DE1493643C - Verfahren zur Spaltung von D,L-alpha-Methyl-beta-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanin in seine optischen Antipoden - Google Patents
Verfahren zur Spaltung von D,L-alpha-Methyl-beta-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanin in seine optischen AntipodenInfo
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Description
D,L - a - Methyl - β - (3,4 - dihydroxyphenyl) - alanin
zeichnet sich durch seine günstigen Wirkungen auf
den Blutdruck aus. Es hat daher nicht an Versuchen gefehlt, diese Verbindungen synthetisch herzustellen.
Bei den Synthesen fällt das Produkt in Form eines Racemates an, welches zweckmäßig in seine optischen
Antipoden getrennt wird, da die genannte nützliche biologische Wirkung nur der L-Form zukommt.
Würde man auf die Trennung des Racemates verzichten, so würde bei der Verabreichung des Produktes
die nicht aktive D-Form als Ballast mitgeschleppt, was um so ungünstiger ist, als das Produkt ohnehin
in verhältnismäßig hohen Dosen verabfolgt werden muß.
Erfindungsgemäß ist es möglich, das Racemat des α -Methyl -ß -(3,4- dihydroxyphenyl) -alanins in seine
optischen Antipoden zu spalten, indem man auf Derivate der allgemeinen Formel .
20
CH3
CH2-C- COOR"
NH
CO
NH
CO
R'
wobei R Wasserstoff oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen
bedeutet und wobei, zwei Alkylreste R auch zu einer Alkylenkette verbunden sein können,
oder Acylreste mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, die durch eine Carboxyl- oder Carboalkoxygruppe substituiert
sein können, R' Wasserstoff oder einen Alkylrest mit 1 bis 17 Kohlenstoffatomen ist, der durch
eine Carboxyl- oder Carboalkoxygruppe substituiert sein kann, und R" Wasserstoff oder eine Alkylgruppe
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, im wäßrigen Medium Bakterien des Stammes Schyzomycetes von
Naegel i (1857) (NRRL-B-3050 oder NRRL-B-3051, hinterlegt bei der ARS Culturcollection, Northern
Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, USA) bzw. daraus hergestellte Extrakte
einwirken läßt, dabei entstandenes freies L- bzw. D-Amin vom bleibenden D- bzw. L-Acylamin in an
sich bekannter Weise trennt und gegebenenfalls vorhandene Acyl-, Alkyl- bzw. Alkylengruppen R, R'
oder R" abspaltet.
Für die Acylierung des Stickstoffes sind besonders die Reste der Bernsteinsäure und der Buttersäure geeignet.
Man kann das erfindungsgemäße Verfahren jedoch auch unter anderem mit Essigsäure-, Stearinsäure-,
Adipinsäure-, Sebazinsäure- oder Pivalinsäurederivaten durchführen.
Es ist bekannt, daß man stereospezifische Spaltungen
von Derivaten der natürlich vorkommenden α-Aminosäuren mit tierischen oder pflanzlichen Enzymen
durchführen kann (vgl. J. P. Greenstein und M. W i η i t z, »Chemistry of the Aminoacids«, Vol. 1,
S.715; John Wiley an Sons, Inc. 1961, N.Y. und London).
Alle derartigen Spaltungsversuche sind im vorliegenden Fall jedoch fehlgeschlagen, was auf die zusätzliche
und unnatürliche Substitution des a-C-Atoms durch die Methylgruppe zurückzuführen ist. Es war
deshalb nicht vorherzusehen, daß durch ein spezifisches Verfahren Mikroorganismen aufzufinden sind,
welche Enzyme bilden, die Derivate des a-Methylj3-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanin
stereoselektiv spalten.
Die zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Bakterien -werden nach folgender
Methode gefunden: Man gibt in sterile Nährlösungen, die 1 % einer der vorstehenden Formel entsprechenden
Dialkoxyacylamin-Verbindung und neben notwendigen Salzen eine anorganische Stickstoffquelle enthalten,
Erdproben verschiedenster Herkunft zu und bebrütet sie auf Schüttelmaschinen bei 28° C.
