisztémás Candida albicans fertőzéssel szemben
ICR-törzsbeli, 4 hetes nőstény egereknek (csoportonként 5 állatnak) intravénásán (a vénába) beadunk £
2,5 x 10 sejtet tartalmazó Candida albicans FP633 tenyészetet· A hatóanyagokat 1 órával a fertőzés után, majd további három, egymást követő napon, naponta egyszer, szubkután (a bőr alá) adjuk be· Az eredményeket 9 nappal a fertőzés után állapítjuk meg· A megfigyelt eredményeket a III· táblázatban adjuk meg·
III. TÁBLÁZAT
Dózis (mg/kg)
0,3
Tulélő/kezelt
5/5
5/5
3/5
0/5 ♦ * · • · • · · · · • · 4 · · 44 4 ·· ·····« · • · · · ·· 4
3. vizsgálat: az FR901379 jelzésű vegyület akut toxicitása
Az FR9O1379 jelzésű vegyület akut toxicitását ICR-törzsbeli, 4 hetes nőstény egereken határozzuk meg, a hatóanyagot egyszeri, intraperitoneális (a hasüregbe adott) injekció formájában adjuk be. Az 500 mg/kg-os dózis beadása után toxikus tünetek nem jelentkeztek.
4. vizsgálat: antimikrobiális hatás (2. módszer)
Az FR901379 jelzésű vegyületnek és a 2, példában leirt módon kapott, FR133302 jelzésű vegyületnek a Candida albicans FP633 törzzsel szemben megmutatkozó antimikrobiális hatását a szűrőpapír-korongos módszerrel, a fent említett YRBD jelzésű agaros táptalajon, 16 órás, 37°C hőmérsékleten végzett tenyésztés utján határozzuk meg. Az eredményeket azon gátlási zóna átmérőjével jellemezzük, amelyet az egyes hatóanyagok 2 /ug-nyi mennyiségével átitatott korongokon figyelhetünk meg. Az ereáményeket a IV. táblázatban adjuk meg.
Λ
IV. TÁBLÁZAT
Vegyület | Átmérő (mm) |
FR9O1379 | 21 |
FR133302 | 16 |
A vizsgálati eredmények alapján megállapíthatjuk, hogy a jelen találmány szerinti (I) általános képletű polipeptiéteknek antimikrobiális (és különösen gombaellenes) hatásuk van.
A jelen találmány szerinti vegyületeket gyógyászati készítmények formájában, például szilárd, félszilárd vagy cseppfolyós halmazállapotú készítmények formájában alkalmazhatjuk, e készítmények hatóanyagként valamely (I) általános képletű polipeptidet vagy ennek gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazzák, szerves vagy szervetlen, külsőleges, orális vagy parenterális adagolásra alkalmas vivőanyagok vagy töltőanyagok kíséretében. A tabletták, drazsék, kapszulák, kúpok, oldatok, emulziók, szuszpenziók és más, alkalmas gyógyszerformák elkészítéséhez a hatóanyagot összekeverhetjük például a szokásos, nem-toxikus, gyógyászatilag elfogadható • * 1 » · 9 · ♦· • · » · · ·· · » · « ·« ·· ····«* · ·· · · « · ·
- 26 vivőanyagokkal. Ezenkívül, szükség esetén használhatunk segédanyagokat, stabilizálószereket, sűritőszereket, színezőanyagokat és ízesítőanyagokat is. E gyógyászati készítmények az (I) általános képletű polipeptidet vagy gyógyászatilag elfogadható sóját olyan mennyiségben tartalmazzák, amely elegendő ahhoz, hogy kiváltsa a betegség lefolyására vagy a beteg állapotára gyakorolt, kívánt antimikrobiális hatást.
Ha e készítményeket embereknek akarjuk adagolni, akkor előnyösen intravénásán, intramuszkulárisan vagy orálisan adagoljuk azokat. Habár egy (I) általános képletű polipeptid gyógyászatilag hatásos mennyisége függ a kezelni kívánt beteg életkorától és állapotától, és ennek megfelelően változhat is, emberek kezelésére intravénás adagolás esetében a napi dózis testsulykilogrammonként 0,01 - 10 mg polipeptid, intramuszkuláris adagolás esetében a napi dózis testsulykilogrammonként 0,1 - 10 mg, mig orális adagolás esetében a napi dózis testsulykilogrammonként 0,5 - 50 mg (I) általános képletű vegyület, amennyiben valamely fertőző betegséget kívánunk kezelni.
A találmány szerinti eljárást a továbbiakban
- a találmány oltalmi körének szűkítése nélkül - példákkal szemléltetjük.
• · · w * · t ♦ · • ♦ · · ··· 4 ·« «« • · ···*·* « • ♦ · · « · ·
1. példa
1/ Két, 500 ml térfogatú Erlenmeyer lombikba beletöltünk 160 - 160 ml inokulum táptalajt, amely 4 szaccharózt, 2 $ gyapotmag lisztet, 1 $6 szárított élesztőt, 1 $ peptont, 0,2 $ kálium-dihidrogén-foszfátot, 0,2 $ kalcium-karbonátot és 0,1 % (a Nakarai Chemicals Ltd. által előállított) Tween 80-at tartalmaz, és a táptalajokat félórán át 121°C hőmérsékleten sterilezzük. Utána mindkét lombikot beoltjuk a Coleophoma sp. F-11899 jelzésű törzs ferdeagaros tenyészetével, és a lombikok tartalmát 4 napon át 25°C hőmérsékleten rázatva tenyésztjük.
