KR101667086B1 - Ｋｕ86 에 대한 자기항체의 면역측정 방법, 거기에 사용하는 키트, 및 그것을 사용한 원발성 간세포암의 판정 방법 - Google Patents

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Abstract

검체중에 함유된 Ku86 에 대한 자기항체를 Ku86 항원 (시약으로서 기능함) 과 반응시켜 자기항체와 Ku86 항원의 면역 복합체를 생성하고, 이 면역 복합체를 표지된 항인간 면역글로블린 항체를 이용하여 측정함으로써, Ku86 에 대한 자기항체를 측정할 수 있다. 이 자기항체의 측정은 원발성 간세포암의 판정을 가능하게 할 수 있다.

Description

ＫＵ86 에 대한 자기항체의 면역측정 방법, 거기에 사용하는 키트, 및 그것을 사용한 원발성 간세포암의 판정 방법 {METHOD FOR IMMUNOASSAY OF AUTOANTIBODY AGAINST KU86, KIT FOR USE IN SAME, AND METHOD FOR DETERMINATION OF PRIMARY HEPATOCELLULAR CARCINOMA USING SAME}
본 발명은 Ku86 에 대한 자기항체를 측정하기 위한 면역측정 방법 및 면역측정용 키트에 관한 것이다. 특히, Ku86 에 대한 자기항체는 원발성 간세포암 환자의 혈중에서 특이적으로 출현한다. 따라서, 본 발명은 자기항체를 단순히 측정하는 방법을 제공할 뿐만 아니라, 원발성 간세포암의 판정에도 이용할 수 있다.
Ku86 은 이중 사슬 DNA 의 절단에 관여하는 단백질이며, Ku70 과 함께, Ku 로 불리는 헤테로2량체를 형성한다. 이 Ku 헤테로2량체는 DNA 의존성 단백질 키나아제 등과 공동으로, 이중 사슬 DNA 절단을 수복할 수 있는 것으로 기재되어 있다 (비특허 문헌 1).
한편, 아가로오스 2 차원 전기영동에 2D-DIGE (two-dimensional fluorescence difference gel electrophrosis) 기법을 적용한 개량 아가로오스 2 차원 전기영동 (비특허 문헌 2) 에 따라서, 프로테옴 해석을 이용하여 원발성 간세포암의 암 부분 및 주변의 비암 조직간의 단백질 발현량을 비교함으로써, 단백질 Ku86 은 암 부분에서 많이 발현되는 것이 밝혀지고 있다 (비특허 문헌 3).
비특허 문헌 1: Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.9, No.2, 832-837, 2002 비특허 문헌 2: Takeshi Tomonaga et al., Clin. Cancer Res. 2004;10:2007-2014 비특허 문헌 3: Masanori Seimiya et al., Hepatology 2008;48:519-30
본 발명자들은 암이 의심되는 환자 또는 암 환자 유래의 조직 검체중에 존재하는 Ku86 의 발현 레벨을 측정함으로써, 그들의 조직의 암 부분과 비암 부분을 판별할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 추가로 혈액 검체중의 Ku86 의 존재에 대해 연구를 수행하였으며, 놀랍게도 혈액 검체중에 Ku86 에 대한 자기항체가 존재할 수도 있어, 원발성 간세포암 환자의 경우, 자기항체의 양이 특이적으로 많다는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명의 목적은 원발성 간세포암 판정에 응용할 수 있는, Ku86 에 대한 자기항체의 측정 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 검체중의 Ku86 에 대한 자기항체를 시약으로서의 Ku86 항원과 반응시키고, 생성되는 자기항체와 Ku86 항원의 면역 복합체를 표지된 항인간 면역글로블린 항체로 측정함으로써, 상기 자기항체를 측정할 수 있으며, 이로써 암 판정이 가능하게 되는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.
따라서, 본 발명은 검체중의 Ku86 에 대한 자기항체를 시약으로서의 Ku86 항원과 반응시키고, 생성되는 Ku86 에 대한 자기항체와 Ku86 항원의 면역 복합체를 측정함으로써, 상기 자기항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, Ku86 에 대한 자기항체의 면역측정 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 시약 성분으로서 적어도 Ku86 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는, Ku86 에 대한 자기항체 면역측정용 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 Ku86 에 대한 자기항체를 측정함으로써 원발성 간세포암을 판정하는, 원발성 간세포암의 판정 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 Ku86 에 대한 자기항체를 포함하는 원발성 간세포암 판정용 마커에 관한 것이다.