In verschiedenen Zeitabständen nimmt man Proben, in denen man chromatographisch die etwa vorhandene
entacylierte Aminoverbindung nachweist. Nach mehreren Tagen lassen sich in einzelnen Kulturen
tatsächlich solche Aminoverbindungen nachweisen. Diejenigen Kulturen, bei denen dies der Fall
ist, enthalten Mikroorganismen, die zur Durchführung einer Spaltung fähig sind.
Diese Mikroorganismen reichert man zweckmäßig in der Weise an, daß man mehrere Passagen in der
gleichen Nährlösung durchlaufen läßt. In diesen Nährlösungen können sich nämlich nur solche Mikroorganismen
vermehren, die zu einer Spaltung geeignet sind, denn nur diese Stämme können sich die zu
ihrer Vermehrung notwendige Kohlenstoffquelle durch die Spaltung beschaffen. Sie verwenden zum Aufbau
ihrer Zellsubstanz und zur Atmung nur den Acylrest — CO — R'; die verbleibende Alkoxy verbindung wird,
wie verschiedene Versuche gezeigt haben, im Gegensatz zu den entsprechenden 3,4-Dialkoxyphenyl-alaninverbindungen
praktisch nicht angegriffen.
Die angereicherten Kulturen, in denen sich durch die mehrmalige Auslese vorwiegend Bakterien desselben
Stammes befinden, werden auf Agarnährböden ausgestrichen. Nach der Bebrüturig werden
aus den sich entwickelnden Kolonien einzelne typisch aussehende auf Schrägröhrchen abgeimpft.
Die so gefundenen Bakterien werden dann in einem präparativen Spaltungsversuch eingesetzt, wobei festgestellt
wird, ob die Spaltung stereoselektiv verläuft. Zwei der isolierten Stämme aus der Klasse der
Schyzomyceten von Naegeli (1857) erwiesen sich als für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Sie
wurden bei der ARS Culturcollection, Northern Utilization Research and Development Division,
Peoria, Illinois, USA, hinterlegt unter den Nummern NRRL B-3O5O und NRRL B-3051.
Die Spaltung der N-Acylverbindungen geht, wenn man die Bakterien ohne zusätzliche Kohlenstoffquelle
wachsen läßt, auch wenn man mit einer Reinkultur massiv beimpft, relativ langsam vor sich. Es empfiehlt
sich daher, zur Beschleunigung der Spaltung zusätzlich zum Anwachsen der Bakterien eine Kohlenstoffquelle,
z. B. 0,1 bis 0,5 Glukose oder Glycerin, zuzusetzen. Noch schneller geht die Spaltung, wenn man
die Bakterien ohne Zusatz der zu spaltenden Verbindung in einer komplexen Nährlösung etwa 24 Stunden
anwachsen läßt und dann erst die zu spaltende Verbindung zugibt. Um die Aufarbeitung nach der
Spaltung in diesem Fall zu erleichtern, kann man auch die Bakterien nach der Wachstumsphase abschleudern,
mit Wasser waschen und nun die zu spaltende Verbindung zu der wäßrigen Bakteriensuspension
zugeben.
Die letztere Arbeitsweise empfiehlt sich besonders, wenn man mit den freien 3,4-Dihydroxyverbindungen
arbeitet. Diese sind bei neutralen bis alkalischen Bedingungen autoxydabel.