Egy 30 1 térfogatú, keverős fermentorba beletöltünk 20 1 termelő táptalajt, amely 3 $ (Matsutani Chemical Ltd. által előállított) Pine Dex No. 3-at, $ glükózt, 1 # búzacsírát, 0,5 gyapotmag lisztet, $ kálium-dihidrogén-foszfátot, 1,5 $ dinátrium-hidrogén-foszfát-dodekahidrátot, 0,001 $ cink-szulfát-heptahidrátot és 0,05 $ Adekanolt (az Asahi Denka Co., Ltd. által gyártott habzásgátló anyagot) tartalmaz, és a táptalajt félórán át 121°C hőmérsékleten sterilezzük.
A termelő táptalajt beoltjuk a fent leirt módon kapott, 320 ml térfogatú inokulummal, majd a tenyésztést 25°C hőmérsékleten 4 napon át folytatjuk, eközben az elegyet
- 28 percenként 200-as fordulatszámmal keverjük, és 20 1/perc ütemben levegőztetjük. Az igy kapott, 20 1 térfogatú tenyészközeghez hozzáadunk vele azonos térfogatú acetont. Az elegyet egy ideig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, és közben esetenként összekeverjük. Utána a tenyészközeget megszűrjük, és a szűrlétről az acetont csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A 10 1 térfogatú vizes szürletet etil-acetát két, egymásközt azonos térfogatú részletével mossuk, majd kétszer 10 1 n-butanollal kirázzuk. Az egyesített n-butanolos részekről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, és a maradékot felvisszük egy 300 ml térfogatú, szilikagél 60-nal (E. Merek) töltött oszlopra. Az oszlopot diklór-metán és metanol különböző arányú elegyeivel eluáljuk. A Candidával szemben hatásos frakciók a 3:1-1:1 arányú elegyekkel eluálhatók az oszlopról. Az aktív frakciókat egyesítjük, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot feloldjuk 15 ml 50 %-os, vizes metanolban, és az oldatot felvisszük egy 250 ml térfogatú (a Yamagura Chemical Láb. által előállított) ODS YMC GEL-lel töltött oszlopra. Az oszlopot 50 %-os, vizes metanollal mossuk, majd 80 %-os, vizes metanollal eluáljuk. Az elutumról az oldószert ledesztilláljuk, és a maradékot centrifugális megoszlásos kromatográfiával tisztítjuk tovább, e célra az n-butanol : metanol s viz =4:1:5 elegyet használjuk, ahol a felső fázis az álló fázis, és az alsó, mozgó fázis lefelé halad.. A kívánt vegyületet (az elegy fő összetevőjét) tartalmazó frakciókat egyesitjük, az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, és a maradékot felvisszük egy 35 ml térfogatú, szilikagél 60-nal töltött oszlopra. Az oszlopot n-butanol, ecetsav és viz 6:1:1 arányú elegyével eluáljuk. Az aktív frakciókat egyesítjük, és az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A maradékot feloldjuk kis mennyiségű 50 $-os, vizes metanolban, és az oldatot átcsorgatjuk egy 3»5 ml térfogatú, ODS YMC GEL-lel töltött oszlopon. Az oszlopot 50 $-os, vizes metanollal mossuk, majd metanollal eluáljuk. Az elutumról az oldószert ledesztilláljuk, a maradékot feloldjuk kevés vizben, és az oldat pH-ját 0,01 normál nátrium-hidroxid-oIdáttál 7,O-ra állítjuk. A kapott oldatot fagyasztva szárítjuk, ily módon fehérszínű, porszerü anyag formájában 11 mg kívánt vegyületet kapunk nátrium-sója formájában, a továbbiakban ezt a vegyületet FR9O1379 jelzésű vegyületként említjük.
A centrifugális megoszlásos kromatográfiás művelet után kapott azon frakcióról, amely két, kisebb ·· «··· · ·« • · · ·4 ·«· · · ··· • · * ···· · · ·· *4 ··· mennyiségben jelenlevő összetevőt tartalmaz, az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, és a maradékot preparativ méretű, nagyfelbontású folyadék-kromatográfiával tisztítjuk, oszlop: LiChrosorb RP-18 (védjegyzett termék, előállítja: Merek, mérete:
250 x 25 mm), mozgó fázis: 45 $-os, vizes acetonitril
- 0,5 ammónium-dihidrogén-foszfát, áramlási sebesség:
9,9 ml/perc. A fent említett két összetevő egyikét tartalmazó frakciót vele azonos térfogatú vizzel hígítjuk, és az oldatot átcsurgatjuk egy 1 ml térfogatú,
ODS YMC GEL-lel töltött oszlopon. Az oszlopot 40 $-os, vizes metanollal mossuk, majd metanollal eluáljuk.
Az elutumról az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, majd a maradékot feloldjuk kevés vízben, és az oldatot fagyasztva szárítjuk. Ily módon fehérszinü, porszerü anyag formájában 2,2 mg említett vegyületet kapunk, mégpedig ammónium-sója formájában. Ezt a vegyületet a továbbiakban FR901381 jelzésű vegyületként említjük.
Hasonló módon eljárva különítjük el a másik, kis mennyiségben jelenlevő összetevőt, ily módon fehérszinü, porszerü anyag formájában 1,2 mg ilyen vegyületet kapunk, mégpedig ammónium-sója formájában. Ezt a vegyületet a továbbiakban FR901382 jelzésű vegyületként említjük.