본 발명은 검체, 특히 혈액에서 유래하는 검체중에 존재하는 Ku86 에 대한 자기항체를 간단하게 측정할 수 있어, 원발성 간세포암 환자의 판정에 유효하다.
도 1 은 Ku86 항원을 감작한 ELISA 플레이트를 이용한, 정상인 검체, C형 간염 환자 혈청 검체, C형 간경변 환자 혈청 검체, 초기 원발성 간세포암 (이하, 때때로 초기 HCC 라고 함) 환자 혈청 검체 및 재발 원발성 간세포암 (이하, 때때로 재발 HCC 라고 함) 환자 혈청 검체중의 Ku86 에 대한 자기항체의 측정 결과를 나타낸다. 도면에서, 가로축은 질환명을 나타내고, 세로축은 파장 450 ㎚ 의 광에 대한 흡광도를 나타낸다. 별표는 정상인 혈청 검체군, C형 간염 환자 검체군 또는 C형 간경변 환자 혈청 검체군과 비교한 모든 경우에, Wilcoxon 2 표본 검정에 의한 유의한 차이 (p < 0.0001) 가 존재하는 혈청 검체군을 나타낸다.
도 2 는 Ku86 항원을 감작한 ELISA 플레이트를 이용한, 정상인 혈청 검체, 초기 HCC 환자 혈청 검체, 대장암 환자 혈청 검체, 위암 환자 혈청 검체, 췌장암 환자 혈청 검체, 유방암 환자 혈청 검체, 폐암 환자 혈청 검체 및 식도암 환자 혈청 검체중의 Ku86 과 이의 자기항체의 복합체의 측정 결과를 나타낸다. 도면에서, 가로축은 질환명을 나타내고, 세로축은 파장 450 ㎚ 의 광에 대한 흡광도를 나타낸다. 별표는 정상인 혈청 검체군, 대장암 환자 혈청 검체군, 위암 환자 혈청 검체군, 췌장암 환자 혈청 검체군, 유방암 환자 혈청 검체군, 폐암 환자 혈청 검체군 또는 식도암 환자 혈청 검체군과 비교한 모든 경우에, Wilcoxon 2 표본 검정에 의한 유의한 차이 (p < 0.0001) 가 존재하는 혈청 검체군을 나타낸다.
본 발명의 KU86 에 대한 자기항체의 면역측정 방법은, 검체중의 Ku86 에 대한 자기항체를 시약으로서의 Ku86 항원과 반응시키고, 생성되는 Ku86 에 대한 자기항체와 Ku86 항원의 면역 복합체를 측정함으로써, Ku86 에 대한 자기항체를 측정하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 검체는 생체 유래의 시료가 바람직하고, 특히 혈액 유래 검체가 바람직하며, 혈액 유래 검체의 예는 전혈, 혈장, 및 혈청을 포함할 수 있다.
본 발명의 면역측정 방법의 측정 대상은 Ku86 에 대한 자기항체이다. 상술한 바와 같이, Ku86 은 이중 사슬 DNA 의 절단에 관여하는 단백질이며, 이의 정식 명칭은 ATP-의존성 DNA 헬리카아제 2 서브유닛 2 이다. 다르게는, XRCC5 로도 불린다. 또한, Ku86 은 732 개의 아미노산으로 이루어진 82 kDa 단백질이며, 이의 미국 국립 생물 공학 정보 센터 (NCBI) 의 수락 번호 (accession No.) 는 gi-10863945 이다.
본 발명의 면역측정 방법을 실시하기 위해서는, 시약으로서 Ku86 항원을 사용한다. 시약으로서의 Ku86 항원은, Ku86 에 대한 자기항체와 항원-항체 반응할 수 있는 항원이면 특별히 한정되지 않지만, 이의 예는 전장 Ku86 단백질, Ku86 에 대한 자기항체와 항원-항체 반응할 수 있는 전장 단백질과 동일한 기능을 가지며, 또한 그 아미노산 배열과 90 % 이상의 상동성을 갖는 단백질, 또는 전장 Ku86 단백질의 아미노산 배열에서 1 개 내지 몇 개의 아미노산 잔기가 제거, 치환 또는 부가된 아미노산 배열을 갖는 단백질인 전장 Ku86 단백질의 변이체, 및 Ku86 에 대한 자기항체와 항원-항체 반응할 수 있는 Ku86 의 단편 펩티드를 포함할 수 있다. 전장 Ku86 단백질은 Abnova Corporation 에서 입수 가능하지만, 전체 아미노산 배열이 상술한 바와 같이 공지되어 있기 때문에, 상기 단백질 또는 이의 변이체는 유전 공학 기술에 의해서도 합성할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 경우, Ku86 의 단편 펩티드는 전장 Ku86 단백질을 효소 가수분해 등에 의해 각종 펩티드 단편으로 절단하여 형성할 수 있거나, 또는 시판의 자동 펩티드 합성장치를 이용해서도 용이하게 형성할 수 있다. 또한, 표적의 Ku86 의 단편 펩티드는 유전 공학 기술에 의해서도 형성할 수 있다.