Da die Isolierung von Mikroorganismen nach der oben beschriebenen Methode mehrere Wochen in
Anspruch nimmt, würden diese Verbindungen vollständig oxydiert sein. Man kann jedoch die mit
dem O-alkylierten Verbindungen isolierten Mikro-Organismen
auch zur Spaltung der freien 3,4-Dihydroxyverbindungen verwenden. Man läßt zweckmäßigerweise
die Bakterien vorwachsen und gibt dann zu der dichten gewaschenen und ungewaschenen
Bakteriensuspension unter Stickstoff oder unter gleichzeitiger Ansäuerung auf pH 3 bis 5 oder unter Stickstoff
mit gleichzeitiger Ansäuerung die zu spaltende Verbindung zu. Zweckmäßigerweise verwendet man
zur Spaltung Verbindungen, die am Stickstoff und an den beiden Sauerstoffatomen am Phenylrest dieselben
Substituenten, z. B. Succinyl oder Butyryl usw., tragen.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß die verwendeten Mikroorganismen in den obengenannten
Acylaminoverbindungen nur die eine optische Antipode spalten. Die Trennung der gespaltenen
einen optischen Antipode von der nicht gespaltenen anderen optischen Antipode kann nach allgemein
üblichen Methoden, z. B. durch Extraktion mit Lösungsmitteln, erfolgen.
In den folgenden Beispielen wurde die gespaltene optische Antipode jeweils aus analytischen Gründen
als N-Acetylderivat isoliert.
Eine wäßrige Nährlösung, die 1% D,L-N-Succinyl· α - methyl - β - (3,4 - dimethoxyphenyl) - alanin, 0,2%
KH2PO4, 0,2% (NHJ2SO4 und Spuren von MgSO4,
FeSO4 und CaCO3 enthält, wird mit KOH auf pH 6,0
eingestellt, steril durch Glasfilter G 5 filtriert und je 50 ecm davon in 200er-Erlenmeyerkolben steril abgefüllt.
Insgesamt wurden 81 Kolben eingesetzt und diese mit 81 Erdproben verschiedenster Herkunft,
zum Teil aus der näheren Umgebung Wuppertals, zum Teil aus Südamerika und zum Teil aus Afrika,
beimpft, indem man je Kolben eine Spatelspitze der entsprechenden Erde dazugab. Die Kolben bebrüteten
wir auf einer Rundschüttelmaschine bei 28° C. Am 7. und 12. Tag nahmen wir Proben. Diese wurden
chromatographisch auf die Anwesenheit von D,L-a-Methyl-,S-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin
untersucht. Zu diesem Zweck wurden je 10 μ der Proben auf Chromatographiepapier
(Schleicher und Schüll 2043 a oder Whatman I) aufgetragen, 5 Stunden absteigend im
System n-Butanol (4), Eisessig (1), Wasser (1) entwickelt und mit Ninhydrin abgefärbt. Für a-Methyl-/9-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin
wurde ein RF-Wert von 0,57 bis 0,59 gefunden.
Am 7. Tag waren bei zwei Proben geringe Mengen der freien Aminoverbindung nachweisbar. Am 12. Tag
entstanden auf den Chromatogrammen bei zwei Proben kräftig gefärbte Flecken, bei zwei anderen
Proben schwach gefärbte Flecken, die dem «-Methyl-/S-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin
zugeordnet werden konnten. Bei allen anderen Proben war keine Abspaltung der Bernsteinsäure aufgetreten.
Zur weiteren Anreicherung der Bakterien, die die Spaltung durchführen können, führten wir insgesamt
sechs Passagen im selben Nährmedium durch. Wir beimpften dazu mit je 0,1 ecm der älteren Kultur die
jeweilige Nachkultur. In Abständen von 1 bis 3 Tagen nahmen wir Proben zum chromatographischen Nachweis
der Spaltung. Sobald in einer Kultur eine Spaltung nachzuweisen war, wurde sofort eine neue Nachkultur
angelegt. Dies war bei den ersten Passagen nach 1 bis 3 Tagen, bei den letzten Passagen nach 14 bis
20 Tagen der Fall.
Eine Spaltung fand nur in zwei von den vier Kulturen statt, und zwar in den beiden, die in der ersten
Anreicherungskultur am 12. Tag kräftig gefärbte Flecke auf dem Chromatogramm zeigten.
