DK148751B - Fremgangsmaade til fremstilling af cyclosporinderivater - Google Patents

Description

i 148751

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte cyclosporinderivater med den almene formel I

CH3v /H3 CH C?3 /CH3 CH, CH, I Nh \V 3 CH, CH,I CH ,3 I 2 I 3I il CH,-N-CH-CO-N — CH- A — CO-N-CH-C-N-CH, 3 L L I L II I 2

„„CO H O CO

I I I

CH-CH,-CH l n-ch, 1 CH3/ 2 I 3

Η O H

I D L I L || L I L

OC-CH-N-CO-CH-N-CO-CH-N-C-CH-N-CO-CH

111 111 I

CH, H CH, CH, CH, CH CH, 3 3 .*2 V\ I 2

CH CH3 CH3 CH

ch3 nch3 ch3 ch3 hvor A betegner

CH, H

\y c 5 (i det nedenstående / \

H CH

betegnet cyclosporin D), i 2

e,,er HO _ CH

^cif ^CH,

f3 I

-C-N-CH —

II L

O

2 148751 CH3\ CH, I 2 H2C\

CH

I 2

IR

(i det nedenstående HØ ^

betegnet dihydro-cyclo- ^CH

sporin D), eller CH^ j 3 | N lH~ 0

CH, H

\ /

C

H CH,

(i det nedenstående |R

5 betegnet isocyclosporin D). 0 n CH

κ\κ/ \ XCH CH,

-C HN-CH

I 1 L

b ch3

Det er kendt, jfr. dansk fremlæggelsesskrift nr. 136.780 og beskrivelsen til dansk patentansøgning nr. 4831/76, at fremstille antibiotika betegnet cyclosporin A (også kendt som S 7481/F-1), cyclosporin B

3 148751 (også kendt som S 7481/F-2) og cyclosporin C ved dyrkning af en stamme af svampearten Trichoderma polysporum (Link ex. Pers) især NRRL 8044 og isolering af nævnte cyclosporiner fra kulturfiltratet.

Nævnte stamme indordnes nu under svampearten Tolypocladium infla-5 turn Cams. Cyclosporin A, B og C har immunoundertrykkende, betændelseshæmmende og arthritishæmmende virkning.

Det har nu overraskende vist sig, at ovennævnte svampeart ud over cyclosporin A, B og C danner en yderligere cyclosporin, nemlig cyclosporin D.

10 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til fremstilling af de hidtil ukendte cyclosporin D, dihydro-cyclosporin D eller isocyclo-sporin D er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at a) der ud fra et kulturfiltrat vundet ved dyrkning af en cyclospo-rin-producerende stamme af svampearten Tolypocladium inflatum Cams

15 isoleres cyclosporin D, hvorpå det vundne cyclosporin D

b) eventuelt hydrogeneres til dannelse af dihydro-cyclosporin D, eller c) eventuelt underkastes syrebehandling til dannelse af isocyclosporin D.

Til fremstillingen af cyclosporin D kan som nævnt anvendes stammer 20 af svampearten Tolypocladium inflatum Cams, fx NRRL 8044 eller sådanne, som kan fås ved selektion eller mutation af svampestammen NRRL 8044 ved påvirkning med ultraviolette stråler eller røntgenstråler eller under anvendelse af andre foranstaltninger, fx behandling af laboratoriekulturer med egnede kemikalier. 1

Cyclosporin D kan isoleres på i og for sig kendt måde, fx som beskrevet i eksempel 1. Herved kan cyclosporin D skilles fra samtidigt i store mængder tilstedeværende noget mere polært cyclosporin A, mere polært cyclosporin B og det endnu mere polære cyclosporin C.

4 148751

Det eventuelle fremgangsmådetrin b) ifølge den foreliggende opfindelse kan udføres på i og for sig kendte måder, fx ved katalytisk hydrogenering.

