FI59814C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbar cyklosporin d - Google Patents

Description

ν55^71 ΓβΊ m,KUULUTUSjULKAISU cc o -li.

•^ΙΠ? ^ ^ UTLÄGGNINGSSKRIFT 5 581 4 c (4¾ Pat;·;.:. Li I Ly 12 lU 1 .· J1 ' ^ ' (51) Kv.ik.^/int.ci.3 G 12 P 17/10, C 07 D 259/00.

C O? C 103/52 SUOMI — FINLAND (21) P»tanttlhakemut — Patentanseknlng 7813^8 (22) Hakemiaptlvl — Ansöknlngsdag 02.05.78 (23) AlkupSlvi—Glklghatsdag 02.05.78 (41) Tullut Julkiseksi — Bllvlt offentlig 11.11.78

Patentti· ja rekisterihallitut .... .............______ . . .....

· , (+4) Nlhtivlkslpanen Ja kuuLjulkalaun pvm. — n.

Patent- och registerstyrelsen Ansökan utlagd oeh utl.skrlften publicerad 30. 00. Ö1 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird priorltet 10.05*77 10.05*77, i7.O6.77 Sveitsi-Schveiz(CH) 5822/77, 5823/77, 71*57/77 (71) Sandoz A. G. , CH-1*002 Basel, Sveitsi-Schveiz(CH) 1 (72) Rene P. Trater, Basel, Max Kuhn, Basel, Hans Hofmann, Ettingen,

Eugen Harri, Therwil, Sveitsi-Schweiz(CH) (7l*) Oy Kolster Ah

(5*0 Menetelmä terapeuttisesti käytettävän syklosporiini D:n valmistamiseksi - Förfarande för framställning av terapeutiskt användbar cyklosporin D

Tämän keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käytettävän syklosporiini D:n valmistamiseksi, jolla on kaava

C

II

l/ ''''CHj CH3\ /CHa „ Ir ch, .ch, CH HO. R^CH 3v / 3

I CK3^ ^CH3 ch Ncn3 CH

CHj ch3 ch CHj I j CH3 CHj-M-CH-CO-N--Ιη -C-Nl-CH-CO-N-CH-C-f!)-CH,

I «- L II l I L II

I O HO

CO

CH3^ j CO

CH-CHj-CH t.

CH3 I N-CH,

CHj-N

I H 0 m I t I e II u I i

OC-CH-N-CO-CH-N-CO-CH-N-C-CH-N-CO-C M

III III I

CH3 ·Η CH] CH2 CH] CH CH]

I C H] SCH] I

CM CH

/ \ / \ CH] CH] CH] CH] 2 59814

Keksinnön mukaan syklosporiini D:tä saadaan siten, että viljellään viljelyväli-aineessa tunnettua sienilajin Tolypocladium inflatum Gams kantaa NRRL 80I+U ja syklosporiini D eristetään sinänsä tunnetuin menetelmin 'viljelyväliaineesta, joka sisältää syklosporiini D:n lisäksi tunnettuja polaarisempia syklosporiineja A, B ja C.

Menetelmän mukainen viljely voidaan suorittaa analogisten kantojen viljelystä sinänsä tunnetuin menetelmin, esim. siten kuin on kuvattu esimerkissä 1.

Edullinen syklosporiini D:tä tuottava kanta on vapaasti saatavana oleva sienilajin Tolypocladium inflatum Gams kantaa NRRL 8oUU. Tämän kannan viljelmä on talletettu laitoksessa United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, 111., USA. Tämä kanta on aikaisemmin määritelty kuuluvaksi sienilajiin Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.), ja se on kuvattu esimerkiksi FI-patenttijulkaisussa 5^ 6θ6.

Syklosporiini D voidaan eristää sinänsä tunnetulla tavalla, esim. siten kuin esimerkissä on kuvattu. Tällöin syklosporiini D voidaan erottaa suurina määrinä esiintyvistä luonnon tuotteista, esim. jonkin verran polaarisemmasta syklosporiini A:sta (tunnetaan myös nimellä S 7^81/F-1), polaarisemmasta syklosporiini B:stä (tunnetaan myös nimellä S 7^81/f-2) ja vielä polaarisemmasta syklosporiini C:stä.

Syklosporiini D:llä on mielenkiintoisia kemoterapeuttisia ja farmakologisia ominaisuuksia, ja erityisesti se sopii käytettäväksi lääkeaineena niveltulehduksen vastaisen' aktiviteettinsa vuoksi.

Syklosporiini D:n edullinen vaikutus niveltulehdukseen todettiin käyttämällä Freund-adjuvantilla keinotekoisesti aikaansaatua niveltulehdusta. Kokeissa saatiin syklosporiini D:n ED^-annoksen arvoksi mg/kg p.o. Vertailuyhdisteenä käytetyllä syklosporiini A: 11a (FI-patenttijulkaisun 52 851 yhdiste S 7*+8l/F-l) vastaava ED^Q oli 25 mg/kg p.o. Erityisen mielenkiintoinen on kuitenkin syklosporiini D:n erittäin heikko hylkimisreaktiota vastustava vaikutus, joka ominaisuus viittaa sen erityisen hyvin sopivan niveltulehdusten vastaiseksi lääkeaineeksi, koska sitä käytettäessä lymfosyytit eivät vaurioidu. Syklosporiini D:n ja syklosporiini A:n hylkimisreaktion vastaista vaikutusta verrattiin Janossy'n ja Greaves’in ^Clin. exp. Immunol.