Parallel zu den Anreicherungspassagen wurden Proben auf Platten mit Standard-Agar Merck ausgestrichen.
Anfangs fanden wir Gemische von verschiedensten Bakterien, nach mehreren Passagen
wurde das Bild einheitlicher. Einzelne typisch aussehende Bakterienkolonien wurden abgeimpft und
danach in Reinkultur erneut chromatographisch auf ihre Fähigkeit zur Succinylabspaltung geprüft. Von
den beiden Erden, deren erste Anreicherungskulturen am 12. Tag kräftig gefärbte Flecke auf dem Chromatogramm
zeigten, wurde der Stamm NRRL B-3050 isoliert.
In einem weiteren . Ansatz in derselben Nährlösung wurden diese beiden Stämme auf ihre Fähigkeit
zur stereoselektiven Spaltung von D,L-N-Succinyl - α - methyl - β - (3,4 - dimethoxyphenyl) - alanin
geprüft.
Je 100 ecm der obengenannten Nährlösung wurden in 1-L-Erlenmeyerkolben mit einer öse der auf
Standard-Merck-Agar vorgezogenen Bakterienkultur des Stammes NRRL B-3050 beimpft und 16 Tage auf
der Rundschüttelmaschine bei 28° C bebrütet. Hierauf wurden die Bakteriensuspensionen 5 Minuten bei
20 000 xg zentrifugiert, der überstand auf pH 1 bis 2
angesäuert und mit Essigsäureäthylester 4mal ausgeschüttelt.
Die organische Phase enthält die ungespaltene Succinylverbindung, die nach dem Abdampfen
des Lösungsmittels in Form eines kristallinen Rückstandes erhalten wurden.
Die wäßrige Phase wurde neutralisiert und gefriergetrocknet. Der Rückstand, der die gewünschte Aminosäure
neben anorganischen Salzen enthält, wurde mit 8 ml Pyridin und 8 ml Essigsäureanhydrid 20 Stunden
bei 37° C inkubiert. Hierauf wurden die überschüssigen Mengen an Pyridin und Essigsäureanhydrid im
Vakuum entfernt, der Rückstand wurde in Wasser aufgenommen, auf pH 7 bis 7,5 gestellt, filtriert und
mit Essigester ausgeschüttelt. Die wäßrige Phase wurde mit konz. HCl auf pH 1 bis 2 eingestellt und mit
Essigsäureäthylester 4mal ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft, wobei
L-N-Acetyl-a-methyl-/?-(3,4-dimethoxy-phenyl)-alanin
als kristalliner Rückstand erhalten wurde. Die Ausbeuten und spezifischen Drehungen wurden
in der Tabelle 1 zusammengefaßt.
• Tabelle
Menge (mg)
Ausbeute in % der
DL-N-Succinyl-
verbindung
Reinheit der Isomeren in %*)
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung
Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat)
202'
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat)
*) Die optischen Dreh werte der reinen Substanzen betragen:
D-N-Succinyl-a-methyl-/J-(3,4-dimethoxyphenyl)-analin, [d]l! = —48,1°; c
L-N-Acetyl-a-methyl-/9-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin, [α]" = +56°; c ~
60
24
71
71
16
- 1% in Methanol.
1% in Methanol.
1% in Methanol.
