JPWO2011090017A1 - Ｋｕ８６に対する自己抗体の免疫測定方法、それに用いるキット、及びそれを用いた原発性肝細胞癌の判定方法 - Google Patents

Abstract

検体中のＫｕ８６に対する自己抗体を、試薬としてのＫｕ８６抗原と反応させて、生成する自己抗体とＫｕ８６抗原との免疫複合体を標識抗ヒトイムノグロブリン抗体により測定することにより、その自己抗体を測定することができ、それによって原発性肝細胞癌を判定することができる。

Description

本発明は、Ｋｕ８６に対する自己抗体を測定するための免疫測定方法及び免疫測定用キットに関するものである。Ｋｕ８６に対する自己抗体は、特に原発性肝細胞癌患者の血中に特異的に出現するものであり、したがって、本発明は、自己抗体を単に測定する方法を提供するだけでなく、原発性肝細胞癌の判定にも利用することができる。

Ｋｕ８６は、二重鎖ＤＮＡ切断に関与する蛋白質であり、Ｋｕ７０と共に、Ｋｕと呼ばれるヘテロ二量体を形成し、そのＫｕヘテロ二量体は、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ等と共同で、二重鎖ＤＮＡ切断を修復することができるとされている（非特許文献１）。
他方、アガロース２次元電気泳動に２Ｄ−ＤＩＧＥ法（two-dimensional fluorescence difference gel electrophrosis）を適用した改良アガロース２次元電気泳動法（非特許文献２）により、原発性肝細胞癌の癌部および周辺の非癌部組織の蛋白発現量の比較をプロテオーム解析により行ない、Ｋｕ８６という蛋白質が癌部に多く発現されることが明らかになっている（非特許文献３）。

Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.9, No.2, 832-837, 2002 Takeshi Tomonaga et al., Clin. Cancer Res. 2004;10:2007-2014 Masanori Seimiya et al., Hepatology 2008;48:519-30

本発明者らは、癌が疑われる患者または癌患者由来の組織検体中に存在する、Ｋｕ８６の発現レベルを測定して、それらの組織の癌部と非癌部の判別をすることができることを見出した。本発明者らは、さらに血液検体中のＫｕ８６の存在について研究を続けたところ、驚くべきことに、血液検体中にＫｕ８６に対する自己抗体が存在する場合があり、原発性肝細胞癌患者の場合、その自己抗体の量が特異的に多いことを見出した。したがって、本発明の目的は、原発性肝細胞癌判定に応用することのできる、Ｋｕ８６に対する自己抗体の測定方法を提供することである。

本発明者らは、検体中のＫｕ８６に対する自己抗体を、試薬としてのＫｕ８６抗原と反応させて、生成する自己抗体とＫｕ８６抗原との免疫複合体を標識抗ヒトイムノグロブリン抗体により測定することにより、その自己抗体を測定することができ、それによって癌判定が可能になることを見出し、本発明を完成させた。
従って、本発明は、検体中のＫｕ８６に対する自己抗体と試薬としてのＫｕ８６抗原とを反応させ、生成するＫｕ８６に対する自己抗体とＫｕ８６抗原との免疫複合体を測定することにより、その自己抗体を測定することを特徴とする、Ｋｕ８６に対する自己抗体の免疫測定方法に関する。
更に、本発明は、試薬成分として少なくともＫｕ８６抗原を含むことを特徴とする、Ｋｕ８６に対する自己抗体免疫測定用キットに関する。
更に、本発明は、Ｋｕ８６に対する自己抗体を測定することにより、原発性肝細胞癌であることを判定する、原発性肝細胞癌判定方法に関する。
更に、本発明は、Ｋｕ８６に対する自己抗体からなる、原発性肝細胞癌判定用マーカーに関する。

本発明においては、検体中、特に、血液由来検体中に存在するＫｕ８６に対する自己抗体を簡単に測定でき、原発性肝細胞癌患者の判定に有効である。

Ｋｕ８６抗原を感作したＥＬＩＳＡプレートを用いて健常人検体、Ｃ型肝炎患者血清検体、Ｃ型肝硬変患者血清検体、初発原発性肝細胞癌（以下、初発ＨＣＣということもある）患者血清検体および再発原発性肝細胞癌（以下、再発ＨＣＣということもある）患者血清検体においてＫｕ８６に対する自己抗体を測定した結果である。なお、図中、横軸は疾患名を示し、縦軸は波長４５０ｎｍ光に対する吸光度を示している。また、アスタリスクは、健常人血清検体群、Ｃ型肝炎患者検体群またはＣ型肝硬変患者血清検体群との比較をした全ての場合に、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの２標本検定による有意差（ｐ＜０．０００１）が存在する血清検体群を示している。 Ｋｕ８６抗原を感作したＥＬＩＳＡプレートを用いて健常人血清検体、初発ＨＣＣ患者血清検体、大腸癌患者血清検体、胃癌患者血清検体、膵臓癌患者血清検体、乳癌患者血清検体、肺癌患者血清検体および食道癌患者血清検体においてＫｕ８６とその自己抗体との複合体を測定した結果である。なお、図中、横軸は疾患名を示し、縦軸は波長４５０ｎｍ光に対する吸光度を示している。また、アスタリスクは、健常人血清検体群、大腸癌患者血清検体群、胃癌患者血清検体群、膵臓癌患者血清検体群、乳癌患者血清検体群、肺癌患者血清検体群または食道癌患者血清検体群との比較をした全ての場合に、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの２標本検定による有意差（ｐ＜０．０００１）が存在する血清検体群を示している。