·· ···· « ·» 9 9 · ·· • · · 9·· • · · ···· · ·· 99 999
Az FR9O1379 jelzésű vegyület fizikai-kémiai jellemzői a következők·
Külső megjelenés: fehérszinü, porszerü anyag.
Jellege: | semleges. |
Op.: | 215 - 221°C (bomlik). |
Fajlagos forgatóképesség: [ajjp = -20,3° (c = 0,5, viz).
Összeképlet: | C51H81N8°21SNa· |
Elemi analízis | a képlet alapján: |
számított: | C: 51,17, H: 6,77, N: 9,36, S: 2,6s fa |
talált: | C: 49,61, H: 7,58, N: 7,65, S: 2,14 fa |
Molekulasúly:
nagyfelbontású | tömegspektrum, gyorsatom-ütköztetéses |
módszer,
* °51H 82V021 | + 2Na - H képlet alapján: |
számított m/e = 1219,5032, talált m/e = 1219,5078.
Oldhatóság:
metanolban és vízben oldható, etil-acetátban és acetonban kismértékben oldható, és kloroformban és n-hexánban nem oldható.
Szinreakciók:
pozitív szinreakció: jódgőz reakció, cérium-szulfát reakció, vas(III)-klorid reakció, ninhidrin reakció;
negatív szinreakció: Dragendorff reakció, Ehrlich reakció.
Vékonyréteg-kromatográfiai
Álló fázis Futtató elegy R^-érték szilikagél* n-butanol:ecetsav: viz (3:1:1) 0,36 etil-acetát:izopropil-alkoholsviz (5:3:1) 0,31 36 = szilikagél 60 (E. Merek).
Ultraibolya abszorpciós spektrum:
metanol .. Λ (Ex cm^ 2°7(169), 276(13,5), 225(sh), 2s3(sh) nm, max metanol+0,01N-NaOH Λ a, i (E1 cm>s 209 <232>’ 244(59,5), msoc
284(13,5), 294(sh) nm.
Intravörös abszorpciós spektrum:
KBr \ : 3350, 2920, 2840, 1660, 1625, 1530, 1510, max
1435, 1270, 1240, 1070, 1045, 800, 755, 710 cm-1.
^H-NMR-spektrum (CD^OD, 400 MHz):
delta: 7,30 (1H, d, J = 2 Hz), 7,03 (1H, dd, J = 8 és 2 Hz), 6,85 (1H, d, J = 8 Hz), 5,23 (1H, d, J = 3 Hz), 5,06 (1H, d, J = 4 Hz), 4,93 (1H, d, J = 3 Hz), 4,59 - 4,51 (3H, m), 4,47 - 4,35 (5H, m), 4,29 (1H, dd, J = 6 és 2 Hz), 4,17 (1H, m), 4,07 (1H, m), 3,95 - 3,89 (2H, m), 3,76 (1H, br d, J = 11 Hz), 3,36 (1H, m), 2,75 (1H, dd, J = 16 és 4 Hz), 2,50 (1H, m), 2,47 (1H, dd, J = 16 és 9 Hz), 2,38 (1H, m), 2,21 (2H, m), 2,03 - 1,93 (3H, m), 1,57 (2H, m), 1,45 - 1,20 (24H, m), 1,19 (3H, d, J = 6 Hz), 1,08 (3H, d, J = 6 Hz), 0,90 (3H, t, J = 7 Hz).
A fenti fizikai és kémiai tulajdonságok elemzése alapján, valamint a kémiai szerkezet meghatározására szolgáló további vizsgálatok eredményei alapján az FR9O1379 jelzésű vegyületnek az (Ic) szerkezetet tulajdonítjuk.
• · · *
- 34 A fent leírt módon előállított FR901381 jelzésű vegyület fizikai-kémiai sajátságai a következők:
külső megjelenés: fehérszinü, porszerü anyag.
Jellege: semleges.
Op.: 218 - 223°C (bomlik).
Fajlagos forgatóképesség: = -10,5° (c = 0,5, metanol).
Összegképlet: G51H8iKg020S,'NH4·
Molekulasúly:
nagyfelbontású tömegspektrum, gyorsatom-ütköztetéses módszer, a G51H82lí8°20S + 2Na “ H alapján:
számított m/e = 1203,5083, talált m/e = 1203,5100.
Oldhatóság:
metanolban és etanolban oldható, vízben és acetonban kismértékben oldható, és kloroformban és n-hexánban nem oldható.
Szinreakció:
pozitív szinreakció: jódgőz reakció, cérium-szulfát reakció.
negatív szinreakció: Dragendorff reakció, Ehrlich reakció.
- 35 Vékonyréteg-kromatográfiai ,ι
Álló fázis Futtató elegy R^-érték szilikagél 60s n-butanol:ecetsav:viz (3:1:1)0,34 etil-acetát:izopropil-alkohol:viz (5:3:1)0,67 a = szilikagél 60 (E· Merek).
Ultraibolya abszorpciós spektrum:
metanol χ (E x ): 206(196), 278(4), 243(sh), 2s4(sh) nm.
Amax1 cm metanol+0,01N-Na0H (E * ^m): 208(252), 290(5),
Anax 241 (sh.) nm.
Infravörös abszorpciós spektrum:
KBr . : 3300, 2900, 2840, 1680, 1660, 1640, 1620, 1510,
A mpx
1460, 1430, 1330, 1240, 1040, 960 cm-1.