-10,7
+ 24,7
+ 2,0
+ 2,0
-3,0
61
72
Eine wäßrige Nährlösung, die 1% D,L-N-Succinyl-α
- methyl - β - (3,4 - dimethoxyphenyl) - alanin, 0,2% KH2PO4, 0,2% (NHJ2SO4, 0,1% Glycerin, Spuren
von MgSO4 und CaCO-, enthält, wird mit KOH auf
pH 7,0 eingestellt, steril filtriert und 100 ecm
1-1-Erlenmeyerkolben abgefüllt. Dieser Erlenmeyerkolben
wird mit einer Impföse des Stammes NRRL B-3050 beimpft und 10 Tage auf der Rundschüttelmaschine
bei 28° C bebrütet. Die Aufarbeitung wurde wie im Beispiel 1 beschrieben vorgenommen. Das
Ergebnis zeigt die Tabelle 2.
| Menge (mg) |
Ausbeute in % der DL-N-Succinyl- verbindung |
[a]f in Methanol c= ~1 |
Reinheit der Isomeren in % |
|
| Zurückgewonnene N-Succinylverbindung Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetyl- derivat) |
323 .488 |
32 59 |
-40,7 + 20,5 |
92 68 |
Eine wäßrige Nährlösung, die 1% D,L-N-Succinyl-α
- methyl - β- (3,4 - dimethoxyphenyl) - alanin, 0,2% KH2PO4, 0,2% (NHJ2SO4, 0,2% Glycerin, Spuren
von MgSO4, FeSO4 und CaCO3 enthält, wird mit KOH
auf pH 7,0 eingestellt, steril filtriert und 100 ecm in 1-1-Erlenmeyerkolben abgefüllt. Dieser Erlenmeyerkolben
wird mit einer Impföse des Stammes NRRL B-3051 beimpft und 17 Tage auf der Rundschüttelmaschine
bei 28° C bebrütet. Die Aufarbeitung erfolgt nach Beispiel 1. Das Ergebnis zeigt die Tabelle 3.
40
| Menge (mg) |
Ausbeute in % der DL-N-Succinyl- verbindung |
[a]& in Methanol c = ~1 |
Reinheit der Isomeren in% |
|
| Zurückgewonnene N-Succinylverbindung Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetyl- derivat) |
246 338 |
25 41 |
-43,1 ' +15,8 |
95 64 |
Eine wäßrige Nährlösung, die 1% D,L-N-Succinyl-α
- methyl - β - (3,4 - dimethoxyphenyl) - alanin, 0,2% KH2PO4, 0,2% (NHJ2SO4, Spuren von MgSO4,
FeSO4 und CaCO3 enthält, wird mit KOH auf
pH 7,0 eingestellt, steril filtriert und 100 ecm in 1-1-Erlenmeyerkolben abgefüllt. Dieser Erlenmeyerkolben
wird mit einer Impföse des Stammes NRRL B-3051 beimpft 23 Tage auf der Rundschüttelmaschine
bei 28° C bebrütet. Die Aufarbeitung erfolgte nach Beispiel 1. Das Ergebnis zeigt die Tabelle 4.
Menge (mg) Ausbeute in % der
DL-N-Succinyl-
verbindung
Reinheit
der Isomeren
in %
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung
Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat)
474 152 47
18
18
-9,5
+ 21,7
60
69
69
Zweimal 100 ecm einer wäßrigen Nährlösung, die 0,15% Lab Lemco, 0,15% Bacteriocym, 0,4% Caseinhydrolysat,
0,1 % Glukose, 0,1 % NaCl, 0,37% K2HPO4
und 0,13% KH2PO4 enthält, werden in 1-1-Erlenmeyerkolben
20 Minuten bei 120° C sterilisiert, mit je einer öse des Stammes NRRL B-3050 beimpft
und 48 Stunden bei 28° C auf der Rundschüttelmaschine bebrütet. Danach werden die Bakterien bei
10 000 xg abgeschleudert, dreimal mit je 25 ecm steri-
IO lern destilliertem Wasser gewaschen, mit 25 ecm
sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und dann mit ·50 ecm 2%iger DjL-N-Succinyl-a-methyl-jS-ß^-dimethoxyphenyl)-alanin-Lösung
und 25 ecm Phosphatpufferlösung pH 8,0 nach Sörensen (8fach konzentriert)
gemischt und weiter auf der Rundschüttelmaschine bei 28° C bebrütet. Nach 48 bzw. 72 Stunden
