FI63743B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbart iscyklosporin - Google Patents

Description

63743 .Menetelmä terapeuttisesti, käytettävän isosyklosporiini G:n valmistamiseksi

Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 793142 5 Tämä keksintö koskee kaavan I mukaisen isosyklo sporiini G:n valmistusmenetelmää.

10

H

k" VvCKj CHSN. s·*"’ I f«3 CM O .Cm 1 i, cc;-n/CH’ /?h» i i i / | | * ? CM3-fv· CM- CO-N-Cm—c UN —CM-CO-N—CM-C-tl-CH, 1B L «* li I «- i t u i 15 l0 o Ch3 h o

Cm»·^ J co CH-CHj-CM l 11

CM3/ I I

CHj- u on I *i o h 20 I, ° i I i II v I .

oc-cm n co-ch-n·—co—CM-s* c—CM—W-CO—CM

III II i i CMa· M CH3 CH, CHJ CM CH,

l CHj NC«j I

CHS CM3 CHj CM3 \ 25 Keksinnön mukaisesti 'isosyklosporiini G:tä valmistetaan siten, että kaavan II mukainen syklosporiini G isomeroidaan.

2 63743 c«3 c

II

hTCvch, C"J\ /Ch3 I CM3 CH H°v /CH « I CHK /CH, ,>h‘«»\CH3 ?"*

CH, CHj Cm CH] I CH, CHJ

lii I I I I .

CHj-H-CH-CO-N-CH-C-.-N-CH- CO-U-CH-C-U-CMJ

I «· L II l I L II I

I O HO

co I

CH] I CO

\ I I II

CH-CHj- CH «. I

CHJ^ I N-CH)

CH]-N . I

I H OH

I O I 1 t )l «. I I I

OC-CH-N-CO" CM-N-CO-CH-hi-C-c H — N-CO-^CH

CHj h CHj CHj CM-i CH CHj

CH C"> ^CMl CH

c-r, ^CH3

Isomerointi suoritetaan sinänsä tunnetulla tavalla, edullisesti happokäsittelyllä, esim. käyttämällä vahvoja orgaanisia happoja, kuten trifluorietik-kahappoa, edullisesti metaanisulfonihappoa tai p-to-5 lueenisulfonihappoa.

Isomeroinnissa käytetyn vahvan hapon määrä on edullisesti 1-4 moolia syklosporiini G-moolia kohti.

Sopivia liuottimia ovat alemmat alkoholit, esim. metanoli, halogenoidut hiilivedyt, esim. kloroformi, 10 tai eetterit, esim. dioksaani.

Reaktiolämpötila voi olla välillä 20-65°C, edullisesti välillä 45-55°C.

Lähtöaineena käytetty syklosporiini G valmistetaan siten, että syklosporiini G:tä tuottavaa kantaa, 15 esimerkiksi Tolypocladium-sieniin kuuluvaa Tolypocladium inflatum Gams-kantaa viljellään ravintoliuoksessa ja syklosporiini G eristetään.

Viljely suoritetaan sinänsä tunnetuilla, vastaavien kantojen viljelyssä käytetyillä menetelmillä, 2o kuten esim. esimerkissä on kuvattu.

Il 63743 3

Edullinen syklosporiini G:tä tuottava kanta on Toly-pocladium inflatum Gams-sionilajiin kuuluva NRRL 8044.

Näyte tästä kannasta luovutettiin laitoksen United States Department of Agriculture (Northern Research and Development 5 Division), Peoria, 111., U.S.A., kokoelmiin, jossa sille annettiin numero NRRL 8044, ja josta se on yleisesti saatavissa. Toinen näyte tästä kannasta luovutettiin laitokseen Fermentation Research Institute, Inage, Chiba City, Japan, jossa sil-10 le annettiin numero FRI FERM-P No. 2796. Tämä kanta luettiin aikaisemmin sienilajiin Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.) ja se on kuvattu esim. englantilaisessa patenttijulkaisussa 1 491 509.

Syklosporiini G voidaan eristää tunnetuilla menetelmillä, 15 kuten esim. esimerkissä kuvataan. Tällöin syklosporiini G saadaan erilleen samanaikaisesti läsnäolevista luonnontuotteista, kuten vähemmän polaarisesta syklosporiini D:stä, hieman polaa-risemmasta syklosporiini A:sta (tunnetaan myös nimellä S 7481/ 20 F-l), polaarisommasta syklosporiini B:stä (tunnetaan myös nimellä S 7481/F-2) ja vielä polaarisemmasta syklosporiini C:stä.

Isosyklosporiini G:llä en osoittautunut olevan erinomainen vaikutus Freundin apuaineella aikaansaatuun niveltulehdukseen. Tällöin sen ED^Q-arvoksi on saatu 18 mg/kg p.o., kun taas esim. 25 FI-patenttijulkaisusta 54- 606 tunnetun rakenteeltaan läheisen syklosporiini A:n ED^-arvoksi vastaavassa testissä on saatu 25 mg/kg p.o. Lisäksi isosyklosporiini G:llä on havaittu olevan immunosuppressiivinen vaikutus. Lymfosyyttien stimulointi-testissä (Janossy & Greaves, Clin. exp. Immunol. 9 (1971) 483 30 ja 10 (1972) 525) proliferaation inhibitioasteeksi in vitro saatiin 63 % konkanavaliini A:11a stimuloiduilla hiirien pernasta eristetyillä lymfosyyteillä tutkittavan yhdisteen konsen-traation ollessa 0,1 ug/ml.

Isosyklosporiini G:tä voidaan käyttää lääkkeenä sellaise-35 naan tai valmisteina, joihin on sekoitettu farmaseuttisesti hyväksyttäviä inerttejä apuaineita.

Seuraavussa esimerkissä tarkoittavat kaikki lämpötilat Celsius-asteita.

i 4

Esimerkki: Isosyklosporiini G 63 7 4 3

Liuokseen, jossa on 6,08 syklosporiini G:tä 40 ml:ssa absoluuttista dioksaania, sekoitetaan liuos, jossa on 1,20 g metaanisulfonihappoa 20 ml:ssa dioksaania, ja seos pidetään 5 50°C:ssa kosteudelta suojattuna. Reaktion kulkua seurataan ohutkerroskromatografisesti /"Polygram SIL G"-foliot, kloro-formimetanolijääetikka (90:6:4), tehdään näkyväksi jodihöy-ryllä/. 16 tunnin kuluttua seos jäähdytetään huoneen lämpötilaan. Hapon neutraloimiseksi lisätään 1,13 g vedetöntä nat-10 riumasetaattia, seosta sekoitetaan 45 minuuttia, erottunut suola suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan vakuumissa 45°C:ssa.

8,1 g jäännöstä kromatografoidaan 500 g:11a silikageeliä (raekoko 0,063-0,2 mm (Merck)) käyttämällä eluenttina kloroformi-metanoliseosta (98:2). Käytännöllisesti katsoen puhtaasta iso-syklosporiini G:stä koostuvat jakeet yhdistetään, haihdutetaan vakuumissa 50°C:ssa ja jäännös kiteytetään eetteristä +7°C:ssa, jolloin saadaan isosyklosporiini G:tä, jonka sp. on 143-146°. Bruttokaava: cg3Hn3Nll012 {XJ 20 = -196° (c = 0,72 kloroformissa) D -128° (c = 0,73 metanolissa) 20 UV-spektri metanolissa: pääteabsorptio IR-spektri metyleenikloridissa: katso kuva 3 ^H-NMR-spektri (CDCl^), 90 MHz, sisäisenä standardina tetra-metyylisilaani: katso kuva 4.

25 Lähtöaineena käytetty syklosporiini G voidaan valmistaa seuraavasti: 500 litraan ravintoliuosta, joka sisältää litraa kohti 40 g glukoosia, 2,0 g natriumkaseinaattia, 2,5 g ammoniumfosfaat-tia, 5 g MgSO4-7H20, 2 g KH2PC>4, 3 g NaNO^, 0,5 g KC1, 0,01 g 30 FeS04 sekä mineraaleista vapaata vettä, siirrostetaan 50 litraa kannan NRRL 8044 esiviljelmää ja saatua seosta inkuboidaan teräsfermenttorissa 13 vuorokautta 27°C:ssa käyttämällä sekoitusta (170 1/min) ja ilmastusta (1 litra ilmaa/min/litra ravintoliuosta) (katso DE-hakemusjulkaisu 2 455 859).

35 Viljelyliuokseen sekoitetaan viljelyliuoksen tilavuuden verran n-butyyliasetaattia, orgaaninen faasi 5 63743 erotetaan ja väkevöidään vakuumissa ja konsentraatista poistetaan rasva kolmivaiheisessa erotuksessa metanoli-vesiseoksen (9:1) ja petrolieetterin avulla.

Metanolifaasi otetaan talteen, väkevöidään vakuumissa 5 ja raakatuote saostetaan lisäämällä vettä. Suodattamalla talteenotettu tuote kromatografoidaan 5-7-keltaisella määrällä "Sephadex LH-20:tä" käyttämällä eluent-tina metanolia. Sen jälkeen kärkijakeet kromatografoidaan silikageeli 60:llä (raekoko 0,063-0,2 mm (Merck)) 10 käyttämällä asetoni-heksaaniseosta (2:1), ja tällöin ensimmäisinä eluoituneissa jakeissa on pääasiassa syk-losporiini A:ta ja syklosporiini D:tä ja myöhemmin eluoituneissa osissa pääasiassa syklosporiini C:tä. Jatko-puhdistusta varten kiteytetään syklosporiini A:ta ja 15 D:tä sisältävät jakeet 2-2,5-kertaisesta määrästä asetonia -15°C:ssa, tuote kromatografoidaan kaksi kertaa silikageeli 60:llä (raekoko 0,063-0,2 mm (Merck)) käyttämällä eluenttina asetoni-heksaaniseosta (2:1), jolloin ensimmäisissä jakeissa eluoituu syklosporiini 20 D:tä voimakkaasti rikastuneena. Nämä jakeet liuotetaan kaksinkertaiseen määrään asetonia ja annetaan kiteytyä '-15°C:ssa. Epäpuhdas kidemassa koostuu hyvin voimakkaasti rikastuneesta syklosporiini D:stä ja emä-liuos sisältää syklosporiini D:n lisäksi myös muita 25 komponentteja, kuten syklosporiini G:tä. Syklosporiini G:n erottamiseksi emäliuos haihdutetaan kuiviin, jäännös kromatoggrafoidaan silikageeli 60:llä (raekoko 0,063-0,2 mm (Merck)) käyttämällä eluenttina vedellä kyllästettyä etikkaesteriä, jolloin ensin eluoitu-30 neet jakeet sisältävät syklosporiini D:tä ja myöhemmin eluoituneet jakeet syklosporiini G:tä sekä muita komponentteja. Rikastamista jatketaan siten, että seos kromatografoidaan silikageeli 60:llä (raekoko 0,063-0,2 mm (Merck)) käyttämällä ensin eluenttina kloroformi-me-35 tanoliseosta (98:2) ja sen jälkeen heksaani-asetoseos- 63743 ta (2:1), ja tällöin myöhemmin eluoituneet jakeet sisältävät syklosporiini G:tä erittäin rikastuneessa muodossa. Kun puhdistusta jatketaan siten, että syklosporiini G:tä sisältävät jakeet kiteytetään kahdesti 5 huoneenlämpötilassa eetteripetrolieetteriseoksesta (1:1), saadaan ohutkerroskromatograafisesti yhtenäistä, puhdasta (puhtausaste >95 %) syklosporiini G:tä värittöminä monitahokkaina, sp. 193-194° (kiteitä kuivattu korkeavakuumissa 80°C:ssa 2 tuntia).

10 “245° (c = 1,00 kloroformissa) -191° (c = 1,04 metanolissa).

UV-spektri metanolissa: pääteabsorptio IR-spektri metyleenikloridissa: Ks. kuva 1. ^H-NMR-spektri (CDCl^), 90 MHz, sisäisenä standardina 15 tetrametyylisilaani: katso kuva 2.

Bruttokaava: .

Il

Claims (4)

1. 63743 Patenttivaatimus Menetelmä kaavan I mukaisen terapeuttisesti käyttökelpoisen isosyklosporiini G:n valmistamiseksi, 5 CH^ I c n H XH;
2. 10 CH*\ . | CH3 CH „ O vCH. * I CH^ /CH’ / CHi CH3 CM / \ CU, CHj I | I / I I I CMj-W-Crt-CO-W--CH— C HH-CH-CO-N—CM--O—-M-CH·» I t II I L Iti! , _ I O CH HO 15 co u ‘3 CM\' I ?° CM-CHj-CM t J cn:> I L-CHj I V OH I *> « I t li t I i. on OC-CH--N CO-CH-N CO —CH--»4 c CH N-CÖ CM iii iii ί c,,3 H CHj CHj CHj CH CHj I CHj ''''CH} I CM ·* CH / \ / 'v c*<3 chj CHa cHa 25 tunnettu siitä, että kaavan II mukainen syklosporiini G 63743 cmj^ c li /CH3 I 9h3 CH H O yCH pii I CH3\ /CM5 t>H '"'\h3 ,2 CHj Ch3 cm CH, I CM, CH3 ! . I I II t 2 I CHj-N-cM-CO-iy-'CM — c-N-CM-CO-N —CM — C — N-CM j I «- L II u lii» I I O MO co I CH3^ I · CO CH-CHj-ch l I II CHJ j N-CH, CH«— N · ä I H O M 1 i> i I i n i I i OC-CH-N-CO-CM — N-CO-CH-N-c-CM-N - CO-CH III III I Cl<3 H CH3 CHj CH3 cm CH} 1 I CHj I CH J CH / \ / \ CHj CMJ CHj CH] isomeroidaan. Patentkrav 63743 Förfarande för framställning av terapeutiskt användbart isocyklosporin G med formeln I, 5 c f 10 ch3 CHj . H CH- \ / I · I 3 CM ^ O. yCH ‘ I _^CH, / CH? CHj· CM S I CH, CHJ I 11/1 \ \ CMj-W-CH'CO-M-'CH—C HN — CH-CC-N—CH-C-lv-CH, I I «. Il | t l L 11 L ° C,,3 M ° C"J. I CO 1K \ I 1 i Le h, CHj-ll « I M OH I ° i I i li t I i! OC-CM--N-CO-CH-N--CO-CH---U--e--CH-N-CO-CH
3. 111 III I CHj H CM-* CMj CHi CM CH,
4. 20. I CHj NCH5 l CM CM / \ / S. CHa CMj CHj CMj 25 kännetecknat därav, att man isomeriserar cyklosporin G med formeln II