본 발명에서는, 이와 같이 수득된 전장 Ku86 단백질의 변이체 또는 단편 펩티드를 Ku86 에 대한 자기항체와 반응시키고, 이어서 항원-항체 반응을 하는 것을 선택하여 시약으로서의 Ku86 항원으로서 사용할 수 있다. 본 발명에서는, 상술한 각 펩티드 단편의 전체, 또한 이의 일부 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있어, 이들도 시약으로서의 Ku86 항원에 포함된다.
본 발명에서 Ku86 에 대한 자기항체의 면역측정을 위해서는, 예를 들어 시약으로서의 Ku86 항원을 마이크로플레이트 또는 그 밖의 담체상에 고상화시킨 후, 수득되는 수불용화 담체에, 자기항체를 함유하는 것으로 예상되는 검체를 적용하여, 시약으로서의 Ku86 항원과의 항원-항체 반응에 의해 자기항체를 결합시킨다. 그 후, 효소 등으로 표지한 항인간 면역글로블린 항체를 담체에 적용하여 자기항체에 반응 결합시킨다.
수불용화 담체의 제조는 단백질을 고상의 표면에 결합시키는 공지의 방법을 이용하여 용이하게 실시할 수 있다. 고상으로 전환시키기 위한 담체로서는, 예를 들어 비이드, 마이크로플레이트 및 튜브가 통상적으로 사용된다. 이들 고상 표면에 시약으로서의 Ku86 항원을 결합시키는 방법으로서는, 물리흡착 및 화학 결합과 같은 공지의 고정화 기술을 적절히 이용할 수 있다.
이와 같이 고상화시킨 Ku86 항원과 자기항체를 함유하는 검체를 접촉시키면, Ku86 에 대한 자기항체 만이 시약으로서의 Ku86 항원과 특이적으로 결합한다. 따라서, 표지한 항인간 면역글로블린 항체를 첨가하면, 항인간 면역글로블린 항체는 Ku86 에 대한 자기항체와 결합하므로, 이 표지를 이용하여 자기항체의 측정을 실시할 수 있다.
표지로서는, 상용되는 표지, 예를 들어 효소, 방사성 동위원소, FITC, 로다민 및 루미놀과 같은 형광물질 및 화학발광 물질이 적절히 사용된다. 이들 각종 표지를 이용하여, 효소 면역 측정 방법, 방사 면역 측정 방법, 형광 면역 측정 방법 및 화학발광 면역 측정 방법과 같은 방법에 의해, Ku86 에 대한 자기항체를 측정할 수 있다.
효소 면역 측정 방법에 사용하는 표지 효소로서는, 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 소 소장 알칼리 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 우레아제 또는 글루코오스 옥시다아제와 같은 효소 면역 분석법 (EIA) 에 상용되는 효소가 적절히 사용되고, 이들 효소에 적합하며 EIA 에 상용되는 발색 기질이 적절히 사용된다. 발색 기질로서는, 예를 들어 HRP 의 경우에는, 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 (TMBZ), TMBZ·HCl, TMBZ·PS, ABTS, o-페닐렌 디아민 및 p-히드록시페닐 아세트산이 사용되고, 알칼리 포스파타아제의 경우에는, p-니트로페닐 포스페이트 및 4-메틸움벨리페릴 포스페이트가 사용되며, β-갈락토시다아제의 경우에는, o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노시드 및 4-메틸움벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드가 사용된다.
방사 면역 측정 방법, 형광 면역 측정 방법, 화학발광 면역 측정 방법 등에 있어서도, 통상적으로 사용되는 공지의 표지를 채용할 수 있다.
본 발명의 면역측정 방법에서는, 상술한 방법 이외에, 웨스턴 블로팅법, 면역 조직 염색법, 라텍스 면역 비탁법 및 면역 침강법과 같은 면역 측정법, 및 액체 크로마토그래피법에 의해서도, Ku86 에 대한 자기항체를 측정할 수 있다.