- 36 ^H-NMR-spektrum (GD^OD, 400 MHz):
delta: 7,18 (1H, d, J = 2 Hz), 6,90 (1H, dd, J » 2 és
8,5 Hz), 6,81 (1H, d, J = 8,5 Hz), 5,29 (1H, d, J = 3 Hz), 5,08 (1H, d, J = 3,5 Hz), 4,98 (1H, d, J = 3 Hz), 4,63 (1H, dd, J = 7 és 11 Hz), 4,58 - 4,51 (3H, m), 4,46 - 4,38 (3H, m),
4.37 (1H, d, J = 2 Hz), 4,16 (1H, dd, J = 2 és
Hz), 4,07 (1H, dd, J = 7,5 és 9,5 Hz),
4,02 - 3,94 (2H, m), 3,78 (1H, br d, J = 11 Hz),
3.38 (1H, t, J = 9,5 Hz), 2,69 (1H, dd, J = 4,5 és 15 Hz), 2,63 - 2,50 (3H, m), 2,46 (1H, m), 2,43 (1H, dd, J = 9 és 15 Hz), 2,21 (2H, t, J = 7,5 Hz), 2,07 - 1,95 (3H, m), 1,58 (2H, m), 1,29 (24H, m), 1,16 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,07 (3H, d,
J = 7 Hz), 0,89 (3H, t, J = 6,5 Hz).
^C-NMR-spektrum (CD^OD, 100 MHz), delta: 176,7 (s), 175,8 (s), 174,4 (s), 174,0 (s), 172,8 (s), 172,5 (s), 172,5 (s), 169,4 (s), 149,1 (s), 141,1 (s), 131,1 (s), 128,0 (d),
125,j | * (d), | , 118 | ,3 (d), 75,9 (d), 74,0 (4), 73 | ,9 (4), 71, | • 3 (<) |
70,7 | (4), | 70,5 | (4), 70,2 (d), 68,2 (4), 62,4 | (4), 58,6 | (<), |
58,4 | (<), | 57,2 | (t), 55,5 (4), 52,9 (t), 51,4 | (d), 40, @ | (t), |
39,9 | (t), | 39,1 | (aj, 39,0 (t), 36,7 (i), 35,0 | (t), 33,1 | (t), |
30,8 | (t X | 5), . | 30,7 (t), 30,7 (t), 30,5 (t), : | 30,4 (t), | |
30,3 | (t), | 27,0 | (t), 23,7 (t), 19,5 (q), 14,4 | (q), U,1 | (q)· |
• · · *
A fenti fizikai és kémiai adatok elemzése alapján, továbbá a kémiai szerkezet meghatározására irányuló további vizsgálatok eredményei alapján az FR901381 jelzésű vegyületnek az (Id) szerkezetet tulajdonítjuk.
A fent leirt módon előállított FR901382 jelzésű vegyület fizikai-kémiai jellemzői a következők. Külső megjelenés: fehérszinü, porszertt anyag.
Jellege: semleges.
Op.: 208 - 217°C (bomlik).
Fajlagos forgatóképesség: [a]jp = -9,4° (c = 0,5, metanol).
.Összegképlet:
Molekulasúly: nagyfelbontású tömegspektrum, gyorsatom-ütköztetéses módszer, a C5iH82N8°19S + 21'ía “ H alapján:
számított m/e = 1187,5134, talált m/e = 1187,5139.
Oldhatóság:
metanolban és etanolban oldható, vízben és acetónban kismértékben oldható, és kloroformban és n-hexánban nem oldható.
Szinreakció:
pozitív szinreakoió: jódgőz reakció, cérium-szulfát reakció, negatív szinreakció: Dragendorff reakció, Ehrlich reakció.
V ékonyréteg-kromatográf ia:
Álló fázis Futtató elegy Rf-érték szilikagél35 n-butanol: ecetsav: viz (3:1:1)0,43 etil-acetát:izopropil-alkohol:viz (5:3:1)0,9 35 s= szilikagél 60 (E· Merek).
Ultraibolya abszorpciós spektrum:
metanol$ ^maz tE 1 cm>! 2°5(1βΟ), 276(13), 224(sh), 2s3(sh) nm.
·« metanol+0,01N-Na0H (E ^max
Infravörös abszorpciós
Kbr i : 3350, 2900, max
1510, 1430, ··· · · · ·· • · «···*« · •» · · « · ·
- 39 1 *): 208(262), 281(12), 241(sh), lem
295(sh) nm.
spektrum:
2840, 1680, 1660, 1640, 1620, 1330, 1245, 1080, 1040, 960 cm1.
1H-NMR-spektrum (CDjOD, 400 MHz), delta: 7,18 (IH, d, J = 2 Hz), 6,90 (1H, dd, J = 2 és 8,5 Hz), 6,80 (IH, d, J = 8,5 Hz), 5,37 (IH, dd, J = 3 és 11 Hz), 5,08 (IH, d,
J =3,5 Hz), 5,00 (IH, d, J = 3 Hz), 4,61 (IH, dd, J = 7 és 11 Hz), 4,59 (IH, d,
J = 2 Hz), 4,58 - 4,52 (2H, m), 4,46 - 4,35 \ (3H, m), 4,29 (IH, d, J = 2 Hz), 4,12 (IH, dd, J = 2 és 4,5 Hz), 4,07 (IH, dd,
J = 8 és 9,5 Hz), 4,01 (IH, dd, J = 3 és
Hz), 3,77 (IH, br d, J = 11 Hz), 3,37 (IH, t, J = 9,5 Hz), 2,69 (IH, dd, J = 4,5 és
15,5 Hz), 2,63 - 2,50 (3H, m), 2,45 (IH, m), γ'*
2,43 (IH, dd, J = 9* és 15,5 Hz), 2,24 (2H, m), 2,09 - 1,95 (3H, m), 1,76 - 1,66 (2H, m), 1,59 (2H, m), 1,29 (24H, m), 1,15 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,06 (3H, d, J = 7 Hz), 0,89 (3H, t, J = 7 Hz).