Som opløsningsmidler kan fortrinsvis anvendes lavere aliphatiske alko-5 holer, fx methanol, ethanol eller isopropanol, eller ethylacetat. Hydrogeneringen udføres hensigtsmæssigt ved neutral pH-værdi ved temperaturer mellem 20 og 30°C og ved atmosfæretryk eller ved svagt forhøjet tryk. Som katalysator anvendes fortrinsvis palladium, fx palladium/kul.

10 Syrebehandlingen ved det eventuelle fremgangsmådetrin c) kan udføres på i og for sig kendt måde, fx med trifluoreddikesyre, fortrinsvis med methansulfonsyre eller p-toluensulfonsyre.

Den til isomeriseringen anvendte mængde stærk syre ligger fortrinsvis mellem 1 og 4 mol pr. mol cyclosporin D.

15 Som opløsningsmidler kan fx anvendes lavere alkoholer, fx methanol, halogenerede carbonhydrider, fx chloroform, eller ethere, fx dioxan.

Reaktionstemperaturen kan variere mellem 20 og 65°C, fortrinsvis mellem 45 og 55°C.

Cyclosporin D, dihydro-cyclosporin D og isocyclosporin D udmærker 20 sig ved interessante kemoterapeutiske og farmakologiske egenskaber og kan derfor anvendes som lægemidler.

Cyclosporin D, dihydro-cyc.losporin D og isocyclosporin D er især indiceret ti| anvendelse som antiarthritica.

Cyclosporin D, dihydro-cyclosporin D og isocyclosporin D kan som 25 lægemidler administreres alene eller i en egnet lægemiddelform sammen med farmakologisk indifferente hjælpestoffer.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse belyses nærmere ved følgende eksempler.

5 148751

EKSEMPEL 1 Cyclosporin D

500 liter af en næringsopløsning, som pr. liter indeholder 40 g glucose, 2,0 g natriumcaseinat, 2,5 g ammoniumphosphat, 5 g 5 MgSO^.THjO, 2 g KHjPO^, 3 g natriumnitrat, 0,5 g kaliumchlorid, 0,01 g FeSO^ og demineraliseret vand, podes med 50 liter af en forkultur af stamme NRRL 8044 og inkuberes i 13 dage ved 27°C i en stålfermenteringsbeholder under omrøring (170 OPM) og beluftning (1 liter luft/minut/liter næringsopløsning) (se tysk offentliggørelsesskrift 10 nr. 2.455.859).

Dyrkningsvæsken ekstraheres med en lige så stor mængde n-butylace-tat, den organiske fase skilles fra og inddampes i vakuum, og råekstrakten affedtes ved tre-trins-fordeling mellem methanol-vand (9:1) og petroleumsether. Den methanoliske fase fraskilles og inddampes i 15 vakuum, og råproduktet udfældes ved tilsætning af vand. Det ved filtrering vundne materiale chromatograferes på silicagel med hexan-acetone (2:1) som elueringsmiddel, hvorhos de først eluerede fraktioner overvejende indeholder cyclosporin A og cyclosporin D og de senere eluerede dele overvejende cyclosporin C. De cyclosporin A- og 20 D-holdige fraktioner krystalliseres til yderligere rensning af en 2 til 2,5 gange så stor mængde acetone ved -15°C, og det krystallinske materiale opspaltes derpå yderligere ved to gange chromatografi på silicagel, hvorhos de med vandmættet ethylacetat først eluerede fraktioner indeholder cyclosporin D i stærkt opkoncentreret form. Disse 25 opløses i en dobbelt så stor mængde acetone og lades krystallisere ved -15°C. Det således vundne rå krystallinske cyclosporin D opløses til videre rensning i en 10 gange så stor mængde acetone, der tilsættes 2 vægtprocent aktivt kul og opvarmes i 5 minutter til 60°C. Efter filtrering over talkum fås et klart og næsten farveløst filtrat, som 30 derpå inddampes til 1/3 af det oprindelige volumen og lades afkøle til stuetemperatur, hvorved cyclosporin D spontant udkrystalliserer. Ved henstand ved -17°C fuldendes krystalliseringen. Krystallerne frafil-treres og vaskes med lidt iskold acetone og tørres derpå i højvakuum ved 80°C i 2 timer.