本発明のＫｕ８６に対する自己抗体の免疫測定方法は、検体中のＫｕ８６に対する自己抗体と試薬としてのＫｕ８６抗原とを反応させ、生成するＫｕ８６に対する自己抗体とＫｕ８６抗原との免疫複合体を測定することによりＫｕ８６に対する自己抗体を測定することを特徴とする。

本発明において、検体とは、生体由来の試料が好適で、特に、血液由来検体が好適であり、血液由来検体としては、全血、血漿、血清を例示できる。

本発明の免疫測定方法の測定対象は、Ｋｕ８６に対する自己抗体である。Ｋｕ８６は、前記したとおり、二重鎖ＤＮＡ切断に関与する蛋白質であり、その正式名は、ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＤＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅ ２ ｓｕｂｕｎｉｔ ２であり、別名としてＸＲＣＣ５とも言われている。また、Ｋｕ８６は、米国の国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）の受け入れ番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ）が ｇｉ−１０８６３９４５である、７３２個のアミノ酸からなる８２ｋＤａの蛋白質である。

本発明の免疫測定方法を実施するには、試薬としてのＫｕ８６抗原を用いる。試薬としてのＫｕ８６抗原としては、Ｋｕ８６に対する自己抗体と抗原抗体反応しうる抗原であれば特に限定しないが、Ｋｕ８６全長蛋白質、Ｋｕ８６全長蛋白質の変異体であって該蛋白質と同様のＫｕ８６に対する自己抗体と抗原抗体反応しうる機能を有し且つ該アミノ酸配列と９０％以上の相同性を有する蛋白質もしくはＫｕ８６全長蛋白質のアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸残基が欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列を有する蛋白質である変異体、Ｋｕ８６の断片ペプチドであってＫｕ８６の自己抗体と抗原抗体反応しうるペプチドを例示できる。Ｋｕ８６全長蛋白質は、Ａｂｎｏｖａ社より入手可能であるが、全アミノ酸配列が上記の通り既知であるので、Ｋｕ８６全長蛋白質やその変異体は、遺伝子組換え技術によっても合成できる。本発明においてＫｕ８６の断片ペプチドを用いるときは、Ｋｕ８６全長蛋白質を酵素分解等によって各種のペプチド断片に切断して作成してもよいし、市販の自動ペプチド合成装置を用いても容易に作成することができる。また、標的のＫｕ８６の断片ペプチドを遺伝子組み換え技術によっても作成することができる。

本発明においては、そのようにして得られたＫｕ８６全長蛋白質の変異体や断片ペプチドを、Ｋｕ８６に対する自己抗体と反応させ抗原抗体反応をするものを選択して試薬としてのＫｕ８６抗原として用いることができる。本発明においては、上記した各ペプチド断片の全体のほか、その一部も使用できるし、それらの混合物も使用でき、これらも試薬としてのＫｕ８６抗原に包含される。

本発明においてＫｕ８６に対する自己抗体を免疫測定するには、例えば、試薬としてのＫｕ８６抗原をマイクロプレートその他の担体に固相化しておき、得られる水不溶化担体に該自己抗体を含有すると予想される検体を適用して試薬としてのＫｕ８６抗原と抗原抗体反応させて結合させ、次いで酵素等で標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体を適用して該自己抗体に反応結合させる。

水不溶化担体の調製は、蛋白質を固相面に結合する既知の方法を用いて容易に行うことができる。例えば、固相化担体としては、通常、ビーズ、マイクロプレート、チューブ等が用いられる。これらの固相面に試薬としてのＫｕ８６抗原を結合する方法としては、物理吸着、化学結合等既知の固定化技術が適宜利用できる。
このようにして固相化したＫｕ８６抗原とその自己抗体含有検体とを接触させると、Ｋｕ８６に対する自己抗体のみが特異的に試薬としてのＫｕ８６抗原と結合する。そこで、標識した抗ヒトイムノグロブリン抗体を加えると、抗ヒトイムノグロブリン抗体はＫｕ８６に対する自己抗体と結合するので、この標識を利用して測定を行うことができる。