• · ··
13C-NMR-sp | lektrum (C | D-jOD, 100 MHz), | |||
delta: | 176,6 | (s), 176,0 (s) | , 175 | , 1 (s | ), |
174,0 | (s), 172,8 (s) | , 172 | ,6 (s | ), | |
172,5 | (s), 169,1 (s) | , 149 | ,1 (s | )r | |
141,1 | (a), 131,1 (s) | , 128 | ,1 (d | >, | |
125,3 | (d), 118,2 (d) | , 76, | 1 (d) | ||
74,0 | (d), 71,8 (d), | 71,3 | (d), | ||
70,5 | (d), 70,3 (d), | 68,3 | (d), | 62,5 | |
(d), | 58,5 (d), 58,2 | (d), | 57,2 | (t), | |
55,4 | (d), 52,9 (t), | 52,1 | (d), | ||
40,8 | (t), 39,8 (t), | 39,1 | (d), | 38,9 | |
(t), | 36,8 (t), 33,1 | (t), | 30,9 | (t), | |
30,8 | (t x 5), 30,7 ( | t), 3 | 0,7 ( | t), | |
30,7 | (t), 30,5 (t), | 30,4 | (t), | ||
30,3 | (t)> 27,3 (t), | 26,9 | (t), | 23,7 | |
(t)i | 19,4 (q), 14,4 | (q)» | 11,1 | (q)· |
4
- 41 A fenti fizikai és kémiai tulajdonságok elemzése alapján, továbbá a kémiai szerkezet meghatározására szolgáló további vizsgálatok alapján az FR901382 jelzésű vegyületnek az (le) szerkezetet tulajdonítjuk.
2. példa mg FR9O1379 jelzésű vegyület 30 ml 50 mmólos Trisz-HCl-pufferoldattal (pH = 7,1) készült oldatához hozzáadunk 200 egység VI. tipusu, Aerobacter aerogenesből (SIGMA, No.S-1629) származó szulfatáz enzimet. Az elegyet 30 órán át 37°C hőmérsékleten tartjuk, majd az igy képződött, deszulfonált FR901379 jelzésű vegyületet •(e terméket a továbbiakban ERI33302 jelzésű vegyület,'ként említjük) a vizes oldattal azonos térfogatú n-butanollal kirázzuk, és a butanolos részt vízzel egyszer mossuk. Ezután a butanolos részről az oldószert csökkentett nyomáson ledesztilláljuk, és a maradékot felviszszük egy B-méretü, előre megtöltött LiChroprep RP-18 (40 - 63 /um) oszlopra (Merek), amelyet 0,5 % ammónium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó, 47 %-os, vize,s acetonitrillel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot ugyanezzel az oldattal eluáljuk. Az PR133302 jelzésű vegyületet tartalmazó frakciót vele azonos térfogatú vízzel hígítjuk, és közvetlenül felvisszük egy (a Yamamura Chemical Láb. által előállított) ODS YMC GEL-lel töltött oszlopra.
- 42 4
Az oszlopot vizzel mossuk, majd metanollal eluáljuk.
Az elutumról a metanolt csökkentett nyomáson ledesztillaljuk, és a maradék elegyét fagyasztva szárítjuk. Ily módon fehérszinü, porszerü anyag formájában 26 mg FR133302 jelzésű vegyületet kapunk.
Az igy előállított FR133302 jelzésű vegyület fizikai-kémiai sajátságai a következők:
külső megjelenés: fehérszinü, porszerü anyag.
Jellege: semleges.
Op.: 218 - 222°C (bomlik).
2? o
Fajlagos forgatóképesség: [a]D = -30 (c = 1,0, metanol).
Összegképlet:
G51H82N8°18·
Molekulasúly:
nagyfelbontású tömegspektrum, gyorsatom-ütköztetéses módszer, a C51H82N8°18 + Na «-lapján:
számított m/e = 1117,5645, talált m/e = 1117,5659.
- 43 * « * « · · 9 t> V « ·
ς. < · · * • · · ►
Oldhatóság:
metanolban és etanolban oldható, vizben és etil-acetátban kismértékben oldható, és kloroformban és n-hexánban nem oldható.
Szinreakció:
pozitív szinreakció: jódgőz reakció, cérium-szulfát reakció, negatív szinreakció: Dragendorff reakció, Molish reakció.
Vékonyréteg-kromatográfia:
Álló fázis Futtató elegy R^-érték szilikagélK n-butanol:ecetsav:viz (6:1:1)0,35 x
szilikagél 60 (E. Merek)
Ultraibolya abszorpciós spektrum:
metanol > (E 1 ): 207(353), 282(25), 232(sh) nm.
max1 cm metanol[0,OlN-NaOHj
Anax (E í cm> : 208(462)> 246(54,5), 293(31,2) nm.
• <f ·#*· *
- 44 • · • Λ Λ * » ··» · · · »· • ♦ ·►#*·· «· « * · · « · *
Infravörös abszorpciós spektrum:
KBr . : 3350, 2925, 2855, 1660, 1630, 1530, 1445, max .
1285, 1250, 1065 cm .