werden die Kolben geerntet und nach Beispiel 1 aufgearbeitet. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle 5:
| Inkubationszeit | Menge | Ausbeute in % | [α] ? in Methanol | Reinheit | |
| Stunden | (mg) | der | c = ~1 | der Isomeren | |
| DL-N-Succinyl- | in % ■ | ||||
| 48 | 560 | verbindung | -9,4 | 60 | |
| Zurückgewonnene N-Succinylverbindung... | 56 | ||||
| Ausbeute an Aminosäure (isoliert als | 48 | 388 | + 9,2 | 58 | |
| N-Acetylderivat) | 72 | . 494 | 42 | -21,3 | 72 |
| Zurückgewonnene N-Succinylverbindung... | 49 | ||||
| Ausbeute an Aminosäure (isoliert als | 72 | 467 | + 15 ' | 63 | |
| N-Acetylderivat) | 56 | ||||
Zweimal 100 ecm einer wäßrigen Nährlösung, die 0,15% Lab Lemco, 0,15% Bacteriocym, 0,4% Caseinhydrolysat,
0,1 % Glukose, 0,1 % NaCl, 0,37% K2HPO4
und 0,13 % KH2 P O4 enthält, werden in 1-1-Erlenmeyerkolben
20 Minuten bei 120° C sterilisiert, mit je einer öse des Stammes NRRL B-3050 beimpft und 48 Stunden
bei 28° C auf der Rundschüttelmaschine bebrütet. Danach werden die Bakterien bei lOOOOxg abgeschleudert,
dreimal mit je 25 ecm sterilem destilliertem Wasser gewaschen, mit 25 ecm sterilem destilliertem
Wasser aufgenommen und dann mit 50 ecm 2%igerD,L-N-Succinyl-a-methyl-/?-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin-Lösung
und 25 ecm Phosphatpufferlösung pH 6,0 nach Sörensen (8fach konzentriert)
gemischt und weiter auf der Rundschüttelmaschine bei 280C bebrütet. Nach 48 bzw. 72 Stunden werden
die Kolben geerntet und nach Beispiel 1 aufgearbeitet. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle 6:
| Inkubationszeit Stunden |
Menge (mg) |
Ausbeute in % der DL-N-Succinyl- verbindung |
[α]" in Methanol e = ~1 |
Reinheit der Isomeren in % |
|
| Zurückgewonnene N-Succinylverbindung... Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat) |
48 48 72 72 |
407 348 260 498 |
41 42 26 60 |
-23,0 + 10,0 -42,3 + 15,2 |
74,0 59 94 64 |
| Zurückgewonnene N-Succinylverbindung... Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat) |
Zweimal 100 ecm einer wäßrigen Nährlösung, die 0,15% Lab Lemco, 0,15% Bacteriocym, 0,4% Caseinhydrolysat,
0,1 % Glukose, 0,1% NaCl, 0,37% K2HPO4
und 0,13% KH2PO4 enthält, werden in 1-1-Erlenmeyerkolben
20 Minuten bei 120° C sterilisiert, mit je einer öse des Stammes NRRL B-3051 beimpft und
48 Stunden bei 280C auf der Rundschüttelmaschine
bebrütet. Danach werden die Bakterien bei 10 000 xg abgeschleudert, dreimal mit je 25 ecm sterilem destilliertem
Wasser gewaschen, mit 25 ecm sterilem destilliertem Wasser aufgenommen und dann mit 50 ecm
2%iger D,L-N-Succinyl-a-methyl-/3-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin-Lösung
und 25 ecm Phosphatpufferlösung pH 8,0 nach Sörensen (8fach konzentriert)
gemischt und weiter auf der Rundschüttelmaschine bei 28° C bebrütet. Nach 48 bzw. 72 Stunden werden
die Kolben geerntet und nach Beispiel 1 aufgearbeitet. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle 7:
209 632/84
io
Inkubationszeit Stunden
Menge (mg)
Ausbeute in %
der
DL-N-Succinylverbindung
[α]? in Methanol
Reinheit der Isomeren
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung...