20 148751 6

Karakterisering af cyclosporin D:

Farveløse, prismatiske krystaller, smeltepunkt 148-151°C, [ct]^ = -245° (c = 0,52 I chloroform), [α]ρ0 = -211° (c = 0,51 i methanol).

5 EKSEMPEL 2

Dihydro-cyclosporin D

400 mg palladium/kul (10%'s palladium) forhydrogeneres i 15 ml ethanol i 20 minutter. Til denne suspension af palladiumkatalysatoren sættes en opløsning af 3,66 g cyclosporin D opnået som i eksempel 1 i 30 ml 10 ethanol, og derpå hydrogeneres ved 24°C og et tryk på 736 mm Hg, til der ikke længere optages hydrogen. Derpå filtreres katalysatoren fra, og filtratet inddampes til tørhed i vakuum ved 20-30°C. Derved fås tyndtlagschromatografisk ensartet dihydro-cyclosporin D i form af et farveløst amorft pulver, som tørres i højvakuum i 4 timer ved 15 70°C.

Egenskaber for dihydro-cyclosporin D:

Smeltepunkt 153-156°C, [a]*° = -237° (c = 0,56 i CHCIg), [,«]q° = “196° (c = 0,58 i CHgOH).

20 EKSEMPEL 3

Isocyclosporin D

Til en opløsning af 18,25 g cyclosporin D opnået som i eksempel 1 i 120 ml absolut dioxan sættes en opløsning af 3,60 g methansulfonsyre i 60 ml dioxan, og blandingen holdes ved 50°C under fugtighedsude-25 lukkelse. Reaktionens forløb følges på tyndtlagschromatogram (Poly-

Claims (6)

148751 gram SIL G-folier, chloroform-methanol-iseddike (90:6:4), ioddamp til fremkaldelse). Efter 17 timer afkøles til stuetemperatur. Syren neutraliseres ved tilsætning af 3,38 g vandfrit natriumacetat, der omrøres i 15 minutter, 5 det udfældede salt isoleres ved sugefiltrering, og filtratet inddampes i vakuum ved 45°C. Remanensen (21 g) chromatograferes på 1,5 kg si-licagel, hvorhos der elueres med chloroform-methanol (98:2). De fraktioner, som praktisk taget består af rent isocyclosporin D, forenes og inddampes i vakuum ved 50°C, og remanensen krystalliseres to til tre 10 gange af ether, hvorved fås isocyclosporin D. Egenskaber for isocyclosporin D: Farveløse prismer, smeltepunkt 142-144°C. [o]p° = -205,5° (c = 0,51 i CHCIg), [a]p° = -144,4° (c = 0,64 i CHgOH).

15 PATENTKRAV Fremgangsmåde til fremstilling af cyclosporinderivater med den almene formel I CH3 /CH3 ''cH /CH3 CH-. CH3 I CH \V 3h |H2 ?H3| T I 3 CH,-N-CH-C0-N — CH- A — CO-N-CH-C-N-CH,

3. L I 1 li I 2 CO H O CO 3\ I I . CH-CH0-CH L N-CH, 1

2 I 3 CH3-·? Η O H i D L I L || L I L OC-CH-N-CO-CH-N-CO-CII-N-C-CH-N-CO-CH III III i CHj H CH3 CH2 CH3/CH CH2 CH CH3 CH3 CH CH3 Nch3 CH3 CH3 148751 hvor A betegner CH- H \/ C A |r2 . HO CH (i det nedenstående \ηχί CH betegnet cyclosporin D), CH_ I J I J d,er -C-N- CH —

11 L o CH3\ CH, 5 (i det nedenstående CH betegnet dihydro-cyclo- i 2 sporin D), eller H0 in \ R X \ ^CH CH- CH- I i3 I -C—N-CH- II o CH, H N / C II X\ H CH, I £ i R (i det nedenstående J,u κο η ^CH <;H -C HN-CH- t 1 L

0 CH3