본 발명의 면역측정 방법은 시약 성분으로서 적어도 Ku86 항원을 포함하는 Ku86 에 대한 자기항체의 면역측정용 키트에 의해 실시할 수 있다. Ku86 항원은, 예를 들어 마이크로플레이트와 같은 수불용성 담체에 결합시킨 형태의, 키트의 시약 성분일 수 있다. 키트의 다른 시약 성분으로서는, 항인간 면역글로블린 항체가 포함된다. 이 항인간 면역글로블린 항체는, 효소 면역 측정 방법, 방사 면역 측정 방법, 형광 면역 측정 방법 및 화학발광 면역 측정 방법과 같은 채용하는 측정 방법에 따라, 효소, 방사성동위원소, 형광 물질 또는 화학발광 물질과 같은 표지 물질로 표지된 것이 사용된다. 그 밖의 시약 성분으로서는, 계면활성제 및 완충제를 적절히 첨가할 수 있다.
본 발명에서는, Ku86 에 대한 자기항체를 측정함으로써, 원발성 간세포암을 판정할 수 있다. 본 발명의 측정 방법에 의해 Ku86 에 대한 자기항체를 측정하는 것은 환자의 암 질환의 판별에 유효하다. 본 발명의 측정 방법의 이용은, 예를 들어 정상인과 초기 원발성 간세포암 환자 및 재발 원발성 간세포암 환자의 판별에 유효하다. 또한, 본 발명의 측정 방법을 이용함으로써, 대장암 환자, 위암 환자, 췌장 환자, 유방암 환자, 폐암 환자 또는 식도암 환자와 같은 암 환자와 초기 원발성 간세포암 환자 및 재발 원발성 간세포암 환자의 판별이 가능하다. 또한, 본 발명의 측정 방법을 이용함으로써, C형 간염 환자 또는 C형 간경변과 같은 간장 질환 환자와 초기 원발성 간세포암 환자 또는 재발 원발성 간세포암 환자와 같은 원발성 간세포암 환자의 판별이 가능하다.
이상의 설명으로부터 명백한 바와 같이, Ku86 에 대한 자기항체는 원발성 간세포암 판정용 마커로서 기능하며, 원발성 간세포암의 판정용 마커로서 사용할 수 있다. 또한, Ku86 에 대한 자기항체는 전혈, 혈장 및 혈청과 같은 혈액 유래 검체를 이용하여 원발성 간세포암을 판정하는 마커로서 바람직하다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 아무런 제한이 되는 것은 아니다.
실시예 1
Ku86 에 대한 자기항체의 측정
정상인, C형 간염 환자, C형 간경변 환자, 초기 원발성 간세포암 환자, 재발 원발성 간세포암 환자, 대장암 환자, 위암 환자, 췌장암 환자, 유방암 환자, 폐암 환자 및 식도암 환자에서 채취한 혈청 검체에 대해, Ku86 에 대한 자기항체를, 이하에 구체적으로 설명하는 효소 면역 측정 방법 (ELISA 법) 으로 측정하였다.
1. 방법
(1) Ku86 결합 ELISA 플레이트의 형성
수불용성 담체로서 ELISA 플레이트 (Nalge Nunc International 제, Maxisorp) 를 이용하여, Ku86 으로서 전장 XRCC5 (재조합 단백질 GST-태그됨: Abnova Corporation 제, 5 ㎍/㎖, 100 ㎕/well) 를 상기 플레이트 상에서 4 ℃ 에서 하룻밤 정치시켜 감작시킨 후, 플레이트를 0.05 % Tween 20 을 함유하는 PBS (200 ㎕/well) 로 3 회 세정하였다. 그 후, 플레이트를 1.5 % BSA 및 10 % 사카로오스를 함유하는 PBS (200 ㎕/well) 로 하룻밤 코팅하여 Ku86 결합 ELISA 플레이트를 형성하였다.
(2) Ku86 에 대한 자기항체의 측정
각 샘플 혈청을 PBS 로 100 배 희석시키고, 희석액을 100 ㎕/well 의 양으로 Ku86 결합 ELISA 플레이트에 첨가한 후, 37 ℃ 에서 1 시간 동안 정치시키고, 이어서 플레이트를 0.05 % Tween 20 을 함유하는 PBS (200 ㎕/well) 로 3 회 세정하였다. 이 플레이트에, HRP 표지된 면역글로블린 (HRP-표지된 항인간 IgG (Zymed Laboratories Inc. 제) 를 0.05 % Tween 20 을 함유하는 PBS 로 4000 배 희석시킨 것) 을 100 ㎕/well 의 양으로 첨가하고, 혼합물을 37 ℃ 에서 30 분간 정치시켰다. 그 다음에, 플레이트를 0.05 % Tween 20 을 함유하는 PBS (200 ㎕/well) 로 3 회 세정한 후, TMBZ 를 100 ㎕/well 의 양으로 플레이트에 첨가하였다. 이 플레이트를 실온에서 10 분간 정치시킨 후, 반응 정지제로서 1 N 황산 100 ㎕/well 을 플레이트에 첨가하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더 (Bio-Rad Laboratories, Inc. 제) 를 이용하여 파장 450 ㎚ 에서 측정하였다.