1H-NMR-spektrum (CD^OD, 400 MHz), delta: 6,79 (1H, d, J «·2 Hz), 6,71 (1H, d,
J = 8 Hz), 6,61 (1H, dd, J = 8 és 2 Hz),
5,25 (1H, d, J = 2,5 Hz), 5,06 (1H, d,
J = 4 Hz), 4,96 (1H, d, J = 3 Hz),
4,60 - 4,20 (9H, m), 4,15 (1H, m),
4,08 (1H, m), 3,99 (1H, m), 3,91 (1H, m),
3,77 (1H, m), 3,34 (1H, m), 2,80 (1H, dd,
J = 15 és 3 Hz), 2,54 - 2,40 (3H, m),
2,20 (2H, t, J « 7 Hz), 2,05 - 1,96 (3H, m), 1,56 (2H, m), 1,35 - 1,20 (24H, m), 1,15 (3H, d, J = 6 Hz),
1,02 (3H, cL, J = 7 Hz), 0,89 (3H, t,
J = 7 Hz).
- 45 ·* ·*·· ♦»f • · · · · «4· · · ··· « « * ·«·· · · ·· ·· ·**
1^C-NMR-spektrum (CD^OD, 100 MHz), | |
delta: | 177.2 (s), 175,8 (s), 174,5 (s), 173,4 (s), 172,7 (s), 172,6 (s), 172,5 (s), 169,1 (s), 146.4 (s), 146,3 (s), 133,7 (s), 120,1 (d), 116.2 (d), 115,3 (d), 76,9 (d), 75,9 (d), 75.8 (d), 74,0 (d), 71,3 (d), 70,6 (d), 70.6 (d), 70,1 (d), 68,2 (d), 62,5 (d), 58.4 (d), 57,1 (t), 56,4 (d), 55,6 (d), 53,0 (t), 51,5 (d), 39,5 (t), 39,0 (d), 38.5 (t), 36,7 (t), 34,8 (t), 33,1 (t), 30.8 (t x 5), 30,7 (t), 30,6 (t), 30,5 (t), 30,4 (t), 30,3 (t), 26,9 (t),. 23,7 (t), 19.7 (q), 14,4 (q), 11,1 (q). |
Az FR133302 jelzésű vegyület szerkezetét az (If) képlettel írhatjuk le
Claims (4)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás az (I) általános képletű, ahol £R jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, pR jelentése hidrogénatom vagy hidroxilcsoport, ésR jelentése hidroxilcsoport vagy hidroxi-szulfoniloxi-csoport, azzal a megkötéssel, hogy haR jelentése hidrogénatom, akkorR jelentése ugyancsak hidrogénatom, polipeptidek és ezek sói előállítására, azzal j ellemezve, hogya) egy» a Coleophoma nemzetséghez tartozó, valamely (la) általános képletű, aholR1 és R2 jelentése a fenti, vegyületet vagy sóját termelni képes törzset egy alkalmas táptalajon tenyésztünk, majd az (la) általános képletü vegyületet vagy sóját elkülönítjük, vagy «· ·· ···· · • · · ·· ··· · · ···' • · · ···· · · ·· ·· ···- 47 b) a fenti a) pontban leirt módon előállított (la) általános képletű vegyületről vagy sójáról lehasitjuk a szulfocsoportot, és igy (Ib) általános képletű, ahol1 2R és R jelentése a fenti* vegyületet vagy sóját állítjuk elő.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű polipeptid előállítására, ahol1 2R és R jelentése egyaránt hidroxilcsoport, ésR jelentése hidroxi-szulfoniloxi-csoport.
- 3. Eljárás olyan gyógyászati készítmények előállítására, amelyek hatóanyagként valamely, az 1. igénypontban meghatározott (I) általános képletű vegyületet vagy ennek gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazzák, gyógyászatilag elfogadható vivőanyagok kíséretében.
- 4. Eljárás a Coleophoma sp. F-11899 jelzésű (FERM BP-2635) mikroorganizmus biológiailag tiszta tenyészetének előállítására.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB898925593A GB8925593D0 (en) | 1989-11-13 | 1989-11-13 | Fr901379 substance and preparation thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU907105D0 HU907105D0 (en) | 1991-05-28 |
HUT58820A true HUT58820A (en) | 1992-03-30 |
Family
ID=10666207
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU907105A HUT58820A (en) | 1989-11-13 | 1990-11-12 | Process for producing new polypeptides |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5502033A (hu) |
EP (1) | EP0431350B1 (hu) |
JP (1) | JP3111470B2 (hu) |
KR (1) | KR910009729A (hu) |
CN (1) | CN1051757A (hu) |
AT (1) | ATE125550T1 (hu) |
AU (1) | AU6655790A (hu) |
CA (1) | CA2029766A1 (hu) |
DE (1) | DE69021176T2 (hu) |
DK (1) | DK0431350T3 (hu) |
ES (1) | ES2075115T3 (hu) |
FI (1) | FI905575A0 (hu) |
GB (1) | GB8925593D0 (hu) |
HU (1) | HUT58820A (hu) |
IE (1) | IE904072A1 (hu) |
IL (1) | IL96272A0 (hu) |
NO (1) | NO904904L (hu) |
PT (1) | PT95876A (hu) |
ZA (1) | ZA908892B (hu) |
Families Citing this family (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5386009A (en) * | 1990-03-19 | 1995-01-31 | Merck & Co. Inc. | Lipopeptide derivatives |
US5330973A (en) * | 1990-03-19 | 1994-07-19 | Merck & Co., Inc. | Lipopeptide derivatives |
IE990233A1 (en) * | 1990-06-18 | 2000-11-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | New Polypeptide Compound and a Process for Preparation thereof |
US5428009A (en) * | 1990-07-16 | 1995-06-27 | Merck & Co., Inc. | Lipopeptide derivatives |
USH1638H (en) * | 1990-11-08 | 1997-03-04 | Furuta; Takahisa | Use of the polypeptide compound |
EP0486011A3 (en) * | 1990-11-16 | 1992-07-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Pharmaceutical composition against pneumocystis carinii |