標識としては、酵素、ラジオアイソトープ、ＦＩＴＣ、ローダミン、ルミノールといった蛍光物質、化学発光物質等常用される標識が適宜使用される。これらの各種標識を用いて、酵素免疫測定方法、放射免疫測定方法、蛍光免疫測定方法、化学発光免疫測定方法等の方法により、Ｋｕ８６に対する自己抗体を測定することができる。
酵素免疫測定方法に用いる標識酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウシ小腸アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素免疫分析法（ＥＩＡ）に常用される酵素が適宜使用され、これらの酵素に適合しＥＩＡで常用される発色基質が適宜使用される。発色基質としては、例えばＨＲＰの場合は、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、ＴＭＢＺ・ＨＣｌ、ＴＭＢＺ・ＰＳ、ＡＢＴＳ、ｏ−フェニレンジアミン、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸等が使用され、アルカリフォスファターゼの場合は、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート、４−メチルウンベリフェリルフォスフェート等が使用され、β−ガラクトシダーゼの場合は、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド等が使用される。
放射免疫測定方法、蛍光免疫測定方法、化学発光免疫測定方法等においても、通常用いられる公知の標識を採用することができる。
本発明の免疫測定方法においては、上記した方法のほか、ウエスタンブロット法、免疫組織染色法、ラテックス免疫比濁法及び免疫沈降法等の免疫測定法、液体クロマトグラフィー法によっても、Ｋｕ８６に対する自己抗体を測定することができる。

本発明の免疫測定方法は、試薬成分として少なくともＫｕ８６抗原を含む、Ｋｕ８６に対する自己抗体免疫測定用キットにより実施することができる。Ｋｕ８６抗原は、例えば、マイクロプレートなどの水不溶性担体に結合させた形態で、キットの試薬成分とすることができる。キットの他の試薬成分としては、抗ヒトイムノグロブリン抗体が挙げられ、この抗ヒトイムノグロブリン抗体は、採用する酵素免疫測定方法、放射免疫測定方法、蛍光免疫測定方法、化学発光免疫測定方法などの測定方法に応じて、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、化学発光物質などの標識物で標識されたものが用いられる。その他の試薬成分として、界面活性剤、緩衝剤を適宜、加えてもよい。

本発明においては、Ｋｕ８６に対する自己抗体を測定することにより、原発性肝細胞癌の判定をすることができる。本発明の測定方法によりＫｕ８６に対する自己抗体を測定することは、患者の癌疾患の判別に有効である。本発明の測定方法の利用は、例えば、健常人と、初発原発性肝細胞癌患者や再発原発性肝細胞癌患者との判別に有効である。また、本発明の測定方法を利用することにより、大腸癌患者、胃癌患者、膵臓患者、乳癌患者、肺癌患者または食道癌患者等の癌患者と、初発原発性肝細胞癌患者や再発原発性肝細胞癌患者との判別が可能である。さらに、本発明の測定方法を利用することで、Ｃ型肝炎患者またはＣ型肝硬変等の肝臓疾患患者と、初発原発性肝細胞癌患者または再発原発性肝細胞癌患者等の原発性肝細胞患者との判別が可能である。

以上の説明から明らかな通り、Ｋｕ８６に対する自己抗体は、原発性肝細胞癌判定用マーカーとなるものであり、原発性肝細胞癌の判定用マーカーとして使用できるものである。また、Ｋｕ８６に対する自己抗体は、全血、血漿、血清などの血液由来検体を用いて原発性肝細胞癌を判定するマーカーとして好適なものである。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に何ら制限されるものではない。
実施例１
Ｋｕ８６に対する自己抗体の測定
健常人、Ｃ型肝炎患者、Ｃ型肝硬変患者、初発原発性肝細胞癌患者、再発原発性肝細胞癌患者、大腸癌患者、胃癌患者、膵臓癌患者、乳癌患者、肺癌患者および食道癌患者から採取した血清検体について、Ｋｕ８６に対する自己抗体を、以下に具体的に説明する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）にて測定した。

１．方法
（１）Ｋｕ８６のＥＬＩＳＡプレートの作成
水不溶性担体としてＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ社製，Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を用い、それにＫｕ８６としてＸＲＣＣ５全長体（リコンビナントタンパク質 ＧＳＴタグ付き: Ａｂｎｏｖａ社製５μｇ／ｍＬ，１００μＬ／ｗｅｌｌ）を１晩４℃静置して感作し、その後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄を行った。ついで、１．５％ＢＳＡ、１０％サッカロースを含むＰＢＳ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で１晩コーティングしてＫｕ８６のＥＬＩＳＡプレートを作成した。