9., U83 (1971) ja £0, 525 (1972)7 esittämässä lymfosyyttistimulaatiokokeessa in vitro käyttäen koemateriaalina konkan avaliini A:11a stimuloituja hiiren pernan lymfosyyttejä. Syklosporiini D:llä saatiin 50-$:inen proliferaation estovaikutus konsentraatiolla 200 ng/ml, kun se vastaavasti syklosporiini A:11a oli 30 ng/ml.

Marsuilla suoritetuissa tuberkkelikokeissa (PPD-koe) /.G.L. Floersheim, Z. Naturviss. med. Grundlagenforsch. 2, 307 (1905)7 koe-eläinten nahan paksuuden lisäkasvu annettaessa syklosporiini D:tä 50 mg/kg i.p. samanaikaisesti PPD:n kanssa pysyi samana kuin käsittelemättömillä kontrollieläimillä (syklosporiini A:11a 3 59814 saatu arvo oli TO % pienempi).

Syklosporiini D:tä voidaan käyttää lääkkeenä joko sellaisenaan tai sopivana lääkemuotona sekoitettuna farmakologisesti vaikuttamattomien apuaineiden kanssa.

Seuraavissa esimerkeissä kaikki lämpötilatiedot ovat Celsius-asteina.

Esimerkki:

Syklosporiini D

500 litraan ravintoliuosta, joka litraa kohti sisältää U0 g glukoosia, 2,0 g natriumkaseinaattia, 2,5 g ammoniumfosfaattia, 5 g MgSO^. THgO, 2 g KH^PO^, 3 g NaNO^, 0,5 g KC1, 0,01 g FeSO^ ja demineralisoitua vettä, ympätään 50 litraa Toly-pocladium inflatum Gams kannan NRRL 80l*U esiviljelmää ja inkuboidaan teräsferment-torissa sekoittaen (1TO rpm) ja ilmastaen (1 litra ilmaa/min/1 ravintoliuosta) 13 vrk 2T°:ssa (ks. FI-patenttijulkaisu 5^ 6θ6).

Viljelyliemeen lisätään yhtä suuri tilavuusmäärä n-butyyliasetaattia, orgaaninen faasi erotetaan ja väkevöidään tyhjössä, sitten raakauutteesta poistetaan rasva 3-vaiheisella jakouutolla metanolivedellä (9**l) ja petrolieetterillä. Metanolifaasi erotetaan, haihdutetaan tyhjössä, ja raakatuote saostetaan lisäämällä vettä. Suodattamalla saatu materiaali kromatografoidaan silikageelillä käyttäen eluointiin hek-saani-asetonia (2:1), jolloin ensiksi eluoituneet fraktiot sisältävät pääasiassa syklosporiini A:ta ja syklosporiini D:tä, myöhemmin eluoituneet fraktiot pääasiassa syklosporiini C:tä. Puhdistusta jatketaan kiteyttämällä syklosporiini A:ta ja syklosporiini D:tä sisältävät fraktiot 2-2,5-kertaisestä määrästä asetonia -15°C:ssa, ja kromatografoimalla kaksi kertaa saatu kiteytetty tuote silikageelillä, jolloin vedellä kyllästetyllä etyyliasetaatilla ensin eluoituneet fraktiot sisältävät syklosporiini D:tä vahvasti rikastuneena. Nämä liuotetaan kaksinkertaiseen määrään asetonia ja kiteytetään -15°:ssa. Saatu kiteinen syklosporiini D puhdistetaan edelleen liuottamalla 10-kertaiseen asetonimäärään, lisäämällä liuokseen 2 paino-5 aktiivihiiltä ja kuumentamalla liuosta 5 min 6o°:ssa. Suodattamalla talkkikerroksen lävitse saadaan kirkas, lähes väritön suodos, joka haihdutetaan 1/3 tilavuuteen ja jätetään sitten huoneen lämpötilaan jäähtymään, jolloin siitä kiteytyy itsestään syklosporiini D:tä. Seisottamalla -1T°:ssa kiteytyminen saadaan täydellisemmäksi. Suodattamalla erotetut kiteet pestään pienellä määrällä jääkylmää asetonia ja kuivataan sitten suurtyhjössä 80°:ssa 2 tuntia.

Syklosporiini D:n ominaisuudet: Värittömiä, prismamaisia kiteitä, sp. lU8-151° 20 o /Si/» = -2U5 (c = 0,52 kloroformissa) _ _2n° (c = 0,51 metanolissaj.

Claims (1)

11 5981 4 Pat ent t i vaat imus: Menetelmä terapeuttisesti käytettävän syklosporiini D:n valmistamiseksi, c II H CH3v* CH3 Ir ch, .ch, > CH CH HO^R/Cm 3n/ 3 I CH3^ ^CH, ch CHj ch ch2 ch, ch ch, I I chj I ! i I I II CH,—N-CH-CO-N-CH C-N-CH-CO-N-CH-C N-CH, I L «.Il L I L II I O HO CO ch3^ j CO CH-CH,-CH t. / l CHj j N-CH3 CH,-N I H OH I O. L | L II U | (. OC-CH-N-CO-CH — N-CO-CH-N-C-CH-N-CO-CH II! Ill I CH, H CH, CH, CH, CH CH, I CH3 CHj I Ch CH / \ / N Chj CHj Chj CHj tunnettu siitä, että viljellään viljely-väliaineessa tunnettua sienilajin Tolypocladium inflatum Gams kantaa NRRL 8oUU ja syklosporiini D eristetään tavanomaisin menetelmin viljelyväliaineesta, joka sisältää syklosporiini D:n lisäksi tunnettuja polaarisempia sylllosporiineja A, B ja C.