US5385884A (en) * | 1991-08-27 | 1995-01-31 | Merck & Co. Inc. | Lipopeptide derivatives |
US5378804A (en) * | 1993-03-16 | 1995-01-03 | Merck & Co., Inc. | Aza cyclohexapeptide compounds |
IL109615A (en) * | 1993-05-17 | 2000-12-06 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Cyclic polypeptide derivatives processes for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing the same |
US5516757A (en) * | 1994-09-16 | 1996-05-14 | Merck & Co., Inc. | Semi-synthetic lipopeptides, compositions containing said lipopeptides, and methods of use |
US5516756A (en) * | 1994-10-31 | 1996-05-14 | Merck & Co., Inc. | Aza cyclohexapeptide compounds |
WO1996022784A1 (en) * | 1995-01-26 | 1996-08-01 | Merck & Co., Inc. | Novel antifungal cyclohexapeptides |
DE69739532D1 (de) | 1996-03-08 | 2009-09-24 | Astellas Pharma Inc | Prozess für die deacylierung von zyklischen lipopeptiden. |
WO1997047738A1 (fr) * | 1996-06-13 | 1997-12-18 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Acylase des lipopeptides cycliques |
US5696084A (en) * | 1996-08-16 | 1997-12-09 | Abbott Laboratories | Amino-lipopetide antifungal agents |
AUPO371596A0 (en) * | 1996-11-19 | 1996-12-12 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | New compound |
AUPO691897A0 (en) * | 1997-05-21 | 1997-06-12 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | New compound |
US6319757B1 (en) * | 1998-07-08 | 2001-11-20 | Caldus Semiconductor, Inc. | Adhesion and/or encapsulation of silicon carbide-based semiconductor devices on ceramic substrates |
CA2410480A1 (en) * | 2000-05-26 | 2001-12-06 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Reagents and methods for identifying and modulating expression of genes regulated by retinoids |
EP1366065A1 (en) * | 2001-02-26 | 2003-12-03 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Echinocandin derivatives, pharmaceutical compositions containing same and use thereof as drugs |
AUPS188302A0 (en) * | 2002-04-22 | 2002-05-30 | Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. | Pharmaceutical composition |
US7459290B1 (en) | 2004-03-30 | 2008-12-02 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Methods of using functional 30S subunits |
RU2470939C2 (ru) | 2007-10-29 | 2012-12-27 | Астеллас Фарма Инк. | Полипептидное соединение |
JP5387567B2 (ja) * | 2008-03-14 | 2014-01-15 | アステラス製薬株式会社 | 環状化合物およびその塩 |
CA2813330A1 (en) | 2010-09-29 | 2012-04-05 | Shanghai Techwell Biopharmaceutical Co., Ltd. | Process for purifying cyclolipopeptide compounds or the salts thereof |
US8877777B2 (en) * | 2010-09-30 | 2014-11-04 | Shanghai Techwell Biopharmaceutical Co., Ltd. | Process for purifying cyclolipopeptide compounds or the salts thereof |
CN102485879A (zh) * | 2010-12-03 | 2012-06-06 | 上海医药工业研究院 | 一种用于生产wf11899a的发酵培养基 |
CN102533551B (zh) * | 2010-12-15 | 2013-10-09 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种肽类抗生素的高产菌株及其制备方法和用途 |
CN102618604B (zh) * | 2011-01-31 | 2014-09-03 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种环脂肽化合物的制备方法 |
CN102952179B (zh) * | 2011-08-24 | 2015-11-25 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种高纯度米卡芬净前体化合物的制备方法 |
CN102627689B (zh) | 2012-03-30 | 2014-08-06 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种环肽类化合物的水合物及其制备方法和用途 |
CN102659930B (zh) | 2012-03-30 | 2014-04-23 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高纯度环肽类物质的晶体及其制备方法和用途 |
CN102627688B (zh) | 2012-03-30 | 2014-12-31 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种高纯度环肽化合物及其制备方法和用途 |
CN103387975A (zh) | 2012-05-11 | 2013-11-13 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种固定化环脂肽酰基转移酶及其制备方法和用途 |
CN103848900B (zh) * | 2012-12-04 | 2015-12-02 | 上海医药工业研究院 | 一种从发酵液中分离纯化wf11899a的方法 |
CN114874919B (zh) * | 2022-05-09 | 2023-06-27 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一株米卡芬净前体fr901379高产菌株及其应用 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1159450A (en) * | 1979-12-13 | 1983-12-27 | Manuel Debono | Process for the preparation of derivatives of cyclic peptide nuclei |
US4322338A (en) * | 1979-12-13 | 1982-03-30 | Eli Lilly And Company | Derivatives of A-30912B nucleus |
US4320052A (en) * | 1979-12-13 | 1982-03-16 | Eli Lilly And Company | Derivatives of A-30912A nucleus |
US4320053A (en) * | 1979-12-13 | 1982-03-16 | Eli Lilly And Company | Derivatives of A-30912D nucleus |
CA1182812A (en) * | 1979-12-13 | 1985-02-19 | Bernard J. Abbott | Process for the preparation of derivatives of cyclic peptide nuclei |
