DD295871A5 - Verfahren zur mikrobiellen herstellung von cyclosporinen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Cyclosporinen insbesondere von Cyclosporin A. Aufgrund der spezifischen immunsupressiven Wirkung des Peptidantibiotikums Cyclosporin A findet es in der Humanmedizin vor allem in der Transplantationschirurgie Anwendung. Durch Zusatz geringer Mengen grenzflaechenaktiver Substanzen werden Cyclosporinbildner, wie beispielsweise der an sich bekannte Produktionsstamm Tolypocladium inflatum GAMS, zu einer wesentlich gesteigerten Synthese des Antibiotikums befaehigt.{mikrobielles Verfahren; Peptidantibiotikum; Cyclosporin A; Detergenzien; Cyclosporinbildner; Tolypocladium inflatum}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Cyclosporinen. Aus dieser Gruppe zyklischer Peptide hat insbesondere das Cyclosporin A aufgrund seiner vielgestaltigen Wirkungen auf biologische Systeme Bedeutung erlangt. Dazu gehören die entzündungshemmenden, immunsupressiven, antifungalen und antiparasitären Eigenschaften des Wirkstoffes. Die spezifische, immunsuppressive Wirkung von Cyclosporin A wird weltweit in der Transplantationschirurgie und bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen genutzt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die technische Gewinnung der Cyclosporine, welche aus 11 aliphatischen Aminosäuren aufgebaut sind, erfolgt in Submerskultur durch einen Pilz der Art Tolypocladium inflatum GAMS (CH-PS 603790). Als Hauptkomponente eines natürlichen Vorkommens verschiedener Cyclosporinverbindungen wird das Cyclosporin A mit einer Ausbeute von 150 bis 200mg Cyclosporin A pro Liter Kultursuspension gebildet (DREYFUSS et al., Europ. J. Appl. Microbiol. 3 [1976], 125-133). Der Wirkstoff verbleibt im Myzel und wird nur in sehr geringen Mengen im umgebenden Medium nachgewiesen.

In Untersuchungen zur gerichteten Biosynthese produzierte der Pilz unter Zuführung spezieller Aminosäuren (8 g/l) zu einem Minimalmedium maximal 396mg Cyclosporin A pro Liter (KOBEL und TRABER, Europ. J. Appl. Microbiol. 14 [1982], 237-240). Dieses Ergebnis hat jedoch aus ökonomischen Gründen für industrielle Fermentationen keine Bedeutung erlangt. Unabhängig vom Wirkstoff Cyclosporin A sind in der Patentliteratur Verfahren zur Steigerung von Biosynthesen mit Hilfe des Einsatzes von grenzflächenaktiven Stoffen (Detergenzien) beschrieben, wie zum Beispiel für die Aminosäuren L-Lysin und L-Isoleucin (JP-PS 102853), L-Arginin (JP-PS 081 241), L-Glutaminsäure (JP-PS 096882) und L-Prolin (JP-PS 074925). GRÄFEet al. (DD-PS 231084) konnten in ähnlicher Weise durch Zusatz von Methanol zum Kulturmedium eine erhöhte Biosyntheserate für das Antibiotikum Griseochelin belegen.

Während für alle genannten Verfahren ausschließlich Bakterien als Stoffproduzenten genutzt werden, konnten DESAI et al. (J. Ferment. Technol. 64, 6 [1986], 499-501) am Beispiel der Pilzgattung Claviceps durch exogene Zuführung bestimmter Detergenzien eine erhöhte Ausbeute für die Stoffgruppe der Mutterkornalkaloide erreichen, indem sowohl die Biomasseproduktion als auch die Ausschüttung der Metabolite ins Medium verbessert wurden.

Andererseits wird auch eine für Pilze auffallend wachstumshemmende Eigenschaft von grenzflächenaktiven Stoffen erwähnt (MADELIN, J. Appl. Bacteriol. 63 [1987], 47-52), die bis zur totalen Unterdrückung führen können.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, in einem bekannten Verfahren der Herstellung von Cyclosporin A die Produktivität des Mikroorganismus wesentlich zu steigern und damit die Voraussetzung für eine ökonomisch günstigere Produktion des Wirkstoffes zu schaffen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein industriell anwendbares Verfahren zu beschreiben, das es gestattet, die biologische Ausbeute des Wirkstoffes Cyclosporin A in einem bekannten mikrobiologischen Verfahren wesentlich zu steigern. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß man einen cyclosporinbildenden Stamm in an sich bekannter Weise submers kultiviert, jedoch der Kultur eine grenzflächenaktive Substanz (Detergens) zusetzt. Als Detergenzien sind hierbei folgende Stoffe bevorzugt: Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, 1,2-Propandiol, Ν,Ν-Diaethylacetamid und N-methyl-2-pyrrolidon.