Ausbeute an Aminosäure (isoliert als
Ausbeute an Aminosäure (isoliert als
N-Acetylderivat)
Zurückgewonnene N-Succinylverbindung...
Ausbeute an Aminosäure (isoliert als
Ausbeute an Aminosäure (isoliert als
N-Acetylderivat)
48
48
72
72 539
329
459
459
370
54
40
46
46
45
-11,1.
+ 11,0
-17,4
-17,4
+ 15,2
62
60
68
68
64
Zweimal 100 ecm einer wäßrigen Nährlösung, die 0,15% Lab Lemco, 0,15% Bacteriocym, 0,4% Caseinhydrolysat,
0,1 % Glukose, 0,1 % NaCl, 0,27% K2HPO4
und 0,13% KH2PO4 enthält, werden in 1-1-Erlenmeyerkolben
20 Minuten bei 120°C sterilisiert, mit je einer öse des Stammes NRRL B-3051 beimpft und
48 Stunden bei 28° C auf der Rundschüttelmaschine bebrütet. Danach werden die Bakterien bei 10 000 xg
abgeschleudert, dreimal mit je 25 ecm sterilem destilliertem Wasser gewaschen, mit 25 ecm sterilem destilliertem
Wasser aufgenommen und dann mit 50 ecm 2%iger D,L-N-Succinyl-a-methyl-/?-(3,4-dimethoxyphenyl)-alanin-Lösung
und 25 ecm Phosphatpufferlösung pH 6,0 nach Sörensen (8fach konzentriert)
gemischt und weiter auf der Rundschüttelmaschine bei 28° C bebrütet. Nach 48 bzw. 72 Stunden werden
die Kolben geerntet und nach Beispiel 1 aufgearbeitet. Die Ergebnisse zeigt Tabelle 8:
| Inkubationszeit Stunden |
Menge (mg) |
Ausbeute in % der DL-N-Succinyl- verbindung |
[α]!? in Methanol c= ~I |
Reinheit der Isomeren in % - |
|
| Zurückgewonnene N-Succinylverbindung... Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat) |
48 48 72 72 |
450 365 ■ 392 421 |
45 44 39 51 |
-13,3 + 9,2 -28,7 + 14,9 |
64 58 80 63 |
| Zurückgewonnene N-Succinylverbindung... Ausbeute an Aminosäure (isoliert als N-Acetylderivat) |
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zur Spaltung von D,L-a-Methyljö-(3,4-dihydroxyphenyl)-alanin in seine optischen Antipoden, dadurch gekennzeichnet, daß man auf Derivate der allgemeinen FormelCH3
CH2-C- COOR"NH
CO
R'5560wobei R Wasserstoff oder Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei zwei Alkylreste R auch zu einer Alkylenkette verbunden sein können, oder Acylreste mit 1 bis 18 Kohlenstoffatomen, die durch eine Carboxyl- oder Carboalkoxygruppe substituiert sein können, R' Wasserstoff oder einen Alkylrest mit 1 bis 17 Kohlenstoffatomen ist, der durch eine Carboxyl- oder Carboalkoxygruppe substituiert sein kann, und R" Wasserstoff öder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen bedeuten, im wäßrigen Medium Bakterien des Stammes Schyzomycetes von N a e g e 1 i (1857) (NRRL-B-3O5O oder NRRL-B-3051, hinterlegt bei der ARS Culturcollection, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, USA) bzw. daraus hergestellte Extrakte einwirken läßt, dabei entstandenes freies l- bzw. D-Amin vom bleibenden D- bzw. L-Acylamin in an sich bekannter Weise trennt und gegebenenfalls vorhandene Acyl-Alkyl- bzw. Alkylengruppen, R, R' oder R" abspaltet.
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