또한, 검체는 정상인 48 예, C형 간염 환자 16 예, C형 간경변 환자 21 예, 초기 원발성 간세포암 환자 검체 35 예, 재발 원발성 간세포암 환자 52 예, 대장암 환자 검체 16 예, 위암 환자 16 예, 췌장암 환자 16 예, 유방암 환자 20 예, 폐암 환자 10 예 및 식도암 환자 18 예를 사용하였다.
2. 결과
Ku86 결합 ELISA 플레이트를 이용한 Ku86 에 대한 자기항체의 측정 결과를 도 1 에 나타냈다. 유의한 차이 검정은 KaleidaGraph 4.0 을 이용하여, Wilcoxon 2 표본 검정으로 통계 처리하였다.
도 1 에 나타내는 바와 같이, 정상인 군, C형 간염 군 및 C형 간경변 군과 비교해, 초기 원발성 간세포암 환자 검체군 및 재발 원발성 간세포암 환자 검체군에서, Ku86 에 대한 자기항체의 양에 분명한 유의한 차이가 관찰되었다. 따라서, 혈중의 Ku86 에 대한 자기항체의 면역측정은, 간장 질환 중에서도, 원발성 간세포암의 판별에 유효한 것으로 나타났다.
도 2 에 나타내는 바와 같이, 정상인 군 및 여러 가지 암 환자 검체군, 즉, 대장암 환자 검체군, 위암 환자 검체군, 췌장암 환자 검체군, 유방암 환자 검체군, 폐암 환자 검체군 및 식도암 환자 검체군과 비교해, 원발성 간세포 환자 검체군에서, Ku86 에 대한 자기항체의 양에 분명한 유의한 차이가 관찰되었다. 따라서, 혈중의 Ku86 에 대한 자기항체의 면역측정은 정상인과 원발성 간세포암 환자의 판별에 유효한 것으로 나타났다. 또한, 혈중의 Ku86 에 대한 자기항체의 면역측정은 대장암 환자, 위암 환자, 췌장 환자, 유방암 환자, 폐암 환자 또는 식도암 환자와 같은 암 환자와 원발성 간세포암 환자의 판별에도 유효한 것으로 나타났다.
산업상 이용 가능성
이상에서 상세하게 설명한 바와 같이, 혈액 유래 검체와 같은 검체중의 Ku86 에 대한 자기항체를 시약으로서의 Ku86 항원과 반응시키고, 생성되는 자기항체와 Ku86 항원의 면역 복합체를 측정함으로써, 상기 자기항체를 측정할 수 있으며, 이로써 원발성 간세포암의 판정이 가능하다.

Claims (13)

  1. 검체중의 Ku86 에 대한 자기항체와 시약으로서의 Ku86 항원을 반응시키고, 생성되는 Ku86 에 대한 자기항체와 Ku86 항원의 면역 복합체를 측정함으로써, 그 자기항체를 측정하는 것을 특징으로 하는, 원발성 간세포암 판정용의, Ku86 에 대한 자기항체의 면역측정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 검체가 혈액 유래 검체인 면역측정 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 면역측정 방법이 효소 면역 측정 방법, 형광 면역 측정 방법, 화학발광 면역 측정 방법 또는 방사 면역 측정 방법인 면역측정 방법.
  4. 시약 성분으로서 적어도 Ku86 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항 또는 제 2 항에 기재된 방법을 위한 키트.
  5. 제 4 항에 있어서, Ku86 항원이 수불용성 담체에 결합되어 있는 키트.
  6. 제 5 항에 있어서, 추가로, 항인간 면역글로블린 항체를 포함하는 키트.
  7. 제 6 항에 있어서, 항인간 면역글로블린 항체가 표지 물질로 표지되어 있는 키트.
  8. Ku86 에 대한 자기항체를 포함하는, 원발성 간세포암 판정용 마커.
  9. 제 8 항에 있어서, 혈액 유래 검체를 이용하여 암을 판정하기 위한, 원발성 간세포암 판정용 마커.
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