Als cyclosporinbildender Stamm kann beispielsweise der Mikroorganismus Tolypocladium inflatum GAMS eingesetzt werden, der beim Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena unter der Stammsammlungs-Nr. IMET 43889 hinterlegt wurde. Dabei bewirkt der Zusatz des Deterdens nicht etwa, wie zu erwarten war, eine erhöhte Ausschüttung des Cyclosporins aus dem Myzel in die Kulturlösung, sondern überraschenderweise eine drastische Erhöhung der Biosynthese von Cyclosporin A bei konstanter Biomasseproduktion.

Eine möglicherweise verbesserte Extrahierbarkeit des Wirkstoffes vor der quantitativen Bestimmung konnte als Ursache durch parallele Untersuchung ausgeschlossen werden.

Die Kultivierung des Stammes Tolypocladium inflatum GAMS und seiner Mutante IMET 43889 wird wie folgt vorgenommen:

Auf geeigneten Agarmedien wird der Stamm innerhalb eines Zeitraumes von 10 bis 14 Tagen bei einer Temperatur von 24⁰C angezogen. Die von dieser Kultur gebildeten Sporen werden in ein flüssiges und steriles Medium übertragen, welches in Glaskolben maximal 18 Tage, vorzugsweise 12 bis 15 Tage geschüttelt wird.

Das Nährmedium besteht aus einer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie verschiedenen Mineralsalzen. Als Kohlenstoffquellen können vor allem Maltose, Saccharose oder Glukose eingesetzt werden; als Stickstoffquelle eignen sich besonders komplexe Substrate wie zum Beispiel Peptone.

Die Zugabe der verschiedenen, jeweils vorher sterilisierten Detergenzien erfolgt zu Beginn der Hauptkultur.

Nach Beendigung der Fermentation erfolgt die Extraktion der Cyclosporine aus der Kultursuspension mit allgemein üblichen Methoden. Die exakte qualitative und quantitative Bestimmung wird chromatografisch (HPLC) gegen Standardsubstanz in Anlehnung an die Publikation von KREUZIG (J. Chromatography 290,1984,181-186) durchgeführt.

Ausführungsbeispiel

500-ml-Erlenmeyer-Weithalskolben enthalten je 100ml Nährmedium mit folgender Zusammensetzung:

75 g/l Maltose

25g/l Kaseinpepton

1 g/l KH₂PO₄

2,5g/l KCL in entionisiertem Wasser, pH5,5

Jeder Kolben wird mit einer Sporensuspension (1 · 10⁷ Sporen/ml) des Stammes Tolypocladium inflatum GAMS, Stamm IMET 43889, beimpft, welche mit steriler isotonischer Kochsalzlösung von einer 10 bis 14 Tage alten Kultur des Stammes auf Malz-Agar hergestellt wird.

Nach zweitägiger Bebrütung bei einer Temperatur von 24"C auf einer Schüttelmaschine mit einer Frequenz von 190U · min"' wird die Vorkultur in ein neues Medium gleicher Zusammensetzung im Verhältnis 1:10 überführt und unter gleichen Bedingungen wie die Vorkultur weiter kultiviert.

Vor Beimpfung der Hauptkultur wird eine vorher sterilisierte grenzflächenaktive Substanz (gemäß Tabelle 1) in einer Konzentration von 0,5% (v/v) zugegeben.

Am 15. Kulturtag konnten bei Zusatz spezieller Detergenzien Ausbeutesteigerungen gegenüber der Kontrolle (Ohne Zugabe von grenzflächenaktiven Substanzen) um das 4-bis 5fache erzielt werden.

Tabelle 1 faßt die eingesetzten Detergenzien sowie die dadurch erzielten Steigerungen in der Ausbeute an Wirkstoff Cyclosporin A zusammen.

Tabelle 1

Steigerung der Ausbeute an Cyclosporin A durch Zusatz von Detergenzien Detergens Cyclosporin A

(mg pro I Kulturlösung)*¹

Kontrolle (ohne Detergens) 131 (177)

Dimethylformamid 179(237)

Dimethylsulfoxid 185(266)

1,2-Propandiol 198(270)

N,N-Diaethylacetamid 383(399)

N-methyl-2-pyrrolidon 616(717) * Angaben sind Mittelwerte identischer Versuchsansätze, Wertein Klammern = höchste erreichte Ausbeute.

Claims (3)

1. Patentanspruch:

   1. Verfahren zur mikrowellen Herstellung von Cyclosporinen durch Submerskultur eines cyclosporinbildenden Stammes, dadurch gekennzeichnet, daß der Kultur eine grenzflächenaktive Substanz (Detergens) zugegeben wird.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den als Detergens die folgende Substanzen einzeln oder in Kombination miteinander einsetzt: Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, 1,2-Propandiol, Ν,Ν-Diaethylacetamid, N-methyl-2-pyrrolidon.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als cyclosporinbildender Mikroorganismus der Stamm Tolypocladium inflatum GAMS, IMET-Nr. 43889, eingesetzt wird.