（２）Ｋｕ８６に対する自己抗体の測定
各サンプル血清はＰＢＳにて１００倍に希釈し、それを１００μＬ／ｗｅｌｌずつＫｕ８６のＥＬＩＳＡプレートに加え、１時間３７℃で静置し、その後、そのプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄した。そのプレートもＨＲＰ標識免疫グロブリン（ＨＲＰ標識されたａｎｔｉ−ＨｕｍａｎＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社製）を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて４０００倍に希釈したもの）を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、３０分間３７℃で静置した。ついで、そのプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で３回洗浄した後、ＴＭＢＺを１００μＬ／ｗｅｌｌずつ加え、１０分間室温で静置の後、反応停止剤として１００μＬ／ｗｅｌｌの１Ｎ硫酸を加えた。吸光度はマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、波長４５０ｎｍにて測定を行った。
なお、検体は健常人４８例、Ｃ型肝炎患者１６例、Ｃ型肝硬変患者２１例、初発原発性肝細胞癌患者検体３５症例、再発原発性肝細胞癌患者５２例、大腸癌患者検体１６例、胃癌患者１６例、膵臓癌患者１６例、乳癌患者２０例、肺癌患者１０例、食道癌患者１８例を用いた。

２．結果
Ｋｕ８６のＥＬＩＳＡプレートを用いてＫｕ８６に対する自己抗体を測定した結果を、図１に示す。有意差検定はＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ４．０を用い、Ｗｉｌｃｏｘｏｎの２標本検定にて統計処理した。
図１に示すように、健常人群、Ｃ型肝炎群およびＣ型肝硬変群と比較し、初発原発性肝細胞癌患者検体群および再発原発性肝細胞癌患者検体群のＫｕ８６に対する自己抗体量は、明らかな有意差を認めた。したがって、血中のＫｕ８６に対する自己抗体の免疫測定は、肝臓疾患の中でも、原発性肝細胞癌の判別に有効であることが示された。
図２に示すように、健常人群や種々の癌患者検体群、すなわち、大腸癌患者検体群、胃癌患者検体群、膵臓癌患者検体群、乳癌患者検体群、肺癌患者検体群および食道癌患者検体群と比較して、原発性肝細胞患者検体群のＫｕ８６に対する自己抗体量は、明らかな有意差を認めた。したがって、血中のＫｕ８６に対する自己抗体の免疫測定は、健常人と原発性肝細胞癌患者との判別に有効であることが示された。さらに、血中のＫｕ８６に対する自己抗体の免疫測定は、大腸癌患者、胃癌患者、膵臓患者、乳癌患者、肺癌患者または食道癌患者等の癌患者と原発性肝細胞癌患者との判別にも有効であることが示された。

以上に詳細に説明したように、血液由来検体などの検体中のＫｕ８６に対する自己抗体を、試薬としてのＫｕ８６抗原と反応させて、生成する自己抗体とＫｕ８６抗原との免疫複合体を測定することにより、その自己抗体を測定することができ、それによって、原発性肝細胞癌の判定が可能である。

Claims (13)

1. 検体中のＫｕ８６に対する自己抗体と試薬としてのＫｕ８６抗原とを反応させ、生成するＫｕ８６に対する自己抗体とＫｕ８６抗原との免疫複合体を測定することにより、その自己抗体を測定することを特徴とする、Ｋｕ８６に対する自己抗体の免疫測定方法。
2. 検体が血液由来検体である、請求項１に記載の免疫測定方法。
3. 免疫測定方法が、酵素免疫測定方法、蛍光免疫測定方法、化学発光免疫測定方法、又は放射免疫測定方法である、請求項１又は２に記載の免疫測定方法。
4. 癌判定用である、請求項１から３のいずれかに記載の免疫測定方法。
5. 癌が原発性肝細胞癌である、請求項４に記載の免疫測定方法。
6. 試薬成分として少なくともＫｕ８６抗原を含むことを特徴とする、Ｋｕ８６に対する自己抗体免疫測定用キット。
7. Ｋｕ８６抗原が水不溶性担体に結合されている、請求項６に記載のキット。
8. さらに、抗ヒトイムノグロブリン抗体を含む、請求項７に記載のキット。
9. 抗ヒトイムノグロブリン抗体が標識物で標識されている、請求項８に記載のキット。
10. Ｋｕ８６に対する自己抗体を測定することにより、原発性肝細胞癌であることを判定する、原発性肝細胞癌判定方法。
11. 血液由来検体中の自己抗体を測定する、請求項１０に記載の原発性肝細胞癌判定方法。
12. Ｋｕ８６に対する自己抗体からなる、原発性肝細胞癌判定用マーカー。
13. 血液由来検体を用いて判定するための、請求項１２に記載の原発性肝細胞癌判定用マーカー。

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