US4287120A (en) * | 1979-12-13 | 1981-09-01 | Eli Lilly And Company | Derivatives of S31794/F-1 nucleus |
EP0311193B1 (en) * | 1987-10-07 | 1993-12-01 | Merck & Co. Inc. | Antifungal fermentation product |
DK173802B1 (da) * | 1988-09-12 | 2001-11-05 | Merck & Co Inc | Præparat til behandling af Pneumocystis carinii infeksioner og anvendelse af et cyclohexapeptid til fremstilling af et lægemiddel mod Pneumocystis carinii infektioner |
US5330973A (en) * | 1990-03-19 | 1994-07-19 | Merck & Co., Inc. | Lipopeptide derivatives |
IE990233A1 (en) * | 1990-06-18 | 2000-11-15 | Fujisawa Pharmaceutical Co | New Polypeptide Compound and a Process for Preparation thereof |
-
1989
- 1989-11-13 GB GB898925593A patent/GB8925593D0/en active Pending
-
1990
- 1990-11-06 ZA ZA908892A patent/ZA908892B/xx unknown
- 1990-11-07 IL IL96272A patent/IL96272A0/xx unknown
- 1990-11-08 JP JP02305797A patent/JP3111470B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-10 EP EP90121558A patent/EP0431350B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-10 AT AT90121558T patent/ATE125550T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-11-10 ES ES90121558T patent/ES2075115T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-10 DE DE69021176T patent/DE69021176T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-11-10 DK DK90121558.2T patent/DK0431350T3/da active
- 1990-11-12 FI FI905575A patent/FI905575A0/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-11-12 KR KR1019900018232A patent/KR910009729A/ko not_active Application Discontinuation
- 1990-11-12 NO NO90904904A patent/NO904904L/no unknown
- 1990-11-12 HU HU907105A patent/HUT58820A/hu unknown
- 1990-11-12 IE IE407290A patent/IE904072A1/en unknown
- 1990-11-13 PT PT95876A patent/PT95876A/pt not_active Application Discontinuation
- 1990-11-13 CA CA002029766A patent/CA2029766A1/en not_active Abandoned
- 1990-11-13 AU AU66557/90A patent/AU6655790A/en not_active Abandoned
- 1990-11-13 CN CN90109271A patent/CN1051757A/zh active Pending
-
1994
- 1994-03-28 US US08/218,883 patent/US5502033A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK0431350T3 (da) | 1995-09-11 |
AU6655790A (en) | 1991-05-16 |
JPH03184921A (ja) | 1991-08-12 |
DE69021176T2 (de) | 1996-01-11 |
JP3111470B2 (ja) | 2000-11-20 |
EP0431350B1 (en) | 1995-07-26 |
FI905575A0 (fi) | 1990-11-12 |
IL96272A0 (en) | 1991-08-16 |
HU907105D0 (en) | 1991-05-28 |
GB8925593D0 (en) | 1990-01-04 |
IE904072A1 (en) | 1991-05-22 |
ES2075115T3 (es) | 1995-10-01 |
DE69021176D1 (de) | 1995-08-31 |
PT95876A (pt) | 1991-09-13 |
CN1051757A (zh) | 1991-05-29 |
NO904904L (no) | 1991-05-14 |
ATE125550T1 (de) | 1995-08-15 |
US5502033A (en) | 1996-03-26 |
KR910009729A (ko) | 1991-06-28 |
ZA908892B (en) | 1991-09-25 |
NO904904D0 (no) | 1990-11-12 |
CA2029766A1 (en) | 1991-05-14 |
EP0431350A1 (en) | 1991-06-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HUT58820A (en) | Process for producing new polypeptides | |
HU211514A9 (en) | Fr 901228 substance and preparation thereof | |
JPH06339390A (ja) | Bu−4164e−a及びb、プロリルエンドペプチダーゼインヒビター | |
EP0345735A2 (en) | Glycoside antibiotics BU-3608D and BU-3608E | |
US5854276A (en) | Substance WF16616, process for production thereof, and use thereof | |
EP0584360B1 (en) | Wf11243 substance | |
SK287310B6 (sk) | Memnopeptidy, spôsob ich prípravy, kompozície, ktoré ich obsahujú a ich použitie ako liečiva | |
US6730776B1 (en) | WF14573 or its salt, production thereof and use thereof | |
EP1087987B1 (en) | A compound, wf002, production thereof and use thereof | |
JP4095116B2 (ja) | スクレロデルマ・テキセンスからの抗真菌性ペプチド | |
US5096817A (en) | Process for producing antibiotics BU-3608 D and BU-3608 E | |
KR0143769B1 (ko) | 항균성 폴리펩티드 화합물과 그 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물 | |
JP2002510335A (ja) | 新規化合物wf00144 | |
WO1999020651A1 (fr) | Nouveaux composes antifongiques | |
JPH11255797A (ja) | 新規抗真菌化合物 | |
IE62085B1 (en) | New compound WF 2015 A en B, production thereof and use thereof | |
WO1995018142A1 (en) | Wf15604 substances | |
JP2003520804A (ja) | 新規な環状化合物 | |
JPH0971598A (ja) | Wf16616物質、その製法及び用途 | |
JPH08259585A (ja) | 生理活性物質fr183783 | |
JPH1160572A (ja) | チアゾリルピリジン系化合物 | |
JP2002069075A (ja) | 新規生理活性物質nk34896b、及びその製造法 | |
GB2293379A (en) | WF17819 substance | |
WO2000063239A1 (fr) | Nouveaux composes antifongiques | |
JP2002509445A (ja) | 新規化合物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |