FI63742C - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbart diydrocyklosporin g - Google Patents

Description

1 63742

Menetelmä terapeuttisesti käytettävän dihydrosyklospo-riini G:n valmistamiseksi

Jakamalla erotettu patentihakemuksesta 7931H2 5 Tämä keksintö koskee kaavan I mukaisen dihydro-syklosporiini G:n valmistusmenetelmää.

I * CH, ^CH2 , CH,

CH HO .CH

I /CH3 ^CH3 ?h2

C«2 Ch3- CH CHj I CH2 CHJ

C«3- N-CH-CO-K-CM-c-N-CH- CO-N-CH-C-il-CHi

«- til L I t II

i O MO

CO

CB\ I r

CH-CIU-CH L I T

en/ I . » .. I N-CH,

20 CH3"H I

H OH

\ ° « I «. ϋ i ' i J

OC-CM-rv CO-Cm — rv CO — CH-U C—-CH N-CO — CH

lii li! 1 CH3 ** CHj CH j Cl<3 CH CH}

I ^ v. I

I CH3 Ch5 i

CH CH

CHj ^CHj CH-. NCHJ

25

Keksinnön mukaisesti dihydrosyklosporiini G:tä valmistetaan siten, että kaavan TI mukainen syklo-sporiini G hydrataan.

2 63742 c

H

h/'C\h2 ^Chj I cn3 CH HO. XM J...

I C“K ^ciT»'^c«3

CM} CHj CM CH3 I CH, CHJ

III I I I 2 I

CHj-N-CH-CO-N-CM-C-N-CH-- CO-W-CM-C-U-CMj

I I L II t I L II I

I O HO

CO 1 CHj I · co

\ I I TT

CH-CM.-CM U I XI

/ I I

CHj I n-CH,

CHj-N · I

I H OH

I O « I I II *· I I I

OC-CH-N-CO- CH-Kl-CO—CM-N-c-CH-N — CO — CH

III III I

CH} H CH] CH, CHj CM CH}

I S’ \ I

I CHJ CHj I

CM -CM

/ \ / s _

CHj CHJ CH} CHJ

Keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan sinän sä tunnetuilla menetelmillä, esim. käyttämällä katalyyttistä hydrausta.

Edullisia liuottimia ovat etyyliasetaatti ja alem- 5 mat alifaattiset alkoholit, kuten metanoli, etanoli ja isopropanoli. Hydraus on edullista suorittaa neutraalilla alueella 20-30°C:ssa ulkoilman paineessa tai hieman korotetussa paineessa. Katalyytteinä tulevat kysymykseen platina ja edullisesti palladium, esim. palladium/ 10 hiili.

Lähtöaineena käytetty syklosporiini G valmistetaan siten, että syklosporiini G:tä tuottavaa kantaa, esimerkiksi Tolypocladium-sieniin kuuluvaa Tolypocladium inflatum Gams-kantaa viljellään ravintoliuoksessa 15 ja syklosporiini G eristetään.

Viljely suoritetaan sinänsä tunnetuilla, vastaavien kantojen viljelyssä käytetyillä menetelmillä, kuten esim. esimerkissä on kuvattu.

Il 3 63742

Edullinen syklosporiini G:tä tuottava kanta on Tolypocladium inflatum Gams-sienilajiin kuuluva NRRL 8044.

Näyte tästä kannasta luovutettiin laitoksen United States Department of Agriculture (Northern Research and Development 5 Division), Peoria, 111., U.S.A., kokoelmiin, jossa sille annettiin numero NRRL 8044, ja josta se on yleisesti saata? vissa. Toinen näyte tästä kannasta luovutettiin laitokseen Fermentation Research Institute, Inage, Chiba City, Japan, jossa sille annettiin numero FRI FERM-P No. 2796. Tämä kanta 10 luettiin aikaisemmin sienilajiin Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.), ja se on kuvattu esim. englantilaisessa patenttijulkaisussa 1 491 509.

Syklosporiini G voidaan eristää tunnetuilla menetelmillä, kuten esim. esimerkissä kuvataan. Tällöin syklosporiini 15 G saadaan erilleen samanaikaisesti läsnäolevista luonnontuotteista, kuten vähemmän polaarisesta syklosporiini D:stä, hieman polaarisemmasta syklosporiini A:sta (tunnetaan myös nimellä S 7481/F-l) , polaarisemmasta syklosporiini. B:stä (tunnetaan myös nimellä S 7481/F-2) ja vielä polaarisemmasta 20 syklosporiini C:stä.

Dihydrosyklosporiini G:llä on osoittautunut olevan hyvä niveltulehdusten vastainen vaikutus (ED^g = 27 mg/kg p.o. Freundin adjuvantilla aikaansaadussa niveltulehduksessa). Erikoisen merkittävä on kuitenkin tämän yhdisteen erittäin 25 vähäinen immunosuppressiivinen vaikutus verrattuna tähän asti tunnettuihin syklosporiineihin. Esim. FI-patenttijulkaisusta 54 606 tunnetulla syklosporiini Ailia lymfosyyttien stimu-lointitestissä proliferaation inhib.itioasteeksi saatiin 51 %. Tällä ominaisuudella on erittäin tärkeä merkitys, koska tulen-30 dusten vastaiset aineet eivät saisi vahingoittaa lymfosyyttejä.

Dihydrosyklosporiini G itä voidaan käyttää lääkkeenä sellaisenaan, sopivina tai valmisteina, joihin on sekoitettu farmaseuttisesti hyväksyttäviä inerttejä apuaineita.

Seuraavassa esimerkissä tarkoittavat kaikki lämpö-35 tilat Celsius-asteita.

" 63742

Esimerkki: Dihvdrosvklosporiini G

700 mg palladium/hiilikatalyyttiä (10 % palladiumia) esihydrataan 30 minuuttia 20 mltssa etanolia.

Tähän palladiumkatalyyttisuspensioon lisätään liuos, 5 jossa on 4,55 g syklosporiini G:tä 60 ml:ssa etanolia, ja tämän jälkeen hydrataan 21°C:ssa 99 kPa:n paineessa, kunnes vedynkulutus lakkaa. Seuraavaksi katalyytti suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan kuiviin vakuumissa 20-40°C:ssa. Jäännös koostuu ohutkerroskro-10 matografisesti yhtenäisestä dihydrosyklosporiini G:stä, joka on valkoisen amorfisen jauheen muodossa, jonka sp. on 150-153° (kuivattu korkeavakuumissa 80°C:ssa 4 tuntia).

Bruttokaava: C~0H,, ..N,, 0, _ 7n 63 115 11 12 15 = “232° (c = 0,64 kloroformissa) UV-spektri metanolissa: pääteabsorptio IR-spektri metyleenikloridissa: katso kuva 3. ^H-NMR-spektri (CDCl^), 90 Mhz, sisäisenä standardina tetrametyylisilaani: katso kuva 4.

20 Lähtöaineena käytetty syklosporiini G voidaan valmistaa seuraavasti: 500 litraan ravintoliuosta, joka sisältää litraa kohti 40 g glukoosia, 2,0 g natriumkaseinaattia, 2,5 g ammoniumfosfaattia, 5 g MgSO^VI^O, 2 g KF^POj^, 3 g 25 NaNOj, 0,5 g KC1 , 0,01 g FeSO^ sekä mineraaleista vapaata vettä, siirrostetaan 50 litraa kannan NRRL 8044 esiviljelmää ja saatua seosta inkuboidaan teräsfer-' menttorissa 13 vuorokautta 27°C:ssa käyttämällä sekoitusta (170 1/min) ja ilmastusta (1 litra ilmaa/min/litra 30 ravintoliuosta) (katso DE-hakemusjulkaisu 2 455 859).

Viljelyliuokseen sekoitetaan viljelyliuoksen tilavuuden verran n-butyyliasetaattia, orgaaninen faasi erotetaan ja väkevöidään vakuumissa ja konsentraatis-ta poistetaan rasva kolmivaiheisessa erotuksessa meta-35 noli-vesiseoksen (9:1) ja petrolieetterin avulla.

5 63742

Metanolifaasi otetaan talteen, väkevöidään vakuumissa ja raakatuote saostetaan lisäämällä vettä. Suodattamalla talteenotettu tuote kromatografoidaan 5-7-kertaisena määrällä "Sephadex LH-20:täM käyttämällä eluent-5 tina metanolia. Sen jälkeen kärkijakeet kromatografoidaan silikageeli 60:llä (raekoko 0,063 - 0,2 mm (Merck)) käyttämällä asetoni-heksaaniseosta (2:1), ja tällöin ensimmäisinä eluoituneissa jakeissa on pääasiassa syklosporiini A:ta ja syklosporiini D:tä ja myö-10 hemmin eluoituneissa osissa pääasiassa syklosporiini C:tä. Jatkopuhdistusta varten kiteytetään syklosporiini Aita ja D:tä sisältävät jakeet 2-2,5-kertaisesta määrästä asetonia -15°C:ssa, tuote kromatografoidaan kaksi kertaa silikageeli 60:llä (raekoko 0,063 - 0,2 mm 15 (Merck)) käyttämällä eluenttina asetoni-heksaaniseosta (2:1), jolloin ensimmäisissä jakeissa eluoituu syklosporiini D:tä voimakkaasti rikastuneena. Nämä jakeet liuotetaan kaksinkertaiseen määrään asetonia ja annetaan kiteytyä -15°C:ssa. Epäpuhdas kidemassa 20 koostuu hyvin voimakkaasti rikastuneesta syklosporiini D:stä ja emäliuos sisältää syklosporiini D:n lisäksi myös muita komponentteja, kuten syklosporiini G:tä. Syklosporiini G:n erottamiseksi emäliuos haihdutetaan kuiviin, jäännös kromatografoidaan silika-25 geeli 6 0 :1lä (raekoko 0,063-0,2 mm (Merck)) käyttämällä eluenttina vedellä kyllästettyä etikkaesteriä, jolloin ensin eluoituneet jakeet sisältävät syklosporiini D:tä ja myöhemmin eluoituneet jakeet syklosporiini G:tä sekä muita komponentteja. Rikastamista jat-30 ketään siten, että seos kromatografoidaan silikageeli 60:llä (raekoko 0,063-0,2 mm (Merck)) käyttämällä ensin eluenttina kloroformi-metanoliseosta (98:2) ja sen jälkeen heksaani-asetoniseosta (2:1), ja tällöin myöhemmin eluoituneet jakeet sisältävät syklospo-35 riini G:tä erittäin rikastuneessa muodossa. Kun puhdistusta jatketaan siten, että syklosporiini G:tä 6 63742 sisältävät jakeet kiteytetään kahdesti huoneenlämpö-tilassa eetteripetrolieetteriseoksesta (1:1), saadaan ohutkerroskromatograafisesti yhtenäistä, puhdasta (puhtausaste >95 %) syklosporiini G:tä värittöminä 5 monitahokkaina, sp. 193-194° (kiteitä kuivattu kor-keavakuumissa 80°C:ssa 2 tuntia).

= -245° (c = 1,00 kloroformissa) -191° (c = 1,04 metanolissa).

UVspektri metanolissa: pääteabsorptio 10 IR-spektri metyleenikloridissa: Ks. kuva 1.

^H-NMR-spektri (CDClg), 90 MHz, sisäisenä standardina tetrametyylisilaani: Katso kuva 2.

Bruttokaava: CggH^gN^O^g.

»

Il.

Claims (4)

1. 63742 Patenttivaatimus . Menetelmä kaavan I mukaisen terapeuttisesti käyttökelpoisen dihydrosyklosporiini G:n valmistamisek- 5 si, C«3N CH, I £ ch2 10 ^CHJ , CM3 C» HO. yCH ' . I CB\ /CB’ C»5 i"s CM? CH3 cm CH3 I CH, CH3 I II i l i l CW3- M - CH - CO-N-C H—c— N-CH CO N —CH — C—ls( CH, L t II L I L II I O HO 15 CH3^ J · CM-ClHj-Ch t X CMl I N~ C Hj CM3-n 3 I H OH I p « I i H v I i OC'CH-M—CO-CH —M CO — CH-hi c CH—M-CO — CH
2. 20 III III I ch3 m CH3 CHj CH3 CH CH} I ^CH, I Ch3 Ch3 C»I3 CH} 1 tunnettu siitä, että kaavan II mukainen syklosporiini G 63742 C II h'' \h2 CH-\ ^CH3 I 9^3 Cm HO. /CH ' I CM^ /CM’ ,>£<"> NcHj ΪΜ2 CHZ CH3 CM CHj I CH2 CMj Cm,- N-CH-CO-N-CH — c-N-CH-CO-N—CH— C—S-CM, I I L II L I l U I I O M O co I en, I co \ I I Cm-CHj-Ch V J II CH3 I H-CMj CH,- N I J M OH I o i I v H «. I 11 OC- CH-K — CO-CH — N-co — CH-u-C-CM—M-CO-CM III III I CHj H CMj CHj CM3 cm CM? I CHJ ^CH* I CH CH / \ / s, CHj CM3 CHj CHJ hydrataan. 63742 Patentkrav. Förfarande för framställning av terapeutiskt användbart dihydrocyklosporin G med formeln I, 5 C«3N ch, I * Cll2
3. 10 CHV /CH3 I ?H3 CH ^ HO .CM * | CH>\ >^WNCM3 |H2 CM? CHj CM ch3 I CH, CHj „ lii il i l CHj-N-CH-CO-M-CH—c— N-CH- CO-N —CM — C— n-CH, * <-11 «. I I ;i I O HO CO l5 ch3^ J CO CM-CH?-CH t. J „ I H-CH, CM3-N I 3 I H OH I °r « I i II v I OC-CH-N— CO-C H — K-CO-CH-N-e-CH-N-CO-CH
4. 20. Il III I CM0 H CH3 CH, CH3 CH CH, I / \ I I CMl CHj I CM CH / \ / \ CH3 CHJ CM] CMj kännetecknat därav, att man hydrerar cyklosporin G med formeln II